Количественный микро-КТ-анализ паренхимы лёгких и ремоделирования дыхательных путей в модели феррета при фиброзе лёгочных

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол использования микро-КТ для количественной оценки характеристик фиброза лёгких, индуцированного блеомицином, в модели хорьков. Эта модель хорька демонстрирует сильный трансляционный потенциал для понимания фиброза лёгочных и тестирования новых методов лечения.

Аннотация

Лёгочный фиброз (ПФ) — это хроническое и прогрессирующее заболевание легких, характеризующееся повторяющимся повреждением альвеоляр, приводящим к утолщению паренхимы, рубцованию и нарушению дыхания. Современные модели грызунов, особенно те, что используют блеомицин (BLEO), имеют ограниченное трансляционное значение для человеческого идиопатического лёгочного фиброза (IPF) из-за анатомических различий, таких как отсутствие респираторных бронхиол. Чтобы решить это ограничение, мы разработали модель лёгочного фиброза на крупных животных у хорьков, у которых есть респираторные бронхиолы, похожие на человеческие. Трехмесячные хорьки дикого типа получили внутритрахеальную инстилляцию BLEO. Лёгкие были взяты через 8 недель после обработки для микрокомпьютерной томографии (микроКТ) и гистологической оценки. Из-за ограниченного пространственного разрешения мультидетекторной КТ (MDCT) при визуализации узких дыхательных путей хорьков, вырезанные лёгкие экс виво были снимены с помощью микро-КТ-сканера при контролируемом давлении дыхательных путей (0 см·ч₂° и 25 см·ч₂°°) для имитации выдоховых и дыхательных условий.

Микрокомпьютерная томография выявила чёткие структурные различия между нормальными и лёгкими, обработанными с помощью BLEO, у хорьков. Нормальные лёгкие демонстрировали низкую атенуацию и сохраненную архитектуру, тогда как лёгкие, обработанные BLEO, демонстрировали заметно повышенное затухание, характерное для фиброза. Признаки, характерные для фиброзного заболевания лёгких у человека, включая соты с кистозными пространствами, утолщённые межлобулярные перегородки и непрозрачность измельчённого стекла, указывающие на ранние фиброзные или воспалительные изменения. С помощью количественного микро-КТ-анализа было обнаружено, что дыхательные пути в лёгких хорьков, обработанных BLEO, демонстрировали значительно сниженное радиальное расширение, продольное растяжение и изменение объёма при обоих приложенных давлениях. Кроме того, анализ по поколениям выявил значительное утолщение стенок дыхательных путей в областях с видимым фиброзом. Гистологическая оценка, включая трихромное окрашивание Массона, подтвердила обширное накопление коллагена и фиброз.

Это исследование показывает, что хорьки, обработанные BLEO, развивают радиологические, механические и гистопатологические признаки, напоминающие человеческий лёгочный фиброз. Кроме того, микро-КТ позволяет с высокой четкостью оценивать распределение фиброзов, динамику дыхательных путей и изменения объёма лёгких. Эти результаты подчёркивают потенциал хорька как трансляционной модели для изучения патогенеза ПФ и оценки новых терапевтических стратегий.

Введение

Легочная фиброз (ПФ) — это хроническое и прогрессирующее интерстициальное заболевание легких, при котором повторяющиеся повреждения альвеолы вызывают утолщение паренхимы, фиброз и прогрессирующую дисфункцию^{дыхательных путей 1}. Лёгочный фиброз может быть вызван различными воздействиями, включая медикаменты, токсины окружающей среды, инфекции, скрытые аутоиммунные заболевания, или может быть^{идиопатическим 1}. Хотя медикаменты были разработаны для замедления прогрессирования заболевания, особенно у пациентов с идиопатическим лёгочным фиброзом (ИПФ), лёгочный фиброз остаётся неизлечимым, с выживаемостью 3–5 лет после постановки^{диагноза 1,2}. В большинстве случаев единственным окончательным методом лечения является пересадка лёгких; Поэтому существует острая необходимость разработать новые и более эффективные терапевтические методы.

Блеомицин — это препарат, который обычно используется у людей для лечения злокачественных заболеваний; Однако его использование ограничено токсичностью лёгких, которая может быстро перерасти в лёгочный^{фиброз 3}. После открытия этого побочного эффекта блеомицин был использован в исследованиях для создания животных моделей лёгочного фиброза. Мыши часто использовались для этой^{цели 4,5,6} с различными методами введения блеомицина, включая внутривенную и внутритрахеальную^{инстилляцию 7,8}. Хотя фиброз развивается в этих моделях, ни одна из них не охватывает все основные признаки лёгочного фиброза, наблюдаемые у^{людей 8}. Гризуны не отражают ключевые признаки прогрессирующего заболевания, включая формирование сотовидных кист и бронхиолизацию дистальных^{альвеол 9}. Кроме того, исследования показали, что повреждение легких, вызванное блеомицином, начинает проявляться спонтанно у грызунов примерно через 28 дней после лечения^{блеомицином 10}. Кроме того, ни один из препаратов, показанных как подавляющий фиброз в этих моделях, не оказал аналогичного эффекта у людей, что ограничило наши терапевтические^{возможности 11}.

Домашние хорьки (Mustela putorius furo) всё чаще используются в респираторных биомедицинских исследованиях из-за их анатомического сходства с человеческой дыхательной^{системой 12}. Кроме того, они подвержены схожим респираторным патогенам, которые заражают людей, включая респираторно-синцитиальный вирус (РСВ) и грипп, что демонстрирует их физиологические^{сходства 12}. Модели Ферретов с блеомицином демонстрируют бронхиолизацию, формирование фиброзных очагов и наличие аберрантных базалоидных клеток (KRT7⁺/KRT17⁺/KRT5^–/TP63⁺)⁹. Одноразовая доза блеомицина вызывала устойчивый фиброз лёгких у хорьков, при этом ограничительная физиология и фиброзные аномалии лёгких сохранялись не менее 22^{недель 13}. Это открытие существенно отличается от широко используемой модели блеомицина у мышей, где фиброз обычно самоограничивающийся и начинает проходить примерно через 28 дней, с существенной регрессией через 6–8 недель, что говорит о том, что модель хорьков может лучше воссоздать хронический и прогрессирующий характер фиброза лёгочных у человека. Кроме того, хорьки в последнее время начали использовать в исследованиях муковисцидоза — системного заболевания, которое чаще всего поражает дыхательную систему из-за их сходства с^{людьми 14}. Поэтому эти животные могут служить лучшими моделями для ПФ, чем предыдущие модели грызунов.

Текущее исследование было направлено на создание животной модели фиброза лёгких, которая бы больше напоминала человеческое состояние. Мы ввели внутритрахеальный блеомицин домашним хорькам. Через 8 недель эти хорьки продемонстрировали рентгенографические и гистологические изменения, аналогичные тем, что наблюдались у людей с лёгочным фиброзом.

Протокол

Все процедуры с животными проводились в соответствии с руководящими принципами и правилами Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) при Мичиганском государственном университете (No одобрения протокола для животных). PROTO202300066). Протоколы ухода за животными и экспериментальные протоколы были одобрены Университетом штата Мичиган и выполнялись в соответствии с институциональными стандартами этического использования животных в исследованиях.

1. Бронхоскопическое введение блеомицина у хорьков

1. Приобретайте самцов хорьков в возрасте 3–4 месяца. Средний вес самца хорька в этом возрасте должен составлять примерно 0,9–1,6 кг. Содержать животных при температуре 21 °C при влажности 40–50%.
2. Введите хорьку 3%–5% изофлуран с помощью прецизионного аппарата для анестезии с использованием испарителя.
3. Поддерживайте анестезию, закрывая нос хорька носовым конусом, и продолжайте вводить газ изофлуран в концентрации 3–5%.
4. Когда хорёк достаточно седирован и лежит, начинайте бронхоскопию с использованием бронхоскопа наружного диаметра 2,7 мм.
5. Введите смесь блеомицина (2 U/кг массы тела) и физиологического раствора через рабочий канал в дистальную трахею, чтобы обеспечить диффузное распространение блеомицина. Убедитесь, что общий объём инстилляции не превышает 1 мл. Верните хорьков в соответствующие жилые единицы и наблюдайте за ним в течение 8 недель.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инсталяция должна занять не более двух минут.
6. Вводите изофлуран с помощью прецизионного аппарата для газовой анестезии с использованием испарителя. Накройте нос хорька носовым конусом и введите 1%–5% изофлуран до тех пор, пока хорёк не станет лежащим. Продолжайте воздействие газов до тех пор, пока не будет подтверждена предполагаемая клиническая смерть. Вводите внутривенный раствор для эвтаназии в дозе 90 мг/кг и контролируйте жизненные показатели до подтверждения смерти.
7. Взятие легких через 8 недель после обработки для микрокомпьютерной томографии (микро-КТ) и гистологической оценки.

2. Высокоразрешающая микро-КТ лёгких хорьков

1. Подготовьте вырезанную ткань лёгких к визуализации, удаляя посторонние ткани и кровь через разрез нижней полой вены, чтобы обеспечить кровоотток. Проведите КТ сразу после подготовки лёгких.
2. Получить томографические микро-КТ-изображения с помощью микро-КТ-системы со следующими настройками получения изображений: 90 кэВ, 88 мА, настройка мощности с коллиматорным фильтром меди 60 мкм и алюминиевым коллиматором 500 мкм, с использованием поля обзора (FOV) 72 мм при изотропном разрешении изображения 144 мкм.
3. Получить в общей сложности 5 изображений при стандартном времени 18 секунд с использованием автоматического протокола сшивания для перекрытия, сшивания и отклонения дублирующихся срезов с целью создания окончательного сшитого изображения для анализа дыхательных каналов; это приведёт к тому, что FOV диаметром 68 мм x 186 мм общая глубина сшитого изображения (Z-плоскость) при воксельном разрешении 144 мкм, что позволит полностью захватить весь ex vivo блок лёгких хорьков.
   1. Повторяйте этот протокол визуализации для каждого набора лёгких хорьков ex vivo при давлении в лёгких 0 см·ч₂₀и 25_см·ч2 0.
   2. Используйте систему контроля давления, напрямую подключённую к лёгкому, чтобы точно контролировать и поддерживать давление в дыхательных путях во время визуализации.
   3. Подключите измеритель давления к регулируемому источнику потока воздуха, чтобы обеспечить непрерывную регулировку внутрилегочного давления.
   4. Перед визуализацией установите в системе желаемый уровень давления (либо 0 cmH₂O, либо 25 cmH₂O) и надуйте лёгкие с помощью постоянного воздушного потока.
   5. Во время визуализации используйте измеритель давления для получения обратной связи в реальном времени о давлении в дыхательных путях и компенсации незначительных колебаний давления с помощью источника потока воздуха.

