Методическая статья

Метод на основе флуоресценции для визуализации липидных капель и динамики органелл во время митоза в клетках гепатомы

160 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71222

⸱

15 мая 2026 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biological Chemistry, Showa Medical University Graduate School of Pharmacy

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол позволяет воспроизводимо визуализировать липидные капли и динамику органелл во время митоза с помощью синхронизированных клеток гепатомы.

Аннотация

Внутриклеточные липидные капли (LDs) повсеместны в нескольких типах клеток. LD хранят нейтральные липиды, такие как триациллглицерин и холестерилэфир, и играют важную роль в энергетическом метаболизме, сигнальном сигнале и стрессовых реакциях. Хотя LD признаются внутриклеточными органеллами, их поведение в ходе прогрессирования клеточных циклов остаётся неясным. Во время митоза несколько органелл, включая митохондрии и аппарат Гольджи, подвергаются обширной ремоделированию и последующей сборке, что ставит под вопрос, подвергаются ли LD также изменениям, зависящим от клеточного цикла. Поскольку LD могут служить источниками энергии и сигнальными узлами, особенно важно уточнить их динамику во время митоза. Для решения этой проблемы мы представляем протокол, который сочетает синхронизацию клеточного цикла с флуоресцентным LD-окрашиванием в клетках гепатомы. Клетки синхронизируются на границе G2/M с использованием подхода, основанного на ингибиторах киназы-1, выделяются в клеточный цикл и собираются в определённые временные моменты. Затем LD маркируются нейтральным липидным красителем и визуализируются флуоресцентной микроскопией. Этот метод обеспечивает воспроизводимый подход для изучения перераспределения LD во время митоза и может широко применяться к изучению биологии органелл, метаболической регуляции и физиологии раковых клеток.

Введение

Клеточный цикл — это высокоскоординированное событие, обеспечивающее точное дублирование и сегрегацию хромосомнойДНК 1,2, в ходе которого внутриклеточные органеллы динамическиреорганизуются 3. Он состоит из четырёх основных фаз: G1, S, G2 иM 1,2. Во время митоза дублированные хромосомы выстраиваются в экваториальной плоскости биполярного веретена и затем переносятся в две дочерние клетки4. Органеллы, такие как митохондрии и аппарат Гольджи, подвергаются обширной ремоделированию во времямитоза 5,6,7,8. Эти органеллы фрагментировались на маленькие пузырьки, прежде чем распределяться по двум дочерним клеткам, где они собираются заново в ходе прохождения третьегоцикла клетки.

Липидные капли (LDs) — это органеллы, содержащие нейтральные липиды, состоящие из ядра нейтральных липид, окружённых фосфолипидным монослоем. Они связаны с разнообразными белками и широко встречаются во многих типах клеток, включая пролиферирующиеклетки 9,10. Белковый и липидный состав LDs варьируется в зависимости от типа клетоки ткани 11. Среди этих белков семья перилипинов (PLIN) была широко изучена, и PLIN2 стабилизирует LDs вгепатоцитах 12,13. Помимо структурной стабилизации, белки семейства PLIN участвуют в регуляции динамики LD и взаимодействия с другими клеточнымикомпонентами 14. LD функционируют не только как хранилища триациллглицерина и холестерилэфира, но и как узлы энергетическогометаболизма 15, сигнальныхпутей 16 и адаптации кстрессу 17. При патологических состояниях, таких как стеатогепатит, ассоциированный с нарушением метаболической дисфункции (MASH, ранее называвшийся NASH), накопление LD значительно увеличивается по сравнению со здоровьемконтроля 18,19, что подчёркивает его важность в биологии заболеваний. Однако, несмотря на обширные исследования динамики митохондрий, эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи во время митоза, были доступны лишь ограниченные наблюдения пространственной локализации LD в делящихся клетках. Мы проанализировали локализацию LD во время митоза, используя приведённый здесь метод. Ранее мы сообщали, что LD проявляли пространственные паттерны распределения, отличающиеся от других внутриклеточныхорганелл 20.

