Методическая статья

Трёхмерная иммунолокализация в мейоцитах кукурузы

DOI:

10.3791/71224

⸱

22 июня 2026 г.

 ,  ,  , 
1Institute of Biotechnology, National Autonomous University of Mexico (UNAM), 2Lankester Botanical Gardens, University of Costa Rica, 3Faculty of Food and Agricultural Sciences, Rodrigo Facio Campus, School of Agronomy, University of Costa Rica, 4Fabio Baudrit Agricultural Research Station, University of Costa Rica

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол иммунолокализации в мейоцитах самцов кукурузы поддерживает трёхмерную целостность клеток во время мейоза. Он позволяет динамически отслеживать внутриклеточную локализацию до трёх независимых антител в сохранившемся параформальдегид-фиксированном материале, помимо DAPI, который окрашивает ДНК.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Во время мейотической профазы I физическая конфигурация хромосом сильно варьируется на разных стадиях развития, к счастью, эти специфичные для стадий конфигурации позволяют правильно идентифицировать каждую из классических мейотических стадий, которые соответственно называются лептотеном (например, «тонкие нити»), зиготеном (например, «связанными нитьями»), пахитеном (например, «толстыми нитьями»), диплотеном (например, «двойными нитьями») и диакинезом (например, «отталкивающим движением»). Визуальный анализ нескольких цитогенетических явлений, возникающих в профазе I, таких как рекомбинация, парирование и синапсис, требует высоконадежных методов иммунолокализации. В отличие от традиционных методов распространения и сжатия, которые подавляют всю субклеточную и субядерную информацию, описанная здесь 3D-процедура сохранения позволяет сохранять ключевые мейотические белки в их естественных субклеточных местах расположения (цитоплазматические, ядерные и субядерные: эухроматин, гетерохроматин и нуклеолярный). Таким образом, этот протокол описывает, как эффективно фиксировать мейотические пыльники, рассекивать и высвобождать мейоциты из пыльников, а также одновременно осуществлять иммунолокализацию трёх ключевых белков в самцах мейоцитов кукурузы.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мейоз — это ключевой процесс, регулирующий передачу признаков у модельных растений и культур; Таким образом, простые методы микроскопии, позволяющие последовательно и точно визуализировать локализацию белков, позволяют понять, как эти признаки могут передаваться более эффективно. К сожалению, визуализация локализации белков внутри мейоцитов сильно варьируется в зависимости от используемойтехники 1,2. Таким образом, цель протокола — предоставить простой и воспроизводимый метод, который устраняет артефакты во время наблюдения за мейоцитами. Например, давно признано, что наблюдение за мейотическими хромосом — это деликатный процесс, который облегчается сдавлением клеток либо простым сдавливанием, либо ещё более разрушительными методами распространения 3,4,5. В Arabidopsis thaliana исследователи обычно используют методы распространения, использующие фиксатив Карноя (смесь этанола и уксусной кислоты 3:1) вместе с различными детергентными средствами, такими как Lipsol, Tween-20 и TritonX-100, а также ферментные смеси, содержащие целлюлазу, пектиназу и цитогеликазы, чтобы расщеплять клетки и обеспечивать эффективную иммунолокализацию на их маленькиххромосомах 1,2. Эти методы преобразуют 3D-хромосомную конформацию в двумерную, позволяя быстро наблюдать все искусственно рассеянные хромосомы на одном изображении. Определённые особенности хромосом, выдерживающих такие суровые обработки, могут быть очевидны; однако они часто не отражают типичное поведение клеток и хромосом invivo 6. Быстрое и очень широкое обнаружение до двух антител возможно с помощью двумерных методов распространения на различных видах растений, включаякукурузу 7,8,9,10,11.

