Оценка эффективности трансдукции и целевого целевого направления клеток с помощью пептидов, проникающих в клетки, в лёгких мыши

Краткое содержание

Этот протокол описывает интегрированный рабочий процесс для оценки эффективности трансдукции и специфичности клеточных пептидов, проникающих в клетки, с использованием пептида, нацелённого на лёгкие, циклизированного R11A (cR11A; Например, KAPWHLSSQYSAT). Рабочий процесс сочетает парную фракцию FACS, затем секвенирование одноклеточной РНК, потокную цитометрию у мышей с репортерами AT2 и конфокальную z-стековую визуализацию для подтверждения поражения пептидной мишени с AT2.

Аннотация

Пептиды, проникающие в клетки (CPP) — это короткие пептиды (5–30 аминокислот), способные пересекать клеточные мембраны и доставлять макромолекулярные грузы без необходимости трансфекционных реагентов. Однако определение in vivo клеточной селективности требует валидации на уровне типа клеток. Представлен интегрированный рабочий процесс для оценки эффективности трансдукции циклизированного CPP, маркированного Cy5.5, cR11A, внутри клеток альвеолярного эпителия типа II (AT2) после ретро-орбитального внутривенного введения мышей. Лёгкие были взяты через 15 или 60 минут после инъекции и проанализированы с использованием комплементарных показаний, включая парно-фракционную флуоресцентно-активную сортировку клеток (FACS) для выделения суспензии Cy5.5⁺ и Cy5.5⁻ лёгких, затем последовательное секвенирование одноклеточной РНК, проточная цитометрия отдельных клеток лёгких из Sftpc-CreERT2^(+/−); LSL-GFP^(+/−) AT2-репортерские мыши для количественной оценки событий GFP⁺/Cy5.5⁺, а также конфокальную z-стековую визуализацию криосекций лёгких для подтверждения колокализации cR11A-Cy5.5 с сигналом, ассоциированным с AT2. Этот протокол даёт согласованные доказательства взаимодействия типов клеток с использованием множества комплементарных показаний и предоставляет воспроизводимую основу для оценки специфического клеточного таргетинга CPP с модификациями для различных целевых органов.

Введение

Пептиды, проникающие в клетки (CPP) — это пептиды из 5–30 аминокислот, которые могут проходить через клеточные мембраны и способствовать внутриклеточной доставке макромолекулярных грузов в целостном, полностью функциональном виде без необходимости трансфекционных^{реагентов 1,2}. Предыдущие исследования, использующие комбинаторные методы дисплея фагов in vitro и in vivo, выявили 12-аминокислотный кардиак-таргетинг пептид (APWHLSSQYSRT), который поглощается кардиомиоцитами всего за 5^{минут 3,4}. Для изучения механизма трансдукции было проведено аланиновое сканирование, в результате чего были обнаружены два варианта — S7A и R11A (APWHLSSQYSAT), которые неожиданно проявили обогащение лёгких in vivo. и поэтому были названы пептидами, направленными на лёгкие (LTPs⁾⁵. Кроме того, добавление N-концового лизина и циклизация от головы к хвосту создали циклическую версию R11A (cR11A) с значительно улучшенной стабильностью сыворотки и значительно улучшенным внутриклеточным поглощением по сравнению с^{линейным аналогом 5}.

LTP обладают потенциалом точно доставлять терапевтические средства в дистальные эпителиальные популяции лёгких, включая альвеолярные эпителиальные клетки типа II (AT2). Эти клетки критически важны для поддержания гомеостаза поверхностно-активных веществ и служат предшественниками альвеолярной^{регенерации 6}. Однако одной из главных проблем в разработке LTP является строгая оценка клеточной селективности in vivo. Само по себе биораспределение на уровне органов не может отличить истинную клеточную трансдукцию от сосудистого сигнала, внеклеточного удержания или фагоцитарного клиренса, поэтому должно дополняться одноклеточными^{измерениями 7}. Для устранения этого ограничения этот рабочий процесс интегрирует одноклеточное транскриптомическое назначение, репортерную потоковую цитометрию и конфокальную z-стековую визуализацию для получения доказательств взаимодействия пептидов на уровне клеток за пределами флуоресценции или биораспределения на уровне органов ^8,9.

Общая цель этого протокола — обеспечить воспроизводимый многократный рабочий процесс для проверки эффективности трансдукции in vivo и специфичности клеточного препарата cR11A, маркированного Cy5.5, в дистальных легких, с акцентом на клетки AT2 после ретро-орбитальной инъекции. Протокол определяет идентичность клеток, ассоциированных с пептидом, с помощью комплементарных и независимых показаний, включая сортировку клеток, активируемую флуоресценцией парной фракцией (FACS) (Cy5.5⁺ против Cy5.5⁻), затем секвенирование одноклеточной РНК для картирования популяций, ассоциированных с пептидами, количественную оценку поглощения в репортерных лёгких с помощью потоковой цитометрии и конфокальную z-стековую визуализацию криосекций легких для подтверждения колокализации cR11A-Cy5.5 с сигналом, ассоциированным с AT2. Этот протокол легко адаптируется к другим LTP или векторам доставки и применяется к легким или другим органным системам для оценки специфичности клеток разрабатываемых CPP. Он особенно подходит для приложений, требующих проверки целевого CPP на уровне клеток in vivo, а не только оценки накопления на уровне органов.

Протокол

Все процедуры на животных проводились в соответствии с руководящими принципами Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) клиники Майо и были утверждены по протоколу номер A00006842-22-R25. Были приложены все усилия для минимизации страданий животных и обеспечения этичного обращения в соответствии с соответствующими национальными и институциональными нормативами. Исследовательские инструменты, используемые для этого протокола, перечислены в Таблице материалов.

1. Животные

1. Используйте взрослых смешанных мышей C57BL/6J (6–8 недель), полученных в лаборатории Джексона (штамм #000664).
2. Для квантовой оценки AT2 используйте Sftpc-CreERT2^(+/+) (Jax Strain #028054), скрещённый с LSL-GFP^(+/+) (Jax Strain #007906) для генерации Sftpc-CreERT2^(+/−); Мыши ^{LSL-GFP(+/−)} AT2.
3. Домашние мыши находятся в индивидуально вентилируемых клетках. Убедитесь, что все протоколы по уходу за животными одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных.
4. Проведите индукцию тамоксифена в Sftpc-CreERT2^(+/−); Мыши ^{LSL-GFP(+/−} ). Когда мышам ≥6 недель, вводите 100 мг/кг тамоксифена, растворённого в кукурузном масле, через оральную гаважу, в течение трёх доз в течение 7 дней. Проводите эксперименты не менее чем через 2 недели после последней дозы, чтобы обеспечить максимальную эффективность рекомбинации.

2. Подготовка реагентов и оборудования

1. Приготовьте анестезию (рабочая смесь кетамина и ксилазина).
   1. Приготовьте рабочий раствор объёмом 5 мл: кетамин (1 мл 50 мг/мл), ксилазин (50 мкл 100 мг/мл) и стерильный физиологический раствор (3,95 мл).
   2. Введите 1 мкл/г массы тела с помощью .внутрибрюшинная инъекция (окончательная доза: 10 мг/кг кетамина и 1 мг/кг ксилазин).
2. Приготовьте пептид (cR11A-Cy5.5).
   1. Получите CPP в виде лиофилизированных порошков. Храните порошки при −20 °C до 2 лет или в качестве стандартных растворов в DMSO при −80 °C до 6 месяцев в светозащитных трубках. Избегайте циклов заморозки и оттаивания и минимизируйте воздействие света. Приготовьте 10 мМ стандартного раствора cR11A-Cy5.5 в DMSO.
   2. Взвесьте мышь, рассчитайте дозу и разведите бульон до 1 мг/кг в воде без нуклеазы до итогового объёма 100 мкл на мышь.
3. Подготовьте буфер для пищеварения (свежий; храните на льду).
   1. Приготовьте пищеварительный буфер, содержащий 2 мг/мл Dispase II, 0,1 мг/мл DNase I, DMEM/F12 и 1% (v/v) пенициллин-стрептомицина.
   2. Используйте 3 мл на мышь.
4. Подготовьте буфер для промывки ферментом с неспецифической протеазой (держите на льду).
   1. DMEM/F12 содержит 0,05 мг/мл ДНКазы I и 1% (v/v) пенициллин-стрептомицина.
   2. Используйте 10 мл на мышь.
5. Подготовьте буфер для лизиса эритроцитов (держите на льду).
   1. Разбавьте буфер 10× лизиса до 1× с помощью PBS.
   2. Используйте 2 мл на образец.
6. Подготовьте перфузионный буфер.
   1. Используйте ледяную температуру DMEM/F12 (10 мл на мышь).
7. Подготовьте буфер для стирки.
   1. Используйте DMEM/F12 с 2% FBS.
8. Предварительное охлаждение центрифуг до 4 °C.

3. Ретро-орбитальное введение cR11A-Cy5.5

1. Анестезиируйте мышь с помощью рабочего раствора кетамина и ксилазина. Подтвердите адекватную анестезию по отсутствию отъёма конечности в ответ на защемление пальца.
2. Введите 100 мкл cR11A-Cy5.5 (1 мг/кг ) ретро-орбитально внутривенно с помощью инсулинового шприца.
3. Запустите таймер и держите мышь на грелке под соответствующим контролем 15–60 минут.

4. Сбор лёгких и перфузия

1. Эвтаназия мыши согласно утверждённым протоколам (например, вдыхание CO₂ с последующим вывихом шейки матки). Положите мышь в положение на спине и распылите грудь 70% этанола.
2. Откройте грудную полость, чтобы открыть сердце и лёгкие.
3. Сделайте разрез в правом предсердии, чтобы обеспечить дренаж во время перфузии.
4. Введите иглу на 26 G, прикреплённую к шприцу объемом 10 мл с ледяным DMEM/F12, в правый желудочек. Держите правый разрез предсердия открытым во время перфузии, чтобы обеспечить дренаж.
5. Перфузия вручную без шприцового насоса, медленно и равномерно вводя 10 мл DMEM/F12 примерно в течение 1-2 минут. Поддерживайте низкое давление во время инъекции и избегайте видимого чрезмерного надувания лёгких или утечки из стенки желудочка. Продолжайте, пока лёгкие не станут равномерно бледными.

5. Надувание лёгких и пищеварение

1. Канлюляруйте трахею катетером 20G внутривенно и закрепите швом 3-0 шелка. Введите 1 мл пищеварительный буфер с помощью шприца 1 мл для надувания лёгких.
2. Вскрытие лёгких как единого целого блока и немедленно перенесите их в предварительно охлаждённую 100-мм тарелку на льду.
3. Разделить доли лёгких и перенести в коническую трубку объёмом 15 мл с буфером для холодного пищеварения объёмом 2 мл (по одному лёгкому на трубку).
4. Инкубировать при 4 °C в течение 20 часов на вращающейся коромысле (10–15 об/мин).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к Janas PP. и ^{др. 10} для подробной методологии.

6. Диссоциация тканей

1. Поставьте 100 мкм клеточное сито поверх конической трубки объемом 50 мл и предварительно увлажните буфером для промывания ферментов с неспецифической протеазой на 1 мл.
2. Перенесите ткань лёгких на сито и аккуратно отдельте её с помощью стерильного поршня для шприца.
3. Прополоскайте 10 мл неспецифическим протеазным ферментным буфером.
4. Центрифуга при 130 × г в течение 15 минут при 4 °C.
5. Восстановите пеллет в буфере лизиса эритроцитов объемом 2 мл 1× на 90 секунд при комнатной температуре.
6. Закалить лизис с помощью буфера для промывки на 10 мл.
7. Профильтруйте через сито диаметром 40 мкм и прополосните буфером для стирки.
8. Центрифуга при 300 × г в течение 5 минут при 4 °C.
9. Ресуспензировать клетки в 500–1 000 мкл PBS + 2% FBS (≥1 × 10⁶ клеток/мл).
10. Пропустите фильтровую крышку диаметром 35 мкм в трубку FACS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к Konishi S. и ^{др. 11} для подробной методологии.

7. Сортировка FACS по парным дробям

1. Проводите сортировку с помощью потокового цитометра.
2. Используйте лёгкие с инъекцией PBS в качестве отрицательного контроля для определения затвора Cy5.5.
3. Применяйте стандартные ограничения: исключение мусора, синглеты и элементы Cy5.5⁺.
4. Сортируйте популяции Cy5.5⁺ и Cy5.5⁻ по отдельным трубкам.

8. подготовка образца scRNA-seq

1. Храните отсортированные образцы на льду.
2. Центрифугировать при 300 × г в течение 5 минут при 4 °C и снова суспензировать в буфере 500 мкл.
3. Продолжайте только если жизнеспособность ≥80%.
4. Подготовьте библиотеки и последовательность по мере необходимости.

9. Проточная цитометрия у мышей AT2 Reporter

1. Подготовьте одиночные суспензии легких, как описано в разделах 5–6.
2. Нанесите морилку фиксируемым живым/мертвым красителем (1:1 000) в течение 30 минут (защита от света).
3. Промыть и центрифугировать при 300 × г в течение 5 минут при 4 °C.
4. Фильтруйте и храните образцы на льду.
5. Собирайте данные с потокового цитометра.
6. Выполнить гейтинг для идентификации клеток, выбрать синглеты, исключить мёртвые клетки и определить популяции GFP и Cy5.5.
   1. Количественно определите события GFP⁺/Cy5.5⁺ в процентах от клеток GFP⁺.

10. Фиксация и криозащита

1. Надуть лёгкие 1 мл 4% PFA и закрепить трахею.
2. Установите 10 мл 4% PFA за ночь при 4 °C.
3. Мойка с помощью PBS (3×).
4. Инкубировать сахарозу 15% за ночь.
5. Переведите на сахарозу 30% на ~48 час.

11. Вложение и криосекция

1. Подготовьте криоформы с ОКТ, позиционируйте лёгкие и встраивайте в ОКТ.
2. Заморозьте с помощью жидкого азота. Храните при ˗80 °C.
3. Сечение при 10 мкм после уравновешения. Сушка на воздухе проходит ночью.

12. Визуализация и анализ

1. Участки для мойки с помощью PBS (3×).
2. Крепите с помощью DAPI medium.
3. Получите конфокальные z-стеки.
4. Используйте соответствующие настройки визуализации.
5. Выполните 3D-реконструкцию.
6. Количественно оценивайте колокализацию с помощью последовательных порогов.
   Дополнительные методы:
   Эти необязательные методы не включены в репрезентативный рабочий процесс, но могут быть внедрены для обеспечения истощения или анализа популяции иммунных клеток CD45⁺, которая составляет значительную долю клеток^{лёгких 12}.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте истощение или исключение CD45⁺, когда анализ сосредоточен на неиммунных популяциях легких, поскольку эти этапы удаляют или разделяют сигналы поглощения иммунных клеток и изменяют клеточный состав образца. Окрашивание CD45 также может использоваться для отдельного анализа популяции иммунных клеток CD45⁺.

13. Истощение CD45⁺ клеточной популяции

1. После диссоциации тканей (Шаг 6) используйте либо антитело CD45, конъюгированное с магнитной шарикиной (Miltenyi Biotech 130-052-301), либо антитело CD45, конъюгированное с флуорофором, совместимое с Cy5.5, GFP и живым/мертвым пятном, например CD45-BV605 (BioLegend #103140). Покрасьте 20 минут при 4°C в темноте.
2. Если вы выполняете истощение шариков по магниту CD45, следуйте инструкциям производителя по использованию колонки Lineage Depletion (LD) (Miltenyi Biotech 130-042-901) и переходите к разделению магнитных клеток (MACS) (Miltenyi Biotech). Затем переходите к сортировке FACS по парным дробям (шаг 7).
3. Если вы проводите истощение CD45 с помощью флуоресцентно конъюгированного антитела, сначала промыйте суспензию клеток буфером для удаления избыточного антитела. Затем переходите к шагу 7. После установления элементов для исключения дублетов и обломков (шаг 7.3) вставьте дополнительный элемент для исключения популяции CD45⁺ . Затем переходите к шагу 7.4.

14. Проанализировать популяцию клеток CD45⁺ во время потоковой цитометрии

1. После шага 9.3 используйте антитело CD45, конъюгированное с флуорофором, совместимое с Cy5.5, GFP и живой/мёртвой окраской, например, CD45-BV605 (BioLegend #103140). Покрасьте 20 минут при 4°C в темноте.
2. Промой клеточный суспензия буфером для промывания, чтобы удалить избыточные антитела. Затем переходите к шагу 9.4. После установки ворот для исключения дублетов и мусора (шаг 9.6) вставьте дополнительный элемент для исключения ^{популяции} CD45+ перед установкой ^{популяций GFP+} и Cy5.5^{+ 12}.

Результаты

Успешное применение этого протокола должно привести к согласованным доказательствам из трёх дополнительных показаний: парной фракции scRNA-seq, цитометрии потока на основе репортеров и конфокальной z-стековой визуализации.

В анализе парных фракций scRNA-seq были извлечены отдельные фракции легких Cy5.5⁻ и Cy5.5⁺ после системного введения cR11A-Cy5.5 и проанализированы отдельно. Визуализация UMAP выявила основные популяции лёгких клеток, включая иммунные, эндотелиальные, эпителиальные и мезенхимальные компартменты (рисунок 1A, B). Хотя иммунные клетки представляли собой доминирующую популяцию в обеих отсортированных фракциях, фракция Cy5.5⁺ показала относительное обогащение неиммунных компартментов, включая эпителиальные клетки (рисунок 1C). Анализ эпителиальных подмножеств показал более высокое представление AT2-клеток в фракции Cy5.5⁺, чем в фракции Cy5.5⁻, тогда как клетки AT1 оставались низкими в обеих фракциях (рисунок 1D). Эти результаты показывают, что парные фракции scRNA-seq могут выявлять обогащение AT2-клеток внутри cR11A-Cy5.5–положительной фракции лёгких клеток.

Потокная цитометрия использовалась для количественной оценки сигнала cR11A-Cy5.5 внутри репортер-определённых AT2-ячей. Репрезентативное гейтинг включало отбор всех клеток с помощью FSC-A/SSC-A, два последовательных синглетных элемента, гейтинг живых клеток и финальный GFP по сравнению с ним. Анализ Cy5.5 (рисунок 2A–E). В контрольной выборке события GFP⁺/Cy5.5⁺ были минимальными, что позволило определить фоновой порог флуоресценции. После введения cR11A-Cy5.5 положительные репортёрные события GFP⁺/Cy5.5⁺ AT2 увеличились до 7,99% через 15 минут и 7,41% через 60 минут после инъекции в этом репрезентативном наборе данных (рисунок 2E). Эти результаты подтверждают обнаружение сигнала cR11A-Cy5.5 в репортер-положительных клетках AT2 in vivo.

Конфокальная z-стек-визуализация обеспечивает пространственную валидацию флуоресценции, ассоциированной с пептидами, в срезах лёгких тканей. Для оценки фоновой флуоресценции был включён контрольный модуль без репортеров, который показал минимальный сигнал в каналах GFP и Cy5.5. В репортерных лёгких AT2, обработанных cR11A-Cy5.5, флуоресценция Cy5.5 была обнаружена рядом с репортер-положительными клетками GFP⁺ AT2, а канал колокализации, созданный Imaris, выявил перекрытие между сигналами GFP и Cy5.5 (рисунок 3A). Репрезентативный анализ колокализации Имариса показал 89,6% и 86,8% колокализации в компартменте GFP⁺ AT2 на 15 и 60 минутах соответственно (рисунок 3B).

Неоптимальные результаты могут включать высокую фоновую флуоресценцию Cy5.5 в контрольных образцах, плохое восстановление эпителиальных клеток, низкую жизнеспособность клеток или слабое разделение событий GFP⁺/Cy5.5⁺. Эти проблемы обычно указывают на неполную перфузию, чрезмерное нарушение тканей, недостаточную компенсацию или непоследовательные пороги визуализации.

Рисунок 1: Парная фракция scRNA-seq идентифицирует обогащение альвеолярного эпителия в cR11A-Cy5.5–положительной фракции легких. Суспензии легких с одной клеточкой были отсортированы на фракции Cy5.5⁻ и Cy5.5⁺ после ретро-орбитального введения cR11A-Cy5.5, и каждая фракция анализировалась с помощью секвенирования одноклеточной РНК. (A) Графики UMAP показывают кластеры ячеек в соответствующих дробях от представительной мыши. (B) Наложение UMAP показывает распределение ячеек Cy5.5⁻ и Cy5.5⁺. Окружённые области в (A) и (B) обозначают эпителиальный компартмент, выделенный для анализа эпителиальных подмножеств. (C) Иммунные популяции широко распространены в обеих фракциях, составляя более 80% каждой. По сравнению с фракцией Cy5.5⁻, фракция Cy5.5⁺ содержит большую долю эндотелиальных, эпителиальных и мезенхимальных популяций, что указывает на поглощение cR11A в этих популяциях. (D) Внутри эпителиальной популяции клетки AT2 более выражены в фракции Cy5.5⁺, чем в фракции Cy5.5⁻, тогда как клетки AT1 остаются низкими в обеих фракциях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Валидация потоковой цитометрии поглощения cR11A-Cy5.5 в репортерных лёгких AT2 .Репортерским мышам AT2 вводили cR11A-Cy5.5 путём ретро-орбитальной внутривенной инъекции, а лёгкие брали через 15 или 60 минут после инъекции для подготовки в виде одной клетки. Репрезентативное гейтинг показано для образцов, обработанных с помощью PBS (Ctrl) и cR11A-Cy5.5: (A) клетки были выбраны с помощью FSC-A/SSC-A, (B, C) синглеты были ограничены рассеяным исключением, (D) живые клетки идентифицированы по исключению красителей по жизнеспособности, и (E) GFP (AT2-репортёр) по счёту . Cy5.5 использовался для количественной оценки событий GFP⁺/Cy5.5⁺. В этом репрезентативном наборе данных события GFP⁺/Cy5.5⁺ AT2 составляли примерно 8% как через 15 минут, так и через 60 минут после введения cR11A-Cy5.5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Конфокальная визуализация и колокализационный анализ Имариса при поглощении cR11A-Cy5.5 в репортерных лёгких AT2 .(A) Репрезентативные поля отображаются для нерепортерного управления (Ctrl) и репортерных лёгких с обработкой cR11A-Cy5.5, полученных через 15 или 60 минут после инъекции для криосекции и конфокальной z-стековой визуализации. Сигнал GFP (зелёный) отмечает клетки AT2, а флуоресценция cR11A-Cy5.5 (красная) указывает на сигнал, ассоциированный с пептидом. Панель «Coloc» отображает пиксели или объекты, классифицированные как колокализованные по Имарису (жёлтый), а объединённые изображения иллюстрируют пространственное перекрытие между двумя каналами. Нерепортерский контроль был включён для оценки фоновой флуоресценции в каналах GFP и Cy5.5. (B) Количественная оценка колокализации внутри компартмента GFP⁺ AT2 показывает, что 89,6% и 86,8% сигнала GFP колокализованы с cR11A-Cy5.5 на 15 и 60 минутах соответственно. Эти данные свидетельствуют о устойчивом пересечении с ячейками GFP⁺ AT2 в обеих временных точках, что поддерживает преимущественное включение отсека AT2 in vivo. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Этот протокол определяет таргетирование пептидов на конкретные популяции клеток с помощью нескольких независимых показаний, работающих с комплементарным разрешением: картирование на уровне транскриптома (парная фракция scRNA-seq), количественное измерение на основе событий (цитометрия потока репортеров) и пространственное подтверждение (конфокальные z-стеки). Вместе эти подходы уменьшают распространённые неоднозначности, присущие исследованиям на основе флуоресцентного или объемного биораспределения на уровне органов, такие как смешивание сосудистой флуоресценции или внеклеточное удержание, а также невозможность присвоить пептидно-ассоциированный сигнал конкретным популяциям лёгких⁷.

Несколько этапов требуют особого внимания. Качество перфузии сильно влияет на фоновую флуоресценцию и производительность сортировки по следующему потоку; Достаточная перфузия характеризуется равномерным, белоснежным видом всех долей лёгких, тогда как неполная перфузия может повысить сигнал Cy5.5 в нецелевых компартментах. Для диссоциации тканей используется длительное холодное пищеварение (4 °C, 20 ч) вместо типичных условий пищеварения (37 °C, 1–2 часа) для сохранения эпителиальных популяций и улучшения восстановления хрупких клеток, особенно альвеолярных клеток типа I (AT1^{) 10}. Клетки AT1 легко теряются при изоляции, так как их крупная, тонкая морфология делает их очень чувствительными к механическому перевариванию. Помимо стандартных лабораторных практик, включая последовательное переваривание, компенсацию, гейтинг и пороговое определение, анализ 3D-колокализации помогает определить, перекрывается ли пептидный сигнал с сигналом AT2-репортёра, а не зависит только от двумерного перекрытия^{флуоресценции 13}.

Перед количественной оценкой scRNA-seq или проточной цитометрией может быть рассмотрен этап истощения иммунных клеток CD45⁺. Иммунные клетки составляют значительную долю популяций лёгких и могут поглощать CPP как часть типичного иммунного ответа на чужеродные частицы. Для более точной количественной оценки поглощения CPP в неиммунных популяциях, включая эндотелиальные, эпителиальные и мезенхимальные компартменты, истощение CD45⁺ клеток может повысить чувствительность. Этого можно достичь с помощью истощения на основе бусинок перед сортировкой или исключая клетки CD45⁺ при анализе потоковой^{цитометрии 12}. Однако эту модификацию следует использовать селективно, так как она удаляет информацию о поглощении иммунных клеток и изменяет клеточный состав анализируемого образца.

Следует учитывать несколько ограничений этого рабочего процесса. Флуоресценция Cy5.5 идентифицирует сигнал, ассоциированный с пептидом, но сама по себе не различает внутреннее, прилипший к мембране или перицеллюлярный сигнал. Парная фракция scRNA-seq также зависит от диссоциации тканей, восстановления клеток, порогов сортировки и относительной численности каждой популяции лёгких клеток. Поэтому редкие популяции, такие как базальные клетки или ионоциты, могут быть недостаточно представлены или упущены. Цитометрия репортерного мышиного потока обеспечивает более сильное распределение типов клеток, но требует соответствующей репортерной линии или валидированной панели антител. Кроме того, управление транспортным средством с использованием репортерских мышей лучше определит фоновую колокализацию внутри клеток GFP⁺ AT2 в визуализационных анализах. Поэтому интерпретация должна основываться на согласованных данных по scRNA-seq, проточной цитометрии и конфокальной визуализации, а не на каком-либо единичном показании.

Этот рабочий процесс модульный и может быть адаптирован под альтернативные флуорофоры, репортерные линии мыши, схемы дозирования или временные точки сбора урожая. Для исследований, направленных на развитие дополнительных клеточно- или органоспецифических CPP, дизайн scRNA-seq с парными фракциями может применяться с модификациями к другим органам (например, печени, почки или мозгу). Этот протокол обеспечивает эффективный подход к сравнению популяций, связанных с пептидами, внутри одного органа одного и того же животного, что повышает интерпретируемость и снижает изменчивость между животными. Будущие применения включают скрининг дополнительных CPP, тестирование конъюгатов CPP–карго, сравнение линейных и циклических конструкций пептидов, а также применение рабочих процессов к моделям заболеваний, в которых изменяется архитектура ткани или численность целевых клеток.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Anti-mouse CD45-BV605 antibody	BioLegend	103140	Используется для идентификации или исключения клеток CD45+
Мыши C57BL/6J	The Jackson Laboratory	Штамм #000664	Дикий тип мышей, используемых для экспериментов
CD45 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotec	130-052-301	Используется для магнитного очищения клеток CD45+
Счетчик клеток	Invitrogen	Countess 3; AMQAX2000	Автоматизированный счет клеток
Инкубатор CO2	Thermo Scientific	Heracell VIOS 160i; TSH160IDS	Инкубация клеток
Конфокальный микроскоп	Zeiss	LSM 980; 1872-551	Используется для получения изображений z-stack
Пептид cR11A-Cy5.5	Mayo Clinic Proteomics Core	Кастомный синтез; нет номеров каталога	Флуоресцентно метченный CPP, используемый для in vivo доставки
Криостат	Leica Biosystems	Leica CM1950	Используется для секционирования тканей
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693-1G	Фермент, используемый для растворения ткани легких
DMEM/F12	Gibco	11330-032	Буфер для диссоциации клеток и их мойки
DNase I	Roche	10104159001	Снижает скопление клеток, вызванное ДНК
Сортировщик клеток FACS	BD Biosciences	BD FACSAria II, 4 лазерной системы	Используется для сортировки Cy5.5+ и Cy5.5- клеток
FBS	Gibco	A52567-01	Добавляется в буферы для улучшения жизнеспособности клеток
Программное обеспечение FlowJo	FlowJo	Версия 10.10.0	Анализ данных потокового цитометра
Программное обеспечение GraphPad Prism	GraphPad Software	Версия 10	Статистический анализ и построение графиков
Программное обеспечение Imaris	Oxford Instruments	Версия 9.9.1	3D визуализация и анализ коллокаций
Орбитальный инкубатор-шейкер	Thermo Scientific	Solaris; 01-258-086	Используется для растворения тканей
Кетамин	WestWard (Hikma)	NDC 0143-9508-01
LD колонки	Miltenyi Biotec	130-042-901	Используется для магнитной сепарации клеток (MACS)
LD колонки	Miltenyi Biotec	130-042-901
Набор для окрашивания клеток Live/dead fixable yellow dead cell stain	Invitrogen	L34968	Используется для окрашивания виable клеток в потоковом цитометре
Набор для окрашивания клеток Live/dead fixable yellow dead cell stain	Invitrogen	L34968
Мыши с репортерным геном LSL-GFP	The Jackson Laboratory	Штамм #007906	Cre-индуцируемая линия репортера GFP
Мыши с репортерным геном LSL-GFP	The Jackson Laboratory	Штамм #007906
Микроцентрифуга	Eppendorf	EPP-5427R	Центрифугирование образцов
Микроцентрифуга	Eppendorf	EPP-5427R
Среда для монтирования с DAPI	Abcam	AB104139	Ядерная контростент для иммунофлуоресценции
Среда для монтирования с DAPI	Abcam	AB104139
Нуклеаз-свободная вода	Qiagen	175034992
Игла для орального зонда	Braintree Scientific	N-PK 020
PBS	Gibco	10010-023	Общий буфер для мойки
PBS	Gibco	10010-023
Пенициллин-стрептомицин	Gibco	15140-122	Предотвращает бактериальную контаминацию
Пенициллин-стрептомицин	Gibco	15140-122
Холодильный центробежный аппарат	Thermo Scientific	ST16R; TSST16R	Пеллирование клеток при контролируемой температуре
Холодильный центробежный аппарат	Thermo Scientific	ST16R; TSST16R
Физиологический раствор	Baxter	2F7124
Мыши Sftpc-CreERT2	The Jackson Laboratory	Штамм #028054	АТ2-специфичная индуцируемая линия Cre
Мыши Sftpc-CreERT2	The Jackson Laboratory	Штамм #028054
Мыши Sftpc-CreERT2(+/−);LSL-GFP(+/−) АТ2-репортер	Внутрилабораторное разведение	Получены скрещиванием мышей Sftpc-CreERT2(+/+) и LSL-GFP(+/+)	Используется для АТ2-специфичного метки GFP
Мыши Sftpc-CreERT2(+/−);LSL-GFP(+/−) АТ2-репортер	Внутрилабораторное разведение	Получены скрещиванием мышей Sftpc-CreERT2(+/+) и LSL-GFP(+/+)
Ш