Здесь мы предлагаем подробный протокол для изучения распределения LD и других внутриклеточных органелл во время митоза в клетках гепатомы. Метод включает синхронизацию клеточного цикла и флуоресцентное окрашивание, что позволяет воспроизводимо визуализировать динамику ЛД во время митоза. Репрезентативные результаты показывают, что LD демонстрируют изменения пространственного распределения, зависящее от клеточного цикла, между межфазой и митозом, что облегчает сравнительный анализ локализации LD во время деления клеток. Этот подход можно широко применять для изучения локализации органелл, динамики и метаболической регуляции как в физиологическом, так и в патологическом контекстах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Стандартные решения, необходимые для этого протокола

  1. Приготовьте 24% (w/v) раствор бычьей сыворотки из альбумина (BSA), растворённый в 150 мМ NaCl.
  2. Приготовьте 10 мМ раствора RO-3306 (селективного ингибитора киназы-1 (CDK1)), растворённого в DMSO в стерильных условиях.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другие широко используемые растворы, такие как NaOH, NaCl и фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS), были подготовлены в соответствии со стандартной лабораторной практикой. PBS был приготовлен путём растворения 2,6 г₂PO₄·2H₂O, 29 г Na₂HPO₄·12H₂O, 80 г NaCl и 2,0 г KCl в дистиллированной воде с корректировкой конечного объёма до 1 л.

2. Приготовление олеиновой кислоты, конъюгированной с BSA.

  1. Поместите 90 мг олеиновой кислоты в стакан объемом 50 мл и добавьте 2 мл этанола (99,5%) для растворения.
  2. Добавьте в раствор 100 мкл 5 N NaOH и перемешайте до полного смешивания.
  3. Испарить этанол под струей азота.
  4. Добавьте 10 мл 150 мМ NaCl и инкубуйте смесь при 60 °C в течение 5 минут.
  5. Добавьте 12,5 мл охлаждаемого 24% раствора BSA в раствор олеиновой кислоты (2,4) медленно, по каплям, и аккуратно перемешивать смесь непрерывно в течение 10 минут, чтобы постепенное и однородное смешивание при комнатной температуре.
  6. Отрегулируйте pH до 7,4 и доведите итоговый объём до 25 мл с 150 мМ NaCl. Итоговая концентрация олеиновой кислоты составит 12,8 мМ.
  7. Фильтруйте раствор через фильтр 0,22 мкм в стерильных условиях и храните аликвоты при 4 °C до 2 недель или при -20 °C для длительного хранения.

3. Синхронизация границ ячеек G2/M

  1. Подготовьте необходимые органы управления.
    1. Подготовьте необработанные асинхронные клетки без обработки RO-3306 в качестве базового контроля.
    2. Для состояний, обработанных олеиновой кислотой, подготовьте клетки, обработанные только олеиновой кислотой без синхронизации в качестве базового контроля.
    3. Для флуоресцентного окрашивания проводите однократные контроли для каждого флуорофора, чтобы проверить специфичность сигнала и исключить спектральное перекрытие между каналами (дополнительный рисунок 1).
    4. Получайте изображения с помощью последовательных настроек захвата или соответствующих конфигураций фильтров, чтобы минимизировать спектральное перекрытие и перекрёстные пересечения каналов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти контроли необходимы для различия изменений, зависящих от клеткового цикла, от базового распределения органелл и для проверки специфичности флуоресценции.
  2. Поддерживайте клетки HuH7 в модифицированной среде Eagle's Dulbecco с добавлением 10% плодовой сыворотки крупного рогатого скота, пенициллина 100 U/mL и 100 мкг/мл стрептомицина при 37 °C в инкубаторе с содержанием CO₂ 5%.
  3. Поместите стеклянные накладки в 35-мм культурную чашу. Семена 2 × 105 клеток в 35-мм чашке в описанной среде и инкубируют клетки ночью при 37 °C в инкубаторе с концентрацией CO₂.
  4. Промывайте клетки дважды PBS, а затем инкубируют свежей средой, содержащей 9 мкм RO-3306 и 0,5 мМ олеиновой кислоты.
  5. Инкубировать клетки в течение 20 часов в стандартных условиях культуры.

4. Удаление реагента RO-3306 из синхронизированных клеток для перехода в митотическую фазу

  1. Промывайте клетки (шаг 3.4) три-пять раз с помощью PBS.
  2. Промой клетки один раз свежей культурной средой.
  3. Инкубировать клетки в свежей среде в течение 1 часа при 37 °C в 5% CO₂-инкубаторе для входа в митоз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление RO-3306 позволяет синхронизированным клеткам входить в митотическую фазу от границы G2/M. После вымывания реагента значительная часть клеток входит в митотическую фазу примерно в течение 1 часа, в течение которого митотические клетки можно идентифицировать по округлению клеток и конденсации хромосом. Оптимальное время для наблюдения определённой фазы митоза может варьироваться в зависимости от типа клетки и условий культуры.

5. Подготовка образцов митотических клеток

  1. Фиксируйте клетки с 4% параформальдегида в PBS на 10 минут при комнатной температуре.
    ВНИМАНИЕ: Митотические клетки склонны отделяться от блюда; Избегайте мытья перед фиксацией.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При окрашивании PLIN3 клетки фиксировались с помощью комбинации 2% параформальдегида и 2% глутаральдегида.
  2. Пермеабилизуйте фиксированные клетки с Triton X-100 0,1% (w/v) в PBS на 10 минут при комнатной температуре.
  3. Блок-клетки с 1% (с в/в) BSA в PBS на 1 час при комнатной температуре.

6. Окрашивание LD и других клеточных органелл

  1. Аккуратно снимите стеклянные накладки из посевной чашки с помощью тонких щипцов и поместите их ячейкой вверх в увлажнённую камеру, чтобы предотвратить высыхание.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все последующие этапы окрашивания в увлажнённой и защищённой светом среде для сохранения флуоресцентных сигналов.
  2. Промывайте клетки дважды с помощью PBS и инкубируйте первичными антителами, разбавленной в PBS, в течение 1 часа при комнатной температуре.
  3. Промывайте клетки дважды с помощью PBS и инкубируйте вторичными антителами, разбавленной в PBS, в течение 1 часа при комнатной температуре.
  4. Промыйте клетки дважды с помощью PBS и покрасьте нейтральным липидным флуоресцентным красителем в течение 10 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Были выбраны красители с различными спектральными свойствами для обеспечения гибкой многоцветной визуализации и минимизации спектрального перекрытия с другими органеллинными маркерами.
  5. Промывайте клетки дважды с помощью PBS и окрашивают ядра с помощью ДНК-связывающегося флуоресцентного красителя (DAPI: возбуждение, 350–410 нм; эмиссия, 420–450 нм) в разведении 1:1 000 в PBS в течение 5 минут.
  6. Промывайте клетки дважды с помощью PBS, затем закрепляйте накладки на стеклянные стекли с помощью монтажного средства против фейда для сохранения флуоресценции во время съёмки.
  7. Запечатайте края покрытий прозрачным лаком для ногтей, чтобы предотвратить высыхание и движение во время визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку флуоресцентные сигналы постепенно затухают, изображения делают в течение 1 недели после окрашивания.