Тем не менее, несмотря на удобство устаревших двумерных методов, теперь признано, что некоторые явления чувствительны к разрушительным методам и не могут быть обнаружены при повреждении клетки, ядра или хромосомы во время распространения или сдавливания. Например, перемещение белка RAD50 из цитоплазмы в ядро на стадии лептотена или при центромерном соединении (лептонема/зигонема) было обнаружено только в целостных3D-мейоцитах 12. Здесь читателям предлагается подробный четырёхдневный 3D-протокол, в котором используются пыльники, закреплённые в 4% параформальдегиде, для иммунолокализации трёх ключевых белков в мужских мейоцитах кукурузы, тем самым сохраняя их структурную целостность. По сравнению с аналогичной методологией 3D-иммунолокализациикукурузы 8, мы добавили практические заметки и советы по устранению неполадок для исследователей. Этот протокол принесёт пользу работе растительных биологов и селекционеров, заинтересованных в изучении различных мейотических процессов, таких как контроль мейотической рекомбинации синаптонемным комплексом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ВНИМАНИЕ: Обращайтесь с формальдегидом и акриламидом с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты и химического капюшона; Оба токсичны (акриламид также нейротоксичен до полимеризации). Все материалы, использованные в исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Фиксация пыльников кукурузы для сохранения целостной структуры мейоцитов

