Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Исследовательская статья
* These authors contributed equally
У даннойся рыбки зебрафиш Mollugin в безопасных дозах (≤200 µg/mL) способствовал улучшению регенерации хвоста, что сопровождалось изменениями в экспрессии генов, связанных с апоптозом, маркеров воспаления, активности антиоксидантных ферментов и маркеров, ассоциированных с макрофагами. Эти результаты позволяют предположить, что Mollugin может модулировать локальный ответ на повреждение в процессе регенерации хвоста у рыбки зебрафиш.
Моллюгин представляет собой природное нафтохиноновое соединение с зарегистрированной противовоспалительной и антиоксидантной активностью, однако его роль в регенерации тканей остается изученной не полностью. В данном исследовании была использована модель ампутации хвоста у рыб zebrafish для изучения влияния моллюгина на заживление ран, а также связанные с этим иммунный ответ и окислительно-восстановительные реакции. Эмбрионы zebrafish после повреждения хвоста подвергали воздействию моллюгина в концентрациях 22 µg/mL, 66 µg/mL и 200 µg/mL. Обработка моллюгином была связана с улучшением восстановления площади хвоста дозозависимым образом, что сопровождалось снижением экспрессии генов, связанных с апоптозом, и подавлением провоспалительных медиаторов, включая IL-1β, IL-6, TNF-α, TLR4 и NF-κB1. Параллельно с этим моллюгин восстанавливал активность антиоксидантных ферментов — супероксиддисмутазы и каталазы. Флуоресцентная визуализация рыб zebrafish линии Tg(mpeg1:GFP) показала зависящий от времени эффект моллюгина на накопление макрофагов: через 24 h явного снижения не наблюдалось, однако через 48 h в группах 66 и 200 µg/mL площадь, положительная по макрофагам, была меньше по сравнению с контрольной группой с повреждением. Анализ qRT-PCR дополнительно показал снижение экспрессии маркера M1-типа iNOS и повышение экспрессии маркера M2-типа arginase-1. В совокупности эти результаты позволяют предположить, что моллюгин может поддерживать регенерацию хвоста у zebrafish, что связано с изменениями маркеров воспаления, окислительного стресса, апоптоза и маркеров, ассоциированных с макрофагами. Необходимы дальнейшие исследования для определения лежащих в основе этого клеточных и молекулярных механизмов.
Регенерация тканей представляет собой критический физиологический процесс, посредством которого организмы восстанавливают повреждения; этот процесс включает сложную регуляцию пролиферации и дифференцировки клеток, а также поддержание гомеостаза микроокружения1. Среди моделей позвоночных данио-рерио стали ключевой системой для изучения механизмов заживления ран благодаря своей исключительной регенеративной способности. В частности, регенерация хвостового плавника у данио-рерио охватывает пространственно-временную координацию множества биологических событий, включая регуляцию воспаления, баланс окислительного ответа и контроль апоптоза2,3. В последние годы фармакологическая активность природных соединений стала центральным объектом исследований в области регенеративной медицины. В частности, нафтохиноновые соединения широко изучались из-за их разнообразных биологических эффектов4. Моллугин — это нафтохиноновое соединение, выделенное из растений семейства Rubiaceae, которое в предыдущих исследованиях продемонстрировало противовоспалительную, антиоксидантную активность и способность регулировать клеточный цикл5,6. Однако механизм его действия при регенерации тканей остается неясным, и его потенциальная роль в модуляции воспалительного микроокружения и поляризации иммунных клеток требует систематического изучения.
После повреждения быстро активируется воспаление, которое напрямую влияет на восстановление тканей. Умеренная воспалительная сигнализация необходима для удаления некротизированных тканей и запуска программы регенерации, в то время как избыточный воспалительный каскад может усилить окислительный стресс и привести к фиброзу тканей7. После повреждения заметно повышается уровень цитокинов, включая IL-1β, IL-6 и TNF-α, что сопровождается активацией сигнализации TLR4/NF-κB, приводящей к усилению воспалительных реакций и ремоделированию тканей8,9. После повреждения также повышаются уровни молекулы межклеточной адгезии-1 (ICAM-1) и лиганда хемокина СС 2 (CCL-2), что связано с усиленным привлечением нейтрофилов и макрофагов в поврежденные ткани10. Примечательно, что окислительный дисбаланс дополнительно усугубляет повреждение тканей, а снижение активности супероксиддисмутазы (SOD) и каталазы (CAT) указывает на нарушение антиоксидантной способности2,11.
Макрофаги служат ключевыми регуляторами воспалительного микроокружения, и их функциональная поляризация оказывает значительное влияние на регенерационный процесс12. Макрофаги M1 характеризуются экспрессией индуцибельной синтазы окисационного азота (iNOS) и воспалительной активностью, тогда как макрофаги M2 экспрессируют аргиназу-1 (Arg-1) и связаны с восстановлением тканей13,14. На поляризацию макрофагов влияют локальные цитокины, окислительный стресс и сигналы, связанные с апоптозом. В этом контексте апоптотическая регуляторная сеть, состоящая из белков семейства B-cell lymphoma-2 (Bcl-2) и каспазы-3, не только влияет на выживаемость клеток в месте повреждения, но и косвенно модулирует хемотаксическое поведение иммунных клеток посредством высвобождения сигналов "find-me"15. Следовательно, изучение стратегий вмешательства, которые одновременно модулируют воспалительные реакции, окислительный стресс и поляризацию макрофагов, может помочь в улучшении регенерации тканей.
Природные соединения продемонстрировали уникальные преимущества в модуляции этих биологических процессов. Недавние исследования подтвердили, что нафтохиноновые вещества, благодаря своим сопряженным структурам, обладают способностью улавливать свободные радикалы; их бензохиноновое ядро может влиять на редокс-чувствительные сигнальные пути посредством механизмов переноса электронов16,17. Было отмечено, что моллугин ослабляет воспалительные реакции при колите, индуцированном DSS, что сопровождается снижением продукции провоспалительных цитокинов и уменьшением экспрессии TLR4 в тканях толстой кишки18. Также было показано, что моллугин ингибирует сигнальный путь TAK1-NF-κB/MAPK и активирует путь Keap1-Nrf2 в макрофагах6; однако его влияние на поляризацию макрофагов и сеть апоптоза–антиапоптоза в модели заживления ран in vivo еще не выяснено. Кроме того, дозозависимые биологические эффекты моллугина и его регуляторная роль в процессе регенерации остаются систематически не изученными.
В настоящем исследовании изучалось влияние моллугина на модель регенерации хвостового плавника у рыбок данио-рерио. В частности, мы проанализировали восстановление хвоста, экспрессию генов, связанных с апоптозом, воспалительную сигнализацию, активность антиоксидантных ферментов и макрофагальные ответы после введения моллугина. Наши результаты свидетельствуют о том, что применение моллугина способствует улучшению регенерации хвоста и вызывает изменения множества маркеров ответа на повреждение в данной модели на рыбках данио-рерио.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Все процедуры с животными проводились в соответствии с Руководством Национального исследовательского совета по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены Комитетом по этике Первой многопрофильной больницы города Фучжоу (номер одобрения 202408002).
Разведение zebrafish
Все эксперименты проводились на zebrafish (Danio rerio), содержавшихся в стандартных лабораторных условиях. Zebrafish дикого типа линии AB использовали для анализа токсичности и анализа регенерации после ампутации хвоста. Zebrafish линии Tg(mpeg1:GFP) использовали специально для визуализации макрофагов. Tg(mpeg1:GFP) представляет собой репортерную линию макрофагов, в которой экспрессия GFP маркирует клетки макрофагального ряда под контролем промотора mpeg1, экспрессируемого в макрофагах. Все линии zebrafish содержали при температуре 28.5 °C с циклом свет/темнота 14 ч/10 ч. Для экспериментов использовали только морфологически нормальные эмбрионы. Во всех опытах эмбрионы инкубировали в буфере Данио, приготовленном из химических реактивов квалификации «ч.д.а.», включая NaCl, KCl, Ca(NO₃)₂·4H₂O, MgSO₄·7H₂O и HEPES с доведением pH до 7.2.
Приготовление препарата и определение безопасной дозировки
Моллюгин (40 mg) растворяли в 1 mL DMSO для получения стокового раствора с концентрацией 40 mg/mL. Сначала стоковый раствор разводили 1:10 в буфере Данио до концентрации 4 mg/mL, затем проводили дальнейшее разведение до 22, 66 и 200 µg/mL для проведения обработок. Для определения максимально безопасной концентрации эмбрионы линии AB на стадии 48 часов после оплодотворения (hpf) подвергали дехорионизации и дезинфекции 0,003% гипохлоритом натрия, после чего распределяли по 6-луночным планшетам (n=20, три лунки в каждой группе). Эмбрионы инкубировали с моллюгином (22 µg/mL, 66 µg/mL, 200 µg/mL, 240 µg/mL, 280 µg/mL, 320 µg/mL или 360 µg/mL) в среде E3 в течение 48 h при температуре 28,5 °C. Выживаемость контролировали с помощью стереомикроскопа; наивысшая концентрация, при которой жизнеспособность эмбрионов составляла ≥90%, была определена как верхний безопасный предел для последующих экспериментов.
Создание модели ампутации и регенерации хвоста
Для исследований регенерации эмбрионы дикого типа линии AB в возрасте 48 hpf анестезировали 0,03% раствором трикаина, приготовленным на среде для эмбрионов, и поместили в латеральное положение под стереомикроскопом. Перед ампутацией хвоста эмбрионы содержались в буфере Данио. Под контролем стереомикроскопа выполняли стандартизированную поперечную ампутацию хвоста. Линия ампутации проходила непосредственно позади кончика хорды, при этом задний конец хорды служил анатомическим ориентиром. Складка хвостового плавника дистальнее этого ориентира удалялась микроскальпелем для обеспечения одинакового уровня повреждения у всех образцов. Сразу после ампутации (0 h) производили съемку с помощью стереофлуоресцентного микроскопа. После ампутации эмбрионов переносили в соответствующую среду для обработки на основе E3 для анализа регенерации. Рабочие растворы моллюгина готовили путем разведения стокового раствора моллюгина в среде E3 до конечных концентраций 22, 66 и 200 µg/mL. Моллюгин вводили методом погружения (в ванночке) в течение периода регенерации. Для сопоставимости с воздействием растворителя контрольную группу без повреждений и группу с моделью повреждения содержали в среде E3, содержащей 0,5% DMSO, что соответствует конечной концентрации DMSO в группе с 200 µg/mL моллюгина. Эмбрионов содержали в 6-луночных планшетах при температуре 28,5 °C в течение 2 дней с ежедневной сменой соответствующей среды для обработки на основе E3. Регенерацию фиксировали с помощью визуализации через 24 и 48 h после ампутации как в белом свете, так и в режиме флуоресценции для оценки восстановления хвоста и распределения макрофагов. Измерения по изображениям проводили в программе ImageJ.
Для количественной оценки регенерации площадь восстановившегося хвоста измерялась как абсолютная площадь в µm2 без нормализации относительно размера эмбриона или исходного размера хвоста. Чтобы минимизировать вариабельность, всем эмбрионам проводили ампутацию по одному и тому же анатомическому ориентиру, расположенному непосредственно за кончиком хорды; этот же ориентир использовался для определения области измерения во всех группах. Области интереса (ROI) очерчивались вручную в ImageJ на основе контура хвоста, а анализ проводился исследователем, не знающим о распределении групп по типам обработки. Для количественного определения площади, положительной по макрофагам, в ImageJ анализировали изображения GFP-флуоресценции эмбрионов Tg(mpeg1:GFP). Область повреждения/регенерации хвоста вручную определяли как область интереса, используя тот же анатомический ориентир, что и при измерении площади хвоста. Изображения переводили в 8-битный оттенок серого, а фоновая флуоресценция вычиталась с использованием одинаковых настроек коррекции фона для всех изображений в рамках одного эксперимента. Затем ко всем изображениям внутри каждого эксперимента единообразно применялся фиксированный порог флуоресценции для идентификации GFP-положительных сигналов, связанных с макрофагами. Площадь, положительная по макрофагам, рассчитывалась как площадь GFP-сигнала, превышающая установленный порог, внутри определенной ROI. Измерения основывались на площади флуоресцентного сигнала, а не на интенсивности флуоресценции или ручном подсчете клеток. Весь анализ изображений проводился исследователем, не знающим о распределении групп по типам обработки.
Экстракция РНК и количественная ПЦР в реальном времени (кПЦР)>
По завершении анализа регенерации эмбрионы из каждой экспериментальной группы были собраны и объединены в общие образцы (минимум 20 эмбрионов на группу) для анализа РНК. Для каждого условия один биологический повтор представлял собой объединенный образец, содержащий не менее 20 эмбрионов из одной экспериментальной группы. Для каждого условия было подготовлено три независимых объединенных биологических повтора, которые использовались для статистического анализа. Общая РНК была выделена после механической гомогенизации в реагенте для экстракции РНК на основе фенола/гуанидина. Качество и концентрация РНК оценивались спектрофотометрически путем измерения отношения A260/A280. кДНК синтезировали с использованием коммерческого набора для обратной транскрипции. ПЦР-амплификацию проводили с использованием реагентов SYBR Green. Режим циклирования кПЦР был следующим: начальная денатурация при 95 °C в течение 30 s, затем 40 циклов денатурации при 95 °C в течение 5 s и отжига/элонгации при 60 °C в течение 30 s. Измеряли уровни экспрессии генов, связанных с апоптозом (caspase-3 и Bcl-2), воспалением (TNF-α, IL-1β, IL-6, NF-κB1, TLR4, CCL2 и ICAM1) и фенотипом макрофагов (iNOS и arginase-1). В качестве референсного гена использовали β-Actin. Кратность изменения экспрессии генов определяли методом 2−ΔΔCt. Информация о праймерах представлена в Таблице 1.
Анализы активности SOD и CAT
Уровни SOD и CAT использовались для оценки антиоксидантного статуса после повреждения хвоста. Через 48 ч после ампутации рыб zebrafish из каждой группы собирали и гомогенизировали в холодном PBS. После центрифугирования очищенные экстракты использовали для измерения SOD и CAT с помощью коммерческих наборов для анализа активности. Активность SOD измеряли с использованием набора для анализа на основе WST-1 в соответствии с инструкциями производителя. Образцы вместе со стандартами наносили на 96-луночные планшеты для анализа, а абсорбцию считывали на микропланшетном ридере. Активность ферментов определяли по стандартным кривым. Все анализы проводились в трех повторностях.
Статистический анализ
Данные представлены как среднее значение ± SEM (стандартная ошибка среднего) по результатам не менее трех независимых экспериментов. Для анализа токсичности каждый независимый эксперимент включал одну партию эмбрионов (по 20 эмбрионов на группу) с проведением анализа в трех повторностях. Для визуализации регенерации и макрофагов у zebrafish Tg(mpeg1:GFP) единицами измерения служили отдельные эмбрионы, при этом в каждой группе анализировали по 10 эмбрионов. Для анализа qRT-PCR один биологический повтор представлял собой объединенный образец, содержащий не менее 20 эмбрионов из одной экспериментальной группы; для каждого условия анализировали три независимых объединенных биологических повтора. Для анализа активности SOD и CAT для каждого условия анализировали пять независимых объединенных биологических повторов. Различия между группами анализировали с помощью однофакторного ANOVA с последующим апостериорным тестом Тьюки. Статистический анализ выполняли в программе GraphPad Prism. Различия при p < 0.05 считались значимыми.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Toxicity and safe dose determination
To investigate the effects of Mollugin, we first performed toxicity tests. The results indicated that zebrafish embryo mortality remained low at concentrations up to 200 µg/mL, whereas increased mortality was observed at concentrations above 200 µg/mL (Table 2). Therefore, the highest safe dose was determined to be 200 µg/mL, while the low and medium doses were set at 22 and 66 µg/mL, respectively.
Tail amputati...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
В данной работе мы изучили влияние моллюгина на регенерацию хвоста у zebrafish. В исследованном диапазоне доз применение моллюгина было связано с улучшением восстановления площади хвоста после повреждения, а также с изменениями в экспрессии генов, связанных с апоптозом, маркеров воспаления, активности антиоксидантных ферментов и маркеров, ассоциированных с макрофагами.
Рыбки-зебра, являясь важной моделью для исследований регенерации, демонстрируют регенерацию хвоста, которая включает скоордини...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Настоящее исследование было спонсировано Комиссией по здравоохранению провинции Фуцзянь, Китай (грант № 2022QNA085).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 6-луночные планшеты для культивирования тканей | Corning | 3516 | |
| Набор для анализа каталазы (CAT) | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A007-1-1 | |
| Хлороформ | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| Микропланшетный ридер CMax Plus | Molecular Devices | iD3s | |
| Буфер Данье ’ – Ca(NO3)2·4H2O | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., China | N/A | Конечная концентрация в буфере Данье ’: 0.6 mM. |
| Буфер Данье ’ – HEPES | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., China | N/A | Конечная концентрация в буфере Данье ’: 5 mM; pH доведен до 7.2. |
| Буфер Данье ’ – KCl | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., China | N/A | Конечная концентрация в буфере Данье ’: 0.7 mM. |
| Буфер Данье ’ – MgSO4·7H2O | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., China | N/A | Конечная концентрация в буфере Данье ’: 0.4 mM. |
| Буфер Данье ’ – NaCl | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., China | N/A | Конечная концентрация в буфере Данье ’: 58 mM. |
| Диметилсульфоксид (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Среда для эмбрионов E3 | Приготовлено в лаборатории (стандартный рецепт) | N/A | Стандартный рецепт. |
| Ген-специфичные праймеры для qPCR (tnfα, il1β, il6, nfkb1, tlr4, ccl2, icam1, inos, arginase-1, caspase-3, bcl2, β-actin) | Sangon Biotech | N/A | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, USA | N/A | Версия 8.0. |
| Программное обеспечение ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | N/A | Версия 1.52n. |
| Моллугин (≥98%, ВЭЖХ) | Sigma-Aldrich | SMB00431 | Активное соединение из Rubia cordifolia, растворено в DMSO до 40 mg/mL и разведено до 22, 66 и 200 µg/mL в среде E3. |
| Моторизованный гомогенизатор тканей | IKA, T10 basic ULTRA-TURRAX (или эквивалент) | N/A | |
| NovoScript 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix | Novoprotein | abs60077 | |
| Фосфатно-солевой буфер (PBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Система ПЦР в реальном времени (Archimed X4) | Sansure Biotech Inc. | Archimed X4 | |
| Охлаждаемая микроцентрифуга | SCILOGEX | CF1524R | |
| Наконечники, свободные от РНК | Sangon Biotech | F603222-0010 | |
| RNAiso Plus | Takara Bio Inc. | 9109 | Реагент для экстракции РНК на основе фенола/гуанидина. |
| Микроцентрифужные пробирки, свободные от РНКаз, 1.5 mL | Axygen / Eppendorf | N/A | |
| Флуоресцентный стереомикроскоп SMZ800N | Nikon | SMZ800N | Флуоресцентный стереомикроскоп, используемый для визуализации личинок Tg(mpeg1:GFP) и количественной оценки агрегации макрофагов. |
| Раствор гипохлорита натрия | McLean, USA | N/A | 0.003% рабочий раствор. |
| SYBR Green qPCR Mix (2× SYBR qPCR Mix) | Novoprotein | E096 | |
| Стереомикроскоп SZX16 | Olympus | SZX16 | Используется для морфологических наблюдений, оценки токсичности и ампутации хвостового плавника личинок. |
| Набор для анализа общей супероксиддисмутазы (T-SOD) | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A001-3 | |
| Трансгенные zebrafish Tg (mpeg1:GFP) | Anburui, Fujian, China (или собственная колония) | N/A | Репортерная линия макрофагов. |
| Трикаинметансульфонат (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | 0.03% рабочий раствор. |
| Сверхчистая дистиллированная вода, свободная от ДНКаз/РНКаз | Invitrogen | 10977023 | |
| Zebrafish дикого типа, штамм CZ98 (Danio rerio) | Anburui, Fujian, China | N/A | Оплодотворенные эмбрионы и личинки были получены из взрослого племенного стада. |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.