Методическая статья

Мультимодальная платформа для оценки кокультивирования иммунных клеток с органоидами опухолей толстой кишки, полученными от пациентов

114 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71204

⸱

3 сентября 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Montefiore Einstein Comprehensive Cancer Center, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Oncology and Molecular Pharmacology, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Cell Biology, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Surgery, Albert Einstein College of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данном протоколе описывается создание органоидов опухоли толстой кишки, полученных от пациентов, в совместной культуре с аутологичными лимфоцитами с последующим воздействием терапевтических малых молекул и ингибиторов иммунных контрольных точек для оценки реактивности Т-клеток и эффективности лечения.

Аннотация

Т-клетки играют ключевую роль в иммунотерапии рака, и понимание их взаимодействия с опухолями крайне важно для разработки новых методов иммунотерапии. В данном протоколе приводится пошаговый рабочий процесс создания органоидов, полученных от пациентов с колоректальным раком (PDO), из нашего биобанка и разработки систем аутологичного совместного культивирования PDO и Т-клеток. Используя окрашивание Annexin V NIR и расщепленной каспазы-3, мы стандартизировали протоколы проточной цитометрии для поверхностного и внутриклеточного окрашивания с целью оценки реактивности и цитотоксичности Т-клеток, а также уничтожения опухолевых органоидов. В дополнение к анализу методом проточной цитометрии, протокол включает методологические подходы для функциональных анализов, таких как тест ELISpot для количественного определения секреции гранзима B и перфорина, а также прижизненную визуализацию для мониторинга Т-клеточного уничтожения опухоли в динамике с помощью детектирования апоптоза на основе Annexin V. В данном рабочем процессе также подробно описана настройка условий совместного культивирования, включая введение таргетных ингибиторов и ингибиторов контрольных точек иммунного ответа как в режиме монотерапии, так и при комбинированном лечении. Представлены рекомендации по выбору и применению ключевых иммунологических и опухоле-ассоциированных маркеров, включая CD137 для оценки реактивности Т-клеток, CD107a для дегрануляции Т-клеток, каспазу-3 для апоптоза опухоли и Ki67 для пролиферации опухоли. В совокупности эта работа представляет собой комплексную и воспроизводимую основу для создания органоидов колоректального рака, культивирования и экспансии аутологичных Т-клеток, организации совместного культивирования, введения терапевтических воздействий и последующего анализа с использованием проточной цитометрии, ELISpot, конфокальной микроскопии и прижизненной визуализации.

Введение

Колоректальный рак (КРР) остается одной из ведущих причин смертности от онкологических заболеваний во всем мире, несмотря на успехи в ранней диагностике и применении мультимодальной терапии1. Основной проблемой при улучшении результатов лечения пациентов является нехватка доклинических моделей, которые бы точно воспроизводили сложную архитектуру, внутриопухолевую гетерогенность, опухолево-иммунные взаимодействия и терапевтические ответы, наблюдаемые при КРР у людей2,3,4,5,6. Традиционные модели, включая генетически модифицированные мышиные модели (GEMM) и ксенографты, полученные из опухолей пациентов (PDX), значительно продвинули исследования КРР, но имеют существенные ограничения. Модели GEMM часто не отражают разнообразия опухолей человека и развиваются в микроокружении мышей, которое существенно отличается от физиологии человека. Аналогично, модели PDX сохраняют аспекты гетерогенности опухоли, но являются дорогостоящими, требуют много времени, зависят от иммунодефицитных мышей и ограничены в возможности изучения специфических иммунных ответов человека из-за межвидовых различий7,8. Кроме того, ужесточение ограничений на использование мелких лабораторных животных подчеркивает необходимость поиска более релевантных для человека и этически приемлемых альтернатив.

В последние годы органоиды, полученные из клеток пациентов (PDO), стали преобразующей платформой для трансляционных исследований рака. Органоиды колоректального рака (КРР), созданные из свежих операционных или биопсийных образцов, сохраняют гистологические, генетические и фенотипические характеристики первичных опухолей, включая клональное разнообразие и клеточные состояния, отвечающие на терапию. Эти свойства делают PDO ценными инструментами для моделирования заболеваний, функциональной геномики, поиска биомаркеров и персонализированной медицины7,8,9,10,11. Важно отметить, что включение компонентов иммунной системы человека в системы органоидов еще больше расширило возможности их применения. Сокультивирование органоидов КРР с мононуклеарными клетками периферической крови (PBMCs) или модифицированными популяциями иммунных клеток позволяет исследовать опухолево-иммунные взаимодействия, механизмы уклонения от иммунного ответа, презентацию антигенов и ответы на иммунотерапию в физиологически релевантной системе12. Такие модели позволяют оценивать эффективность ингибиторов контрольных точек, CAR-T/TCR-терапии и биспецифических антител, предоставляя данные о прогностических биомаркерах и механизмах резистентности.

Помимо иммунотерапии, органоиды колоректального рака (КРР) приобретают все большее значение для скрининга лекарственных препаратов и применения в прецизионной онкологии. Культуры, полученные от пациентов, можно тестировать с применением химиотерапевтических и таргетных препаратов для прогнозирования индивидуальных ответов на лечение; при этом в ряде исследований была продемонстрирована корреляция между ответом органоидов и клиническими исходами. Таким образом, данные системы представляют собой масштабируемую и ориентированную на пациента альтернативу традиционным методам с использованием животных моделей10,13,14,15,16,17,18.

В данной работе представлен доступный и масштабируемый протокол создания органоидов колоректального рака (КРР), полученных от пациентов, и их интеграции в системы сокультивирования с иммунными клетками для трансляционных и доклинических исследований. Ткани опухоли подвергаются ферментативной диссоциации и заключаются в трехмерный внеклеточный матрикс при оптимизированных условиях культивирования, обеспечивающих сохранение гетерогенности опухоли и дифференцировки клеточных линий. Полученные органоиды можно экспансировать, криоконсервировать, подвергать генетическим манипуляциям и использовать для последующих исследований, включая молекулярную характеристику, изучение влияния лекарственных препаратов и иммунный профилинг. Кроме того, сокультивирование с PBMC позволяет оценить иммуноопосредованную цитотоксичность, чувствительность к блокаде контрольных точек и опухолеспецифическую иммунную активацию.

Далее мы описываем протоколы обработки тканей, оценки качества органоидов, проточной цитометрии, иммунофлуоресцентной визуализации и иммунного мониторинга методом ELISpot. В совокупности эти системы на основе органоидов представляют собой этически устойчивую и клинически значимую платформу для изучения биологии колоректального рака (КРР), терапевтической резистентности, гетерогенности опухоли и ответов на иммунотерапию. Текущие достижения в области инженерии органоидов и интеграции микроокружения позволяют этим моделям оставаться краеугольным камнем будущих исследований КРР и прецизионной онкологии.

Протокол

Все пациенты предоставили информированное согласие в соответствии с одобренным IRB протоколом биобанка комплексного онкологического центра Montefiore Einstein (Einstein IRB# 2021-13730). Клиническая координация и регуляторная поддержка обеспечивались Офисом клинических исследований в онкологии (CCTO). Ткани опухолей собирали после стандартной хирургической резекции и патологоанатомического исследования, затем подвергали формалиновой фиксации, использовали для создания органоидов из клеток пациента или подвергали криоконсервации в DMEM с 20% FBS и 10% DMSO. Все препараты реагентов приведены в Таблице 1.

1. Создание культуры органоидов опухоли из биоптата или ткани после резекции (4 ч)

  1. Поместите свежеполученную ткань опухоли в стерильную чашку Петри и промойте ее буфером для промывки органоидов 5 раз, по 5 минут каждый раз на льду. С помощью стерильного лезвия бритвы или тонких игл измельчите ткань на небольшие кубики размером примерно 1–2 мм3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время диссекции поддерживайте ткань во влажном состоянии, используя ледяной фосфатно-солевой буфер (PBS), чтобы предотвратить высыхание.
  2. Перенесите вырезанные фрагменты ткани в пробирку Falcon объемом 15 мл, однократно промойте фосфатно-солевым буфером Дульбекко (DPBS) и центрифугируйте при 200 x г в течение 5 мин при комнатной температуре (RT). Осторожно удалите супернатант, затем перенесите кубики ткани в стерильный 6-луночный планшет или чашку Петри диаметром 35 мм.
  3. С помощью стерильных угловых автоклавированных ножниц измельчите ткань до более мелких фрагментов. Приготовьте раствор 1X Gentle Collagenase/Hyaluronidase, разбавив 1 мл препарата в 9 мл DPBS. Добавьте 10 µL Y-27632 (ингибитора ROCK) и 20 µL примоцина.
  4. Добавьте предварительно нагретый раствор для диссоциации в пробирку объемом 15 мл с кусочками ткани. Повторно смочите наконечник дозатора P1000 перед перемешиванием кусочков ткани путем аспирации и выдавливания жидкости.
  5. Инкубируйте пробирку объемом 15 мл в 37 °C в качающейся водяной бане в течение 30 мин, переворачивая каждые 10 мин. Дайте фрагментам ткани осесть, перенесите основную часть раствора для дигестии в новую пробирку и центрифугируйте при 500 x г в течение 5 мин при комнатной температуре.
  6. Добавьте 1 мл среды DMEM в исходную пробирку объемом 15 мл и интенсивно пропипетируйте с использованием наконечника P1000 с покрытием, чтобы механически диссоциировать фрагменты ткани и высвободить дополнительные крипты.
  7. Проверяйте прогресс под микроскопом, чтобы контролировать, распадается ли ткань на одиночные клетки или небольшие кластеры. Перенесите 10–20 µL перелейте DMEM с фрагментами ткани в чашку Петри и исследуйте под микроскопом на наличие крипт.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации варьируется в зависимости от типа образца. Для биоптатов время инкубации составляет 15–30 мин, а для хирургических резекций она составляет 45–60 мин.
  8. Как только крипты будут обнаружены (или через 30 мин для биоптатов/60 мин для резекционных образцов), остановите процесс переваривания, добавив равный объем ледяной базальной среды, и центрифугируйте при 500 x г в течение 5 мин при комнатной температуре.
  9. Промойте осадок DPBS для его ресуспендирования, затем снова центрифугируйте. При необходимости перенесите суспензию в коническую пробирку и центрифугируйте при 300 x г в течение 5 мин при комнатной температуре для осаждения клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для При CRC лизис эритроцитов обычно не требуется.
  10. Если осадок имеет красный цвет, проведите лизис эритроцитов путем инкубации в 5 мл буфера для лизиса эритроцитов в течение 15 мин при комнатной температуре. После лизиса немедленно заполните пробирку раствором PBS и снова центрифугируйте.
  11. Однократно промойте осадок с помощью DPBS. Центрифугируйте при Центрифугируйте при 300 x g в течение 5 мин при комнатной температуре, затем удалите супернатант. Ресуспендируйте осадок в небольшом объеме среды. Подсчитайте количество живых клеток с помощью гемоцитометр с использованием метода исключения трипанового синего или автоматический счетчик клеток
  12. Ресуспендируйте клетки в охлажденный до температуры льда Matrigel (матрикс базальной мембраны) (Опционально: концентрация ~1,5–3 x 10)4 клеток на 10 µL среда). Смешайте суспензию клеток с матрикс базальной мембраны с использованием охлажденных наконечников с широким отверстием (в некоторых лабораториях используют соотношение матрицы базальной мембраны и полной среды для органоидов 1:1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Храните матрикс базальной мембраны и все смеси ледяной для предотвращения преждевременной полимеризации.
  13. Планшет50 µL купола из смеси клеток и матрикса базальной мембраны в каждую лунку предварительно прогретого стерильного культуральная пластина на 24 лунки. Инкубируйте пластину при 37 °C в течение 10–12 мин, чтобы матрикс базальной мембраны затвердел, образовав купол (переверните планшет вверх дном).
  14. После затвердевания матрикса базальной мембраны переверните планшет в вертикальное положение. Осторожно добавьте 500 µL/well среды PDO, содержащей ингибитор Rock (1:1000) и Primocin (1:500).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте Primocin во всех культуральных средах до создания криобанка органоидов для предотвращения контаминации.
  15. Замените среду для органоидов дважды в неделю добавлением свежей полной среды для органоидов. Регулярно контролируйте рост органоидов под микроскопом.

2. Выделение ПБК человека из крови (2 ч)

  1. Распределите по 5 мл Histopaque в стерильные пробирки Falcon объемом 15 мл, доведите до комнатной температуры и осторожно наслаивайте сверху равный объем свежей человеческой крови (до 5 мл). Медленно вносите кровь по стенке пробирки над слоем Ficoll, не нарушая целостности границы раздела фаз; общий объем в одной пробирке не должен превышать 10 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения оптимального разделения перед центрифугированием необходимо поддерживать четкую границу между слоями Ficoll и крови.
  2. При использовании нескольких пробирок правильно сбалансируйте их в центрифуге. Избегайте перемешивания или встряхивания. интерфейс кровь–Ficoll должен оставаться неповрежденным.
  3. Центрифугируйте при 1500-кратное увеличение г в течение 15 мин при комнатной температуре. Используйте 0 настроек торможения, чтобы предотвратить нарушение градиента. После центрифугирования сформируются отчетливые слои: а) нижний слой эритроцитов, б) средний слой лейкоцитарного осадка (PBMC) и в) верхний слой плазмы. Осторожно аспирируйте и удалите плазму до тех пор, пока не станет виден слой лейкоцитарного осадка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно перемещайте пробирку, чтобы не повредить слой МБК (мононуклеарных клеток периферической крови).
  4. С помощью новой стерильной пипетки осторожно аспирируйте слой лейкоцитарного слоя (баффи-кот) содержащий PBMC, и перенесите клетки в новую стерильную пробирка Falcon объемом 15 мл. Для удаления Фиколла и тромбоцитов дважды промойте клетки 10 мл PBSA (ФСБ с добавлением 0,1% БСА) путем центрифугирования при 1000 x г в течение 7 мин при комнатной температуре, осторожно удаляя супернатант после каждой промывки.
  5. Для удаления остаточных тромбоцитов один раз промойте PBSA и центрифугируйте при 200 x г в течение 7 мин при комнатной температуре. Осторожно удалите супернатант. Если осадок имеет красный цвет, проведите лизис эритроцитов, инкубировав в 5 мл буфера для лизиса эритроцитов при 37 °C в течение 5 мин, затем промыть раствором PBSA и центрифугировать при 200 x г в течение 7 мин при комнатной температуре.
  6. Ресуспендируйте осадок PBMC в 2 мл DPBS или культуральной среды и определите количество жизнеспособных клеток, используя трипановый синий с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток. Если клетки не будут использованы немедленно, криоконсервируйте PBMC в концентрации 5–10 x 106 клеток/мл в 90% FBS и 10% DMSO. Постепенно заморозить при –80 °C в течение ночи, затем перенести в жидкий азот для длительного хранения.
  7. Экспансия PBMC (7–12 дней):
    1. Осадите клетки путем центрифугирования при 500 x г в течение 5 мин при комнатной температуре. Ресуспендировать в концентрации 5 x 105 клеток/лунки в среде для экспансии Т-клеток и активируйте их с помощью коктейля CD3/CD28.
    2. Стимулируйте клетки IL-2 в концентрации 500 МЕ/мл и инкубируйте в течение 3 дней. На 3-й день перемешайте и подсчитайте количество клеток, затем расширьте культуру, добавив среду для экспансии Т-клеток с добавлением IL-2.
    3. Доведите концентрацию клеток до 1–2,5 x 10^5 клеток/мл в полной среде для экспансии Т-клеток (T Cell Expansion Medium), инкубируйте в течение 2 дней и контролируйте жизнеспособность каждые 2–3 дня в процессе экспансии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Заменяйте на свежую теплую полную среду каждые 2–3 дня (не превышайте >(3 дня). ПБМК могут быть криоконсервированы в среде для заморозки Т-клеток для последующего использования.

3. Сокультивирование органоидов (4 дня):

  1. Подготовка и контроль качества:
    1. Перед совместным культивированием убедитесь, что органоиды здоровы, не загрязнены и фенотипически охарактеризованы. Получите PBMC от доноров, давших согласие, или из коммерческих источников, и перед использованием подтвердите их жизнеспособность и базовый фенотип.
    2. Определите, будут ли PBMC использоваться свежими, отдохнувшими или предварительно активированными, а также являются ли они аутологичными или аллогенными. Перед совместным культивированием оцените жизнеспособность органоидов, однородность их размера и экспрессию маркеров.
    3. Подтвердите жизнеспособность PBMC и базовый иммунный состав (маркеры CD3, CD4, CD8, NK-клеток, моноциты), запишите метаданные донора.
  2. Изоляция органоидов для совместного культивирования с PBMC:
    1. Удалите культуральную среду и добавьте в каждую лунку предварительно нагретый раствор для восстановления клеток, чтобы растворить внеклеточный матрикс и высвободить органоиды. Осторожно ресуспендируйте органоиды наконечником пипетки с широким отверстием и инкубируйте короткое время до растворения матрикса и высвобождения органоидов.
    2. Перенесите суспензию в пробирку для сбора, при необходимости добавьте 0,5M EDTA и доведите объем сбалансированным буфером. Центрифугируйте для осаждения органоидов, удалите супернатант, промойте базовой средой с добавками (HEPES и Glutamax) и антибиотиками, затем снова центрифугируйте для повторного осаждения.
    3. Ресуспендируйте органоиды в полной культуральной среде, высейте в планшет, обработанный для тканевых культур, и дайте восстановиться в течение ~24 ч перед дальнейшей обработкой.
  3. Параллельное восстановление PBMC:
    1. Быстро разморозьте криоконсервированные PBMC стандартным способом и немедленно разбавьте их в предварительно нагретой среде для экспансии Т-клеток, чтобы минимизировать осмотический шок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При разморозке типична частичная потеря клеток; предварительный нагрев среды улучшает восстановление.
    2. Центрифугируйте размороженные PBMC при 400 x g для осаждения клеток, удалите среду для заморозки и коротко инкубируйте в среде для экспансии Т-клеток, содержащей бензоназу, чтобы уменьшить агрегацию клеток и улучшить качество суспензии одиночных клеток.
    3. Промойте и повторно осадите PBMC в свежей среде для экспансии, затем ресуспендируйте в среде для культуры Т-клеток с добавлением цитокинов (например, IL-2) для поддержания жизнеспособности и восстановления. Высейте PBMC в многолуночный планшет для периода отдыха в течение ночи перед совместным культивированием.
  4. Подготовка перед совместным культивированием (за 1 день до начала):
    1. Опционально обработайте органоиды иммуностимулирующим цитокином (например, IFN-γ) перед совместным культивированием для усиления путей презентации антигена.
    2. Подготовьте планшет для совместного культивирования минимум за 24 ч, покрыв лунки костимулирующим антителом (например, анти-CD28), и храните при 4 °C. Перед использованием удалите несвязавшееся антитело и дважды промойте лунки DPBS.
  5. Диссоциация органоидов до одиночных клеток (в день эксперимента по совместному культивированию):
    1. Соберите предварительно стимулированные органоиды, осадите и удалите супернатант, затем ресуспендируйте в реагенте для ферментативной диссоциации (например, TrypLE) вместе с любыми адгезивными клетками, чтобы восстановить всю популяцию клеток.
    2. Инкубируйте при осторожном перемешивании и контролируйте микроскопически до тех пор, пока большинство органоидов не диссоциируют до одиночных клеток или небольших кластеров, избегая избыточного переваривания.
    3. Нейтрализуйте реагент для диссоциации буфером, осадите клетки, удалите супернатант и ресуспендируйте в среде для культуры Т-клеток для подсчета и смешивания.
  6. Подсчет клеток и подготовка к совместному культивированию:
    1. Осторожно перемешайте клеточную суспензию и определите число жизнеспособных клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика с красителем для определения жизнеспособности. Доведите соотношение опухолевых клеток и PBMC до желаемой плотности в среде для Т-клеток.
    2. Подготовьте PBMC путем осаждения, ресуспендирования в свежей среде и определения числа жизнеспособных клеток. Промойте и ресуспендируйте PBMC в среде для Т-клеток с добавлением цитокинов (например, IL-2) и, при необходимости, опциональных иммуномодулирующих антител (например, анти-PD-1).
  7. Проведение совместного культивирования:
    1. Смешайте диссоциированные опухолевые клетки и PBMC в желаемом соотношении эффекторных клеток к клеткам-мишеням. Промойте лунки, покрытые анти-CD28, перед добавлением клеток, не допуская высыхания лунок.
    2. Высейте смесь органоидов и PBMC в требуемом объеме для анализа и инкубируйте в стандартных условиях культивирования. По мере необходимости обновляйте или разделяйте культуры в ходе эксперимента.
  8. Экспериментальный дизайн и контроли (для стратегии лечения):
    1. Используйте систему совместного культивирования для оценки того, как препараты (например, ингибиторы контрольных точек или малые молекулы) модулируют ответы PBMC на опухолевые органоиды.
    2. Используйте биологические повторности (несколько линий органоидов и доноров PBMC) и технические повторности (минимум три лунки на каждое условие).
    3. Включите контроли: только органоиды, только PBMC (плацебо или активированные), органоиды + PBMC (плацебо), органоиды + препарат и PBMC + препарат.
  9. Типовые временные рамки совместного культивирования:
    1. Анализируйте совместные культуры через 24, 48 и 72 ч после инициации для оценки иммунной активации, пролиферации, секреции цитокинов, апоптоза и уничтожения опухолевых клеток.
    2. Оценивайте ранние маркеры активации и секрецию цитокинов через 24 ч, а цитотоксичность, пролиферацию и маркеры активации/истощения через 48–72 ч с помощью проточной цитометрии, визуализации или тестов на жизнеспособность.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки хронической активации, иммунного истощения или долгосрочного действия препаратов могут быть включены более поздние временные точки (например, 5–7 дни).
  10. Иммунофлуоресцентное окрашивание органоидов:
    1. Промойте стекла в PBS в течение 5 мин и зафиксируйте их в 4% растворе параформальдегида (PFA) в течение 20 мин при комнатной температуре. После фиксации дважды промойте стекла в PBS по 5 мин каждое.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте гидратацию органоидов на протяжении всего процесса окрашивания. При необходимости стекла можно хранить в PBS при комнатной температуре до 3 ч, но избегайте хранения в PBS в течение ночи.
    2. Пермеабилизируйте органоиды 0,1–0,5% раствором Triton X-100 в PBS в течение 15–20 мин при комнатной температуре для обеспечения внутриклеточного и ядерного окрашивания при сохранении структуры органоидов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте избыточной пермеабилизации, так как это может нарушить структуру органоидов. Правильная пермеабилизация обеспечивает равномерное цитоплазматическое и ядерное окрашивание, сохраняя морфологию для визуализации.
    3. Дважды промойте стекла 1-кратным IF-буфером и заблокируйте 1–10% раствором BSA (или сывороткой соответствующего вида) в IF-буфере в течение 60–120 мин при комнатной температуре для снижения неспецифического окрашивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: BSA подходит для общего блокирования, но для окрашивания специфических маркеров рекомендуется использовать сыворотку соответствующего вида, чтобы снизить неспецифическое связывание и повысить специфичность сигнала.
    4. Трижды промойте стекла (по 5 мин) и инкубируйте с первичными антителами (10–50 µg/mL) в блокирующем буфере с 1% сыворотки в течение ночи при 4 °C во влажной камере.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Накройте стекла парафильмом для предотвращения испарения и оптимизируйте концентрацию первичных антител путем титрования для получения специфического окрашивания с минимальным фоном.
    5. Промойте стекла в 1-кратном IF-буфере 3 x 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Промывку следует оптимизировать для каждого конкретного антитела. При одновременном использовании более одного первичного антитела промывка должна быть стандартизирована.
    6. Инкубируйте стекла с органоидами с вторичными антителами, конъюгированными с флуорофором (1:200–1:500 в блокирующем буфере с 1% сыворотки) во влажной камере в течение ночи при 4 °C или в течение 2 ч при комнатной температуре в темноте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После добавления вторичного антитела все последующие этапы следует проводить в темноте, чтобы предотвратить фотовыцветание флуорофоров.
    7. Промойте стекла 1-кратным IF-буфером (2 x 5 мин), затем PBS (5 мин). Инкубируйте с DAPI (1 µg/mL) и антителами, конъюгированными с AlexaFluor-594 (20 µg/mL), в блокирующем буфере с 5% сыворотки в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте, затем промойте PBS (3 x 5 мин).
    8. Нанесите на стекла среду для монтажа и накройте покровным стеклом, аккуратно избегая образования пузырьков воздуха. Если используется среда для монтажа, содержащая DAPI, окрашивание DAPI можно пропустить. Для сканирования стекол используйте среду для жесткого монтажа.
    9. Дайте стеклам высохнуть при комнатной температуре в течение часа, храните при –20 °C и визуализируйте с помощью конфокальной микроскопии или сканера стекол.

4. Протокол проточной цитометрии и внутриклеточного окрашивания органоидов

  1. Осторожно аспирируйте среду для культивирования органоидов и аккуратно промойте органоиды один раз 1x PBS для удаления остатков среды и сывороточных белков. Высвободите органоиды из внеклеточного матрикса, используя холодный PBS или раствор для восстановления, и осторожно дозируйте пипеткой для разрушения матрикса, сводя к минимуму воздействие напряжений сдвига.
  2. Перенесите суспензию органоидов в центрифужную пробирку и осадите при 300 x г в течение 5 мин при 4 °Cи удалите супернатaнт. Ресуспендируйте осадок органоидов в 250–500 µL 0,05% раствора TrypLE для ферментативной диссоциации. Инкубируйте при 37 °C для эффективного расщепления межклеточных контактов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждые 5 минут осторожно перемешивайте суспензию путем постукивания и перемешивания пипеткой (всасыванием и вытеснением), контролируя процесс под микроскопом до получения суспензии одиночных клеток, избегая чрезмерного переваривания.
  3. Пропустите клеточную суспензию через 40 µm фильтр для клеток для удаления комков. Центрифугируйте клетки при 300 x г в течение 5 мин при 4 °C и ресуспендируйте в 1x PBS без Ca2+2+ / Mg2+ буфер
  4. Подсчитайте количество клеток и доведите их число до ~1 x 106 клеток/мл в буфере для окрашивания. Инкубируйте с Fc-блоком (1:200) и красителем жизнеспособности (например, Live/Dead Blue, 1:1000–1:3000) для снижения неспецифического связывания и идентификации живых и мертвых клеток.
  5. Инкубируйте клетки в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте, затем промойте один раз 1x PBS и один раз буфером для окрашивания.
  6. Подготовьте коктейль антител для окрашивания поверхности, смешав каждое антитело в окрашивающем буфере в оптимизированном рабочем разведении; рассчитайте общий объем, исходя из данных титрования. µL/test значения для основной смеси.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если ваша панель содержит несколько флуорохромов на основе полимеров (например, красители Brilliant Violet, Brilliant Ultraviolet или Brilliant Blue), добавьте буфер Brilliant Stain Buffer (BSB) в коктейль антител, чтобы уменьшить взаимодействие флуорохромов и улучшить разрешение сигнала. Добавьте BSB в соответствии с инструкциями производителя (обычно до конечной концентрации 1x), осторожно перемешайте и приготовьте мастер-микс для всех образцов (с избытком объема около 10%). Храните в защищенном от света месте на льду до использования.
  7. Добавьте коктейль из антител и инкубируйте в течение 30–50 мин при комнатной температуре в темноте. Промойте буфером для окрашивания и PBS (без Ca2+).2⁺/Мг2⁺), затем центрифугируйте при 500 x г в течение 5 мин. Приготовьте рабочий раствор для фиксации и пермеабилизации, разбавив концентрат разбавителем. Например, в соотношении 1 часть концентрата к 3 частям разбавителя (для получения 1x или указанной рабочей концентрации).
  8. Добавьте раствор для фиксации/пермеабилизации, чтобы полностью ресуспендировать клетки (~100–200 µL (на 1 млн клеток) и инкубировать в течение 15–20 мин при комнатной температуре или 2–8 °Cв защищенном от света месте. По истечении времени фиксации промойте клетки 1x буфером для пермеабилизации. Удалите супернатант. Повторите промывку еще как минимум один раз (в некоторых случаях дважды), чтобы удалить излишки фиксатора..
  9. Приготовьте коктейль для внутриклеточного окрашивания, разводя конъюгированные с флуорохромами антитела до оптимизированных концентраций в 1x буфере для пермеабилизации. Добавьте коктейль внутриклеточных антител к пермеабилизированным клеткам, включив в состав антитела к цитокинам, транскрипционным факторам или фосфорилированным белкам, в зависимости от целей исследования.
  10. Инкубируйте клетки в течение 2 ч при комнатной температуре в темноте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости время инкубации можно сократить до минимального значения, рекомендованного производителем, либо проводить инкубацию в течение ночи при 4 °C в темноте, чтобы не повлиять на качество окрашивания.
  11. Дважды промойте клетки 1x буфером для пермеабилизации и один раз — буфером для окрашивания, затем ресуспендируйте осадок в 250 мкл300 µL буфер для окрашивания.
  12. Пропустите суспензию через 40 µm сито для получения суспензии из отдельных клеток; образцы следует хранить на льду или при 4 °Cв защищенном от света месте до проведения анализа. Избегайте длительного хранения окрашенных образцов и приступайте к их сбору на цитометре как можно скорее после окрашивания.
  13. Используйте проточный цитофлуориметр с соответствующими лазерами и фильтрами, подобранными под используемые флуорофоры. Подготовьте контроли для компенсации, включая образцы с одним красителем и контроли с отсутствием одного флуорофора (FMO).
  14. Соберите от 50 000 до 100 000 событий на образец для обеспечения достоверности статистического анализа. Проанализируйте данные с помощью FlowJo, FCS Express или эквивалентного программного обеспечения. Выделите популяцию живых одиночных клеток (гейтирование). Проанализируйте экспрессию поверхностных и внутриклеточных маркеров.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите титрование каждого конъюгата антитело–флуорохром с помощью серийных разведений, чтобы определить оптимальную концентрацию, обеспечивающую максимальный сигнал, минимальный фоновый шум и четкое разделение популяций.

5. Анализ апоптоза с использованием аннексина V методом проточной цитометрии:

  1. Основные контроли и реагенты:
    1. Неокрашенный контроль: устанавливает базовый уровень аутофлуоресценции клеток, позволяя отличить истинно положительный сигнал от фона.
    2. Контроли с одним красителем: необходимы для каждого флуорохрома в панели для обеспечения правильной компенсации (при традиционной цитометрии) или спектрального разложения (при спектральной цитометрии). Это гарантирует точное разделение сигналов по каналам.
    3. Контроли Fluorescence-minus-one (FMO): необходимы для определения гейтов малоинтенсивных или переходных популяций. Они помогают предотвратить завышение количества слабоположительных событий.
    4. Положительный контроль апоптоза: образец с намеренно индуцированным апоптозом (например, клетки, обработанные стауроспорином) подтверждает, что анализ надежно регистрирует апоптотические события.
    5. Изотипические контроли: не имеют смысла для самого Annexin V, так как связывание специфично к фосфолипидам, а не опосредовано антителами. Однако их можно включить для дополнительных антител к поверхностным маркерам, если это необходимо.
      ПРИМЕЧАНИЕ: используйте буфер для связывания Annexin V, содержащий ионы кальция, так как связывание Annexin V зависит от кальция; используйте коммерческий или валидированный эквивалентный буфер.
    6. Мембранно-непроницаемый краситель жизнеспособности (например, PI, 7-AAD, DAPI или фиксируемые красители для мертвых клеток) используется для дифференциации ранних апоптотических клеток от поздних апоптотических/некротических клеток. Выберите краситель, совместимый с лазерами проточного цитометра и условиями фиксации.
  2. Процедура окрашивания:
    1. Соберите совместно культивируемые клетки, центрифугируя планшеты при 500 x g в течение 5 мин. Осторожно отожмите и удалите супернатант, чтобы избавиться от культуральной среды и плавающего детрита. Промойте клетки дважды холодным буфером для окрашивания (например, PBS с 1–2% FBS), чтобы снизить фоновое окрашивание и удалить мешающие белки.
    2. Если требуются маркеры линий или субпопуляций (например, CD8 для PBMC, маркеры стволовых раковых клеток, такие как Lgr5 в опухолевых клетках), инкубируйте клетки с коктейлями антител в течение 30–45 мин при комнатной температуре на осторожном шейкере в защищенном от света месте. Окрашивание поверхности на этом этапе сохраняет целостность антигена и позволяет проводить анализ специфических компартментов.
    3. Промойте клетки дважды: сначала холодным буфером для окрашивания для удаления несвязанных антител, затем буфером для связывания Annexin V (например, BioLegend Cat. No. 422201) для обеспечения доступности кальция. Доведите концентрацию клеток примерно до 1 x 106 клеток/mL в буфере для связывания.
    4. Добавьте 5 µL реагента Annexin V, конъюгированного с флуорохромом, к 100 µL клеточной суспензии на образец. Выбранный флуорохром должен быть спектрально совместим с другими красителями в панели.
    5. Проведите контрастное окрашивание красителем жизнеспособности, таким как PI, 7-AAD или DAPI. Для PI и DAPI оптимальные разведения обычно варьируются от 1:1000 до 1:60 000, в зависимости от прибора и мощности лазера, и должны быть определены эмпирически. Фиксируемые красители жизнеспособности предпочтительнее, если в дальнейшем требуется фиксация.
    6. Осторожно ресуспендируйте клетки путем пипетирования вверх-вниз и инкубируйте в течение 20–40 мин при RT в темноте. Оптимальное время инкубации следует определить эмпирически, так как чрезмерная инкубация может увеличить неспецифическое связывание или количество ложноположительных результатов.
    7. Добавьте 200 µL буфера для связывания Annexin V в каждую лунку (минимум 100 µL, если образцы высококонцентрированные). Это обеспечит достаточный объем для проточной цитометрии и поддержит условия буфера во время сбора данных. Незамедлительно проанализируйте образцы на откалиброванном проточном цитометре, убедившись, что настройки напряжения оптимизированы для четкого разделения негативных и позитивных популяций.
  3. Рекомендуемая стратегия гейтирования:
    1. Используйте графики прямого светорассеяния (FSC) против бокового светорассеяния (SSC), чтобы исключить мелкий детрит и крупные агрегаты, оставив только целые клетки. Примените гейтирование FSC-A против FSC-H (или FSC-W) для удаления дуплетов и агрегатов, чтобы гарантировать анализ только одиночных клеток.
    2. На основании красителя жизнеспособности при необходимости исключите сильноположительные мертвые клетки. В качестве альтернативы включите краситель в квадранты анализа Annexin V. Используйте поверхностные маркеры для дифференциации PBMC (например, CD45+) от опухолевых клеток (например, EpCAM+ или другой опухолеспецифический маркер). Это позволяет проводить количественную оценку апоптоза для конкретных компартментов.
    3. Внутри каждого гейтированного компартмента постройте график Annexin V против красителя жизнеспособности для выделения четырех популяций: а) Annexin V− / Краситель− = жизнеспособные клетки; б) Annexin V+ / Краситель− = клетки на ранней стадии апоптоза; в) Annexin V+ / Краситель+ = клетки на поздней стадии апоптоза или некротические клетки; г) Annexin V− / Краситель+ = первичные некротические клетки или артефакты (интерпретировать с осторожностью).
    4. Далее разделите PBMC на субпопуляции (например, T-клетки CD4, T-клетки CD8, NK-клетки, моноциты), чтобы изучить профили апоптоза в конкретных иммунных популяциях.

6. Анализ ELISPOT для мониторинга Т-клеток в кокультурах органоидов (3 дня):

  1. В день 0 промойте предварительно покрытый PVDF-мембраной 96-луночный планшет и активируйте его. Храните при 4 °C в течение 24 ч в соответствии с протоколом набора ELISpot для определения интересующих антител/цитокинов.
  2. В день 1:
    1. Превратите органоиды в суспензию одиночных клеток, как описано в разделе 3.5. Центрифугируйте при 500 x g в течение 5 мин при комнатной температуре (RT), затем ресуспендируйте в среде CTL (поставляется с набором CTL ELISpot). Разморозьте криоконсервированные PBMC или используйте свежевыделенные PBMC. Центрифугируйте PBMC при 500 x g в течение 5 мин при RT.
    2. Ресуспендируйте PBMC в среде из набора. Проведите совместное культивирование, осторожно смешав одиночные клетки органоидов с PBMC в соотношении 5:1. Добавьте по 200 µL/лунку смеси для совместного культивирования в каждую лунку предварительно активированного 96-луночного assay-планшета. Очень осторожно постучите по планшету. Инкубируйте в течение 4 ч при 37 °C. Через 4 ч осторожно извлеките assay-планшет из инкубатора. Добавьте препараты в соответствующие лунки, включая подходящие положительный и отрицательный контроли.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение органоидов и PBMC должно быть оптимизировано для достижения наилучшего развития пятен цитокинов и результатов сканирования.
  3. В день 2:
    1. После 24 ч инкубации следуйте протоколу окрашивания производителя. Используйте контроли для одного и двух цветов, чтобы обнаружить и сравнить количество клеток, секретирующих указанные маркеры. Время инкубации зависит от цвета; за развитием пятен следует следить регулярно. Просканируйте планшет согласно инструкциям производителя. Постройте график и сравните секретируемые иммунные пятна.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от дизайна эксперимента и интересующих маркеров, соотношение между высеянными клетками и пятнами указывает на экспрессию цитокина/антитела в одном или двух цветах.

7. Детекция апоптоза в режиме реального времени с использованием Annexin V NIR и визуализации живых клеток (3 дня):

В сочетании с автоматизированной визуализацией живых клеток Annexin V NIR позволяет проводить высокопроизводительный мониторинг апоптотической гибели клеток в режиме реального времени для анализа цитотоксичности и ответа на лекарственные препараты.

  1. В день 0 приготовьте суспензию из одиночных клеток органоидов. Окрасьте клетки GFP-трекером клеток. Высейте окрашенные одиночные клетки в 100 µL полной среды на лунку. Дайте клеткам прикрепиться и сформировать кластеры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 96-луночные планшеты с U-образным дном и ультранизкой адгезией. Типичная стартовая плотность (корректируется эмпирически): 5,000 клеток/лунку, 10,000 клеток/лунку. Включите лунки для необработанного отрицательного контроля, контроля растворителя и любых экспериментальных воздействий (в трех или более повторах).
  2. В день 1 разморозьте криоконсервированные PBMC или используйте свежевыделенные PBMC. Центрифугируйте PBMC при 500 x g в течение 5 мин при комнатной температуре. Ресуспендируйте PBMC в среде для экспансии с добавлением IL-2 и поместите их в инкубатор.
  3. В день 2 окрасьте PBMC желтым трекером клеток. После окрашивания ресуспендируйте PBMC в RPMI. Очень осторожно удалите среду из лунок с органоидами. Проведите совместное культивирование, аккуратно смешав одиночные клетки органоидов с PBMC в соотношении 1:5. Добавьте 200 µL среды RPMI, содержащей PBMC, в каждую лунку с полученной смесью для совместного культивирования. Очень осторожно постуките по планшету и поместите его в инкубатор.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте беспокойства одиночных клеток органоидов на дне лунок.
  4. Инкубируйте в течение 2–4 ч при 37 °C. Через 4 ч осторожно извлеките планшет из инкубатора.
  5. Подготовьте лунки с препаратом, используя соответствующие положительный и отрицательный контроли. Реконструируйте лиофилизированный реагент Annexin V NIR в 100 µL полной среды или PBS, аккуратно перемешайте. Приготовьте 2-кратную рабочую среду, содержащую Annexin V NIR в двукратной конечной рабочей концентрации (например, 1:100 для конечного разведения 1:200), и убедитесь, что среда содержит ≥1 mM Ca2⁺.
  6. Добавьте разведение Annexin V NIR 1:200 в лунки. Поместите планшет в инкубатор для имиджинга живых клеток на следующие 48–72 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение органоиды:PBMC должно быть оптимизировано для обеспечения достаточного межклеточного взаимодействия и измеряемого апоптотического ответа.
  7. Имиджинг и анализ живых клеток
    1. Используйте объектив 4x или 10x и получайте изображения в NIR-канале для Annexin V NIR (плюс дополнительные каналы при мультиплексировании). Сканируйте планшет каждые 4–6 ч в течение 24–72 ч, в зависимости от продолжительности воздействия.
    2. Используйте программное обеспечение для имиджинга живых клеток, например IncuCyte CX3. Для базового количественного анализа анализируйте NIR-канал, используя общую площадь или подсчет объектов; для кинетики одиночных клеток используйте модули анализа Cell-by-Cell или Object. При мультиплексировании (например, желтый трекер клеток и GFP) ознакомьтесь с примечаниями по спектральному разложению).

Результаты

Для начала мы создали опухолевые органоиды из образцов нескольких пациентов, используя стандартизированный рабочий процесс (Рисунок 1). Эти PDO обычно требуют 2 недель для установления, после чего их можно расширять и пассировать для дальнейших исследований. Следует отметить, что время установления и генерации органоидов варьируется в зависимости от ткани. Например, для некоторых тканей требуется больше времени для получения органоидов, а некоторым органоидам нужно больше времени для достижения подходящей степени конфлюэнтности перед пассированием. Состав добавок в среду для органоидов может быть соответствующим образом скорректирован.

Затем мы использовали описанный здесь протокол (Рисунок 2) для создания совместной культуры органоидов и Т-клеток. PBMCs из периферической крови пациента были выделены согласно описанию, а затем экспандированы. Соотношение опухолевых клеток и лимфоцитов необходимо оптимизировать, так как отклонения от этого диапазона могут привести к иным результатам. Слишком низкое соотношение может ограничить степень взаимодействия между органоидами и Т-клетками.

Для оценки функциональности системы совместного культивирования мы провели параллельную иммунофлуоресцентную визуализацию органоидов и совместных культур для сравнения Ki67 и расщепленной каспазы-3 в качестве биомаркеров пролиферации и апоптоза соответственно (Рисунок 3). Жизнеспособность и функциональность совместной культуры были подтверждены окрашиванием Annexin V и DAPI. Чтобы отличить Т-клетки от органоидов, иммунные клетки и органоиды сначала окрашивали описанным способом и анализировали с помощью проточной цитометрии (Рисунок 4A). После обработки совместные культуры окрашивали Annexin V и DAPI и анализировали методом проточной цитометрии. Маркеры Cell Trace позволяют раздельно измерить апоптоз Т-клеток (Рисунок 4B) и органоидов (Рисунок 4C).

Иммунные биомаркеры CD107a и CD137 также были оценены с помощью проточной цитометрии (Рисунок 5A). Оба маркера обычно указывают на активацию или дегрануляцию T-клеток. В данном исследовании реактивность T-клеток после совместного культивирования можно оценить по экспрессии CD107a и CD137 (Рисунок 5 B,C). Впоследствии была использована система визуализации живых клеток для мониторинга апоптоза в совместных культурах PDO-T-клеток во время лечения. Качественный (Рисунок 6A) и количественный (Рисунок 6B) анализы демонстрируют апоптоз органоидов при различных условиях в течение 33 ч. Платформа IncuCyte CX3 использовалась для непрерывного мониторинга взаимодействий между опухолевыми органоидами и PBMC. Время сканирования можно установить для любой желаемой временной точки после проведения лечения.

Для количественного определения секреции цитокинов Granzyme B и Perforin в кокультуре органоидов, подвергнутых воздействию препарата A и анти-PD-1 в режиме монотерапии и комбинированной терапии в течение 24 ч, был проведен анализ Immunospot. Для кокультуры PDO при КРК мы использовали двухцветный метод ELISpot (Рисунок 7). Важно отметить, что соотношение органоидов и лимфоцитов может привести к получению различных профилей цитокинов.

Подготовка тканей опухоли: механическое и химическое расщепление; органоиды, полученные от пациентов; результаты микроскопии.
Рисунок 1. Создание органоидов опухоли КРР. (A) Графическая схема создания органоидов опухоли. (B) Репрезентативные созданные органоиды, полученные от пациентов. Изображения культур PDO при увеличении (4X) во время нормального роста (получены с помощью Echo Revolve с использованием фазово-контрастной микроскопии). Масштабная линейка = 200 µm. Этот рисунок был модифицирован из работы Mohammadi M et al. 19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Схема процесса лечения рака толстой кишки: изоляция PBMC пациента, экспансия T-клеток, анализ кокультивирования.
Рисунок 2. Графическая схема кокультивирования органоидов опухоли и иммунных клеток и последующего анализа. Органоиды опухоли создаются параллельно с изоляцией и экспансией иммунных клеток. Одноклеточные суспензии органоидов опухоли и иммунных клеток культивируют совместно в заданных соотношениях. Через 24 ч кокультуры подвергают воздействию препаратов. Последующий анализ проводится в соответствии с описанием в данном протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Флуоресцентная микроскопия органоидов; окрашивание DAPI, Caspase-3, Ki67; кокультивирование CRC PDO и PBMC.
Рисунок 3. Сравнение органоидов и кокультуры через 24 ч. Конфокальная микроскопия была проведена для оценки маркеров Ki67 (пролиферация) и расщепленной caspase-3 (апоптоз) при 40-кратном увеличении. Органоиды высевали и культивировали совместно с аутологичными иммунными клетками. Также было проведено окрашивание DAPI для визуализации ядер. Масштабная линейка = 20 µm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Анализ данных проточной цитометрии; включает графики жизнеспособности клеток. Схема эксперимента по апоптозу клеток.
Рисунок 4. Количественная оценка апоптоза в кокультурах с помощью анализа методом проточной цитометрии. (A) Стратегия гейтирования при проточной цитометрии, демонстрирующая маркировку опухолевых клеток CellTrace Far Red и Т-клеток CellTrace Far Yellow. Графики Annexin V против DAPI показывают жизнеспособность Т-клеток и органоидов через 48 h. (B) Количественная оценка жизнеспособности Т-клеток при различных условиях терапии. (C) Количественная оценка апоптоза органоидов опухоли при различных условиях терапии. Эксперимент проводился в трех повторностях. Препарат A (Drug A) и препарат B (Drug B) оценивались как таргетная терапия в виде монопрепаратов и в комбинации с анти-PD-1 (ниволумабом). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Диаграммы анализа проточной цитометрии; подмножества CD8 T-клеток, PDO КРК, ко-культура с PBMC; исследование активации.
Рисунок 5. Оценка иммунных маркеров в ко-культуре органоидов КРК и иммунных клеток. (A) Стратегия гейтирования при проточной цитометрии для обнаружения CD8+ T-клеток, экспрессирующих маркеры активации T-клеток CD107a и CD137. (B) Сравнение уровней экспрессии CD107a CD8+ T-клетками в ко-культурах разных групп терапии. (C) Сравнение уровней экспрессии CD137 CD8+ T-клетками в ко-культурах разных групп терапии. Препарат A и препарат B оценивались как таргетная терапия в виде монотерапии и в комбинации с анти-PD-1 (ниволумабом). Эксперимент проводили в трех повторностях. Столбчатая диаграмма показывает средний процент с SD для маркеров в разных группах (p = 0,0023, однофакторный ANOVA). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Эксперимент по кокультивированию органоидов; микроскопические изображения; анализ воздействия лекарственных средств и график временного ряда для CRC-PDOs+PBMCs.
Рисунок 6. Анализ живых клеток в кокультуре органоидов CRC и иммунных клеток. (A) Репрезентативные изображения живых клеток (короткие записи таймлапса) опухолевых органоидов и иммунных клеток, полученные с помощью системы IncuCyte CX3 в день 0. Опухолевые органоиды помечены зеленым флуоресцентным красителем для их отличия от мононуклеарных клеток периферической крови, окрашенных желтым флуоресцентным красителем CellTrace Yellow (PBMCs; синий цвет). (B) Количественная оценка апоптоза опухолевых органоидов во время кокультивирования при различных условиях терапии. Апоптотическая гибель клеток мониторировалась с помощью анализа Annexin V в ближнем инфракрасном диапазоне (NIR) в режиме непрерывной визуализации живых клеток в течение 33 ч. Масштабная линейка = 1 mm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Результаты эксперимента по совместному культивированию органоидов колоректального рака; диаграммы показывают уровни секреции и эффекты препаратов и методов лечения.
Рисунок 7. Репрезентативные результаты ELISpot для количественного определения цитокинов (гранзим B и перфорин) в кокультуре органоидов CRC и иммунных клеток. (A) Репрезентативные изображения иммуноанализа и проявления секреции человеческого гранзима B (красный) и перфорина (синий) путем стимуляции и обработки эффекторных клеток после 24 ч совместного культивирования. (B) Двухцветная визуализация секреции (перфорин — синий, гранзим B — красный). (C) Секреция перфорина для каждого условия. (D) Секреция гранзима B для каждого условия. Анализ проводили в двух повторностях. Сканирование и подсчет выполняли с помощью анализатора CTL, данные были построены в GraphPad Prism. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

НомерБуфер/реагентМетодикаКомментарии
1среда для КРК-ПДО (пациент-производных органоидов колоректального рака)Разморозьте L-WRN, культивируйте в течение указанного времени до достижения конфлюэнтности, соберите среду и ежедневно добавляйте свежую среду на протяжении до 12–14 дней. К собранной среде добавьте Advanced DMEM, отфильтруйте и сразу после фильтрации дополните GLUTAMAX I, HEPES, [LEU15]-гастрином I человека, B-27 (безсывороточный), N2, пенициллином-стрептомицином и N-ацетилцистеином.В первый день эксперимента добавьте в среду для культивирования органоидов второй набор добавок: A83-01, SB202190, EGF, никотинамид и PGE2. Добавляйте Y-27632 и Primocin в течение первой недели после размораживания и пассирования. Хранить при -80 °C.
2Раствор для промывки органоидовДобавьте в PBS Primocin в соотношении 1:500, гентамицин в соотношении 1:200, 1% пенициллин-стрептомицин и амфотерицин в соотношении 1:100.
3Среда для размораживания Т-клетокДополните среду RPMI-1640 1% пенициллина/стрептомицина и 10% FBS
4Среда для культивирования Т-клетокДобавьте 10% человеческий сывороточный альбумин и 1% пенициллин-стрептомицин в среду RPMI-1640. Храните среду при 4 °C не более 1 месяца
5Среда для экспансии Т-клетокДобавьте в среду для выращивания Т-клеток IL-2 в концентрации 500 МЕ/мл и коктейль CD3/CD28.Приготовить непосредственно перед использованием
6Среда для замораживанияПриготовление 10% раствора ДМСО в ФБС
7Буфер для покрытияДобавьте 1% БСА и 15 мМ HEPES в среду Advanced DMEM/F12Храните буфер при 4 °C на срок до 3 месяцев
8Буфер для FACSДобавьте 1% FBS в PBS Хранить при 4 °C
9буфер для иммунофлуоресценцииДобавьте 0,2% Triton X-100 и 0,05% Tween-20 в PBSХранить при 4 °C
10Блокирующий буферДобавьте 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в буфер для иммунофлуоресценции (ИФ)Хранить при 4 °C

Таблица 1: Приготовление реагентов. В данном протоколе описаны состав и способ приготовления буферов, сред, окрашивающих растворов и добавок, используемых для культивирования органоидов, полученных от пациентов с колоректальным раком, выделения и экспансии PBMC, совместного культивирования органоидов и иммунных клеток, проточной цитометрии, иммунофлуоресценции, ELISpot и анализа живых клеток с помощью визуализации.

Обсуждение

В данном протоколе описан простой и воспроизводимый метод получения PDO и экспансии Т-клеток из нашего биобанка. Также подробно описана схема совместного культивирования PDO и CRC для образцов пациентов с различными мутациями, а также режим лечения. Полученные результаты продемонстрировали эффект терапии на моделях совместного культивирования.

Описанная здесь система совместного культивирования органоидов представляет собой надежную и адаптируемую платформу для моделирования сложных биологических взаимодействий in vitro. Благодаря интеграции PBMC с соответствующими органоидами, полученными от того же пациента, данный протокол позволяет более точно воспроизвести динамику сигналинга и функциональную гетерогенность органоидов, чем традиционное 2-D культивирование клеток. В отличие от предыдущих подходов с более низкой воспроизводимостью или ограниченной жизнеспособностью, наш метод оптимизирует условия культивирования для сохранения как целостности органоидов, так и активности Т-клеток в течение необходимых временных точек20,21. Ключевым преимуществом данного протокола является его гибкость. Он может быть применен к различным типам органоидов, включая модели кишечника, печени и легких, и поддерживает совместное культивирование с широким спектром иммунных клеток13,14,20,21,22,23. Такая адаптивность позволяет исследователям настраивать метод под конкретные биологические задачи: от изучения взаимодействий между хозяином и патогеном до оценки терапевтического ответа в контексте конкретного пациента13,20,24,25. Кроме того, этот рабочий процесс совместим с последующими анализами, включая транскриптомику, метаболомику и визуализацию, что расширяет возможности его применения для механистических и трансляционных исследований26,27.

Данные протоколы широко применимы в различных областях иммунологии рака, трансляционной онкологии и персонализированной медицины13,20,21. Платформа для совместного культивирования органоидов и иммунных клеток представляет собой физиологически релевантную и масштабируемую систему для изучения специфических для конкретного пациента взаимодействий между опухолью и иммунной системой, оценки эффективности иммунотерапии и таргетного лечения, а также идентификации биомаркеров ответа или резистентности13,14,20,21. Интеграция таких функциональных анализов, как проточная цитометрия, ELISpot и прижизненная визуализация клеток, позволяет проводить комплексный анализ иммунной активации, цитотоксичности и поведения опухоли13,14,20,21. Использование трехмерных органоидов, полученных из тканей пациентов, дополнительно повышает трансляционную значимость за счет сохранения гетерогенности опухоли и особенностей микроокружения, что делает данные протоколы ценными инструментами для доклинического тестирования препаратов и разработки иммунотерапии следующего поколения13,14,20.

Несмотря на свои преимущества, модели органоидов всё еще имеют ограничения. Эффективность создания органоидов варьируется в зависимости от типа опухоли, качества образца и истории предшествующего лечения, особенно в случае опухолей, подвергшихся интенсивной терапии20,21. Кроме того, в органоидах часто отсутствуют ключевые компоненты микроокружения опухоли, такие как фибробласты, сосудистая сеть и стромальная сигнализация14,20,21. Хотя системы совместного культивирования улучшают моделирование взаимодействий между опухолью и иммунной системой, поддержание жизнеспособности и функции иммунных клеток in vitro остается сложной задачей13,14,20,21. Вариативность условий культивирования и состава внеклеточных матриксов в разных лабораториях также ограничивает стандартизацию и воспроизводимость результатов14,20,21.

Будущие достижения в области исследований органоидов будут сосредоточены на интеграции фибробластов, эндотелиальных клеток, микробиоты и аутологичных иммунных клеток для более точной имитации микроокружения опухоли и совершенствования тестирования персонализированной иммунотерапии28. Появление систем «орган-на-чипе» и методов инженерии на основе CRISPR/Cas9 позволит расширить возможности моделирования заболеваний, функциональных исследований и терапевтического скрининга. Ожидается, что стандартизация в рамках инициатив по биобанкингу повысит масштабируемость, воспроизводимость и возможности клинического внедрения. В целом, данный протокол предоставляет воспроизводимую, физиологически релевантную платформу для изучения взаимодействий между органоидами и иммунными клетками, а также поддерживает трансляционные исследования и исследования в области прецизионной онкологии.

Раскрытие информации

C.K. сообщает о следующих конфликтах интересов, ни один из которых не связан с данной рукописью: Loki Therapeutics (финансирование исследований), Teiko (консультант), Seattle Genetics (консультант), Insights Driven Research (консультант), BMS (консультант), Guardant Health (консультант), OMNI Oncology (консультант), Exelixis (консультант), Nuvectis Pharma (консультант, лекарственные препараты), Real CME (гонорары). C.K. и N.T. являются соавторами предварительной заявки в США 63/746,435, поданной 17 января 2025 года, которая не связана с данной рукописью. Остальные авторы не имеют сведений о конфликтах интересов.

Благодарности

Данная работа была поддержана Комплексным онкологическим центром Монтефиоре Эйнштейн CCSG (P30CA013330). Мы благодарим Хиллари Гузик, Ротем Алон, Цзинхан Чжан, Свати Сваминатан и Джеки Чуен за техническую помощь. Исследования методом проточной цитометрии проводились с использованием анализатора Cytek Aurora, финансируемого Национальными институтами здравоохранения (1S10OD026833-01) в Центре проточной цитометрии Колледжа медицины Альберта Эйнштейна. Конфокальная визуализация была выполнена с помощью микроскопа Leica STELLARIS 8, финансируемого NIH (1S10OD034397-01) в Центре аналимической визуализации Колледжа медицины Альберта Эйнштейна. E.N., W.E. и C.K. получили поддержку по грантам NIH T32CA200561, R01CA248536, R42CA287679 и K12CA279871. Организации-финансиры не принимали участия в подготовке рукописи.

Мы также выражаем благодарность Институту исследований стволовых клеток и регенеративной медицины имени Рут Л. и Дэвида С. Готтесмана за поддержку MM, NS и NT.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Химические вещества, реагенты и антитела
добавка B27 без витамина А GIBCO C12587-010
добавка B27 GIBCO 17504-044 
N-ацетилцистеин Sigma-Aldrich A9165-5G 
Никотинамид Sigma-Aldrich N0636 
Рекомбинантный EGF человека Peprotech AF-100-15 
N2Gibco17502001
A83-01 Tocris2939
SB202190 Cayman Chemicals 10010399
Простагландин E2 Cayman Chemicals 14010-1 
Y-27632 Sigma-Aldrich Y-0503 
Коллагеназа II типа Sigma-Aldrich C6885 
Гиалуронидаза IV типа Sigma-Aldrich H3506 
Advanced DMEM/F12 GIBCO 12634-028 
Пенициллин/стрептомицин GIBCO 15070063
Ультраглутамин тип I Lonza BE17-605E 
HEPES GIBCO 15630-056 
TrypLE Express GIBCO 12604-013 
Среда для замораживания культур клеток для последующего восстановления GIBCO 12648-010 
RPMI 1640 GIBCO 11875093
Сыворотка крови человека, полученная из плазмы крови мужчины с группой крови AB Sigma-Aldrich H3667 
Бензоназа Merck 70746-3 
Рекомбинантный интерферон гамма человека Peprotech 300-02 
Диспаза II типа Sigma-Aldrich D4693 
Раствор для восстановления клеток Corning 354253
Invivogen PrimocinInvivogen ANTPM1NC9141851
Рекомбинантный ИЛ-2 человека (экспрессированный в E. coli, без носителя)Biolegend791906
Рекомбинантный ИЛ-7 человека (экспрессированный в E. coli, без белка-носителя)Biolegend569706
Рекомбинантный ИЛ-15 человека (без белка-носителя)Biolegend570306
PE/Cyanine5 антитела к CD107a (LAMP-1) человекаBiolegend328656
Brilliant Violet 711™ анти-человеческий CD137 (4-1BB)Biolegend309832
Pacific Blue™ антитела к CD8a человекаBiolegend300928
антитела к CD3 человека, конъюгированные с APC/Cy7BioLegend317342
антитела к CD4 человека PerCP/Cyanine5.5, антитела к CD4 человекаBiolegend980810
Alexa Fluor® 647 анти-человеческий/мышиный гранзим BBiolegend515406
антитела к CD56 человека, конъюгированные с PE/Cy7Biolegend985912
ПЭ/Dazzle™ 594 анти-человеческий IFN-γ АнтителоBioLegend506530
PE анти-человеческий CD274 (B7-H1, PD-L1)Biolegend393608
Очищенные антитела к CD28 человекаBiolegend302901
Brilliant Violet 510™ антитела к CD45 человекаBiolegend304036
Мышиные антитела к человеческому CD326 (EpCAM) (конъюгированные с PE/Cy7)BioLegend324222
анти-Ki67Abcamab15580
NucView® Набор для анализа каспазы-3 с использованием 488-го красителя для живых клетокBiotium30029
Набор для определения апоптоза с FITC-аннексином V и PIBiolegend640914
PE/Cyanine7 Аннексин VBiolegend640950
Incucyte® Аннексин V с ближним ИК-красителемПортняжная мышца4768
ЖИВЫЕ/МЕРТВЫЕ™ Набор красителей для фиксации мертвых клеток Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, для УФ-возбужденияInvitrogenL23105
Cell Trace Far YellowThermo FisherC34567
Cell Trace Far RedThermo FischerC34564
Зеленый CMFDAMedChem ExpressHY-126561 
Human TruStain FcX™ (Раствор для блокирования Fc-рецепторов)Biolegend422302
Буфер для окрашивания BrilliantBD Biosciences563794
BD Pharmingen™ Буфер для окрашивания (БСА)BD Biosciences554657
Компенсационные микросферыBiolegend424602
Corning® Дульбекко’Фосфатно-солевой буферный раствор, 1X без кальция и магнияCorning20-031-CM
Corning® Дульбекко’фосфатно-солевой буферный раствор, 1X с добавлением кальция и магнияCorning20-030-CV
Антитело к человеческому рецептору PD-1 (ниволумаб)Merus/SelleckchemA2002
ДиметилсульфоксидFisher ScientificBP231-100 
DMEM (среда Дальтона)Джинзи25-500
ЭДТА-буферInvitrogen15575020
ФСБ (фетальная сыворотка быка)VWR97068-075
Фосфатно-солевой буферный раствор (PBS)Джиниз25-507
Параформальдегид (ПФА)Химические реактивы Thermo Scientific0473779L
Набор растворов для фиксации и пермеабилизацииBD554714
Гастрин I ЧЕЛОВЕКАMilliporeG9145-.1MG
GLUTAMAX IFisher Scientific35050061
коктейль CD3/CD28 STEMCELL Technologies 10971
Среда для экспансии ImmunocultSTEMCELL Technologies 10981
mounting-среда ProLong Diamond Antifade с DAPIInvitrogenP36962
Triton X-100Химические реактивы Thermo Scientific215680025
Раствор трипанового синего, 0,4%Gibco15250061
Tween-20TCI AmericaT0543500G
Оборудование
Центр проточной цитометрии / Проточный цитометрCytek (Wuxi) BiosciencesМодель № N7-0021
Проточный цитометр/Лаборатория СингхаInvitrogenATTUNE NXT (модель № 4486517)
Конфокальный микроскопLeicaSTELLARIS 8
Система анализа живых клетокSartoriusIncucyte CX3

Ссылки

  1. Cervantes A, et al. Metastatic colorectal cancer: ESMO Clinical Practice Guideline for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 2023;34(1):10-32.
  2. Colonna G. Overcoming barriers in cancer biology research: current limitations and solutions. Cancers (Basel). 2025;17(13):2102.
  3. Liu Y, et al. Patient-derived xenograft models in cancer therapy: technologies and applications. Signal Transduct Target Ther. 2023;8(1):160.
  4. Rocha Neto J, Gaspar MM, Reis CP. Experimental murine models for colorectal cancer research. Cancers (Basel). 2023;15(9):2570.
  5. Bleijs M, van de Wetering M, Clevers H, Drost J. Xenograft and organoid model systems in cancer research. EMBO J. 2019;38(15).
  6. Hou X, et al. Opportunities and challenges of patient-derived models in cancer research: patient-derived xenografts, patient-derived organoids and patient-derived cells. World J Surg Oncol. 2022;20(1):37.
  7. Tentler JJ, et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 2012;9(6):338-50.
  8. Drost J, Clevers H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 2018;18(7):407-18.
  9. Zeng G, et al. Advancing cancer research through organoid technology. J Transl Med. 2024;22(1):1007.
  10. Jin MZ, et al. Organoids: an intermediate modeling platform in precision oncology. Cancer Lett. 2018;414:174-80.
  11. Dart A. Organoid 2.0. Nat Rev Cancer. 2019;19(3):126-7.
  12. Cattaneo CM, et al. Tumor organoid-T-cell coculture systems. Nat Protoc. 2020;15(1):15-39.
  13. Neal JT, et al. Organoid modeling of the tumor immune microenvironment. Cell. 2018;175(7):1972-88.e16.
  14. Bar-Ephraim YE, Kretzschmar K, Clevers H. Organoids in immunological research. Nat Rev Immunol. 2020;20(5):279-93.
  15. Jang J, et al. Redefining preclinical testing: human-relevant alternatives beyond animal models. BMB Rep. 2025; in press.
  16. Xie BY, Wu AW. Organoid culture of isolated cells from patient-derived tissues with colorectal cancer. Chin Med J (Engl). 2016;129(20):2469-75.
  17. Vlachogiannis G, et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 2018;359(6378):920-6.
  18. Ooft SN, et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Sci Transl Med. 2019;11(513).
  19. Mohammadi M, et al. Cyclin-dependent kinase 9 inhibitors as oncogene signaling modulators in combination with targeted therapy for the treatment of colorectal cancer [Preprint]. bioRxiv. 2025:2025.08.13.669992. doi:10.1101/2025.08.13.669992.
  20. Guo L, et al. Toward reproducible tumor organoid culture: focusing on standardization. Front Immunol. 2024;15:1290504.
  21. Wang J, et al. Tumor organoid-immune co-culture models: exploring a new frontier in cancer research. Cell Death Discov. 2025;11:98.
  22. Najafi M, et al. Organoid-immune co-cultures: a next-generation platform for studying human immunology and disease. Trends Immunol. 2026;47(1):45-62.
  23. Kakni P, et al. A microwell-based intestinal organoid-macrophage co-culture system to study intestinal inflammation. Biomaterials. 2022;276:121018.
  24. Meirelles LA, Persat A. Decoding host-microbe interactions with engineered human organoids. EMBO J. 2025;44(6):1569-73.
  25. Ryu JO, et al. Applications and research trends in organoid-based infectious disease models. Sci Rep. 2025;15:7816.
  26. Du L, et al. Spatial omics in 3D culture model systems. Nat Rev Bioeng. 2025;3(1):45-67.
  27. Lombardi M, et al. Organoid models through the lens of metabolomics. Analyst. 2026;151(4):1458-78.
  28. Skardal A, et al. Drug compound screening in single and integrated multi-organoid body-on-a-chip systems. Biofabrication. 2020;12(2):025017.

Перепечатки и разрешения

Теги

ELISpot3B

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.