  1. Используйте кукурузные растения на стадии V13, при этом внутри стебля всё ещё растут соцветия. В течение недели мейотической фиксации муравника надевайте перчатки и аккуратно прижимайте увеличенный стебель к бугорку, чтобы определить, достаточно ли он мягкий, чтобы разрезать.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол фиксации и иммунолокализации может использоваться как для мейотических бутонов кукурузы, так и Arabidopsis thaliana (менее 400 мкм). Но в случае кукурузы, в зависимости от используемого сорта и времени года (весной растёт быстрее), она занимает около 8 недель посадки для эталонной инбредной линии B73, а для раннецветущей инбредной линии A344 — всего 6 недель.
  2. Подготовка буферов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: За день до химической фиксации подготовьте следующие рабочие растворы, сделайте это аккуратно и правильно маркируйте все бутылки.
    1. Приготовьте 100 мл 10x Buffer A (BA) соли, добавив 4,53 г PIPES (пиперазин-N, N′-бис (2-этансульфоновая кислота) при конечной концентрации 150 мМ), 5,96 г KCl (конечная концентрация 800 мМ), 1,17 г NaCl (конечная концентрация 200 мМ), 0,74 г EDTA (конечная концентрация 20 мМ), 0,19 г EGTA (конечная концентрация 5 мМ) и 90 мл H2O, сначала отрегулируйте pH до 6,8–7 с помощью KOH, затем объём до 100 мл.
    2. Наконец, стерилизуйте фильтр с помощью одноразового стерильного фильтра Rapid-Flow с PES порой 0,45 мкм (держать при температуре 4 °C, но не замораживать; можно хранить несколько месяцев).
    3. Готовьтесь:
      -50 мМ ТРУБ (pH с КОГ скорректирован до 7).
      - запасы спермина в концентрации 0,4 м (ранее растворённые в трубах 50 мм, с помощью КОГ pH до 7, сохраняйте аликвоты 50 мкл при -20 °C).
      - запасы спермидина в концентрации 0,4 м (растворённые в трубах 50 мм, с pH, скорректированным до 7 при KOH, сохраняйте замороженные аликвоты 125 мкл при -20°C).
      - запасы дитиотрейтола (DTT) 1 M (растворённый в ацетате натрия 0,01 м, до pH 5,2, сохраняют замороженные аликвоты 100 мкл при -20 °C).
      - сорбитол 2 M, поддерживается при 4 °C.
  3. Приготовьте 50 мл 2x Buffer A (BA) на льду, используя 10 мл 10x Buffer A солей (при 4 °C), 50 мкл спермина (0,4 м в трубах 50 мм, с pH 7 при KOH), 125 мкл спермидина (0,4 м в трубах 50 мм, с pH 7 при KOH), 100 мкл ДТТ (1 м в 0,01 м натриевого ацетата, pH 5,2) энергично растворяются; и не нагревайте.
    1. Затем добавьте 16 мл сорбитола 2 М. Отрегулировать конечный объём до 50 мл стерильной водой. Фильтруйте-стерилизуйте с помощью одноразового стерильного фильтра Rapid-Flow и храните при температуре 4 °C.
  4. Подготовьте влажную камеру из 5–10 увлажнённых бумажных полотенец, помещённых в пластиковую коробку. Проверьте, хорошо ли крышка герметизируется. Уберите лишнюю воду.
  5. Затем положите в лоток следующие предметы: влажную камеру, лезвие бритвы, тонкие щипцы (ранее стерилизованные 70% этанолом), небольшую бутылочку стерильной воды и малярную ленту. Принесите лоток и его содержимое к кукурузным растениям, проверьте на шаге 1.1.
  6. Используйте лезвие, чтобы разрезать бугристый стебель на уровне соцветия. Основные ветви кисточки, а также боковые ветви соцветия могут использоваться для сбора мейотических соцветков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти ветви кисти содержат интересные цветки для сбора мейотических пыльников. Каждый флорет содержит шесть пыльников, и обычно для анализа используются три верхних, крупных. Приблизительный размер и цвет пыльников коррелируют с каждой мейотической стадией. Почти прозрачные пыльники длиной около 1 мм находятся на лептотеновой стадии, полупрозрачные пыльники длиной 1,5 мм — на зиготенной стадии, беловатые пыльники длиной 2 мм — на пахитеновой стадии, а желтоватые пыльники длиной > 2 мм могут содержать мейоциты диплотена, тетрады и пыльцевые зерна, завершающие гаметогенез. Обратите внимание, что другая корреляция между длиной и стадией может различаться в зависимости от генетического фона кукурузы, и что факторы окружающей среды (например, высокая температура) могут ускорять прогрессирование мейота и изменять эту связь. Рекомендуется исследователям подтвердить корреляции размера и стадий для каждого конкретного генотипа кукурузы и условий роста (с помощью ацетокарминного сжатия, ср. 1.6).
  7. Используйте тонкие щипцы, чтобы вскрыть и аккуратно собрать боковые ветви соцветия и завернуть их в бумажное полотенце влажной камеры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При практике достаточно короткого линейного разреза 3–4 см в стебле для извлечения ветвей мейотической кисточки. Вы можете закрыть этот разрез, обмотав его стандартной малярной лентой три-четыре раза, что позволит позже собрать то же растение, используя оставшееся нерасчленённое соцветие. Ткани будут продолжать расти, а позже могут использоваться для опыления.
  8. Держите камеру при комнатной температуре. Используйте только те ветви соцветия, в которых на мейотической стадии содержатся сосцветки, несут пыльники. Обязательно накрывайте ветки половиной влажных полотенец, но не погружайте их в воду.
  9. Снова увлажняйте, если полотенца высохнут. Закройте коробку до вскрытия пыльников, желательно до 30 минут до начала сбора пыльников.
  10. Используя бинокулярный стереомикроскоп с калиброванной шкалом, собирайте свежие пыльники из соцветий в 2 мл 1x BA в чашке Петри диаметром 35 мм, обеспечивая точную идентификацию мейотических стадий с использованием размера и цвета пыльника.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для точного определения стадии мейоцита в отобранных пыльниках один из трёх синхронизированных пыльников на цветок быстро анализируется с использованием фиксации этанол-уксусной кислоты 3:1, окрашивания ацетокармина и традиционной микроскопиитыквы 13.
  11. Приготовьте фиксатив 4% формальдегид в 1x BA и 0,0025% Tween-20
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для 3 мл добавьте 750 мкл формальдегида 16%, 750 мкл H2O, 1,5 мл 2x BA и 7,5 мкл Твин-20 при 1%.
  12. Удалите первоначальный буфер BA и добавьте 3 мл этого свежего фиксирующего раствора в поэтапные пыльцы, затем фиксируйте их на 45 минут внутри новой чашки Петри диаметром 35 мм, запечатанной парапленкой для предотвращения испарения формальдегида, затем поместите на большую чашку Петри, установленную на вращающемся шейкере (установленную на 40–60 об/мин, или 0,2 x g). Делайте это при комнатной температуре. Пыльники должны слегка закручиваться для хорошей фиксации. Обычно они плавают на поверхности.
  13. Прополосните 3 мл 1x BA, затем перенесите образец в небольшую чашку Петри и поставьте на вращающийся шейкер (40–60 об/мин) при комнатной температуре на 45 минут.
  14. Используя чистые щипцы, перенесите пыльники в небольшую чашку Петри диаметром 35 мм, содержащую свежие 3 мл 1X BA. Плотно запечатайте чашку Петри парапленкой. Затем храните маленькую чашку Петри внутри, накрывая её алюминиевой фольгой, чтобы оставаться в темноте, и ставьте при температуре 4 °C до использования. Вы можете хранить его несколько месяцев, если потребуется.

2. Встраивание мейоцитов кукурузы в полиакриламидные сэндвич-прокладки

ДЕНЬ 1: Подготовка 3D-слайдов

  1. Приготовьте 2 мл акриламидного раствора, смешав равные объёмы (1:1) акриламида и 2x BA. Перед добавлением сульфита натрия (NaS) и персульфата аммония (APS) дегазируйте акриламидный раствор в вакууме в течение 5–10 минут.
  2. Аликвот акриламида и 2x BA соотношения 1:1 смешивают, пипетируя 100 мкл в трубки по 1,5 мл.
    Количество подготовленных трубок зависит от количества слайдов, которые вы собираетесь подготовить.
  3. Сделайте 1 мл 1x BA.
  4. Положите кусочки парапленки размером 2 см на 2 см поверх чашки Петри, затем поместите их под микроскоп для препарирования. Пипетта 50 мкл раствора BA с пыльниками на парапленке. Обрежайте кончик пипетки ножницами для облегчения подачи.
    1. Пипетта 25 мкл раствора BA на парапленке в другом месте.
  5. С помощью щипцов для удержания пыльников, срезьте кончик пыльников скальпелем и аккуратно выдавите мейоциты. С помощью пипетки аккуратно переведите мейоциты в каплю BA 25 мкл и аккуратно перемешайте.
  6. Пипетта 10 мкл из мейоцитной смеси на отдельную крышку.
  7. Быстро пипетить 5 мкл 20% (0,2 г/ 1 мл) NaS и 5 мкл 20% (0,2 г/ 1 мл) APS в трубку на 1,5 мл с акриламидом/2x буфером A.
  8. Быстро перемешайте 5 мкл вышеуказанного вещества на ковверслип и смешайте с мейоцитами. Положите сверху защитную крышку с поли-L-лизином, но поверните его на 45 градусов. Использование только одного поли-L-лизинового накладного слоя (коммерческого или изготовленного путём погружения коверслипов в раствор поли-L-лизина в чашку Петри на несколько минут и их высохшения на краю новой, чистой чашки Петри) помогает полностью выделяться после полимеризации. Накладка быстро снимается из раствора и сушится перед использованием. Для микроскопии с сверхразрешением необходимо использовать высокопроизводительные накладные скользящие с стандартизированной толщиной (≤170 нм)14.
  9. Пожалуйста, не трогайте накладки в течение 30–50 минут для полной полимеризации образца при комнатной температуре (более быстрый процесс полимеризации сокращает период высыхания подушечки, а качество не оптимальное).
  10. Повторяйте шаги '2.6–2.9' для каждого слайда, который хотите подготовить.
  11. Аккуратно разделяйте все покрытия бритвой. Разместите все накладки, кладкой вверх, на полиакриламидную площадку (или большую часть площадки) в пластину с 6 яками.
  12. Промывайте каждое покрытие с помощью прокладки с 2 мл физиологического раствора с 1x фосфат-буфером (PBS) в течение 10 минут. Повторите эту стирку один раз, в сумме 20 минут при комнатной температуре.
  13. Приготовьте 50 мл, смешивая 49,4 мл PBS 1x, 100 мкл EDTA 0,5 м и 500 мкл Triton.
  14. Промывайте каждую подушечку в 1 мл этого 1x PBS, дополненного 1 мМ EDTA и 1% Triton в течение 2 часов при комнатной температуре.
  15. Приготовьте свежую партию блокирующего буфера с 1x PBS, 1 mM EDTA, 0,1% Tween-20 и 3% BSA (1 мл на слайд). Для 50 мл блокирующего буфера смешайте 44 мл PBS 1x, 100 мкл EDTA 0,5 M, 5 мл 1% раствора Tween-20 и 1,5 г BSA. BSA предпочтительнее ослиной сыворотки в качестве блокирующего агента, поскольку помогает минимизировать неспецифические сигналы при использовании нескольких первичных и вторичных антител.

3. Иммунолокализации

  1. Подготовьте первичные антитела (или антитела) на нужном разбавлении с помощью блокирующего буфера. Комбинируйте первичные антитела на основе их способности создавать разные сигналы при совместном использовании. Они должны происходить от различных организмов, таких как кролик, крыса, морская свинка или курица, которые можно распознать по определённым флуоресцентно маркированным вторичным антителам. Использование ослиных или козьих антител избегается, поскольку они предназначены для использования в качестве вторичных антител. Мы рекомендуем использовать один вид вторичных антител (например, козу в эксперименте, показанном на рисунке 1).
  2. Добавьте 50 мкл этого разбавленного первичного антитела в центр каждого покрытия с помощью подушки.
    Добавьте воду между колодцами, чтобы замедлить испарение. Поставьте пластину в влажную камеру (пластиковую коробку с крышкой). Уезжай на ночь.

ДЕНЬ 2: Мытьё

  1. Подготовьте 500 мл буфера для мойки (1x PBS + 0,1% Tween-20 + 1 mM EDTA).
  2. Удалите ночной раствор из колодцев аспирацией пипеткой.
  3. Быстро промывайте каждый уголок с помощью подушки дважды с 1 мл буфера для мойки, затем убирайте его из колодцев.
  4. Нанесите ещё 1 мл на пипетку с помощью прокладки и оставьте на 1 час при комнатной температуре.
    Повторите ещё 7 раз. (всего 8 часов)
  5. После окончательной промывки добавьте воду между колодцами, накройте тарелку и оставьте на ночь во влажной камере.

ДЕНЬ 3: Вторичные антитела, промывки и монтажные слайды

  1. Подготовьте вторичные антитела, разбавляя каждое в соотношении 1:50 в блокирующем буфере.
    Аспирируйте раствор для промывки. С помощью пипетки нанесите 50 мкл разбавлённого вторичного антитела в центр каждой прокладки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждое вторичное антитело должно использоваться в сочетании с отдельными флуоресцентными красителями с неперекрывающимися длинами волн излучения. Например, одно вторичное антитело должно быть маркировано AlexaFluor488 (зелёный), следующее — AlexaFluor555 (оранжевый), а третий — AlexaFluor647 (дальний красный), который можно комбинировать с DAPI (возбуждение при 461 нМ, синий). Также можно использовать другие флуоресцентные красители, такие как DyLight (от Dyomics GmbH). Кроме того, все эти вторичные антитела не должны реагировать с другими видами, используемыми в смеси первичных антител. Например, вторичные антитела против кроликов должны быть перекрёстно адаптированы для селективности к кроличьим антителам и не распознавать ни антитела крыс, ни морских свинок. То же самое касается всех вторичных антител. Для одновременной валидации всех этих требований при проведении коиммунолокализации следует использовать хорошо спроектированный эксперимент.
  2. Добавьте воду между колодцами, поставьте тарелку в влажную камеру и оставьте на 2 часа при комнатной температуре.
  3. Аспирируйте раствор из скважин.
  4. Проведите четыре промывки с 1 мл на каждую скважину, по 1 час при комнатной температуре (всего 4 часа).
  5. Промыйте каждую колодцу 1 мл 1x PBS в течение 10 минут при комнатной температуре и повторите этот процесс ещё два раза. (всего 30 минут)
  6. Разведите DAPI в 1x PBS.
  7. Покрасьте с конечной концентрацией 1 мкг/мл DAPI (порошок DAPI, растворённый в воде) в течение 30 минут при комнатной температуре и разместите 500 мкл/скважину.
  8. Удалите антифейд ProLong™ Gold из морозильника на 4 °C, чтобы он растаял и достиг комнатной температуры.
  9. Стирка в 1x PBS на 30 минут при комнатной температуре, с 1 мл на колодцу. Сделай это дважды снова. (всего 1 час 30 мин)
  10. Уберите последний убор.
  11. Затем добавьте по две капли ProLong™ Gold Antifade в середину каждого блокпоста.
  12. Крепите скользящие крышки на каждом затворе, подписывайте все затворы, поднимите скользящие крышки из колодца с помощью тонких щипцов и медленно кладите их на затвор. Используя тонкие щипцы, медленно опускайте второй ковер на первый. Используя пылесос, удалите избыток глицерина с краёв покрытия. Запечатайте края покрытий двумя слоями лака для ногтей.
  13. Если стекли не исследуются немедленно под флуоресцентным микроскопом. Храните их в морозильнике при температуре -20 °C, защищённой от света, до наблюдения. Позже поставьте слайды при комнатной температуре 1 час в коробке для слайдов, горизонтально и в темноте, чтобы предотвратить конденсация.

ДЕНЬ 4: Микроскопические наблюдения

  1. Наблюдает слайд под нужными длинами волн возбуждения и фильтрами. Стандартная конфокальная микроскопия достаточна, но рекомендуется использовать микроскоп с объективом 60x для трёхмерного изображения всей клетки с помощью z-стека каждые 0,2 мкм, с последовательным получением изображений и обработкой деконволюции с помощью программного обеспечения Applied Precision SoftWoRx® .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Используя этот протокол, мы можем одновременно наблюдать локализацию трёх ключевых мейотических белков в кукурузе (рисунок 1). Мейотический белок ОТСУТСТВИЕ ПЕРВОГО ДИВИЗИЯ 1 (AFD1) является гомологом субъединицы альфа-клейзина REC8 мейотического когезинного комплекса. ASYNAPTIC 1 (ASY1) является ключевым аксиальным элементом, а ZYPPER1 (ZYP1) — поперечным элементом синаптоническогокомплекса 15. Окрашивание DAPI демонстрирует чёткое о...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол обладает ключевым преимуществом по сравнению с другими, сохраняя важные трёхмерные данные о нагрузке белков мейотических хромосом. Эти особенности нельзя сохранить с помощью регулярных методовраспространения 1,2. Тем не менее, у этого протокола есть два ограничения: он медленный и технически требовательный по сравнению с обычными методами распространения, выполняемыми за один день. В то же время наш протокол требует...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не заявляют о конкурирующих интересах.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят Адриану Монсеррат за административное и закупочное управление. A. Ronceret признаёт гранты UNAM-PAPIIT и SECIHTI, а также благодарит Институт биотехнологий (IBt-UNAM) за первоначальное и ежегодное финансирование. П. Боланьос благодарит вице-ректората по научным исследованиям Университета Коста-Рики за постоянную поддержку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

```html

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1.5 мл микротрубки AxygenCorningMCT-150-C
15 мл пробирки FalconThermo Fisher Scientific339651
50 мл пробирки FalconThermo Fisher Scientific339652
6-лунная пластинка Falcon полистирольная микропластиныThermo Fisher Scientific 08-772-1B
Уксусная кислота, 60% Thermo Fisher ScientificA38-212
Акриламид 30%  и раствор бис-акриламида, 29:1Biorad1610157
Алюминиевые складныеReynolds U07211R0
Персульфат аммония (APS)MerckA3678
Биноклярный стереомикроскопНДНД
Бычий сывороточный альбумин (BSA) Merck A9418
DAPIMerckD9542
Микроскоп DelltaVisionOlympusНД
Дистиллированная H2OНДНД
Одноразовые фильтровальные устройства с PES-фильтрами 0.45 μmThermo Fisher Scientific/Nalgene09-740-63B
Тонкие щипцы FST Dumont SSFine Science Tools 11200-33
козлиный (IgG H+L) высокоперекрестный адсорбированный  анти-крысий, метка AlexaFluor647InvitrogenA-21247
козлиный (IgG H+L) высокоперекрестный адсорбированный анти-кроличиий, метка AlexaFluor568InvitrogenA-21428
козлиный (IgG H+L) высокоперекрестный адсорбированный анти-морской свинки, метка AlexaFluor488 InvitrogenA-11073
ПерчаткиMerckZ412392
Камеры выращивания / теплица / или полеНДНД
DTTMerckD0632
ЭДТАSigma-AldrichE6758
ЭГТАSigma-AldrichE3889
KClSigma-AldrichP3911
Скотч 3МFisher Scientific19-047-259
Семена кукурузыНД
Стеклянные предметные стёкла для микроскопа 22 x 22 мм-1,5Fisher Scientific12-542-B
Стеклянные предметные стёкла для микроскопа 22 x 22 мм-HDeckgläser, Zeiss474030-9020-000
Микроскопические стеклянные предметные стёклаFisher Scientific22-230-900
Коробка для микроскопических предметных стёколFisher Scientific,03-448-9
Микропипетки P20, P200, P1000MerckCLS4069
NaClMerckS7653
Ногтевой лакElectron Microscopy Science72180
Бумажные полотенцаMerckZ188956
ПарафильмMerckP7668
16% раствор параформальдегида Градус электронной микроскопии 15710
PBSMerckP4474
Пластиковая коробка с крышкойTupperwareНД
Поли-L-лизинMerckP4707
Первичные антитела (крысий анти-ZmAFD1, кроличи анти-ZmASY1, морская свинка анти ZmZYP1)НД
Prolong AntifadingMolecular ProbesP36934
Чаша Петри (D x H: 35 мм x 10 ммCorning351008
Чаша Петри стандартного размераMerckP5731
PIPESMerckP1851
Наконечники для микропипеток (0.5-10 мкл) стерильные Merck/CorningAXYT300
Наконечники для микропипеток (200 мкл) стерильныеMerck/CorningAXYT200Y 
Наконечники для микропипеток (1000 мкл) стерильныеMerck/CorningAXYT1000BRS
Лезвие бритвы - однолезвийноеFisher Scientific12-640
Горизонтальная платформа с агитаторомНДНД
СперминMerck85590
Спермидин MerckS2626
СорбитолMerckS8143
Tween-20MerckP9416
Тритон X-100Fisher Scientific9002-93-1
Ультра чистый акриламидInvitrogen15512023
Вакуум
```

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Immunolocalization TechniqueMaize MeiocytesMeiotic ProphaseChromosome ConfigurationProtein LocalizationCytogenetic AnalysisMeiotic Anther FixationSubcellular LocalizationRecombination AnalysisSynapsis Detection
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи