Оценка внутренней жесткости аорты мыши с помощью миографии булав: трансляционная структура для изучения влияния циркулирующей среды

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол оценки внутренней жёсткости стенок аорты (упругого модуля) с помощью пин-миографии и подходы для изучения потенциальной роли циркулирующей среды в модулировании внутренней жесткости стенок аорты.

Аннотация

Затвердение аорты является независимым фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний и других хронических состояний, включая когнитивное снижение, дисфункцию почек, ухудшение зрения и снижение функции глюкозы и инсулина. In vivo жёсткость аорты обычно оценивается с помощью тонометрических или ультразвуковых методов, которые визуализируют артериальные волны или продольные артериальные сегменты соответственно. Однако измерения in vivo зависят от множества факторов — таких как артериальное давление и автономный вход, — которые ограничивают механистическое понимание того, как и почему изменяется жёсткость аорты. Доклинические мышиные модели, позволяющие непосредственно захватывать ткань аорты, предлагают уникальную экспериментальную основу для оценки как жесткости аорты in vivo , так и внутренних механических свойств аорты, свободной от смешительных физиологических переменных. Эти модели также позволяют напрямую анализировать циркулирующую среду (то есть сбор циркулирующих биоактивных молекул в крови) и её роль в модулировании жесткости аорты по всему доклиническому трансляционному спектру. Изменения в циркулирующей среде стали ключевой механизмическим основой затвердения аорты при различных состояниях — включая первичное старение и преждевременное старение, связанное с раком и онкологическими терапиями — как в доклинических, так и в клинических исследованиях, а также в опосредовании последствий вмешательств. В этой статье представлено пошаговое руководство по оценке: (1) внутренней жесткости аорты (эластичный модуль) в доклинических мышиных моделях и (2) вклада циркулирующей среды (и её составляющих) в ужесточение аорты с использованием как доклинических, так и клинических биообразцов.

Введение

Жёсткость аорты является независимым фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний и других хронических^{заболеваний 1,2}. Оценка жёсткости аорты in vivo может не иметь механистического разрешения, учитывая интегративные физиологические процессы, регулирующие жёсткость аорты in vivo (например, артериальное давление и вегетативный вход)^2. Таким образом, оценка внутренней жесткости аорты (т.е. жёсткости/модуля упругости стенки аорты) ex vivo с помощью пин-миографии позволяет проводить прямую оценку жесткости аорты независимо от смешивающих физиологических^{переменных 2}. Кроме того, использование экспериментального подхода ex vivo позволяет исследовать потенциальные молекулярные механизмы, способные опосредовать ужесточение стенок аорты. В отличие от других устоявшихся методов оценки жесткости артерий ex vivo, таких как миография давления, биосное плоское тестирование и циклические/пульсативные миографические системы, которые основаны на моделировании физиологических систем (например, внутрилюминальное давление и пульсациальная гемодинамика), пин-миография позволяет напрямую оценивать жёсткость стенок аорты с помощью изометрической силы в строго контролируемых условиях, не требующих моделирования in vivo.

Циркулирующая среда (то есть накопление биоактивных молекул в кровотоке), которая находится в прямом и частом контакте с аортой, обычно изменяется в условиях затвердевания аорты (например, хронологическое/первичное старение и преждевременное старение, например, у выживших после рака или модели выживаемости при раке)^3,4. Мы установили, используя как доклинические (муринные), так и клинические (человеческие) биообразцы (плазма и сыворотка), что циркулирующая среда напрямую способствует ужесточению аорты как при^{первичном 4}, так и при преждевременном^{старении 3}. Кроме того, мы разработали экспериментальную основу для определения прямого вклада отдельных компонентов в циркулирующей среде в опосредовании её влияния на затвердение^{аорты 3,5,6}. Здесь мы описываем и описываем пошаговые экспериментальные подходы к оценке внутренней жесткости аорты и вклад циркулирующей среды (и её составляющих) в ужесточение аорты с помощью пин-миографии и предоставляем репрезентативные результаты (с рисунками и цитатами).

Протокол

В ходе этого исследования использовались самцы дикого типа C57BL/6J молодых взрослых мышей (4 месяца). Содержание и процедуры с участием экспериментальных мышей были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию Медицинского кампуса Университета Колорадо (IACUC).

1. Подготовка холодного физиологического физиологического раствора (CPSS)

1. Приготовьте бульонный раствор Ca²⁺ Ringer's в 1 л_{diH 2O}и храните при 4 °C (Таблица 1).
2. Добавьте 13,9 г MOPS в 100 мл_{diH 20}для подготовки буферного раствора MOPS и храните при 4 °C.
3. Добавьте 0,186 г EDTA в 100 мл_{диH 20}для приготовления раствора EDTA, pH до 8,0 и храните при комнатной температуре.
4. Подготовьте CPSS, содержащие запасные растворы, подготовленные выше, и химикаты, перечисленные ниже (Таблица 2). Увеличите общий объём до 2 л при_{diH 2}O, pH до 7,4 при 34 °C и отфильтруйте CPSS через ≤ фильтр 0,45 мкм. Распределять в конических трубках объёмом 50 мл и хранить при -20 °C.

2. Диссекция аорты мыши (Рисунок 1, Рисунок 2 и Рисунок 3)

1. Обезболить мышь с помощью вдыхаемого изофлурана (2,5%) и поместить мышь в дорсальное лежащее положение (рисунок 1A-C).
2. После того как мышь находится под хирургической плоскостью анестезии, собирайте кровь с помощью сердечной пункции и завершения вторичной эвтаназии с помощью двусторонней торакотомии (рисунок 1B–C).
3. Затем аккуратно удалите аорту от дуги аорты к брюшной аорте (рисунок 1D–F).
4. Поместите аорту в CPSS и удалите всю соединительную и периваскулярную жировую ткань с помощью Fine Science Tools Vannas Spring Scissors (2,5 мм) (рисунок 2A–E).
5. Аккуратно вырежьте три сегмента аорты шириной 1 мм в грудной области чуть ниже дуги аорты (рисунок 3).
6. Поместите два сегмента аорты диаметром 1 мм в трубку объёмом 1,5 мл, заполненную CPSS, и храните при -80 °C до проведения экспериментов по миографии напряжения-деформации. Храните третий^{сегмент соответствующим} образом для последующих гистологических измерений, как описано ниже.

3. Эксперименты по миографии штифтов с напряжением и деформацией

ПРИМЕЧАНИЕ: Система миографии штифтов будет использоваться для проведения in vitro тестирования жесткости аорты (рисунок 4 и рисунок 5).

1. Сначала предварительно нагрейте камеры до 37 °C, содержащей примерно 6 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), и разморозьте замороженные сегменты аорты толщиной 1 мм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативные физиологические соляные растворы, которые адекватно насыщены кислородом и контролируются pH, также могут использоваться, как описано^{выше 7}.
2. После достижения 37 °C следуйте протоколу калибровки производителя.
   1. Разместите калибровочный мост на миографе так, чтобы Т-образный баланс не касался контакта, соединённого с преобразователем силы камеры миографии штифта.
   2. Убедитесь, что контакт преобразователя силы не подвержен никакой силе. Когда относительная сила стабильна, положите груз весом 2 g на T-образный мост так, чтобы T-балансировочный штанга теперь применял ~2 g силы на штифт преобразователя силы.
   3. Подтвердите, что показатель силы находится в пределах 9,71–9,91 мН. Если да, то калибровка завершена.
3. Определите исходное измерение микрометра и запись значения (то есть начальное измерение).
   1. В рамках диссекции определите базовое микрометровое расстояние, на котором два параллельных контакта почти соприкасаются (рисунок 4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте соприкасания двух штифтов, так как это может повредить или нарушить работу датчика силы в камере миографа.
4. Под дисекционным микроскопом наместите сегмент аорты диаметром 1 мм на два штифта и запишите ширину сегмента с помощью микросуппортов (рисунок 6A). Затем подключите блок камеры к интерфейсу системы миографии контактов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличьте ширину штифта, чтобы создать натяжение на сегменте аорты, одновременно крепляя аорту и закрепляя её на двух штифтах, что предотвращает смещение сегмента аорты.
5. Если на аорте оказывается натяжение, а камера подключена и установлена на систему миографии штифтов, микропозиционер возвращается в «исходное положение», как определено в шаге 3.3 выше.
6. Полный предрастяжение аорты.
   1. Растяните аорту, увеличив расстояние между двумя контактами на 1 мм от начального положения микропозиционера (рисунок 6B).
   2. Далее расслабьте аорту, вернув штифты к начальному микропозиционерному показателю. Выполните эту последовательность растяжки-релаксации три раза (рисунок 6A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: После последней последовательности растяжки-релаксации микропозиционер должен вернуться к исходному показателю.
7. На интерфейсе системы миографии пинов для каждой используемой камеры показания нулевой силы (рисунок 7).
8. Начинайте эксперимент по стрессу и напряжению.
   1. Увеличьте показатель силы примерно до 1 мН, регулируя микропозиционерный элемент (рисунок 7).
   2. После уравновешения силы ~1 мН (3–5 с) запишите новое показание микропозиционера при силе ~1 мН и запишите первое показание силы.
   3. Увеличьте микропозиционер на 50 мкм (то есть 5 кликов/хешей) и дайте сегменту аорты растянуть на 3 минуты. После 3 минут — рекордная сила.
   4. Продолжайте увеличивать микро-позиционерный элемент на 50 мкм каждые 3 минуты и фиксировать силу, пока не достигнете «точки текучести».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точка текучести — это наибольшее количество силы, возникающее до необратимого структурного повреждения аорты (то есть разрыв или разрыв аорты, значительное снижение силы).
   5. Подтвердите точку текучести, растянив аорту ещё на 50 мкм после начальной точки текучести. Убедитесь, что значение силы остаётся низким или немного выше границы текучести. Если балл текучести не подтверждён, продолжайте с увеличением на 3 минуты, пока не достигнут этот показатель.
   6. После подтверждения точки подача эксперименты завершены. Начинайте анализ сейчас.

4. Анализ экспериментов с миографией напряжений-деформационных пина для определения упругого модуля коллагена и эластиновых областей

1. Используя показания силы, полученные с миографа, побудите кривую напряжения-деформации с помощью следующих уравнений:
   Деформация (λ)=∆d/[d(i)]
   здесь d — диаметр, а d_i — начальный диаметр и;
   Напряжение (t)=λL/[2(HD)]
   где L — одномерная нагрузка, H — толщина среды интима, а D — длина сосуда. После формирования кривых напряжений-деформации используйте их для вычисления областей с высокой и низкой силой, как описано ранее ^8,9 (рисунок 8).
2. Вычислите область с высокими силами (область коллагена) (рисунок 8B).
   1. Определите упругий модуль кривой напряжения-деформации как наклон линейной регрессии, соответствующий конечным четырём точкам кривой напряжения-деформации. Чтобы получить измерение высоких сил по графику напряжений-деформаций, следуйте следующим шагам:
      1. Кликните правой кнопкой мыши по точке данных на графике и выберите Выбрать данные > Add > Ввести название серии: Elastic modulus.
      2. Значения серии X: выберите 4 точки данных из значений деформаций. Это должны быть 3 точки, когда сила приближается к «точке поддачи». Обязательно включите пункт уступки как четвёртый пункт.
      3. Значения серии Y: выберите 4 точки данных из значений напряжения. Это должны быть 3 точки, когда сила приближается к «точке поддачи». Обязательно включите пункт уступки как четвёртый пункт.
      4. Нажмите OK и добавьте трендовую линию > линейное уравнение > отображения на графике > Отобразите значение R-квадрата на графике.
   2. Наклон уравнения — это модуль упругости с высокими силами. Убедитесь, что значение R-квадрата ≥ 0,99, чтобы модуль упругости был точным.
3. Вычислите область низкой силы (область эластина) (рисунок 8C)
   1. Определите границы области, доминирующей по эластину (область низкой силы, где кривизна равна ~0) кривой напряжения-деформации, подгонив полиномиальное уравнение седьмого порядка к данным (r² > 0,99) и затем вычисляя корни уравнения. Рассмотрим первый корень — границу между областью очень низкой силы и областью эластина, а второй корень — границу между областью эластина и началом взаимодействия волокон коллагена.
   2. Затем определите модуль упругости области с низкими силами как наклон линейного уравнения, соответствующего данным напряжения-деформации между двумя^{корнями 8,9}. Чтобы получить это:
      1. Создайте таблицу с столбцами, как показано в Дополнительной таблице 1.
      2. Превратите это в «txt»-документ и откройте его в R-коде, скрипте «Modulus of Elasticity».
      3. Чтобы использовать данные, проверьте нормальные наклоны — граф^3-й производной на выходе R должен иметь форму «M».
      4. Во вкладке результатов числовое значение в столбце Уклон — это модуль упругости. Убедитесь, что значение R-квадрата больше или равно 0.99, чтобы модуль упругости был точным.
      5. Чтобы получить это значение в таблице, выберите значения деформации (и соответствующие им значения напряжений) между первой и второй производными, полученные на вкладке результатов кода R .
      6. Следуйте шагам, описанным на шаге 4.2, чтобы получить уравнение и значение^{R 2} на графике таблицы.

5. Оценка диаметра аорты и толщины стенок

1. Поместите последний сегмент аорты диаметром 1 мм в криомолд, заполненный составом с оптимальной температурой резки (OCT). Ориентируйте кольцо так, чтобы просвет был плоским и центрированным внизу формы так, чтобы световая ось была перпендикулярна режущей поверхности, чтобы получить поперечные сечения.
2. Подготовьте контейнер с 2-метилбутаном, охлаждённым в жидком азоте, а затем погрузите криомолд в холодный 2-метилбутан, пока ОКТ не станет непрозрачным белым.
3. Криомолд храните при -80 °C до секционирования. Установите температуру криостата на соответствующую температуру резки OCT (≈-20 °C), а затем закрепите замороженный блок на держатель образца.
4. После закрепления на креплении аккуратно обрезайте блок, поддерживая толщину 7 мкм до появления ткани.
5. Маркируйте слайд идентификатором мыши и вырежьте 4–5 поперечных срезов аортальной ткани толщиной 7 мкм.
6. Чтобы перенести нарезанную ткань на слайды, все разрезанные участки разместите на криостатной стадии (также называемой ножевой стадией), а затем наместите маркированный слайд прямо поверх них.
7. После завершения переноса высушиваются на воздухе.
8. Срезы изображения под 10-кратным увеличением на ярком микроскопе. Сохраняйте изображения в формате JPG/TIFF с шкалой внизу изображения.
9. Для анализа откройте ImageJ, перейдите в раздел File > Open и выберите изображение аорты.
10. Когда изображение аорты появится, увеличите масштаб с помощью значка Control + + и используйте инструмент линии, чтобы измерить длину полосы масштаба. Чтобы заполнить результат, нажмите Control + M. Измерение, рассчитанное по длине, — это измерение шкали.
11. Чтобы откалибровать программу, перейдите в раздел Анализ > Set Scale. Для Distance в пикселях введите длину линии, вычисленную ImageJ на шаге 8. Для известного расстояния введите фактическую длину шкалы, а под единицами запишите единицу измерения (мкм, мм, см и т.д.).
12. Отметьте глобальное поле для автоматической калибровки всех последующих изображений. Обратите внимание, отличается ли масштабная полоса на других изображениях или ImageJ закрыт; Если да, требуется перекалибровка.
13. Для толщины стенки используйте инструмент прямой линии и проведите перпендикулярную линию от люминального края до внешнего адвентиального края. Нажмите Control + M , чтобы автоматически заполнить длину во вкладке результатов .
14. Повторите шаг 5.13, чтобы провести измерения в 6 равномерно расположенных точках вокруг окружности аорты и записайте каждое значение.
15. Для расчёта средней толщины на аорту мыши усредняйте все толщины, полученные из 4–5 образцов одной и той же мыши.
16. Чтобы измерить диаметр света, выберите инструмент полигона и обведите внутреннюю световую рамку по часовой стрелке. Запишите периметр (мкм), нажав Control + M.
17. Повторяйте трассировку против часовой стрелки, начиная с другой точки. Убедитесь, что оба значения окружности находятся близко друг к другу, и усредняйте их для этого аортального кольца.
18. Повторите шаг 5.16 для 4–5 аортальных образцов одной и той же мыши и усредните все значения окружности.
19. Для вычисления диаметра используйте уравнение: Диаметр (мкм) = Периметр/3,14.

6. Циркулирующий модуль упругости аорты

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы определить, изменяют ли циркулирующие факторы или конкретные соединения внутреннюю жесткость аорты, грудные аортальные кольца у наивных мышей могут инкубироваться ex vivo при определённых стандартных условиях культуры (37 °C, 5%_CO2, 20%_O2, увлажнённые) (рисунок 9).

1. Вскрытие грудной аорты и вырезание двух кольцевых сегментов по 1 мм по состоянию. Удалите всю периваскулярную жировую ткань.
2. В пластине с 96 лунками инкубируют аортальные кольца в стандартной среде, которая состоит из DMEM + 1% пенициллина-стрептомицина.
3. Добавьте экспериментальную обработку в медиа. Для плазмы или сыворотки (для этого можно использовать необработанную плазму/сыворотку) используйте 10% от общего объёма среды. Используйте доклиническую и клиническую (человеческую) плазму или^{сыворотку 3,4,6} (рисунок 9).
4. Для установления причинной роли циркулирующего фактора, показавшегося как различающегося между группами, повторить воздействие плазмы и сыворотки, одновременно корректируя наблюдаемую разницу концентрации между группами (то есть нормализуя концентрацию интересующего фактора), определить прямое влияние интересующего фактора при концентрации, которая соответствует средней разнице групп, или блокировать сигнализацию фактора, который, как считается, отвечает за опосредование в движущейся среде.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Последние два подхода ранее применялись соответственно с использованием триметиламина-N-оксида (TMAO)⁵ и блокировки рецептора для конечных продуктов продвинутой^{гликации 3}.
5. Для разъяснения роли избытка сверхоксидного окислительного стресса или митохондрий —
   специфические окислительные напряжения, связанные с супероксидами, в этой модельной системе используют следующие соответствующие концентрации при инкубации аортных колец: TEMPOL: 1 мкм^{, 5,10}, и MitoQ: 1^мкм6.
6. После 48–72 часов инкубации загрузите аортальные кольца в пиновую миографию и следуйте указанным выше шагам.

Результаты

Возрастное ужесточение аорты

Для внутренней механической жесткости фиксируется сила, соответствующая каждому интервалу растяжения, и используется для расчётов. В ранее обсуждаемых расчётах будет создано кривые напряжения-деформации и вычисление упругого модуля для 1) области коллагена и/или 2) области эластина этих кривых, как описано выше и изначально показано Джоша-Райаном^{и др. 9}. Модуль упругости более коллаген-доми...

Обсуждение

Использование пин-миографии для оценки внутренней жесткости аорты ex vivo даёт возможность оценить внутреннюю жесткость аорты независимо от потенциально смешивающих in vivo физиологических переменных, таких как артериальное давление и вегетативный^{вход 2}. Кроме того, этот экспериментальный подход ex vivo предоставляет возможность открыть потенциальные молекулярные механизмы, лежащие в основе различий в внутренней жесткости аорты. Здесь мы...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
2-метилбутан	Fisher Scientific	AA19387AP
BSA	Fisher Bioreagents	BP1600
Дихлорид кальция дигидрат	Sigma-Aldrich	C7902
Cryomold	Fisher Scientific	NC9511236
D-(+)-Глюкоза (Декстроза)	Sigma-Aldrich	G7021
DMEM	Fisher Scientific	MT10017CV
ЭДТА (A.C.S.)	Fisher Chemical	E478
KCl	Sigma-Aldrich	P4504
Сульфат магния семигидрат	Sigma-Aldrich	M2773
MitoQ	Cayman Chemical	845959-50-4
Мононатрий фосфат	Sigma-Aldrich	S5011
MOPS (соль Na)	Sigma-Aldrich	M9024
Система многоконтактной миографии	Danish Myo Technology (DMT)	620M
NaCl	Fisher Chemical	S271
Пенициллин-стрептомицин	Fisher Scientific	15-140-148
RAGE антитело	R&D System	AF1145
Пируват натрия	Sigma-Aldrich	P2256
TEMPOL	Sigma-Aldrich	2226-96-2
Тканевой композит OCT	Sakura	4583
Триметиламин N-оксид (TMAO)	Sigma Aldrich	317594