3. Обработка и сегментация изображений

1. Загрузите восстановленные тома микро-КТ изображений в формате DICOM, которые преобразуются в формат инициативы нейровизуализации информатики (NIfTI), в конвейер сегментации дыхательных путей.
2. Определите область интереса (ROI) на микро-КТ-изображении, вручную обрезая осевые срезы на верхнем конце, чтобы исключить трубку и другие трахеальные вставки (см. рисунок 1A).
3. Выполните сегментацию дыхательных путей с помощью автоматизированного алгоритма^{Freeze-and-Grow 15,16}, описанного в следующих основных шагах.
   1. Поместите семя внутри трахеи на самый верхний осевой срез изображения внутри ROI; создать пустой массив изображений входного размера, чтобы отразить начальный уверенный объем дыхательных путей (CAV), при этом все воксели назначены на '0'; и добавить воксель семя в CAV, установив его значение в '1'.
   2. Установите начальный консервативный порог интенсивности микро-КТ t t = -1000 HU для сегментации просвета дыхательных путей.
   3. Создайте пустой массив изображений размера входного изображения для представления запретного объёма (FV) со всеми вокселями, инициализированными в '0'.
   4. Повторяйте итеративную сегментацию до сходимости сегментации просвета дыхательных путей, определённой одним из двух флагов: 1) весь пороговый диапазон (от -1000 до -600 HU) будет отмечен, или 2) все воксели '0', соседствующие с вокселями '1' на FV-изображении, помечены как '1' на FV-изображении.
      1. Вычислите центральное дерево^{CAV 17} и определите конечные точки^{ветви 18}.
      2. Примените двоичный порог к микро-CT-образу при текущем значении t и вычислите новый пролюменный том¹⁸ с CAV в качестве семян по пороговой области (воксельное значение ≤ t), исключая FV.
      3. Для каждой концевой точки CAV вычислите соответствующие воксели внутри нового объема люмена, исключая CAV, которые ближе к этой точке, чем к любым другим конечным точкам CAV.
      4. Обнаружить конечную точку CAV с большим объёмом сопутствующих вокселей (>150 вокселей, что эквивалентно 0,5^{мм 3}) как потенциальные участки утечки в новом объёме просвета.
      5. Подтвердить потенциальную утечку просвета с использованием автоматических критериев, очерченных в Nadeem и ^др.15.
      6. Удалите все утечки в объёме просвета, удаляя объём поддерева вдали от корней утечки, и добавьте воксели вокруг корней утечки для усиления FV с использованием алгоритмов, описанных^{выше 15}.
      7. Назначьте объём люмена, удалённого после утечки, для обновления CAV с использованием описанных ранее^{алгоритмов 15}.
      8. Увеличите порог t на '1'.
      9. Перейдите к шагу 3.3.4.
4. Выполните вычисление одновоксельного дерева центральной линии дыхательных путей с использованием ранее проверенного автоматизированного^{алгоритма 17} , описанного в следующих основных шагах.
   1. Введите сегментированное дерево дыхательных путей в виде бинарного изображения NIfTI.
   2. Вычислите начальное дерево центральной линии дыхательных путей с помощью медиально предпочтительного подхода с минимальной стоимостью^{пути 17} , описанного в следующих основных шагах.
      1. Создайте пустой массив скелетных изображений размера входного изображения, при этом все воксели назначены на '0'; Добавьте автоматический посев шага 3.3.1 в качестве начального вокселя скелета со значением '1'.
      2. Создайте пустой массив изображений входного размера, при этом все воксели назначены в '0', чтобы представить изображение объёма дыхательных путей.
      3. Определите воксель в неотмеченном объёме дыхательных путей, который находится дальше всего от текущего скелета, и вычислите медиально предпочтительный путь минимальной стоимости, соединяющий эту точку с текущим скелетом, используя алгоритм, описанный^{ранее 17}.
      4. Добавьте полученный путь как новую скелетную ветвь к массиву скелетных изображений и обновите объём, отмеченный дыхателем, применяя локальное масштабно-адаптивное расширение вдоль ветви, как описано^{ранее 17}.
      5. Повторяйте шаги 3.4.2.3–3.4.2.4, пока отмеченный объём дыхательных путей не будет заполнен.
   3. Обрезайте ложные топологические ветви при сохранении истинных центральных линий дыхательных путей, используя локальную масштабную стратегию отбора по длине ветви, как описано^ранее.
   4. Устраните простые^{точки 19} в центральной линии воздуха, которые не являются концами ветви (то есть те, что прилегают к более чем одному вокселю центральной линии), чтобы обеспечить топологическую согласованность и сохранить центральную линию толщиной в один воксель.
5. Проведите сегментацию паренхимы лёгких на микроснимках лёгких хорьков при 0_{смЧ 20}.
   1. Вручную определите паренхиму лёгких на каждом пятом срезе коронального изображения с помощью вычислительных алгоритмов и графических интерфейсов, встроенных в ITK-SNAP²⁰.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Контраст интенсивности микро-КТ между паренхимой лёгких и окружающим фоном при состоянии надувания 25 см·ч₂₀был недостаточным, что мешало надёжной сегментации объёма лёгких.
   2. Примените интерполяцию изображений для генерации сегментации паренхимы лёгких на промежуточных срезах изображения.
   3. Провести вторичный обзор контроля качества для обеспечения структурной непрерывности сегментации паренхимы как по оському, так и по сагиттальному направлениям.
   4. Исключить просвет дыхательных путей и области стенок из паренхимы легких с помощью локального масштабного расширения объёма просвета, а затем вычесть расширенный объём из паренхимы лёгких.
6. Количественная оценка механических измерений воздушных^{путей 21}.
   1. Количественно измерить радиальное расширение отдельных дыхательных путей, связанное с дыханием, измеряя изменения пространственно совпадающей площади сечения просвета дыхательных путей (CSA) между объёмами дыхательных (25_см·ч 2 O) и выдохом (0 см·ч₂° надуваний) лёгких. Вычислим радиальное расширение на ветви дыхательных путей b, обозначаемое как Δ_air-R(b), как:
      (1)
      где_{CSA ins}(b) и_{CSA exp}(b) обозначают просвет дыхательных путей CSA при дыхательных и выдоховых объёмах легких. CSA в точке b вычисляется с помощью радиального линейного трассировки и локально адаптивных методов полу-максимума по центральной половине ветви b²².
   2. Количественно определите продольную растяжение отдельных дыхательных путей, связанное с дыханием, следующим образом:
      (2)
      где L_ins(b) и L_exp(b) обозначают геодезические длины путей ветви дыхательных путей b при вдыхательных и выдоховых объёмах лёгких соответственно. Длина геодезического пути ветви вычисляется путём прослеживания центральной линии от карины до дистальной конечной точки^{ветви 21}.
7. Количественно определите интенсивность измерения паренхимы лёгких.
   1. Пространственно визуализируйте распределение интенсивности микро-КТ паренхимы лёгких у здоровых и фиброзных хорьков, создавая «сквозное 3D-изображение объема» объема паренхимы лёгких в контексте дыхательных путей. Реализуйте эффект просмотра с помощью микро-CT интенситет-отображения прозрачности и цветового кодирования. Применяйте одинаковые масштабы прозрачности и цветокодирования как для здоровых, так и к фиброзных лёгких хорьков. Для генерации 3D-объема с просмотром применяются следующие шаги.
      1. Используйте 3D Slicer²³ для открытия трёхмерного (3D) изображения сегментации дыхательных путей с надувкой 0 см·ч₂₀в виде «сегментации».
      2. Сгенерируйте 3D-изображение дыхательных путей с помощью модуля сегментации . Выберите объём дыхательных путей в качестве входа и на вкладке « Представления » нажмите «Создать » в опции «Закрытая поверхность ».
      3. Импортировать микро-КТ-изображение интенсивности с разделённой паренхимой лёгких в 3D-слайсер в формате объёма. На этом изображении исходные значения интенсивности микро-КТ сохраняются для вокселей лёгких, тогда как всем нелегочным вокселям присвоено значение -2000 HU.
      4. Настройте отображение цвета и прозрачности для интенсивности паренхимы лёгких с помощью модуля Volume Rendering . Отображение значений интенсивности -1500 HU, -600 HU, 0 HU и 1500 HU на чёрный, зелёный, жёлтый и красный цвета с непрозрачностью 0, 0,15, 0,3 и 1 соответственно.
   2. Используйте разработанный в этом исследовании алгоритм для оценки доли заболевшей ткани в паренхиме лёгких, анализируя наблюдаемое распределение интенсивности с помощью микро-КТ. Метод предполагает, что значения интенсивности здоровых паренхимальных областей следуют гауссовскому распределению. В отличие от этого, фиброзные области с характерно более высокой интенсивностью искажают гауссовство правой стороны наблюдаемой гистограммы. Выполните эту задачу следующими шагами.
      1. Вычислите гистограмму для изолированного паренхимального изображения легких на шаге 3.7.1.3 с 50 бинами в диапазоне интенсивности от -1500 HU до 500 HU.
      2. Вычислите среднее целевой гауссового распределения как моду гистограммы и выведите стандартный параметр отклонения, используя значения интенсивности слева от режима на гистограмме.
      3. Количественно определить объём фиброзной ткани как избыточную площадь на правой стороне наблюдаемой гистограммы, расположенную выше ожидаемой гауссовой кривой распределения, определяемой средним и стандартным отклонением, полученными на шаге 3.7.2.2.
      4. Вычислите долю заболённой ткани как отношение объёма фиброзной ткани к общему количеству гистограмм, представляющего объём паренхимальной области.

Результаты

Из пяти хорьков удаленные лёгкие одного здорового хорька и одного фиброзного хорька были снимены с помощью микро-КТ-сканера при контролируемом дыхательном давлении 0_{смЧ 2}О и 25 смЧ₂О для имитации выдохи и вдыхающих надуваний лёгких соответственно.

Рисунок 1 иллюстрирует промежуточные результаты конвейера обработки изображений для микро-КТ-изображения (рисунок 1A) лёгкого хорька ex vivo при давлении 0 смЧ₂°O. На рисунке 1B представлены промежуточные результаты сегментации объёма дыхательных путей по итерациям и соответствующие пороговые параметры на микро-КТ-изображении вырезанного лёгкого хорька, надутого до 0 смЧ₂O. Рисунок 1B демонстрирует эффективность алгоритма FG в захвате меньших дыхательных путей через релаксацию параметров в последующих итерациях. Рисунок 1C иллюстрирует результаты обнаружения деревьев по центральной линии дыхательных путей до и после обрезки ложных ветвей.

Было замечено, что после пятого поколения количество обнаруженных дыхательных путей в фиброзных лёгких значительно меньше, чем при соответствующем генерации в здоровых лёгких (рисунок 2A). В частности, в здоровых лёгких после пятого поколения было обнаружено 161 ветвь дыхательных путей, тогда как в фиброзных лёгких за соответствующие поколения — только 91 дыхательный путь. В целом, стенки дыхательных путей в фиброзных лёгких были толще, чем в здоровых лёгких (рисунок 2B). Вычислительный анализ выявил значительное увеличение толщины стенок дыхательных путей, нормализованных по диаметру просвета, в областях с видимым фиброзом по сравнению с соответствующими областями здорового лёгкого.

Фиброзные лёгкие демонстрировали небольшие, толстостенные кистозные пространства, соответствующие сотообразному сооружению, утолщению междочечных перегородок и участкам непрозрачности грунтового стекла. Непрозрачность грунтового стекла относится к областям лёгких, где утолщённая ткань лёгких и частично заполненное воздушное пространство делают область затуманенной и серой на КТ-снимках. Было замечено, что фиброзные лёгкие имели более высокие значения интенсивности КТ в паренхиме, соответствующих фиброзным областям. Рисунок 3A показывает «просмотр через 3D объем» сегментированного паренхимического объёма лёгких вместе с сегментированным деревом дыхательных путей. Значения интенсивности микро-КТ над паренхимой в лёгких фиброзного хорька (-502 ± 238 HU) были значительно выше (p < 0,001), чем в здоровом лёгком хорька (-588 ± 167 HU). Региональный анализ повышения интенсивности (рисунок 3B) показал, что фиброзное лёгкое имеет 27,8% паренхимального объёма с повышенной интенсивностью КТ (отмечено фиолетовой областью на гистограмме). Для сравнения, здоровое лёгкое имеет всего 1,24% объема паренхимы с повышенной интенсивностью КТ.

Визуальное сравнение механики дыхательных путей между нормальными и больными лёгкими иллюстрирует распределение механических респираторных биомаркеров в здоровых и фиброзных лёгких хорьков по ветвям дыхательных путей (рисунок 4). Радиальное расширение дыхательных путей составило 66,8% ± 9,8% в здоровых лёгких хорька, что значительно выше (p < 0,001), чем у фиброзных хорьков (32,4% ± 7,6%). Также наблюдалось значимое различие (p < 0,001) в продольных растяжении дыхательных путей между здоровыми (35,7% ± 5,3%) и фиброзными (16,0% ± 4,9%) лёгкими хорьков.

Репрезентативные КТ-изображения были получены с помощью микро-КТ-сканера при двух различных давлениях дыхательных путей (0 см·ч_{, 2}° и 25 см/ч₂₀) для каждого лёгкого. Рисунок 5 иллюстрирует различия между нормальными (рисунок 5B, C) и лёгкими, обработанными BLEO (рисунок 5E, F). В нормальных лёгких КТ показывает типичную архитектуру лёгких с низкой атенуацией и отсутствием признаков фиброза (рисунок 5B,C). В отличие от этого, лёгкие хорьков, обработанные BLEO, демонстрируют значительные патологические изменения, включая усиленное ослабление лёгких, что указывает на тканевую фиброз (рисунок 5E,F). Кроме того, наблюдается выраженное сотообразование, характеризующееся кистозными пространствами и утолщёнными межлобулярными перегородками (рисунок 5E,F). Непрозрачность измельчённого стекла (GGO), представляющая участки воспаления или ранних фиброзных изменений, также видна в лёгких, обработанных BLEO (рисунок 5E,F).

Гистологический анализ (рисунок 6) подтвердил значительное ремоделирование тканей и фиброз в лёгких хорьков, обработанных блеомицином. Окрашивание гематоксилином и эозином (HE) выявило сохраненную альвеолярную архитектуру в нормальных лёгких (рисунок 6A, C), тогда как фиброзные лёгкие демонстрировали значительное структурное искажение, увеличенную клеточность, утолщение стенок дыхательных путей и выраженные фиброзные поражения (рисунок 6B,D). Трихромное окрашивание Массона дополнительно показало минимальное отложение коллагена в дыхательных путях и паренхиму нормальных лёгких (рисунок 6E,G), тогда как фиброзные лёгкие демонстрировали заметное накопление коллагена как в дыхательных путях (рисунок 6F), так и в паренхимальных областях (рисунок 6H). Количественный анализ изображений (рисунок 6I,J) подтвердил значительное увеличение коллаген-положительной области в фиброзных лёгких по сравнению с нормальной контрольной системой как в дыхательных путях, так и в паренхимальных отделениях (P < 0,0001), что указывает на обширное внеклеточное отложение матрикса и прогрессивное ремоделирование тканей.

Рисунок 1: Обработка и сегментация КТ-изображений. (A) Выбор области интереса (ROI) на микро-КТ-изображении. Линия обрезки была выбрана вручную, чтобы исключить трубку и другие трахеальные вставки, используемые для надувания вырезанных лёгких хорька. (B) Промежуточные результаты сегментации дыхательных путей на микро-КТ-изображении вырезанного лёгкого хорька, надутого при 0_{смЧ 2}O с использованием алгоритма заморозки и роста (FG). (C) Результаты обнаружения центральной линии до и после обрезки ложных скелетных ветвей, приложенных к объему сегментации дыхательных путей, с микро-КТ-снимка 0_{смЧ 20}. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой рисунка.

Рисунок 2: Вычислительный анализ генерации деревьев дыхательных путей. (A) Количество выявленных дыхательных путей в здоровых и фиброзных лёгких. (B) Различия в толщине стенок дыхательных путей у здоровых и фиброзных лёгких. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Визуализация интенсивности микро-КТ с цветной кодировкой. (A) 3D-визуализация цветокодированных распределений интенсивности микро-КТ по паренхиме для здоровых и фиброзных лёгких хорьков при надувании 0 смH2O. (B) Микро-КТ гистограммы здоровых и фиброзных лёгких хорьков, при этом область гистограммы отмечена фиолетовым цветом, указывая на области повышенной интенсивности КТ на основе гауссовского моделирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Механические биомаркеры дыхательных путей для здоровых и фиброзных хорьков лёгких. Для каждого биомаркера (A показывает радиальное расширение дыхательных путей, B — продольное растяжение дыхательных путей) применялась нормализованная схема цветового кодирования, охватывающая диапазон от μ_x ± 3σ_x, где средние (μ_x) и стандартное отклонение (σ_x) каждой метрики рассчитывались по всем ветвям здорового лёгкого хорька. См. текст для количественных сравнительных результатов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5: Микро-КТ визуализация демонстрирует масштабное структурное ремоделирование и потерю аэрированного объёма лёгких в лёгких, вызванных блеомицином. (A–F) Репрезентативные микроКТ-изображения, полученные при давлении 25 см H₂O, сравнивают здоровых контрольных хорьков (A–C) с фиброзными хорьками, обработанными блеомицином (D–F). Трёхмерные (3D) реконструкции с объёмом (A,D) показывают сохранение архитектуры лёгких и однородное расширение в здоровых лёгких (A), тогда как фиброзные лёгкие (D) демонстрируют уменьшенное расширение лёгких и выраженное паренхимическое искажение. Поперечные (B,E) и корональные (C,F) срезы КТ дополнительно подчёркивают различия между группами. Здоровые лёгкие демонстрируют равномерно аэрированную паренхиму, нормальное ветвление дыхательных путей и минимальную плотность тканей (B,C). В отличие от этого, фиброзные лёгкие демонстрируют обширную двухстороннюю субплевральную и базилярно-доминирующую опасификация, повышенную плотность паренхимы, архитектурные искажения и расширение кистозного воздушного пространства, что соответствует сотообразному ремоделированию (красные стрелки) (E,F). Жёлтые пунктирные линии очерчивают границы лёгких. Эти результаты визуализации указывают на тяжёлое фиброзное ремоделирование и значительное снижение функционального аэрированного объёма лёгких после воздействия блеомицина на хорьков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6: Валидация фиброза лёгких, вызванного BLEO, у хорьков.(A–H) Представительные срезы brightfield гематоксилина и эозина (HE) демонстрируют различия между нормальными лёгкими (A,C) и фиброзными лёгкими (B,D). Изображения HE с низким увеличением показывают сохраненную альвеолярную архитектуру в нормальных лёгких (A), а также обширное ремоделирование тканей и фиброзные поражения в фиброзных лёгких (B). Изображения HE с более высоким увеличением дополнительно подчёркивают нормальную структуру альвеолярных в нормальных лёгких (C), а также повышенную клеточность, утолщение стенок дыхательных путей и архитектурные искажения в фиброзных лёгких (D). Репрезентативные яркие изображения срезов лёгких хорьков, окрашенных трихромом Массона, демонстрируют минимальное отложение коллагена в нормальных лёгких дыхательных путях (E) и паренхиму (G), а также повышенное отложение коллагена (синие) в фиброзных дыхательных путях лёгких (F) и паренхиму (H). (I,J) Количественная оценка коллаген-положительной области показала значительное увеличение отложения коллагена в фиброзных лёгких по сравнению с нормальными легкими как в дыхательных областях (I), так и в паренхиме лёгких (J). P < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

В данном исследовании описывается протокол, сочетающий внутритрахеальное введение блеомицина у хорьков с микрокомпьютерной томографией высокого разрешения ex vivo (микро-КТ) для характеристики структурных и механических особенностей лёгочного фиброза. Микро-КТ может обнаруживать малые дыхательные пути размером до 0,2 мм и измерять их объёмы, толщину, плотность и морфологию. Повышенная плотность тканей, потеря объёма и региональная гетерогенность тесно соответствуют гистопатологии. Основной целью было установить осуществимость и показать, что эта модель крупных животных вместе с передовой аналитикой визуализации способна фиксировать радиологические, дыхательные пути и гистопатологические особенности, напоминающие фиброз лёгких человека. Несколько этапов протокола критически важны для воспроизводимости и интерпретации. Во-первых, бронхоскопически управляемая внутритрахеальная инстилляция блеомицина позволяет диффузно воздействовать на лёгкие и минимизировать скопление проксимальных дыхательных путей, что является известным ограничением моделей мелких^{животных 4,7,11}. Этот подход, вероятно, снижает вариабельность регионального распределения повреждений, что особенно важно для больших лёгких с более сложными ветвлениями дыхательных путей. Во-вторых, выбор 8-недельного времени после инстилляции благоприятствует установленному фиброзу, а не острому воспалению. В мышиных моделях фиброз, вызванный блеомицином, часто частично проходит со временем, ограничивая трансляционную^{релевантность 4,8,11}. В отличие от этого, лёгкие хорьков в этом исследовании продемонстрировали стойкие радиологические и гистологические фиброзные признаки.

Контролируемое надувание лёгких во время экс-виво визуализации является ещё одним важным элементом. Визуализация при стандартизированных давлениях дыхательных путей (0 смH₂O и 25 смH₂O) позволила количественно оценить радиальное расширение дыхательных путей и продольное растяжение, тем самым снижая смешивающие эффекты изменяющегося объёма лёгких и их подчинённости. Эти механические биомаркеры дыхательных путей, полученные с помощью автоматизированных алгоритмов с поколением, предоставляют объективные измерения дисфункции дыхательных путей, которые трудно оценить только с помощью традиционной^{гистологии 15,21}.

Ряд модификаций протокола может дополнительно повысить устойчивость. Дозирование блеомицина можно титрировать или вводить в повторяющихся низких дозах для лучшего моделирования хронического повреждения эпителия, что является центральным для современных парадигм патогенеза лёгочного^{фиброза 1,3}. Стратегии сегментной инстилляции могут позволить сравнивать внутри животных фиброзные и относительно сохранившиеся регионы. С точки зрения визуализации тщательная стандартизация давления дыхательных путей, условий фиксации и температуры крайне важна для минимизации деформации тканей во время экс-виво сканирования. Тяжёлый фиброз может усложнять автоматизированную сегментацию дыхательных путей из-за облитерации дыхательных путей и высокой плотности тканей; Таким образом, адаптивное определение порогов и ручной контроль качества остаются необходимыми дополнениями к автоматизированным^{конвейерам 15}.

У этого метода есть несколько ограничений. Особенно заметно, что небольшое количество животных, изображенных с помощью микро-КТ, ограничивает статистические выводы, и результаты следует интерпретировать как описательные. Эта работа была разработана как пилотное исследование для определения возможности характеристики модели фиброза лёгочной лёгки, индуцированной блеомицином, с помощью количественной микро-КТ. Для подтверждения этих результатов и повышения статистической мощи потребуется будущие исследования с более крупными группами. Однако описание показывает заметное различие в биомаркерах и измерениях визуализации.

Кроме того, несмотря на широкое распространение, блеомицин-индуцированный фиброз остаётся моделью травматизации, вызванной токсинами, и не полностью повторяет многофакторную этиологию идиопатического лёгочного фиброза, включая старение, генетическую восприимчивость и воздействие окружающей^{среды 3,6,11}. Визуализация была проведена ex vivo, что исключало прямую оценку газообмена, сосудистого вклада и прогрессирования продольных заболеваний. Тем не менее, экс-виво микроКТ обеспечивает превосходное пространственное разрешение и позволяет проводить детальный трёхмерный анализ мелких дыхательных путей, что в настоящее время невозможно с помощью клинической мультидетекторной КТ у хорьков.

Несмотря на эти ограничения, этот протокол обладает рядом преимуществ по сравнению с существующими моделями. Хорьки обладают респираторными бронхиолами и паттернами ветвления дыхательных путей, которые больше похожи на человеческие, чем на грызуновых, что делает их особенно подходящими для изучения аспектов фиброза ^6,12. Сочетание человеческой анатомии дыхательных путей с количественной визуализацией на основе микро-КТ позволяет одновременно оценивать плотность паренхимы, толщину стенок дыхательных путей, потерю дыхательных путей и нарушенную механику дыхательных путей. Эти особенности повторяют радиологические паттерны, наблюдаемые при фиброзных заболеваниях лёгких у человека, включая соты, утолщение перегородок и региональную^{гетерогенность 1,2}.

Высокоразрешающая компьютерная томография (ЗГКТ) является ключевым методом визуализации для диагностики и продольного мониторинга идиопатического лёгочного фиброза (ИПФ) в клинической практике. HRCT основана на принципах, схожих с микрокомпьютерной томографией (микро-КТ), и оптимизирована для выявления паренхимальных аномалий лёгких при минимизации радиационного воздействия^{пациентов 24}. Важно отметить, что достижения в области ГГКТ повысили точность диагностики настолько, что хирургическая биопсия лёгких часто больше не требуется для диагностики ИПФ при наличии характерных признаков^{визуализации 25}. Характерные рентгенографические результаты ИПФ, включая архитектурные искажения, бронхоэктаз, соты и кистозные воздушные пространства, можно выявить с помощью ГГКТ у пациентов. В соответствии с этими клиническими наблюдениями, наша модель хорьков демонстрирует искажение дыхательных путей и формирование кистозного воздушного пространства, обнаруживаемые микро-КТ, обеспечивая фенотип визуализации, близок к человеческим заболеваниям.

Помимо ЗГКТ, эндобронхиальная оптическая когерентная томография (EB-OCT) стала ценным методом визуализации для оценки^{ИПФ 26}. EB-OCT — это минимально инвазивная методика, использующая световые волны для создания высококачественных трёхмерных изображений периферических лёгких in vivo с помощью стандартного бронхоскопа²⁶. Подобно HRCT, EB-OCT показала перспективы для выявления фиброзного ремоделирования без необходимости хирургической биопсии. Способность нашей модели хорьков развивать структурные аномалии, обнаруживаемые с помощью КТ, говорит о том, что она также может быть хорошо пригодна для будущей оценки с использованием новых клинических методов визуализации, таких как EB-OCT.

Важно, что многие терапии, снижающие фиброз в моделях грызунов, не показали аналогичной эффективности у^{людей 11}. Описанный здесь подход может помочь преодолеть этот трансляционный разрыв, предоставляя чувствительные, пространственно разрешённые биомаркеры визуализации, отражающие как структуру, так и функцию. Такие биомаркеры могут использоваться для оценки терапевтического ответа за пределами глобальной нагрузки коллагена, фиксируя региональные улучшения в механике дыхательных путей или ремоделировании паренхимы.

В заключение, данное исследование устанавливает жизнеспособный протокол моделирования фиброза лёгких у хорьков и количественной оценки структурных и механических изменений, связанных с заболеваниями, с помощью микро-КТ. Хотя подход предварительный, он подчёркивает потенциал сочетания крупно-животных моделей с передовой аналитикой визуализации для повышения трансляционной значимости, улучшения механистического понимания лёгкового фиброза и поддержки доклинической оценки новых терапевтических стратегий.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1 mL Luer locking syringe	BD	309628
10 mL Luer locking syringe	BD	303134
24 G ´ 3/4" Exel safelet catheter	EXELINT INTERNATIONAL CO.	26751
3 mL Luer locking syringe	BD	309657
30 mL Luer locking syringe	BD	302832
5 mL Luer locking  syringe	BD	309647
BD Precision glide needle 18 G ´ 1 1/1"	BD	305196
BD Precision glide needle 20 G ´ 1"	BD	305175
BD Precision glide needle 23 G ´ 1"	BD	305145
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS -/-)	Gibco	14190250
Endotracheal intubation tubes with cuff oxygen catheter	Caphstion	2.0MM
ET Tube, Uncuffed, 2.0	Teleflex	5-10404
Ethicon Permahand silk suture, Size 2-0, No Needle, 18", 36/Box, A185H	Fisher Scientific	50-209-2809
Invitrogen RNAlater stabilization solution	Fisher Scientific	AM7021
Isoflurane	Covetrus	11695-6777-2
Lubricant PM ointment	AACE Pharmaceuticals	71406-124-35	Глазная мазь
MADgic 700 atomizer	Teleflex	MAD700
Manometer, Professional air pressure meter	Leaton	T168
Rodent ventilator model 683	Harvard Apparatus, Inc.	55-3438
Sterile saline, 0.9%	CellPro	DS0329
Veterinary pulse oximeter	uPM60V	UVMI