7. Наблюдение внутриклеточных органелл и их субклеточной локализации

  1. Получить флуоресцентные изображения с помощью широкополевой флуоресцентной микроскопии для быстрого скрининга нескольких клеток и выбора представительных межфазных и митотических клеток с использованием низкой интенсивности возбуждения и быстрых настроек для минимизации фотоотбеливания.
  2. Получите изображения выбранных клеток с соответствующим увеличением для анализа флуоресцентного окрашивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Межфазные клетки обычно имеют целостное одно ядро, расположенное в центре цитоплазмы. В отличие от этого, митотические клетки демонстрируют конденсированные хромосомы, выровненные в экваториальной плоскости биполярного веретена. Эти морфологические особенности могут служить визуальным критерием для различия между межфазными и митотическими клетками.
  3. Визуализировать LDs и морфологию ядра с помощью соответствующих наборов фильтров для нейтральных липидных флуоресцентных красителей и ДНК-связывающего флуоресцентного красителя с помощью широкополевой флуоресцентной микроскопии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбирайте наборы фильтров в соответствии с спецификациями используемой микроскопической системы.
  4. Для валидации с более высоким разрешением получите флуоресцентные изображения с помощью конфокальной микроскопии, оснащённой объективом с высокой числовой апертурой (например, 60×, NA ≥1.2). Обнаружить флуоресцентные сигналы для нейтральных липидных флуоресцентных красителей и ДНК-связывающегося флуоресцентного красителя с помощью соответствующих возбуждающих лазеров и настроек эмиссионного фильтра. Обрабатывайте изображения с помощью широко доступного программного обеспечения для получения и анализа изображений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от системы микроскопа могут использоваться как линзы с погружением в воду, так и масло. Выбор погружной среды должен соответствовать рекомендациям производителя и экспериментальной цели. Широкопольная флуоресцентная микроскопия подходит для рутинного наблюдения и сравнения распределения LD между межфазными и митотическими клетками, тогда как конфокальная микроскопия рекомендуется при более высоком пространственном разрешении.

8. Количественная оценка количества и размера LD

  1. Получите флуоресцентные изображения клеток при одинаковых условиях визуализации для всех условий.
  2. Откройте полученные изображения с помощью программного обеспечения для анализа изображений.
  3. Установите соответствующие пороги для идентификации LD и проведите анализ частиц для количественного определения количества и площади липидных капель.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры изображения должны оставаться постоянными во всех условиях для точного сравнения числа и площади ЛП.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Синхронизация клеток гепатомы на границе G2/M с использованием RO-3306

Для изучения динамики внутриклеточных органелл во время митоза был использован RO-3306, селективный ингибитор CDK1, для синхронизации клеток на границе G2/M 20,21. При обработке клеток ингибитором CDK1 в течение 20 часов, а затем дополнительно 1 час в свежей среде, более 50% клеток синхронизировались на границе G2/M (см. рисунок...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Наблюдаемое перераспределение ЛД во время митоза свидетельствует о том, что их расположение не случайно, а связано с реорганизацией цитоскелета и прогрессированием клеточных циклов. В частности, исключение LD из области веретена может отражать пространственные ограничения, навязанные сборкой митозного веретена или активными транспортными механизмами, поддерживающими сегрегацию органелл во время деления клеток. В этом исследовании мы предлагаем простой и воспроизводимый подход к подготовк...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конфликтов интересов относительно содержания этой статьи.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантом Университета Шова для молодых исследователей и грантом JSPS KAKENHI No 24K10084.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0.25% Trypsin/EDTAWako201-16945Диссоциация клеток
10 см чашаCorning430167Культура клеток
35 мм тканевая культуральная чашаIWAKI3000-035Культура клеток
6 см тканевая культуральная чашаIWAKI3010-060Культура клеток
Анти-PLIN2 (ADRP) антителоProteintech15294-1-APМаркер липидных капель
Анти-PLIN3 (TIP47) антителоProteintech10694-1-APМаркер липидных капель
Анти-α-тубулин антителоSigma-AldrichT6199Маркер митотического веретена
BODIPY 493/503InvitrogenD3922Окрашивание нейтральных липидов
Фильтр для бутылки (0.22 μm)NESTWNB343001Стерильная фильтрация раствора ОА-БСА
Белок сыворотки быка (БСА)Sigma-AldrichA8022Блокирующий реагент
Прозрачный лак для ногтейКоммерчески доступныйНе применимоГерметизация кавер
Конфокальный микроскопOlympusFV1200Высокоразрешающее изображение
DAPIDojindo340-07971Окраска ядра
D-PBS (-–)Wako049-29793Культура клеток
Дульбекко-среда с измененным орлом (DMEM)Wako041-30081Среда для культуры клеток
Этанол (99.5%)Wako057-00456Растворитель для олеиновой кислоты
БСА без жирных кислотSigma-AldrichA7030Носительный белок для олеиновой кислоты
Фетальная сыворотка быкаGibco10270-106Добавка к среде
Флуоресцентные вторичные антитела (соединенные с Alexa Fluor)Коммерчески доступныеНе применимоВидовые специфические вторичные антитела для иммунофлюоресценции
Программное обеспечение FV10-ASWOlympusНе применимоПолучение и обработка изображений
Стеклянные каверы (φ15 мм)Matsunami2-176-03Посев клеток для микроскопии
Стеклянные микроскопические слайдыMatsunamiSFF-001Стеклянные слайды для установки кавер
Глутаральдегид (25% раствор)Wako073-00536Альтернативная фиксация для PLIN3
Клетки HuH7JCRB Cell BankJCRB0403Человеческая гепатоклеточная линия клеток
LipidTOX Red Neutral Lipid StainInvitrogenH34476Альтернативное окрашивание липидных капель
Азотный газ (N2)Коммерчески доступныйНе применимоИспарение этанола
Олеиновая кислотаSigma-AldrichO1383Для приготовления сопряжений олеиновой кислоты-БСА
Параформальдегид, 4% в PBSNacalai Tesque09154-85Фиксация
Пенициллин-стрептомицинGibco15140-122Антибиотики
Фосфатно-буферный раствор соли (×10)Не применимоНе применимоМожет быть заменен любым поставщиком
RO-3306Sigma-AldrichSML0569Ингибитор CDK1 для синхронизации G2/M
SlowFade Diamond Antifade MountantInvitrogenS36963Монтажное средство
Хлорид натрия (NaCl)Wako191-01665Приготовление 150 мМ NaCl
Гидроксид натрия (NaOH)Wako080-01061Используется для мыловарения олеиновой кислоты
Tali Cellular Analysis SlidesThermoT10794Используется для анализа клеточного цикла
Tali Image-based CytometerThermoНе применимоИспользуется для анализа клеточного цикла
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Пермеабилизирующее клетки
Широкополосный флуоресцентный микроскопKEYENCEBZ-9000Быстрое скринирование митотических клеток

Ссылки

  1. Wang, G., Jiang, Q., Zhang, C. The role of mitotic kinases in coupling the centrosome cycle with the assembly of the mitotic spindle. J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4111-4122 (2014).
  2. Asteriti, I. A., De Mattia, F., Guarguaglini, G. Crosstalk between AURKA and PLK1 in mitotic entry and spindle assembly. Front Oncol. 5, 283(2015).
  3. Gavet, O., Pines, J. Progressive activation of Cyclin B1-CDK1 coordinates entry to mitosis. Dev Cell. 18 (4), 533-543 (2010).
  4. Mardin, B. R., Agircan, F. G., Lange, C., Schiebel, E. Plk1 controls the NEK2A-PP1γ antagonism in centrosome disjunction. Curr Biol. 21 (13), 1145-1151 (2011).
  5. Taguchi, N., Ishihara, N., Jofuku, A., Oka, T., Mihara, K. Mitotic phosphorylation of dynamin-related GTPase DRP1 participates in mitochondrial fission. J Biol Chem. 282 (15), 11521-11529 (2007).
  6. Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (29), 11960-11965 (2009).
  7. Makiyama, T., et al. Trafficking of acetyl-C16-ceramide-NBD with long-term stability and no cytotoxicity into the Golgi complex. Traffic. 16 (5), 476-492 (2015).
  8. Tang, D., Yuan, H., Vielemeyer, O., Perez, F., Wang, Y. Sequential phosphorylation of GRASP65 during mitotic Golgi disassembly. Biol Open. 1 (12), 1204-1214 (2012).
  9. Xia, Y., et al. Silencing of ste20-type kinase TAOK1 confers protection against hepatocellular lipotoxicity through metabolic rewiring. Hepatol Commun. 7 (4), e0037(2023).
  10. Makishima, M., et al. Translation inhibitors induce formation of cholesterol ester-rich lipid droplets. PLoS ONE. 7 (8), e42379(2012).
  11. Krahmer, N., et al. Protein correlation profiles identify lipid droplet proteins with high confidence. Mol Cell Proteomics. 12 (5), 1115-1126 (2013).
  12. Takahashi, K., et al. Glucagon regulates intracellular distribution of adipose differentiation-related protein during triacylglycerol accumulation in the liver. J Lipid Res. 51 (9), 2571-2580 (2010).
  13. Itabe, H., Yamaguchi, T., Nimura, S., Sasabe, N. Perilipins: A diversity of intracellular lipid droplet proteins. Lipids Health Dis. 16 (1), 83(2017).
  14. Herker, E., Vieyres, G., Beller, M., Krahmer, N., Bohnert, M. Lipid droplet contact sites in health and disease. Trends Cell Biol. 31 (5), 345-358 (2021).
  15. Krahmer, N., et al. Organellar proteomics and phospho-proteomics reveal subcellular reorganization in diet-induced hepatic steatosis. Dev Cell. 47 (2), 205-221.e7 (2018).
  16. Ramosaj, M., et al. Lipid droplet availability affects neural stem/progenitor cell metabolism and proliferation. Nat Commun. 12 (1), 7362(2021).
  17. Cruz, A. L. S., Barreto, E. A., Fazolini, N. P. B., Viola, J. P. B., Bozza, P. T. Lipid droplets: Platforms with multiple functions in cancer hallmarks. Cell Death Dis. 11 (2), 105(2020).
  18. Mashek, D. G., Khan, S. A., Sathyanarayan, A., Ploeger, J. M., Franklin, M. P. Hepatic lipid droplet biology: Getting to the root of fatty liver. Hepatology. 62 (3), 964-967 (2015).
  19. Minami, Y., et al. Liver lipophagy ameliorates nonalcoholic steatohepatitis through extracellular lipid secretion. Nat Commun. 14 (1), 4084(2023).
  20. Makiyama, T., et al. Behavior of intracellular lipid droplets during cell division in Huh7 hepatoma cells. Exp Cell Res. 433 (2), 113855(2023).
  21. Makiyama, T., Higashi, S., Sakane, H., Nogami, S., Shirataki, H. γ-taxilin temporally regulates centrosome disjunction in a NEK2A-dependent manner. Exp Cell Res. 362 (2), 412-423 (2018).
  22. Aizawa, R., Ibayashi, M., Mitsui, J., Tsukamoto, S. Lipid droplet formation is spatiotemporally regulated in oocytes during follicular development in mice. J Reprod Dev. 70 (1), 18-24 (2024).
  23. Ohsaki, Y., Maeda, T., Fujimoto, T. Fixation and permeabilization protocol is critical for the immunolabeling of lipid droplet proteins. Histochem Cell Biol. 124 (5), 445-452 (2005).
  24. Helps, N., Luo, X., Barker, H., Cohen, P. Nima-related kinase 2 (NEK2), a cell-cycle-regulated protein kinase localized to centrosomes, is complexed to protein phosphatase 1. Biochem J. 349 (Pt 2), 509-518 (2000).
  25. O'Regan, L., Blot, J., Fry, A. M. Mitotic regulation by nima-related kinases. Cell Div. 2, 25(2007).
  26. Xie, K., et al. MDT-28/PLIN-1 mediates lipid droplet-microtubule interaction via DLC-1 in Caenorhabditis elegans. Sci Rep. 9 (1), 14902(2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи