Исследовательская статья

Связь экспрессии MPO с иммунным микроокружением при раке молочной железы: данные биоинформатического и одноклеточного анализов

38 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71189

⸱

14 августа 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Traditional Chinese Medicine, Aerospace Center Hospital, 2Third Affiliated Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, 3China Academy of Chinese Medical Sciences, 4Graduate School, Beijing University of Chinese Medicine, 5College of Traditional Chinese Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данной статье представлен воспроизводимый биоинформатический рабочий процесс и алгоритм анализа на уровне отдельных клеток для изучения взаимосвязи между экспрессией миелопероксидазы (MPO) и иммунными/миелоидными характеристиками при раке молочной железы. Поскольку анализы основаны на общедоступных наборах данных и методах in silico, полученные результаты интерпретируются как предварительные и служащие для выдвижения гипотез.

Аннотация

Рак молочной железы остается одной из основных причин смертности от онкологических заболеваний, и исследовательские вычислительные алгоритмы могут помочь в определении приоритетных иммуноассоциированных маркеров для дальнейшего изучения. В данной работе мы использовали данные объемной транскриптомики инвазивной карциномы молочной железы из атласа ракового генома (TCGA-BRCA) и общедоступный набор данных одноклеточного секвенирования GSE161529 для изучения связей между экспрессией миелопероксидазы (MPO), клиническими исходами, иммунной инфильтрацией, метилированием, аннотациями апстрим-регуляторов, паттернами экспрессии на уровне отдельных клеток, результатами виртуального нокдауна, поиском взаимодействий «лекарство–ген», а также аннотациями ADMET (всасывание, распределение, метаболизм, выведение и токсичность). Экспрессия MPO была ниже в тканях рака молочной железы, чем в прилегающих нетрансформированных тканях. Более высокая экспрессия MPO была связана с более длительным бессмертными интервалом, в то время как её связь с общей выживаемостью и специфической выживаемостью при данном заболевании была статистически незначимой. Анализ рабочих характеристик приемника (ROC-анализ) указал на разделение опухолевых и нормальных тканей в исследуемом общедоступном наборе данных, однако это не следует интерпретировать как клиническую диагностическую валидацию. Иммунная деконволюция и анализ обогащения показали, что экспрессия MPO в основном коррелировала с транскрипционными признаками, связанными с иммунитетом и миелоидными клетками, а не с установлением опухолевой регуляции иммунного микроокружения. На уровне отдельных клеток сигнал MPO был разреженным: до расширения окрестностей на основе метода k-ближайших соседей (KNN) было обнаружено всего 85 MPO-положительных клеток. Обнаруживаемый сигнал MPO и ассоциированные с MPO показатели интерпретировались с осторожностью, так как на них могли повлиять разреженная экспрессия, неопределенность аннотации типов клеток, выпадение данных (dropout), дублеты или фоновая РНК. In silico Виртуальный нокдаун позволил выявить предполагаемые изменения транскрипции, связанные с иммунными и воспалительными процессами, однако эти результаты носят предварительный характер и требуют подтверждения. Поиск лекарственных средств и генов с использованием базы данных взаимодействий лекарств и генов (DGIdb), а также ADMET-аннотирование использовались исключительно в качестве первичных химических аннотаций и не интерпретировались как терапевтические доказательства. В целом, данное исследование представляет собой воспроизводимый рабочий процесс in silico для генерации гипотез об иммунных/миелоидных особенностях, связанных с MPO при раке молочной железы, которые требуют валидации на внешних когортах и экспериментального подтверждения.

Введение

Рак молочной железы представляет собой крайне гетерогенное иммуноопосредованное злокачественное новообразование1. Прогрессирование заболевания, риск рецидива и метастазирования, а также ответ на терапию тесно связаны с составом и функциональным состоянием иммунного микроокружения опухоли (TIME)2. Несмотря на постоянную оптимизацию стратегий комплексного лечения, у некоторых пациентов все еще наблюдается прогрессирование или рецидив, что подчеркивает острую необходимость в выявлении молекулярных биомаркеров, характеризующих статус TIME и поддерживающих стратификацию рисков, при одновременном выяснении лежащих в их основе механизмов.

Миелопероксидаза (MPO) представляет собой гемсодержащую пероксидазу, экспрессирующуюся преимущественно в нейтрофилах и, в меньшей степени, в моноцитах и макрофагах. Посредством генерации хлорноватистой кислоты и других реактивных окислителей MPO вносит вклад в антимикробную защиту, но также может способствовать окислительному повреждению тканей и хроническому воспалению. При раке биологическая значимость MPO, по-видимому, зависит от контекста3. С одной стороны, опосредованный MPO окислительный стресс играет роль в канцерогенезе и прогрессировании опухоли за счет повреждения ДНК, окисления липидов и белков, воспалительной сигнализации и ремоделирования микроокружения опухоли4,5,6. С другой стороны, инфильтрация MPO-положительными клетками врожденного иммунитета или миелоидными клетками была связана с благоприятным прогнозом или противоопухолевой иммунной активностью в определенных контекстах опухоли7,8,9. Эти, на первый взгляд, противоречивые данные позволяют предположить, что клиническая и биологическая значимость MPO может зависеть от типа опухоли, стадии заболевания, клеточного источника MPO и иммунного состава микроокружения опухоли. Однако паттерн экспрессии и прогностическая значимость MPO при раке молочной железы, особенно на уровне отдельных клеток, остаются охарактеризованными не полностью.

Опухолевое иммунное микроокружение (TIME) содержит гетерогенные миелоидные, лимфоидные, стромальные и эпителиальные компартменты10. MPO классически ассоциируется с нейтрофилами и другими клетками миелоидного ряда, поэтому сигналы MPO в профилях опухолевой массы могут отражать состав иммунных клеток, а не внутреннюю активность опухолевых клеток10. При раке молочной железы распределение сигнала MPO в наборах данных по общей массе и на уровне отдельных клеток, его связь с оценками иммунной инфильтрации и пределы воспроизводимости последующих вычислительных анализов остаются недостаточно изученными. Таким образом, в данной работе MPO рассматривается как иммунно-ассоциированный маркер для разработки исследовательского рабочего процесса, а не как доказанный каузальный регулятор TIME или валидированная терапевтическая мишень. По сравнению с анализом дифференциальной экспрессии в одной когорте или оценками иммунной инфильтрации на одной платформе, интегрированный рабочий процесс, сочетающий общую транскриптомику, иммунную деконволюцию, аннотацию метилирования, картирование отдельных клеток и вычислительное возмущение, может обеспечить более широкий исследовательский обзор иммунного контекста, связанного с геном. Этот подход полезен для приоритизации потенциальных маркеров и генерации проверяемых гипотез, особенно когда экспериментальные наборы данных еще недоступны. Однако такая вычислительная интеграция сама по себе не может определить клеточный источник, причинно-следственную связь, фармакологическую активность или клиническую значимость. С развитием крупномасштабных общедоступных когорт рака и технологий транскриптомики единичных клеток биоинформатические подходы могут быть использованы для изучения взаимосвязей между экспрессией генов, клиническими исходами, составом иммунных клеток и транскрипционными состояниями как на популяционном, так и на уровне отдельных клеток11. Методы вычислительного возмущения, основанные на генных регуляторных сетях единичных клеток, могут дополнительно предоставить информацию для генерации гипотез относительно транскрипционной чувствительности, связанной с генами12,13. Таким образом, целью данного исследования было охарактеризовать паттерн экспрессии, связь с выживаемостью, иммунный/миелоидный контекст, профиль метилирования, распределение на уровне отдельных клеток и исследовательский профиль вычислительного возмущения MPO при раке молочной железы. Общая схема рабочего процесса представлена на Рисунке 1.

Протокол

Получение данных из базы данных TCGA

Данные секвенирования РНК и клиническая информация для когорты пациентов с инвазивной карциномой молочной железы TCGA (TCGA-BRCA) были получены с портала Genomic Data Commons14. Данные RNA-seq, обработанные с помощью рабочего процесса STAR в формате количества транскриптов на миллион (TPM), были извлечены вместе с соответствующими клиническими аннотациями. Образцы RNA-seq, для которых отсутствовала соответствующая клиническая информация, были исключены. Для анализа экспрессии значения TPM были преобразованы по формуле log2(TPM + 1). Экспрессия MPO была извлечена с использованием символа гена MPO и идентификатора гена Ensembl ENSG00000005381.8. Для анализов, требующих разделения на группы с высокой (MPO-high) и низкой (MPO-low) экспрессией, были включены только образцы опухолей TCGA-BRCA, а прилегающие нормальные образцы были исключены из распределения по группам. Образцы опухолей были разделены в соответствии со медианным значением преобразованной экспрессии MPO log2(TPM + 1) среди опухолевых образцов TCGA-BRCA. Образцы с экспрессией MPO больше или равной медиане были отнесены к группе MPO-high, в то время как образцы с экспрессией ниже медианы были отнесены к группе MPO-low. Эта стратегия группировки на основе медианы использовалась для анализа выживаемости, анализа дифференциальной экспрессии, анализа обогащения, группировки по метилированию и сравнения обогащения иммунными клетками, если не указано иное. Клинико-патологические характеристики, включая пол, возраст, этническую принадлежность, патологическую стадию T, гистологическую степень злокачественности, подтип PAM50, патологическую стадию, статус опухоли, а также конечные точки выживаемости, включая общую выживаемость (OS), интервал без прогрессирования (PFI) и специфическую выживаемость (DSS), анализировались с использованием R версии 4.2.1.

Публичный поиск изображений иммуногистохимического анализа

Репрезентативные изображения иммуногистохимического (ИГХ) анализа MPO прилегающей нормальной ткани молочной железы и ткани рака молочной железы использовались в качестве качественных эталонов уровня белка. Эти изображения не включались в количественный морфометрический или статистический анализ. Обведенные области указывают на участки, показанные при большем увеличении. Масштабные отрезки соответствуют 100 µm на изображениях с увеличением 20× и 50 µm на изображениях с увеличением 40×.

Анализ корреляции экспрессии

Набор данных TCGA-BRCA использовался для изучения генов, экспрессия которых ковариирует с экспрессией MPO при раке молочной железы. Были рассчитаны общегеномные коэффициенты корреляции Пирсона между MPO и белок-кодирующими генами, и для визуализации были выбраны 30 наиболее положительно и 30 наиболее отрицательно коррелирующих генов. Для корреляционного анализа с участием нескольких тестируемых генов номинальные значения p были скорректированы с использованием метода контроля ложноположительных результатов Бенджамини-Хохберга. Сеть белок-белковых взаимодействий (PPI), ассоциированная с MPO, была построена с использованием базы данных STRING (инструмент поиска взаимодействующих генов/белков), при этом для визуализации были оставлены пары белков, показатели взаимодействия которых превышали 0,4015.

Анализ функционального обогащения

Дифференциально экспрессируемые гены (DEGs) были идентифицированы путем сравнения групп опухолей TCGA-BRCA с высоким и низким уровнем MPO с использованием пороговых значений |log2FC| > 1 и скорректированного по методу Бенджамини-Хохберга значения p < 0,05. Функциональный анализ обогащения DEGs был выполнен с помощью пакета R clusterProfiler версии 4.4.4, включая анализ биологических процессов, клеточных компонентов и молекулярных функций генной онтологии (GO), а также анализ путей Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG)16,17,18,19,20. Обогащенные термины GO и KEGG считались значимыми при скорректированном значении p < 0,05.

Анализ обогащения наборов генов (GSEA) проводили с использованием предварительно ранжированного списка генов на основе статистики дифференциальной экспрессии между группами с высоким и низким уровнем MPO. Была использована коллекция канонических путей MSigDB C2 c2.cp.all.v2022.1.Hs.symbols.gmt, соответствующая версии MSigDB v2022.1.Hs и содержащая 3 050 наборов генов21,22. Обогащенные термины считались значимыми при значении p-value, скорректированном по методу Бенджамини–Хохберга, < 0.05, FDR q-value < 0.25 и |нормированный показатель обогащения| > 1. Там, где это было применимо, для визуализации значимых обогащенных терминов вычислялись Z-показатели с помощью пакета GOplot.

Анализ обогащения опухолей иммунными клетками

Иммунные и стромальные компоненты в когорте TCGA-BRCA оценивали с помощью алгоритма ESTIMATE, реализованного в пакете R estimate версии 1.0.13. В качестве входных данных использовались данные экспрессии, преобразованные по формуле Log2(TPM + 1); для каждого образца опухоли рассчитывали иммунный показатель (immune score), стромальный показатель (stromal score) и общий показатель ESTIMATE. Для оценки взаимосвязи между экспрессией MPO и расчетными уровнями инфильтрации основных популяций иммунных клеток в когорте TCGA-BRCA, включая B-клетки, CD8+ T-клетки, CD4+ T-клетки, макрофаги, нейтрофилы и дендритные клетки, использовали TIMER/TIMER2.023,24,25. Результаты, полученные с помощью TIMER, интерпретировались как оценки иммунной инфильтрации, полученные из соответствующего онлайн-ресурса. Для анализа обогащения 24 типами иммунных клеток использовали анализ обогащения наборов генов для одного образца (ssGSEA), реализованный в пакете R GSVA версии 1.46.026. Матрица сигнатур иммунных клеток LM22, использованная для деконволюции 22 типов иммунных клеток с помощью CIBERSORT, представлена в Дополнительной таблице 1. Корреляции между экспрессией MPO и показателями обогащения иммунными клетками оценивали с помощью ранговой корреляции Спирмена. Различия в показателях обогащения иммунными клетками между группами опухолей с высоким и низким уровнем экспрессии MPO (разделенными по медиане) сравнивали с помощью суммы рангов Уилкоксона. Для анализов, включающих несколько типов иммунных клеток, значения p корректировали с использованием метода контроля ложных открытий Бенджамини — Хохберга.

Метилирование ДНК гена MPO

Паттерны метилирования ДНК в локусе MPO оценивали с помощью MethSurv. Значения бета-метилирования CpG и ассоциации с выживаемостью для TCGA-BRCA были получены с платформы MethSurv. Визуализировали выбранные CpG-сайты, связанные с MPO, и оценивали их связь с исходами выживаемости, используя результаты анализа выживаемости, предоставленные MethSurv27. Для анализов, включающих несколько CpG-сайтов, p-значения корректировали по всем протестированным CpG-сайтам, связанным с MPO, с использованием метода контроля ложноположительных результатов Бенджамини-Хохберга. Данные анализы метилирования интерпретировали как эксплораторные эпигенетические аннотации.

Построение сети белок-белковых взаимодействий и корреляционный анализ генов, связанных с нейтрофилами

Для изучения связи между MPO и биологией нейтрофилов был проведен систематический сетевой анализ. На основе имеющейся литературы был сформирован набор генов, включающий установленные медиаторы активации нейтрофилов и связанных с ними воспалительных процессов. Полный список генов, связанных с нейтрофилами, представлен в Дополнительной таблице 2. Символы генов были приведены к официальным обозначениям, дубликаты удалены, и доступные гены были сопоставлены с матрицей экспрессии TCGA-BRCA перед проведением анализа STRING/PPI, приоритизацией хаб-генов и анализом корреляции между MPO и хаб-генами. Сеть белок-белковых взаимодействий (PPI) для этих генов была построена с использованием базы данных STRING (версия 11.5) с пороговым значением показателя достоверности взаимодействия средней степени (>0,40). Хаб-гены в этой сети были приоритизированы алгоритмически на основе центральности по степени, которая количественно определяет число прямых взаимодействий на один узел. Для последующего корреляционного анализа были выбраны 20 генов с наивысшими показателями степени.

Затем из транскриптомного набора данных TCGA-BRCA были извлечены профили экспрессии этих хаб-генов и MPO. Связь между MPO и каждым хаб-геном была статистически оценена с помощью ранговой корреляции Спирмена. Для характеристики паттернов корреляции между самими хаб-генами была рассчитана попарная матрица корреляции Спирмена по всем образцам опухоли. Эти корреляционные анализы послужили количественной основой для последующей визуализации, включая леденцовую диаграмму (lollipop plot) корреляций MPO с хаб-генами, а также хордовую диаграмму/тепловую карту, отображающую паттерны корреляции хаб-генов.

Прогнозирование вышестоящих транскрипционных факторов и miRNA мишеней для MPO

Для прогнозирования целевых TF для MPO использовались база данных KnockTF (https://bio.liclab.net/KnockTF/index.php)28,29, база данных ChIP (http://chip-atlas.org/)30,31 и база данных GTRD32,33 (https://gtrd.biouml.org/#!). Кроме того, для прогнозирования потенциальных сайтов связывания miRNA, нацеленных на MPO, использовалась база данных TargetScan (https://www.targetscan.org/vert_80/). Диаграммы Венна были построены с помощью веб-сайта MicroBioinformatics (https://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/example.html)34.

Одноклеточный анализ MPO

Конкретный набор данных GSE161529 был получен из базы данных Gene Expression Omnibus (GEO). При предварительной обработке данных сначала была выполнена фильтрация на уровне клеток для исключения клеток низкого качества, соответствующих любому из следующих критериев: экспрессия митохондриальных генов более 25%, общее количество уникальных молекулярных идентификаторов (UMI) менее 5000 или обнаружение менее 2500 генов. Впоследствии была проведена коррекция загрязнения окружающей РНК и технических батч-эффектов35. Для снижения размерности с целью оценки сходства клеток был выполнен анализ главных компонентов (PCA), за которым следовал UMAP для кластеризации и визуализации клеток. Затем, на основании типичных маркерных генов клеток, различные кластеры были аннотированы по типам клеток11. Набор генов, связанных с MPO и используемый для расчета показателей сигнатуры отдельных клеток, представлен в Дополнительном файле 1. Перед расчетом символы генов были приведены к официальным символам генов, дубликаты были удалены, а доступные гены были пересечены с матрицей экспрессии GSE161529. Для расчета показателей, связанных с MPO, для каждой отдельной клетки использовались AUCell, Seurat AddModuleScore и ssGSEA. Показатели, полученные тремя методами, были нормализованы по Z-показателю, масштабированы до сопоставимого диапазона и объединены для создания композитного показателя, связанного с MPO, для последующего описательного анализа. Были изучены сети межклеточных взаимодействий для сравнения предполагаемых паттернов коммуникации лиганд-рецептор с участием эпителиальных опухолевых клеток, стратифицированных по сигналу, связанному с MPO, и различных типов клеток-партнеров. Эти результаты интерпретировались как описательные паттерны коммуникации, а не как доказательство того, что экспрессирующие MPO клетки непосредственно опосредуют межклеточную коммуникацию.

Виртуальный нокдаун в отдельных клетках MPO и анализ обогащения путей с использованием scTenifoldKnk

Виртуальный нокдаун MPO на уровне отдельных клеток был выполнен путем интеграции Seurat и scTenifoldKnk. После стандартного контроля качества (200–6 000 генов на клетку; доля митохондриальных генов < 10%) данные подвергли логарифмической нормализации, и 2 000 высоковариабельных генов были отобраны для снижения размерности и кластеризации. Для обогащения контекстов, релевантных MPO, были сохранены клетки, вошедшие в топ-50% по показателям модуля генов миелоидных клеток/нейтрофилов. Из этих клеток был определен подмножество «окрестности MPO» путем расширения от MPO-положительных стартовых клеток с использованием k = 40 ближайших соседей в пространстве PCA. Данное расширенное подмножество не рассматривалось как чисто MPO-положительная популяция, и на этапе расширения по методу KNN не делалось никаких выводов о пропорциях типов клеток. Это подмножество было подвергнуто анализу виртуального нокдауна с помощью scTenifoldKnk, при этом в качестве набора генов использовалось объединение высоковариабельных генов и MPO (экспрессируемого в ≥25 клетках). Были выявлены значимо измененные гены (FDR < 0,05, с поправкой Бенджамини-Хохберга). Полученные гены были дополнительно проанализированы на функциональное обогащение в категориях биологических процессов GO и путях KEGG (q < 0,05).

Поиск взаимосвязей между лекарственными средствами и генами и ADMET-аннотирование

Для получения предварительных записей о взаимодействиях «лекарственное средство — ген» или «химическое вещество — ген», связанных с MPO, был использован поиск в базе данных DGIdb. Поскольку списки взаимодействий из баз данных могут содержать записи, подтвержденные гетерогенными типами доказательств, и могут не соответствовать напрямую клинически применимым терапевтическим агентам, найденные соединения рассматривались как предварительные аннотации, а не как приоритетные кандидаты для лечения. Впоследствии для обобщения прогнозируемых физико-химических, фармакокинетических и токсикологических свойств использовались SwissADME и ADMETlab. Эти аннотации, полученные in silico, были использованы для обеспечения предварительного контекста интерпретации на уровне соединений и для подчеркивания необходимости дальнейшего фармакологического, токсикологического и клинического анализа перед рассмотрением какой-либо терапевтической значимости36.

Результаты

Паттерны экспрессии MPO и предварительный анализ ассоциаций с выживаемостью при раке груди

Для описания паттернов экспрессии MPO в наборах данных по раку мы проанализировали данные RNA-seq MPO из пан-ракового набора данных TCGA и обнаружили более низкую экспрессию MPO в опухолевых тканях при уротелиальной карциноме мочевого пузыря (BLCA), инвазивной карциноме молочной железы (BRCA), мультиформной глиобластоме (GBM), плоскоклеточном раке головы и шеи (HNSC), хромофобном раке почки (KICH), гепатоцеллюлярной карциноме печени (LIHC), аденокарциноме легкого (LUAD), плоскоклеточном раке легкого (LUSC), аденокарциноме поджелудочной железы (PAAD), аденокарциноме предстательной железы (PRAD) и карциноме щитовидной железы (THCA), а также более высокую экспрессию MPO при аденокарциноме толстой кишки (COAD), папиллярно-почечно-клеточном раке (KIRP) и в других тканях (Рисунок 2A). Затем мы оценили связь между экспрессией MPO и клиническими исходами для каждого типа рака. В когорте TCGA-BRCA как при непарном, так и при парном сравнении наблюдалась более низкая экспрессия MPO в опухолевой ткани, чем в нормальной/прилегающей ткани (Рисунок 2B,C). После стратификации опухолевых образцов TCGA-BRCA с использованием медианного порога экспрессии MPO в опухоли анализ Каплана-Мейера показал, что пациенты с более высокой экспрессией MPO имели более длительный интервал до прогрессирования (отношение рисков (HR) = 0.67, p = 0.028) (Рисунок 2D). Общая выживаемость (OS) (p = 0.296; Дополнительный рисунок 1A) и специфическая выживаемость (DSS) (p = 0.18; Дополнительный рисунок 1B) не были статистически значимыми. ROC-кривая «опухоль против нормы» предполагала разделение между группами тканей в этом наборе данных (Рисунок 2E), однако этот анализ не следует интерпретировать как клиническую диагностическую валидацию. На эту исследовательскую дискриминацию могут влиять источник нормальных образцов, пакетные эффекты, чистота опухоли и различия в составе тканей. Экспрессия MPO также была связана с патологической стадией T (Рисунок 2F) и распределением подтипов PAM50 (Рисунок 2G). В качестве качественных референсов на белковом уровне были представлены репрезентативные изображения иммуногистохимического (ИГХ) анализа MPO прилегающей нормальной ткани молочной железы и ткани рака молочной железы (Рисунок 2H). Обведенные рамками области указывают на участки, показанные при большем увеличении. Обзорные изображения с увеличением 20× включают масштабные отрезки 100 µm, в то время как изображения с большим увеличением 40× включают масштабные отрезки 50 µm.

Корреляционный анализ и анализ обогащения MPO в когорте TCGA-BRCA

Анализ корреляции Пирсона позволил выявить 30 наиболее значимых генов, положительно коррелирующих с MPO, которые демонстрировали согласованное повышение экспрессии вдоль градиента экспрессии MPO (Рисунок 3A), в то время как 30 наиболее значимых отрицательно коррелирующих генов демонстрировали обратный паттерн экспрессии (Рисунок 3B). На уровне сигнальных путей экспрессия MPO была значимо и положительно связана с несколькими показателями опухолевых сигнатур, включая сигнатуру воспалительного ответа (r = 0.41; Рисунок 3C), маркеры EMT (r = 0.264; Рисунок 3D) и показатель набора генов, связанных с активными формами кислорода (ROS) (r = 0.415; Рисунок 3E), что свидетельствует о том, что экспрессия MPO коррелирует с воспалительными/окислительными и мезенхимальными транскрипционными состояниями в когорте TCGA-BRCA.

Неконтролируемая кластеризация генов, ассоциированных с MPO, позволила дополнительно стратифицировать опухоли по паттернам экспрессии, которые соответствовали клиническим аннотациям, включая патологическую стадию T и внутренние подтипы PAM50 (Рисунок 3F). Чтобы исследовать возможные связи между генами, ассоциированными с MPO, мы построили сеть белок-белковых взаимодействий (PPI) с помощью STRING, которая выявила взаимосвязанный модуль из нескольких генов, коррелирующих с MPO (Рисунок 3G). В сети PPI гены ESR1, FOXA1, XBP1, GATA3 и KRT18 обладали высокой сетевой связностью внутри этого модуля, полученного на основе корреляции. Эти результаты позволяют определить гены, экспрессия которых коварирует с экспрессией MPO, но не устанавливают патогенез, связанный с MPO, или направление этих связей. Анализ дифференциальной экспрессии между группами с высоким и низким уровнем MPO выявил транскриптомные различия, обобщенные на графике «вулкан» (Рисунок 3H). Всего было выявлено 1159 геннов с повышенной экспрессией и 854 с пониженной экспрессией, что послужило базой для последующего анализа обогащения.

Далее мы исследовали функциональную значимость дифференциально экспрессируемых генов (ДЭГ) между группами с высоким и низким уровнем MPO с помощью пакета clusterProfiler в R. Анализ обогащения по генной онтологии (GO) показал, что эти ДЭГ преимущественно участвуют в иммуно-связанных биологических процессах, включая регуляцию сигналинга клеточных поверхностных рецепторов, связанных с иммунным ответом, и лимфоцитарный иммунитет; обогащение также наблюдалось в таких клеточных компонентах, как Т-клеточный рецепторный комплекс, и в молекулярных функциях, связанных с активаторной активностью рецепторов (Рисунок 4A). Соответственно, анализ путей KEGG выявил пути, связанные с иммунитетом и воспалением, включая взаимодействие цитокин–цитокиновый рецептор, хемокиновый сигналинг, сигналинг Т-клеточного рецептора, цитотоксичность, опосредованную NK-клетками, дифференцировку Th1/Th2 и Th17, сигналинг NF-κB, первичный иммунодефицит и кишечную иммунную сеть для продукции IgA (Рисунок 4B).

Для дальнейшей интеграции направленности экспрессии с функциональными терминами использовался график GO для расчета Z-показателей на уровне терминов на основе значений DEG |log2FC|, что вновь выявило иммунные обогащенные транскрипционные программы, такие как гуморальный иммунный ответ, лейкоцитарный/лимфоцитарный иммунитет, активация иммунного ответа и передача сигналов (Рисунок 4C). Анализ обогащения наборов генов (GSEA) на основе ранжированного списка генов также показал обогащение путей иммунной системы, включая адаптивную иммунную систему, взаимодействие цитокинов с цитокиновыми рецепторами и дегрануляцию нейтрофилов (Рисунок 4D–G). Поскольку MPO является геном, ассоциированным с миелоидными клетками/нейтрофилами, данные результаты интерпретируются как свидетельство того, что образцы с высоким уровнем MPO демонстрируют более сильные иммунные/миелоидные транскрипционные сигналы, а не как доказательство того, что сам MPO перестраивает иммунное микроокружение.

Корреляция между экспрессией MPO и инфильтрацией иммунных клеток при раке молочной железы

Мы оценили взаимосвязь между экспрессией MPO и характеристиками микроокружения опухоли в когорте TCGA-BRCA. Применение алгоритма ESTIMATE выявило значимые положительные корреляции между экспрессией MPO и баллом ESTIMATE (R = 0.347, p < 0.001), иммунным баллом (R = 0.361, p < 0.001) и стромальным баллом (R = 0.232, p < 0.001) (Рисунок 5A). Распределение этих баллов по образцам показано на Рисунке 5B. Анализ с использованием ресурса TIMER/TIMER2.0 показал, что экспрессия MPO была связана с расчетными уровнями инфильтрации основных популяций иммунных клеток, включая B-клетки, CD8+ T-клетки, нейтрофилы, CD4+ T-клетки, макрофаги и дендритные клетки в когорте TCGA-BRCA (Рисунок 5C). Этот характер ассоциации был дополнительно оценен с помощью баллов обогащения иммунных клеток на основе ssGSEA для 24 типов иммунных клеток. После коррекции ложноположительных результатов по методу Бенджамини–Хохберга экспрессия MPO продемонстрировала положительную связь с несколькими баллами обогащения иммунных клеток, включая T-клетки, B-клетки, цитотоксические клетки, подмножества дендритных клеток, макрофаги, подмножества T-хелперов, регуляторные T-клетки, CD8+ T-клетки, NK-клетки, тучные клетки и нейтрофилы (Рисунок 5D). Эти результаты интерпретируются как ассоциации с иммунным составом, а не как доказательство того, что MPO напрямую контролирует инфильтрацию иммунных клеток. Для визуализации паттернов обогащения иммунных клеток на уровне образцов в когорте TCGA-BRCA была построена тепловая карта (Рисунок 5E). Затем мы сравнили баллы обогащения иммунных клеток, рассчитанные методом ssGSEA, между группами опухолей с высокой и низкой экспрессией MPO, определенными по медиане. Баллы обогащения нескольких типов иммунных клеток различались между двумя группами, включая активированные дендритные клетки (aDC), B-клетки, CD8+ T-клетки, цитотоксические клетки, нейтрофилы, T-клетки, Tregs, Th1-клетки, Th2-клетки, Th17-клетки, γδ T-клетки, фолликулярные Т-хелперы (TFH), клетки с высоковариабельными генами (HVG), T-клетки эффекторной памяти, T-клетки центральной памяти и T-хелперы (Рисунок 5F,G). Кроме того, была проведена деконволюция на основе CIBERSORT с использованием сигнатурной матрицы LM22 для оценки относительных фракций 22 типов иммунных клеток; полученные паттерны состава иммунных клеток представлены на Рисунке 5H.

Анализ метилирования ДНК MPO в когорте TCGA-BRCA

Используя тот же пороговый уровень медианной экспрессии MPO в опухоли, образцы TCGA-BRCA были разделены на группы с высокой и низкой экспрессией MPO, и для каждой группы была визуализирована картина метилирования ДНК (Рисунок 6A). Выбранные сайты CpG в локусе MPO продемонстрировали связь с выживаемостью в анализе MethSurv, включая cg22331200, cg14619064 и cg11151395 (Рисунок 6B–G). Эти результаты, связанные с метилированием, были интерпретированы как предварительные эпигенетические аннотации и требуют независимой валидации, прежде чем можно будет сделать прогностические или механистические выводы.

Связь между экспрессией MPO и генными сетями, связанными с нейтрофилами, при раке молочной железы

Для изучения связи между экспрессией MPO и генами, связанными с нейтрофилами, была использована когорта TCGA-BRCA. На основе базы данных STRING была построена сеть белок-белковых взаимодействий (PPI) для генов, ассоциированных с нейтрофилами, и приоритетные хаб-гены были определены в соответствии с топологией сети (Рисунок 7A). Впоследствии была проведена оценка корреляции 20 основных хаб-генов с экспрессией MPO. Как показано на леденцовой диаграмме (lollipop plot), MPO демонстрировала преимущественно положительную корреляцию с множеством медиаторов, связанных с нейтрофилами, при этом более сильные связи наблюдались для компонентов хемокинового/врожденного иммунного сигналинга, таких как CCL5, CCL2 и TLR2, а также для TLR4, CXCR4, TNF и MMP9 (Рисунок 7B).

Для дальнейшей характеристики паттерна корегуляции этих хаб-генов мы визуализировали их попарные связи с помощью хордовой диаграммы и тепловой карты корреляций; результаты выявили обширные положительные межгенные корреляции во всем хаб-модуле, что согласуется с координированной воспалительной/нейтрофильной транскрипционной программой (Рисунок 7C,D). В совокупности эти результаты указывают на то, что более высокая экспрессия MPO сопровождается координированной экспрессией сети нейтрофильных генов при раке молочной железы.

Аннотация потенциальных факторов транскрипции для MPO

Для поиска потенциальных факторов транскрипции, связанных с MPO, были проанализированы и сопоставлены данные общедоступных ресурсов по факторам транскрипции, включая KnockTF, ChIP-Atlas и GTRD. В дальнейшем список потенциальных факторов транскрипции был уточнен с помощью сетевой приоритизации и корреляционного анализа. Графическое резюме представлено на Дополнительный рисунок 2, полные табличные результаты представлены в Дополнительный файл 2Поскольку в этих базах данных интегрированы данные из гетерогенных экспериментальных контекстов, пересечение баз данных и степень узла сети использовались только для аннотации и приоритизации кандидатов. Эти результаты не интерпретировались как функциональное доказательство прямой транскрипционной регуляции MPO при раке молочной железы. Таким образом, факторы-кандидаты, включая MYC, представлены в качестве дополнительных исследовательских аннотаций, а не как валидированные вышестоящие регуляторы.

Кластеризация отдельных клеток и описательный анализ межклеточного взаимодействия, стратифицированный по сигналу MPO

Для аннотирования типов клеток мы сначала провели анализ экспрессии, специфичный для каждого кластера, на основе канонических маркеров каждой линии. Средние уровни экспрессии и процент клеток, экспрессирующих эти ключевые гены в разных кластерах, представлены на графике, что служит основанием для последующей аннотации (Рисунок 8A). Соответственно, аннотированные клеточные кластеры визуализированы на графике однородного многомерного аппроксимированного проецирования (UMAP), где каждая популяция обозначена цветом в соответствии с определенным типом, включая плазмоцитоидные дендритные клетки, эндотелиальные клетки, миоэпителиальные клетки, циклические эпителиальные клетки, плазматические клетки, цитотоксические T-клетки, эпителиальные опухолевые клетки, B-клетки, активированные CD4 T-клетки, моноциты-макрофаги, фибробласты и конвенциональные T-клетки (Рисунок 8B). Тепловая карта отображает уровни экспрессии выбранных генов в клеточных кластерах (C1-C8). Каждая строка соответствует гену, а каждый столбец — клеточному кластеру. Цветовой градиент указывает уровни экспрессии, где красный цвет обозначает высокую экспрессию, а синий — низкую. Левая дендрограмма объединяет гены с похожими паттернами экспрессии (Рисунок 8C). Балл, связанный с MPO, рассчитывался для каждой клетки с использованием набора генов, ассоциированных с MPO, представленного в Дополнительном файле 1. Для расчета баллов на уровне отдельных клеток использовались AUCell, Seurat AddModuleScore и анализ обогащения наборов генов в одной пробе (ssGSEA). Баллы, полученные тремя методами, были нормализованы с помощью Z-показателя, приведены к сопоставимому диапазону и интегрированы для получения композитного балла, связанного с MPO, для последующего описательного анализа (Рисунок 8D).

Данный анализ межклеточного взаимодействия позволил сравнить предполагаемые паттерны коммуникации лиганд–рецептор между группами клеток, стратифицированными по сигналу MPO, включая сеть взаимодействий, тепловые карты паттернов сигнализации, пузырьковую диаграмму исходящей сигнализации и пузырьковую диаграмму входящей сигнализации (Рисунок 8E–H). Поскольку сигнал MPO на уровне отдельных клеток был редким, а наблюдаемое распределение по аннотированным типам клеток могло быть подвержено влиянию выпадения данных (dropout), фоновой РНК, дуплетов и неопределенности аннотации, данные графики коммуникации следует интерпретировать как описательные результаты рабочего процесса. Они не доказывают, что клетки, экспрессирующие MPO, опосредуют или контролируют межклеточную коммуникацию. Детектируемый сигнал MPO наблюдался в ограниченном количестве клеток, включая аннотированные эпителиальные опухолевые клетки и моноциты-макрофаги (Рисунок 8I). Учитывая, что MPO канонически ассоциируется с нейтрофильным/миелоидным линиями, этот паттерн требует подтверждения в независимых наборах данных секвенирования единичных клеток или с помощью ортогональных экспериментальных методов.

Поисковый анализ чувствительности scTenifoldKnk на основе разреженных MPO-положительных клеток

Была выполнена интеграция нескольких образцов 10x Genomics с последующей нормализацией и отбором высоковариабельных генов (HVG), снижением размерности на основе PCA, построением графа k-ближайших соседей и кластеризацией по методу Лувена. Характер экспрессии канонических маркерных генов в кластерах был обобщен с помощью DotPlot, что послужило основой для последующей аннотации типов клеток (Рисунок 9A). Визуализация UMAP продемонстрировала аннотированные популяции одиночных клеток в интегрированном наборе данных (Рисунок 9B). Канонические маркеры линий (например, EPCAM и KRT8/KRT18 для эпителиальных клеток; PTPRC для иммунных клеток; MS4A1 для B-клеток; LST1/S100A8/S100A9 для миелоидных клеток; PECAM1 для эндотелиальных клеток и COL1A1 для линий фибробластов/гладких мышц) показали кластерно-специфические паттерны экспрессии, подтверждая аннотацию типов клеток (Рисунок 9C). Стратифицированные по образцам накопительные столбчатые диаграммы показали, что каждый образец содержал несколько кластеров с ограниченной общей вариабельностью между партиями (Рисунок 9D).

Экспрессия MPO в наборе данных одноклеточного секвенирования была относительно низкой: изначально было выявлено всего 85 MPO-положительных клеток (Рисунок 9E). Из-за этого ограниченного количества расширение окрестностей на основе метода KNN использовалось только для определения локального подмножества MPO-окрестности для эксплораторного анализа чувствительности. Данное расширенное подмножество не следует интерпретировать как чистую MPO-положительную популяцию, поскольку оно может включать соседние клетки с низким или необнаружимым уровнем экспрессии MPO. В этом подмножестве MPO-окрестности с помощью scTenifoldKnk был проведен виртуальный нокдаун MPO в качестве вычислительного анализа чувствительности. Полученный график вулкана, анализ смещения многообразия, визуализация выравнивания многообразий, результаты обогащения GO/KEGG и гены с наибольшим смещением (Рисунок 9F-N) выявили потенциальные транскрипционные программы, связанные с презентацией антигена, активацией миелоидных клеток/лимфоцитов, продукцией цитокинов и путями, связанными с фагосомами. Эти результаты следует интерпретировать как данные эксплораторного анализа транскрипционной чувствительности, а не как прямое доказательство того, что MPO механистически регулирует эти пути при раке молочной железы. Для подтверждения этих наблюдений потребуются независимые наборы данных одноклеточного секвенирования и ортогональная экспериментальная валидация, такая как иммуногистохимия, проточная цитометрия, qPCR или функциональные тесты.

Поисковое извлечение взаимодействий между лекарственными препаратами и генами и ADMET-аннотирование

В качестве дополнительного разведывательного расширения анализа, сосредоточенного на MPO, информация о взаимодействиях «лекарство — ген» была получена из базы данных DGIdb. Графическое резюме представлено на Дополнительном рисунке 3, а результаты на уровне соединений приведены в Дополнительной таблице 3. Запрос к DGIdb вернул неоднородный набор химических записей, связанных с MPO, включая соединения с ограниченной клинической обоснованностью или неблагоприятными токсикологическими профилями. Следовательно, данные соединения из базы данных не рассматривались как терапевтические кандидаты для лечения рака молочной железы на основе настоящего анализа. Информация, связанная с ADMET, была обобщена для предварительной аннотации прогнозируемых физико-химических, фармакокинетических и токсикологических свойств. Поиск соединений в базах данных и ADMET-аннотирование не эквивалентны клинически курируемой приоритезации лекарственных средств. Таким образом, эти результаты служат лишь химическими аннотациями на уровне скрининга и иллюстрируют необходимость тщательной фармакологической, токсикологической и клинической фильтрации, прежде чем какое-либо соединение может быть рассмотрено для терапевтического исследования. Основные выводы данного исследования сосредоточены на связи между экспрессией MPO и иммунными/миелоидными транскрипционными особенностями.

ДОСТУПНОСТЬ ДАННЫХ:

Транскриптомные и клинические данные TCGA-BRCA были получены с портала Genomic Data Commons (https://portal.gdc.cancer.gov; загружены 26 августа 2025 г.; выпуск/версия данных 202208). Набор данных единичных клеток GSE161529 был получен из базы Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE161529). В данном исследовании новые данные секвенирования не генерировались. Скрипты для анализа доступны в открытом доступе по адресу https://github.com/tengfeitcm/MPO.

Схема мультиомного анализа, межклеточного взаимодействия, экспрессии MPO и интеграции клинических данных.
Рисунок 1: Схема процесса сбора и анализа данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот рисунок в большем размере.

Исследование рака молочной железы; гистограммы экспрессии MPO, кривая выживаемости, ROC-кривая, анализ гистологических изображений.
Рисунок 2: Паттерны экспрессии MPO и предварительный анализ ассоциаций с выживаемостью при раке молочной железы. (A) Уровни экспрессии MPO были проанализированы в 33 различных типах рака и прилегающих нормальных тканях с использованием базы данных TCGA. (B) Для анализа экспрессии мРНК MPO при раке молочной железы и в нормальных тканях из набора данных TCGA-BRCA были отобраны непарные образцы. (C) Для анализа экспрессии мРНК MPO при раке молочной железы и в нормальных тканях из набора данных TCGA-BRCA были отобраны парные образцы. (D) Анализ Каплана-Мейера PFI у пациентов, стратифицированных по медианному порогу экспрессии MPO в опухоли в когорте TCGA-BRCA. (E) Исследовательская ROC-кривая, оценивающая дифференциацию опухоли и нормальной ткани на основе экспрессии MPO в проанализированном общедоступном транскриптомном наборе данных. (F) Экспрессия MPO на различных патологических стадиях T. (G) Экспрессия MPO в различных молекулярных подтипах PAM50 с указанием меток подтипов. (H) Репрезентативные изображения иммуногистохимического (ИГХ) окрашивания на MPO в прилегающей нормальной ткани молочной железы и в ткани рака молочной железы. Областями в рамках отмечены зоны, показанные при большем увеличении. Обзорные изображения при 20× содержат масштабные отрезки 100 µm, а изображения при большем увеличении 40× содержат масштабные отрезки 50 µm. Данные изображения представлены в качестве качественных ориентиров уровня белка и не использовались для количественного морфометрического или статистического анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Графики анализа экспрессии генов и сетевая диаграмма, тепловые карты, диаграммы рассеяния и вулкан-плоты.
Рисунок 3: Корреляционный анализ и анализ дифференциальной экспрессии, связанных с MPO, при раке молочной железы. (A) Топ-30 кодирующих генов, положительно коррелирующих с экспрессией MPO на уровне мРНК, на основе коэффициентов корреляции Пирсона по базе данных TCGA. (B) Топ-30 кодирующих генов, отрицательно коррелирующих с экспрессией MPO на уровне мРНК, на основе коэффициентов корреляции Пирсона. (C) Диаграммы рассеяния, иллюстрирующие корреляции Спирмена между MPO и генами, экспрессия которых повышена при воспалительном ответе. (D) Диаграммы рассеяния, иллюстрирующие корреляции Спирмена между MPO и генами, экспрессия которых повышена при воздействии маркеров ЭМП. (E) Диаграммы рассеяния, иллюстрирующие корреляции Спирмена между MPO и генами, экспрессия которых повышена при воздействии АФК. (F) Тепловая карта кластеров генов, связанных с MPO, на основе клинической значимости (стадия T и PAM50). (G) Сеть PPI, предсказанная с использованием базы данных STRING для белков, связанных с MPO. (H) Вулкан-плот дифференциально экспрессируемых генов между группами опухолей с высокой и низкой экспрессией MPO (определенной по медиане) в когорте TCGA-BRCA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Диаграммы анализа обогащения генов с путями и категориями онтологии; столбчатые диаграммы и линейные графики.
Рисунок 4: Анализ обогащения MPO при раке молочной железы. (A) Анализ обогащения по Gene Ontology для 2 013 дифференциально экспрессируемых генов между группами с высоким и низким уровнем MPO. (B) Анализ обогащения путей Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes для 2 013 дифференциально экспрессируемых генов. (C) Комбинированная визуализация обогащения Gene Ontology, объединяющая обогащенные термины с направлением дифференциальной экспрессии и значениями |log2FC|. (D) Репрезентативный график обогащения GSEA для набора иммуносвязанных генов, ассоциированных с MPO; название набора генов, нормализованный показатель обогащения (NES) и q-значение FDR указаны на панели. (E) Репрезентативный график обогащения GSEA для дополнительного набора иммуносвязанных генов, ассоциированных с MPO; название набора генов, нормализованный показатель обогащения (NES) и q-значение FDR указаны на панели. (F) Репрезентативный график обогащения GSEA для дополнительного набора иммуносвязанных генов, ассоциированных с MPO; название набора генов, нормализованный показатель обогащения (NES) и q-значение FDR указаны на панели. (G) Репрезентативный график обогащения GSEA для дополнительного набора иммуносвязанных генов, ассоциированных с MPO; название набора генов, нормализованный показатель обогащения (NES) и q-значение FDR указаны на панели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Графики анализа экспрессии генов, роль MPO в инфильтрации иммунных клеток, корреляция и визуализация данных.
Рисунок 5: Корреляция между обогащением иммунными клетками и экспрессией MPO при раке молочной железы. (A) Диаграммы рассеяния, показывающие корреляцию между экспрессией MPO и показателями ESTIMATE score, immune score и stromal score. (B) Диаграммы размаха (box plots), показывающие различия в ESTIMATE score, immune score и stromal score между группами опухолей с высокой и низкой экспрессией MPO, определенными по медиане. (C) Анализ на основе TIMER/TIMER2.0, показывающий связь между экспрессией MPO и расчетной инфильтрацией основных популяций иммунных клеток. (D) Диаграмма «леденец» (lollipop plot), показывающая корреляции Спирмена между экспрессией MPO и показателями обогащения, рассчитанными с помощью ssGSEA для 24 типов иммунных клеток. P-значения для множественных корреляций иммунных клеток были скорректированы с использованием метода контролируемого уровня ложноположительных результатов Бенджамини–Хохберга. (E) Тепловая карта, иллюстрирующая паттерны обогащения иммунными клетками на уровне образцов в когорте TCGA-BRCA. (F) Диаграммы размаха, показывающие первый набор различий в показателях обогащения иммунными клетками, рассчитанных с помощью ssGSEA, между группами опухолей с высокой и низкой экспрессией MPO (по медиане); сравнение групп проводилось с использованием критерия суммы рангов Уилкоксона с поправкой Бенджамини–Хохберга. (G) Диаграммы размаха, показывающие второй набор различий в показателях обогащения иммунными клетками, рассчитанных с помощью ssGSEA, между группами опухолей с высокой и низкой экспрессией MPO (по медиане); сравнение групп проводилось с использованием критерия суммы рангов Уилкоксона с поправкой Бенджамини–Хохберга. (H) Стековая столбчатая диаграмма, показывающая доли иммунных клеток, рассчитанные с помощью CIBERSORT на основе сигнатурной матрицы LM22 для 22 типов иммунных клеток в группах опухолей с низкой и высокой экспрессией MPO, определенными по медиане. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Тепловая карта паттернов метилирования ДНК и графики анализа выживаемости для исследования экспрессии генов.
Рисунок 6: Анализ метилирования ДНК гена MPO при раке молочной железы. (A) Тепловая карта, демонстрирующая паттерны метилирования MPO в группах с высоким и низким уровнем экспрессии MPO, определенных по медиане. (B) Кривая выживаемости Каплана-Мейера, демонстрирующая прогностическую значимость метилирования в сайте cg27456487. (C) Кривая выживаемости Каплана-Мейера, демонстрирующая прогностическую значимость метилирования в сайте cg02668773. (D) Кривая выживаемости Каплана-Мейера, демонстрирующая прогностическую значимость метилирования в сайте cg07110356. (E) Кривая выживаемости Каплана-Мейера, демонстрирующая прогностическую значимость метилирования в сайте cg11151395. (F) Кривая выживаемости Каплана-Мейера, демонстрирующая прогностическую значимость метилирования в сайте cg14619064. (G) Кривая выживаемости Каплана-Мейера, демонстрирующая прогностическую значимость метилирования в сайте cg22331200. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Анализ сети экспрессии генов; диаграмма, график, результаты корреляции; данные о белковых взаимодействиях.
Рисунок 7: Анализ корреляции MPO и генов, связанных с нейтрофилами, на уровне мРНК с использованием базы данных TCGA. (A) Визуализация сети белковых взаимодействий, отображающая связи между основным белком и другими белками. (B) Корреляционный анализ 20 наиболее значимых генов, связанных с нейтрофилами, в отношении MPO, с указанием коэффициентов корреляции и распределения P-value для различных генов. (C) Хордовая диаграмма корреляций между 20 наиболее значимыми генами, связанными с нейтрофилами, визуально представляющая силу и направление ассоциаций между генами. (D) Тепловая карта корреляции 20 наиболее значимых генов, связанных с нейтрофилами, отображающая коэффициенты корреляции и уровни значимости с помощью цветовых градиентов и статистических маркеров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Клеточные кластеры и анализ экспрессии; графики, тепловые карты и сетевая диаграмма; данные секвенирования РНК.
Рисунок 8: Кластеризация единичных клеток и анализ межклеточного взаимодействия, связанного с MPO, в наборе данных одноклеточного секвенирования рака молочной железы. (A) DotPlot канонических маркерных генов в различных кластерах для аннотации типов клеток. (B) Визуализация аннотированных клеточных популяций с помощью UMAP. (C) Тепловая карта выбранных маркерных генов в клеточных кластерах. (D) DotPlot, обобщающий баллы, связанные с MPO, для аннотированных типов клеток, рассчитанные с помощью AUCell, ssGSEA и Seurat AddModuleScore на основе набора генов, представленного в Дополнительном файле 1. (E) Сеть межклеточных взаимодействий, отображающая коммуникацию между эпителиальными опухолевыми клетками, стратифицированными по MPO-ассоциированному сигналу, и другими типами клеток; ширина ребра представляет силу взаимодействия, а размер узла отражает общую активность взаимодействий. (F) Тепловые карты, показывающие паттерны исходящих и входящих сигналов между типами клеток. (G) Bubble plot исходящих сигнальных путей от эпителиальных опухолевых клеток, стратифицированных по MPO-ассоциированному сигналу, к другим типам клеток. (H) Bubble plot входящих сигнальных путей от других типов клеток к эпителиальным опухолевым клеткам, стратифицированным по MPO-ассоциированному сигналу. (I) Распределение экспрессии MPO по аннотированным типам клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Диаграммы кластеризации UMAP, теплокарта экспрессии генов, столбчатые диаграммы и график
Рисунок 9: Анализ атласа отдельных клеток и исследовательский виртуальный нокдаун показателей чувствительности к MPO. (A) DotPlot, демонстрирующий экспрессию канонических маркерных генов в кластерах отдельных клеток; размер точки соответствует проценту клеток, экспрессирующих данный маркер, а интенсивность цвета — среднему уровню экспрессии. (B) Визуализация UMAP аннотированных популяций отдельных клеток, где каждый цвет соответствует определенному типу клеток или кластеру. (C) Визуализация UMAP экспрессии ключевых маркерных генов, показывающая распределение экспрессии маркерных генов для типов клеток, включая миелоидные клетки. (D) Стековая столбчатая диаграмма пропорций клеточных кластеров в образцах. (E) Визуализация UMAP экспрессии гена MPO. (F) Скрипичный график (violin plot), демонстрирующий метрики контроля качества (QC) секвенирования отдельных клеток. (G) График кластеризации ключевых маркерных генов. (H) DotPlot канонических маркерных генов на уровне кластеров. (I) График "вулкан" генов, изменившихся в анализе чувствительности при виртуальном нокдауне. (J) Диаграмма рассеяния смещения относительно значимости. (K) График со стрелками выравнивания многообразий (manifold alignment). (L) Анализ обогащения GO BP для генов из результатов виртуального нокдауна. (M) Анализ обогащения путей KEGG для генов из результатов виртуального нокдауна. (N) Топ-20 генов с наибольшим смещением многообразия после исключения MPO. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Дополнительный анализ выживаемости для MPO в когорте TCGA-BRCA. (A,B) Данный файл содержит дополнительные результаты анализа выживаемости по методу Каплана-Мейера для (A) общей выживаемости и (B) специфической для заболевания выживаемости, стратифицированные по медианному порогу экспрессии MPO в опухоли. Эти анализы представлены в качестве дополнительных результатов к рисунку 2D и не были статистически значимыми в данной когорте.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Поисковая аннотация потенциальных факторов транскрипции для MPO. (A) Диаграмма Венна, показывающая пересечение потенциальных факторов транскрипции из трех открытых ресурсов по факторам транскрипции. (B) Результаты сравнения экспрессии MYC. (C) Тепловая карта корреляции факторов транскрипции с подписями строк и столбцов. (D) Результаты корреляции MPO–MYC. (E) Результаты анализа выживаемости для MYC. (F) Результаты ROC-анализа для MYC. Данные по MYC представлены только в качестве дополнительных аннотаций потенциальных факторов транскрипции и не используются для подтверждения выводов о механизмах действия вышестоящих регуляторов.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная фигура 3: Результаты поискового запроса лекарственных средств и генов для MPO в базе данных DGIdb. Серые узлы представляют ген MPO, оранжевые узлы — найденные записи о малых молекулах, а соединительные линии указывают на предсказанные базой данных связи между лекарственным средством и геном.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 1: Матрица сигнатур иммунных клеток LM22, использованная для анализа деконволюции 22 типов иммунных клеток с помощью CIBERSORT. Символы генов были гармонизированы, дубликаты удалены, а доступные гены были пересечены с соответствующими матрицами экспрессии TCGA-BRCA или GSE161529 перед последующим анализом.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 2: Список генов, связанных с нейтрофилами, который использовался для анализа STRING/PPI, приоритизации хаб-генов и анализа корреляции между MPO и хаб-генами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 3: Результаты предварительного поиска лекарственных средств и генов в базе данных DGIdb и ADMET-аннотации для MPO. Этот файл содержит записи о взаимодействиях химических веществ и генов, связанных с MPO, полученные из DGIdb, а также предсказанные физико-химические, фармакокинетические и токсикологические аннотации на уровне отдельных соединений. Данные результаты представлены исключительно в качестве предварительных химических аннотаций и не должны интерпретироваться как списки терапевтических кандидатов. Они не подтверждают ингибирование MPO, связывание с мишенью, специфичность лигандов, селективность, безопасность, терапевтическую эффективность или клиническую пригодность. Значения в этой таблице представляют собой предсказанные физико-химические параметры и показатели лекарственно-подобности для перечисленных соединений. Молекулярная масса выражена в граммах на моль (g/mol). Значения акцепторов и доноров водородных связей указывают на предсказанное количество акцепторов и доноров водородных связей соответственно. Коэффициент распределения октанол-вода по Моригучи указывает на предсказанную липофильность. Нарушения правил Липински указывают на количество критериев правила пяти Липински, которым не соответствует каждое соединение. Показатель биодоступности представляет собой предсказанный балл, связанный с пероральной биодоступностью, а топологическая площадь поверхности относится к предсказанной топологической полярной поверхности.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 1: Список генов, ассоциированных с MPO, который использовался для оценки сигнатур отдельных клеток с помощью AUCell, Seurat AddModuleScore и ssGSEA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 2: Результаты эксплораторной аннотации потенциальных факторов транскрипции и микроРНК для MPO. Этот файл содержит результаты аннотации потенциальных факторов транскрипции и микроРНК, полученные из баз данных на основе общедоступных ресурсов, включая KnockTF, ChIP-Atlas, GTRD и TargetScan. Данные аннотации представлены исключительно для эксплораторной приоритизации кандидатов и не должны интерпретироваться как функциональное доказательство апстрим-регуляции MPO при раке молочной железы.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

В данном исследовании представлен ознакомительный рабочий процесс с использованием открытых наборов данных и методов in silico для изучения взаимосвязи между экспрессией MPO и иммунными/миелоидными характеристиками при раке молочной железы. Анализ данных TCGA-BRCA показал, что экспрессия MPO в опухолевых тканях была ниже, чем в прилегающих неотморфозированных тканях, и что более высокая экспрессия MPO была связана с более длительным интервалом до прогрессирования заболевания. Однако общая выживаемость и выживаемость с учетом специфики заболевания не имели статистической значимости. Следовательно, на основании имеющихся данных MPO не следует интерпретировать как надежный или общепринятый прогностический биомаркер. В будущих исследованиях необходимо оценить MPO с использованием многофакторных регрессионных моделей Кокса, скорректированных с учетом установленных клинико-патологических переменных, с применением независимых валидационных когорт и анализов, стратифицированных по подтипам.

По сравнению с традиционным анализом дифференциальной экспрессии в одной когорте или оценкой иммунной инфильтрации на одной платформе, данный рабочий процесс, сосредоточенный на MPO, объединяет объемную транскриптомику, иммунное обогащение, аннотацию метилирования, одноклеточное картирование и виртуальное возмущение, что обеспечивает более широкий исследовательский взгляд на иммунные/миелоидные особенности, связанные с MPO. Однако этот рабочий процесс является дополнительным, а не заменяющим внешнюю валидацию когорт, валидацию на пространственном или белковом уровнях, а также экспериментальные анализы возмущения.

Результаты анализа иммунной инфильтрации и обогащения следует интерпретировать как иммунный контекст, связанный с MPO, а не как иммунное ремоделирование, вызванное MPO. MPO экспрессируется преимущественно в нейтрофилах и других клетках миелоидного ряда37. Следовательно, положительные корреляции между экспрессией MPO и показателями ESTIMATE, иммунными показателями, показателями обогащения иммунными клетками, генами, связанными с нейтрофилами, цитокиновыми путями, сигнатурами презентации антигена или путями дегрануляции нейтрофилов биологически правдоподобны и могут в значительной степени отражать различия в количестве иммунных/миелоидных клеток в общих образцах опухоли. Такая интерпретация согласуется с предыдущими исследованиями, показывающими, что инфильтрация MPO-положительными нейтрофилами связана с благоприятным прогнозом при раке молочной железы, а также с тем, что MPO вовлечен в функцию дендритных клеток и Т-клеточное воспаление тканей38,39. Данные общего RNA-seq не позволяют определить, обладает ли MPO собственной активностью в опухолевых клетках или наблюдаемый сигнал преимущественно отражает инфильтрирующие иммунные клетки. Для уточнения клеточного источника и функции потребуются независимые наборы данных одноклеточного секвенирования, пространственное профилирование, иммуногистохимия, проточная цитометрия или экспериментальные модели на основе пертурбаций.

Анализ отдельных клеток предоставляет дополнительную описательную информацию, однако он ограничен низкой частотой детектирования MPO. Первоначально, до расширения окрестности на основе метода KNN, было выявлено только 85 MPO-положительных клеток. Хотя расширение KNN позволило провести анализ чувствительности клеток в локальной транскрипционной окрестности MPO-положительных клеток, эта процедура может включать клетки, которые не экспрессируют MPO напрямую. Соответственно, результат виртуального нокдауна scTenifoldKnk следует интерпретировать как исследовательский вычислительный анализ чувствительности, а не как доказательство регуляции сигнальных путей, опосредованной MPO40. Прежде чем можно будет сделать механистические выводы, потребуется валидация на независимых наборах данных по раку молочной железы на уровне отдельных клеток и проведение ортогональных экспериментальных анализов.

Результаты анализа факторов транскрипции также следует интерпретировать с осторожностью. Пересечение прогнозов KnockTF, GTRD и ChIP-Atlas с последующей приоритизацией на основе степени связей позволяет определить потенциальные факторы транскрипции, но не может однозначно установить наличие функциональной транскрипционной регуляции MPO при раке молочной железы. Поэтому MYC и другие потенциальные факторы были оставлены только в качестве исследовательских аннотаций. Поскольку активность факторов транскрипции сильно зависит от контекста и может варьироваться в зависимости от подтипа опухоли, клеточного состава, платформы анализа и стратегии предварительной обработки, перед присвоением любому потенциальному фактору роли вышестоящего регулятора потребуется контекстная валидация. Такая валидация должна включать ChIP-qPCR или ChIP-seq, репортерный анализ промотора, а также воздействие на факторы транскрипции с последующим измерением экспрессии MPO.

Результаты поиска взаимодействий «лекарство–ген» и аннотации ADMET также следует интерпретировать с осторожностью. DGIdb может возвращать гетерогенные химические ассоциации с генами, включая соединения, которые не являются селективными лигандами MPO и могут иметь ограниченную клиническую обоснованность или неблагоприятные токсикологические свойства36. Прогнозы ADMET предоставляют предварительные химические аннотации, но не подтверждают связывание с мишенью, активность, селективность, безопасность или терапевтическую эффективность41. Следовательно, текущие результаты на уровне отдельных соединений не должны использоваться для вывода о терапевтическом потенциале. Значимая трансляционная оценка потребует курируемого набора фармакологически релевантных ингибиторов или зондов MPO, сравнения с установленными соединениями, нацеленными на MPO, и валидации с помощью биохимических, клеточных и фармакологических анализов. При интерпретации результатов, связанных с лекарственными средствами, также следует учитывать контекстно-зависимую и потенциально двойственную роль MPO при раке. MPO может способствовать процессам, стимулирующим рост опухоли, посредством окислительного стресса, генерации активных форм кислорода, повреждения ДНК, хронического воспаления и ремоделирования микроокружения опухоли. В то же время экспрессия MPO в общих наборах данных опухоли может отражать инфильтрацию нейтрофилами или другими миелоидными иммунными клетками, что в некоторых контекстах может быть связано с иммуноактивным микроокружением и более благоприятными клиническими исходами39,42. Таким образом, биологическая интерпретация MPO зависит от типа опухоли, клеточного источника, стадии заболевания и состава иммунных клеток.

Результаты анализа метилирования ДНК в локусе MPO также считались предварительными. Выбранные CpG-сайты продемонстрировали связь с выживаемостью в ходе анализа MethSurv, однако эти результаты требуют независимой валидации, прежде чем можно будет сделать прогностические или механистические выводы. Эпигенетическая регуляция MPO может взаимодействовать со связыванием факторов транскрипции и регуляцией на уровне хроматина, но подобные взаимодействия остаются спекулятивными при отсутствии функциональных данных по хроматину или данным о пертурбациях43.

К клиническому значению экспрессии MPO следует относиться с осторожностью. Полученные результаты не позволяют считать MPO клинически значимым биомаркером или маркером, который на данный момент мог бы определять выбор методов иммунотерапии при раке молочной железы. Скорее, MPO может отражать иммунный контекст, связанный с миелоидными клетками/нейтрофилами в микроокружении опухоли. В будущих исследованиях экспрессию MPO можно оценивать совместно с общепринятыми маркерами иммунотерапии, включая опухоль-инфильтрирующие лимфоциты, экспрессию PD-L1, экспрессию генов контрольных точек иммунного ответа, молекулярный подтип и валидированные иммунные сигнатуры. Прежде чем MPO можно будет использовать для стратификации пациентов или принятия решений об иммунотерапии, подобные анализы должны включать независимые когорты, многофакторные модели и наборы данных об ответе на лечение.

Несколько этапов рабочего процесса имеют решающее значение для воспроизводимости, включая согласованную предварительную обработку данных TCGA-BRCA, группировку на MPO-high/MPO-low на основе медианы только по опухолевым образцам, предопределенные статистические пороги и коррекцию на множественное тестирование, алгоритмы обогащения иммунными клетками и наборы сигнатур, контроль качества и аннотацию данных одного-клеточного секвенирования, расширение окрестности MPO на основе KNN, а также исследовательскую обработку результатов виртуального нокдауна и данных DGIdb/ADMET. Изменения этих параметров могут повлиять на последующие результаты и их интерпретацию; следовательно, они должны быть тщательно зафиксированы и воспроизведены. При поиске и устранении неисправностей в случае получения противоречивых результатов следует проверить источник образцов, нормализацию экспрессии, порог группировки, коррекцию на множественное тестирование, наборы сигнатур иммунных клеток, контроль качества и аннотацию одного-клеточных данных, определение окрестности KNN, пороги виртуального нокдауна, пороги обогащения и гетерогенность записей о соединениях в DGIdb/ADMET.

Следует признать ряд ограничений данного исследования. Во-первых, исследование основывалось на ретроспективном анализе общедоступных баз данных с использованием TCGA-BRCA и общедоступных данных секвенирования единичных клеток, и, следовательно, может быть подвержено влиянию гетерогенности когорты, различий в источниках образцов, пакетных эффектов, неполной клинической аннотации и различий в составе опухоли. Во-вторых, представленные результаты получены главным образом на основе транскриптомных ассоциаций и анализа in silico и не имеют прямой экспериментальной проверки. Таким образом, наблюдаемые связи между экспрессией MPO, иммунными/миелоидными характеристиками, аннотациями метилирования, потенциальными транскрипционными факторами и результатами виртуального нокдауна не должны интерпретироваться как причинно-следственные механизмы. В-третьих, детектирование MPO в наборе данных единичных клеток было разреженным: до расширения окрестности на основе метода KNN было обнаружено всего 85 MPO-положительных клеток. Расширенный подмножество окрестности MPO может включать клетки с низкой или невыявляемой экспрессией MPO и не должно рассматриваться как чистая MPO-положительная популяция. В-четвертых, поскольку MPO преимущественно ассоциирован с нейтрофилами и другими клетками миелоидного ряда, MPO-связанные сигналы в данных bulk RNA-seq могут быть обусловлены обилием иммунных клеток, чистотой опухоли и клеточным составом, а не отражать внутреннюю активность опухолевых клеток. Наконец, поиск лекарственных средств и генов на основе DGIdb и аннотация ADMET носили исключительно исследовательский характер химической аннотации. Эти результаты не подтверждают ингибирование MPO, связывание с мишенью, селективность, безопасность, терапевтическую эффективность или клиническую применимость. Для подтверждения биологической и клинической значимости этих выводов необходимы будущие исследования с использованием независимых когорт, валидации на пространственном уровне или уровне белков, а также функциональные эксперименты.

Резюмируя, текущий анализ общедоступных наборов данных подтверждает связь между экспрессией MPO и иммунными/миелоидными транскрипционными признаками при раке молочной железы, при этом более высокая экспрессия MPO ассоциируется с более длительным интервалом до прогрессирования в анализируемой когорте. Данные результаты носят предварительный характер и служат для формулирования гипотез. Они не доказывают, что MPO причинно регулирует иммунное микроокружение опухоли, что MYC функционально регулирует MPO или что выявленные соединения имеют терапевтическое значение. Основным вкладом данного исследования являются воспроизводимый вычислительный рабочий процесс и набор проверяемых гипотез, требующих валидации на внешних когортах и экспериментального подтверждения.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в данной работе. Инструмент редактирования языка на базе ИИ использовался исключительно для улучшения английского языка и удобочитаемости текста в процессе пересмотра рукописи. Инструмент не использовался для разработки дизайна исследования, анализа данных, создания рисунков, интерпретации результатов, подбора литературы или формулирования научных выводов. Все анализы, результаты, интерпретации, ссылки и окончательный текст были тщательно проверены, отрецензированы и одобрены авторами, которые несут полную ответственность за содержание рукописи.

Благодарности

Авторы выражают благодарность за финансовую поддержку, предоставленную Научно-исследовательским фондом Госпиталя аэрокосмического центра (YN202530).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
CellChatR-пакет/Open sourcehttps://github.com/sqjin/CellChatАнализ межклеточного взаимодействия
ChIP-AtlasПубличная база данныхhttps://chip-atlas.org/Скрининг мишеней TF; обновление 2021 
clusterProfilerBioconductorhttps://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/Анализ обогащения GO/KEGG; v4.4.4
CytoscapeCytoscape Consortiumhttps://cytoscape.org/Визуализация сетей и анализ топологии
DGIdbВашингтонский университет/Публичная база данныхhttps://www.dgidb.org/Поиск взаимодействий лекарственное средство — ген
GDC/TCGA-BRCAНациональный институт ракаhttps://portal.gdc.cancer.gov/Источник данных объемной транскриптомики и клинических данных
Gene Expression Omnibus: GSE161529NCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/Источник набора данных одноклеточного секвенирования
GSEA/MSigDBBroad Institutehttps://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdbАнализ обогащения наборов генов и справочник наборов генов; версия 3.0 
GSVABioconductorhttps://bioconductor.org/packages/GSVA/Оценка вариации наборов генов/скоринг на основе ssGSEA; версия 1.46.0
GTRDПубличная база данныхhttp://gtrd.biouml.org/Скрининг мишеней TF; 2021 
KnockTFПубличная база данныхhttp://www.licpathway.net/KnockTF/index.htmlРесурс по пертурбации TF; версия 2.0 
RR Foundation for Statistical Computinghttps://www.r-project.org/Среда для статистических вычислений
scTenifoldKnkR-пакет/Open sourcehttps://github.com/cailab-tamu/scTenifoldKnkАнализ виртуального нокдауна
SeuratR-пакет/Open sourcehttps://satijalab.org/seurat/Препроцессинг и кластеризация данных одноклеточного секвенирования
STRINGELIXIR/Публичная база данныхhttps://string-db.org/Анализ белок-белковых взаимодействий; v11 
SwissADMEШвейцарский институт биоинформатики SIBhttp://www.swissadme.ch/Оценка лекарственно-подобных свойств; выпуск 2017/веб-инструмент 
TIMERПубличный веб-ресурсhttps://timer.cistrome.org/Анализ иммунной инфильтрации; TIMER2.0 
UCSC Xena или связанный портал TCGAUCSChttps://xenabrowser.net/Исследовательский доступ к данным/валидация 

Ссылки

  1. Onkar SS, et al. The great immune escape: Understanding the divergent immune response in breast cancer subtypes. Cancer Discov. 2023;13(1):23-40.
  2. Quail DF, Park M, Welm AL, Ekiz HA. Breast cancer immunity: It is time for the next chapter. Cold Spring Harb Perspect Med. 2024;14(2):a041324.
  3. Valadez-Cosmes P, Raftopoulou S, Mihalic ZN, Marsche G, Kargl J. Myeloperoxidase: Growing importance in cancer pathogenesis and potential drug target. Pharmacol Ther. 2022;236:108052.
  4. Ohshima H, Tatemichi M, Sawa T. Chemical basis of inflammation-induced carcinogenesis. Arch Biochem Biophys. 2003;417(1):3-11.
  5. Davies MJ, Hawkins CL. The role of myeloperoxidase in biomolecule modification, chronic inflammation, and disease. Antioxid Redox Signal. 2020;32(13):957-981.
  6. Gomez-Mejiba SE, et al. Myeloperoxidase-induced genomic DNA-centered radicals. J Biol Chem. 2010;285(26):20062-20071.
  7. Eruslanov EB, et al. Tumor-associated neutrophils stimulate T cell responses in early-stage human lung cancer. J Clin Invest. 2014;124(12):5466-5480.
  8. Däster S, et al. Absence of myeloperoxidase and CD8 positive cells in colorectal cancer infiltrates identifies patients with severe prognosis. Oncoimmunology. 2015;4(12):e1050574.
  9. Droeser RA, et al. High myeloperoxidase positive cell infiltration in colorectal cancer is an independent favorable prognostic factor. PLoS One. 2013;8(5):e64814.
  10. Gerber-Ferder Y, et al. Breast cancer remotely imposes a myeloid bias on haematopoietic stem cells by reprogramming the bone marrow niche. Nat Cell Biol. 2023;25(12):1736-1745.
  11. Xu H, et al. Single-cell transcriptomics reveals CCL3+ classical monocyte subset linked to autoimmune pathogenesis. J Inflamm Res. 2025;18:16273-16291.
  12. Jiahao S, Cong W, Xin L, Xu C, Wenpeng X, et al. BCAT1 mediates the carcinogenic effects of environmental bisphenol exposure: mechanistic discoveries in osteosarcoma and pan-cancer analysis. Mol Divers. 2026. doi:10.1007/s11030-026-11566-7.
  13. Huo Z, Sun W, Lou C, Yang T. Integrated single-cell and spatial mapping coupled with machine learning unveils core stemness landscapes and regulatory drivers in triple-negative breast cancer. Discov Oncol. 2026;17(1):602.
  14. Das SC, et al. Comprehensive bioinformatics and machine learning analyses for breast cancer staging using TCGA dataset. Brief Bioinform. 2024;26(1):bbae628.
  15. Szklarczyk D, et al. STRING v11: protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic Acids Res. 2019;47(D1):D607-D613.
  16. Yu G, Wang LG, Han Y, He QY. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. OMICS. 2012;16(5):284-287.
  17. Ashburner M, et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. Nat Genet. 2000;25(1):25-29.
  18. Kanehisa M, Goto S. KEGG: Kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic Acids Res. 2000;28(1):27-30.
  19. Chen GY, et al. Integrating network pharmacology and experimental validation to explore the key mechanism of gubitong recipe in the treatment of osteoarthritis. Comput Math Methods Med. 2022;2022:7858925.
  20. Chen GY, et al. Prediction of Rhizoma Drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evid Based Complement Alternat Med. 2021;2021:5233462.
  21. Liberzon A, et al. Molecular signatures database MSigDB 3.0. Bioinformatics. 2011;27(12):1739-1740.
  22. Subramanian A, et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(43):15545-15550.
  23. Li B, et al. Comprehensive analyses of tumor immunity: implications for cancer immunotherapy. Genome Biol. 2016;17(1):174.
  24. Li T, et al. TIMER: A web server for comprehensive analysis of tumor-infiltrating immune cells. Cancer Res. 2017;77(21):e108-e110.
  25. Li T, et al. TIMER2.0 for analysis of tumor-infiltrating immune cells. Nucleic Acids Res. 2020;48(W1):W509-W514.
  26. Hänzelmann S, Castelo R, Guinney J. GSVA: gene set variation analysis for microarray and RNA-seq data. BMC Bioinformatics. 2013;14:7.
  27. Modhukur V, et al. MethSurv: a web tool to perform multivariable survival analysis using DNA methylation data. Epigenomics. 2018;10(3):277-288.
  28. Feng C, et al. KnockTF: a comprehensive human gene expression profile database with knockdown/knockout of transcription factors. Nucleic Acids Res. 2020;48(D1):D93-D100.
  29. Feng C, et al. KnockTF 2.0: a comprehensive gene expression profile database with knockdown/knockout of transcription co-factors in multiple species. Nucleic Acids Res. 2024;52(D1):D183-D193.
  30. Oki S, et al. ChIP-Atlas: a data-mining suite powered by full integration of public ChIP-seq data. EMBO Rep. 2018;19(12):e46255.
  31. Zou Z, Ohta T, Miura F, Oki S. ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data. Nucleic Acids Res. 2022;50(W1):W175-W182.
  32. Kolmykov S, et al. GTRD: an integrated view of transcription regulation. Nucleic Acids Res. 2021;49(D1):D104-D111.
  33. Yevshin I, Sharipov R, Kolmykov S, Kondrakhin Y, Kolpakov F. GTRD: a database on gene transcription regulation—2019 update. Nucleic Acids Res. 2019;47(D1):D100-D105.
  34. Tang D, et al. SRplot: A free online platform for data visualization and graphing. PLoS One. 2023;18(11):e0294236.
  35. Wang Y, et al. Immunological profiling of rheumatoid factor-positive primary Sjögren's syndrome by single-cell RNA sequencing. Front Immunol. 2026;17:1822615.
  36. Daina A, Michielin O, Zoete V. SwissADME: a free web tool to evaluate pharmacokinetics, drug-likeness and medicinal chemistry friendliness of small molecules. Sci Rep. 2017;7:42717.
  37. Lin W, Chen H, Chen X, Guo C. The roles of neutrophil-derived myeloperoxidase MPO in diseases: The new progress. Antioxidants. 2024;13(1):132.
  38. Odobasic D, et al. Neutrophil myeloperoxidase regulates T-cell-driven tissue inflammation in mice by inhibiting dendritic cell function. Blood. 2013;121(20):4195-4204.
  39. Zeindler J, et al. Infiltration by myeloperoxidase-positive neutrophils is an independent prognostic factor in breast cancer. Breast Cancer Res Treat. 2019;177(3):581-589.
  40. Osorio D, et al. scTenifoldKnk: An efficient virtual knockout tool for gene function predictions via single-cell gene regulatory network perturbation. Patterns. 2022;3(3):100434.
  41. Li X, Tang L, Li Z, Qiu D, Yang Z, et al. Prediction of ADMET properties of anti-breast cancer compounds using three machine learning algorithms. Molecules. 2023;28(5):2326.
  42. Scandolara TB, et al. Anti-neutrophil antibodies anti-MPO-ANCAs are associated with poor prognosis in breast cancer patients. Immunobiology. 2020;225(6):152011.
  43. Gilbert J, Gore SD, Herman JG, Carducci MA. The clinical application of targeting cancer through histone acetylation and hypomethylation. Clin Cancer Res. 2004;10(14):4589-4596.

Перепечатки и разрешения

Теги

TCGA BRCA
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.