Полуавтоматический метод обнаружения групповых различий в протоцеребральных передних медиальных кластерах дофаминергических нейронов в мозге дрозофилы

Краткое содержание

Этот протокол представляет собой полуавтоматический метод количественного определения количества дофаминергических нейронов в крупном протоцеребральном переднемедиальном кластере дрозофилы . Разработанный специально для выявления и сравнения различий между экспериментальной и контрольной группами, этот подход снижает зависимость от ручного подсчёта и предоставляет практический инструмент для группового анализа.

Аннотация

Drosophila melanogaster служит мощным модельным организмом для изучения нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Паркинсона (БП), главным образом через анализ дегенерации дофаминергических (ДА) нейронов и связанных с этим дефицитов передвижения. Исторически количественная оценка потери нейрона DA в мозге мухи ограничивалась меньшими, легко счётными кластерами, включая кластеры протоцеребрального заднего медиального (PPM) и протоцеребральные заднелатеральные (PPL) кластеры. В отличие от этого, значительно больший протоцеребральный передний медиальный (PAM) кластер, включающий более 100 нейронов, представляет собой серьёзную проблему для ручного подсчёта, что приводит к его недопредставленности в количественных исследованиях. На сегодняшний день опубликованные исследования по-прежнему опираются на трудоёмкие ручные подсчёты через конфокальные Z-стеки, которые занимают много времени и склонны к вариативности. Чтобы устранить этот методологический пробел, мы разработали полуавтоматический конвейер анализа изображений с использованием инструмента с открытым исходным кодом Labkit. Этот протокол позволяет эффективно группово относительная количественная оценка нейронов тирозингидроксилазы (TH)-положительных в кластере PAM в одной экспериментальной партии. Метод начинается со стандартного иммунофлуоресцентного окрашивания и конфокальной визуализации, за которым следует подробное, пошаговое руководство по сегментации и анализу. Этот подход решает узкое место количественной оценки кластера PAM и предоставляет практический рабочий процесс для выявления межгрупповых различий в уязвимости нейронов ДА в моделях нейродегенерации. Относительная редкость исследований PD на кластере PAM отражает скорее исторический технический барьер, чем отсутствие биологической значимости. Преодолевая этот барьер, наш метод открывает дверь для систематического изучения уязвимости нейронов PAM при ПД и её возможной связи с немоторными симптомами.

Введение

Уксусная муха, Drosophila melanogaster, является популярным модельным организмом для изучения генетических и молекулярных основ нейродегенеративных заболеваний, в частности болезни Паркинсона (ПП⁾¹. Его консервативные нейронные сигнальные пути, сложный генетический набор и короткая продолжительность жизни делают его исключительно подходящим для изучения возрастно-зависимой уязвимости нейронов и проведения высокопроизводительных генетических и фармакологических^{скринингов 2,3}. Центральным элементом этих исследований является анализ дофаминергических (DA) нейронов, селективная дегенерация которых является патологической отличительной чертой^{PD 4}. В мозге дрозофилы нейроны DA организованы в дискретные, генетически идентифицируемые^{кластеры 5,6}. Прогрессивная потеря нейронов DA внутри определённых кластеров, визуализируемая с помощью иммунокрашивки TH и количественно измеряемая микроскопией, служит основным функциональным показателем для оценки прогрессирования заболевания и нейропротективных вмешательств в экспериментальных^{моделях 7,8}. Таким образом, надёжная количественная оценка потери нейрона ДА крайне важна для превращения силы генетики дрозофилы в значимые результаты исследований ПД.

Традиционно количественный анализ потери нейрона ДА сосредоточен на иммуноокрашивании тирозингидроксилазой (TH) малых кластеров, включая протоцеребральные заднемедиальные (PPM) кластеры и протоцеребральные задне-латеральные (PPL), при этом каждый кластер содержит менее 10 клеток, легко подсчитанных^{глазом 7}. Ручное перечисление с помощью конфокальных Z-стеков, хотя и трудоёмкое, стало установленным методом для этих кластеров во многих исследованиях PD с использованием Drosophila ^9,10,11. В отличие от этого, ручной подсчёт кластера протоцеребрального переднего медиального (PAM), крупнейшей группы нейронов ДА в мозге мухи, насчитывающей более 100 клеток, представляет собой давнее методологическое узкое место и исключает его включение в большинство исследований^{PD 9,10,11}. Несмотря на критическую роль нейронов ПАМ в цепях обучения, памяти и мотивации, это ограничение привело к их относительной недопредставленности в количественном анализе^{нейродегенерации} 12,13,14,15. Примечательно, что даже недавние расследования продолжают опираться на этот неэффективный ручной подсчёт, что подчёркивает устойчивую и неудовлетворённую потребность в стандартизированном, автоматизированном решении в поле¹³.

Чтобы устранить этот критический разрыв, мы разработали полуавтоматизированный конвейер анализа изображений, который позволяет эффективно количественно оценивать TH-положительные (^TH+) нейроны в кластере PAM в рамках эксперимента. Этот протокол использует открытый плагин на основе машинного обучения Labkit в рамках платформы Fiji/ImageJ и программное обеспечение для обработки 3D-изображений ^16,17. Основной рабочий процесс требует от пользователя аннотирования репрезентативного подмножества изображений для обучения модели классификации пикселей, которая затем применяется к экспериментальным наборам TH-окрашивания пакетного процесса, а затем создаётся и классифицируется пятна ядра относительно области TH⁺. Этот подход балансирует автоматизацию с экспертным контролем: снижает нагрузку и вариабельность полностью ручных подсчётов, сохраняя при этом вклад исследователей для руководства алгоритмом и проверки результатов.

Цель этой статьи — предоставить исследователям пошаговый протокол эффективной количественной оценки относительных нейронов PAM кластера DA для сравнений групповых сравнений внутри эксперимента. Мы демонстрируем полный рабочий процесс — от диссекции мозга, иммунофлуоресцентного окрашивания и конфокальной визуализации до детального анализа изображений с использованием полуавтоматического метода. Стандартизируя этот ключевой количественный этап, протокол стремится дать исследовательскому сообществу возможность последовательно включать крупный кластер PAM в свои анализы. Этот полуавтоматизированный метод специально разработан для кластера PAM и не применим к другим дофаминергическим кластерам или к нейронам TH-положительных в оптических долях. Этот метод может способствовать серийным исследованиям уязвимости DA-нейронов кластера PAM и дальнейшим исследованиям синаптической пластичности, нейродегенерации и терапевтического скрининга с использованием модели Drosophila .

Протокол

1. Подготовка образцов и конфокальная визуализация

1. Уход и сбор мух
   1. Скрещивание родителей мух желаемых генотипов для получения экспериментального потомства. При эклозии собирайте 20–30 мух на флакон свежего корма. Поддерживайте мух в соответствии с экспериментальным дизайном пользователя до достижения желаемого экспериментального возраста.
2. Подготовка к вскрытию
   1. Подготовьте диск для вскрытия, заполнив крышку чашки Петри диаметром 30 мм до половины силиконовым эластомером Sylgard. Наполните блюдо 1x физиологическим раствором с фосфатом (PBS). Аликвотируйте 450 мкл фиксативного средства, содержащего 1x PBS и 4% параформальдегида (PFA) в микроцентрифугной трубке объемом 0,6 мл, затем поместите трубку на лёд.
   2. Анестезируйте 10–20 мух импульсом CO₂ в 5–10 секунд, затем немедленно переведите их на чашку Петри диаметром 60 мм, помещённую на лёд для поддержания неподвижности.
      ВНИМАНИЕ: PFA токсичен и подозревается как канцероген. Ручка в капюшоне с перчатками, лабораторным халатом и защитными очками. Утилизировать отходы в соответствии с руководящими принципами по институциональным требованиям по опасным материалам.
3. Диссекция и фиксация мозга мухи
   1. Возьмите муху за корень крыла щипцами и погрузите её вентральной стороной вверх в диск с PBS-диском. Проткните грудь тонким штифтом для вскрытия, чтобы закрепить мушку на подложке Сильгарда.
   2. Ориентируйте тело горизонтально (например, голова влево, живот вправо). Держите основание хобота одним щипцем, а другим удалите весь хобот, создавая отверстие между сложными глазами.
   3. Захватите открытые края глаза двумя щипцами и очень медленно разъедините их симметрично, обнажая мозг, сохраняя его связь с вентральным нервным шнуром.
   4. Удалите трахеальные мешочки и жировое тело вокруг мозга. Перерезайте вентральный нервный шнур, чтобы освободить мозг и позволить ему осеть на чашке с передней стороной, направленной вверх.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если в усталом мозге вентральная половина расположена выше спинной (рисунок 1B,C), используйте щипцы, чтобы аккуратно прижать приподнятую часть.
   5. Предварительно смочите наконечник пипетки P10 с 0,1% Triton X-100, чтобы предотвратить прилипывание вскрытого мозга к внутренней стенке кончика. Используя этот предварительно увлажнённый кончик, переместите каждый расчленённый мозг в трубку с фиксацией, затем переходите к следующему вскрытию. После того как все мозги будут перенесены, инвертируйте трубку 5 раз и положите её горизонтально на лёд на 30 минут. Инкубировать трубку при комнатной температуре (RT) в течение 1 часа с перемешиванием.
   6. Дайте мозгу осесть на дно на 1 минуту. Промывайте мозги 3 x 10 минут раствором для мытья, содержащим 1x PBS и 0,1% Triton X-100 (PBST) с помощью перемешивания. Храните мозг в PBS, содержащем 0,1% азида натрия, при 4 °C или переходите к иммунному окрашиванию.
4. Иммунокраска
   1. Окрашивайте мозг в 300 мкл раствора для окрашивания первичных антител, содержащего 1x PBS, 0,1% тритона X-100, 5% нормальной козьей сыворотки, 0,1% натрия азида и кроличьего антитела к TH (разбавление 1:500) в течение 2 дней при 4 °C с перемешиванием. Помой мозги 3 раза по 10 минут с помощью PBST.
   2. Окрашивайте мозг вторичным раствором антител, содержащим 1x PBS, 0,1% тритон X-100, 5% нормальной козьей сыворотки, 0,1% натрия азида и противокроличью Alexa Fluor 635, в течение 2 дней при 4 °C. Промой мозги один раз PBST.
   3. Инкубировать мозг в PBST с дополнением 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) (разбавление 1:1,000) в течение 2 часов на RT, затем промывать мозг в PBST в течение 2 часа. Храните мозги при 4 °C на ночь или переходите к установке.
5. Монтаж
   1. Загрузите 0,5 мл крепления на шприц объемом 1 мл с тонкой иглой. Создайте монтажную камеру, прикрепив две параллельные полоски прозрачной клейкой ленты к стеклянному затвору, оставив зазор в 3 мм (рисунок 1A,D).
      ВНИМАНИЕ: Острые иглы представляют опасность прокола. Всегда обращайтесь с ними аккуратно, при необходимости повторяйте с помощью одной руки и немедленно утилизируйте использованные иглы в одобренный контейнер для острых предметов.
   2. Переложите мозги в чистую чашу Петри с помощью урезанного наконечника P200. Удалите лишнюю жидкость вокруг мозга и нанесите 10 мкл маунтанта на мозг. Аккуратно смешайте мозг с маунтантом.
   3. Распределите три капли маунтанта вдоль зазора на затворе и равномерно распределите по зазору. Переместить и расположить мозг вдоль центральной линии щели с помощью пипетки P10 (рисунок 1A).
   4. Расположить мозги равномерно вдоль центральной линии щели так, чтобы передняя сторона была обращена вверх. Медленно закройте зазор с помощью coverslip. Нажимайте большими пальцами у краёв чехла 3 секунды, чтобы обеспечить прочный контакт.
   5. Положите затвор горизонтально в папку для слайда, чтобы он засох на ночь на RT в темноте, затем при 4 °C для длительного хранения.
6. Конфокальная визуализация
   1. Включите систему конфокального микроскопа и подождите 15 минут для стабилизации лазера. Найдите мозг в ярком поле с помощью объектива 10x объектива, затем переключитесь на объектив с погружением в масло 100x и перейдите к PAM-кластеру в режиме live view.
   2. Отрегулировать ступень XY, чтобы найти один PAM-кластер в центре визуализации. Просмотр до Z, чтобы подтвердить границы и ориентацию. Регулируйте цифровой зум и ориентацию до тех пор, пока PAM-кластер не поместит кадр изображения вдоль диагонали.
   3. Установите верхнюю и нижнюю позиции стопки. Установите размер Z-step 0,34 мкм и разрешение изображения на 512 x 512. Установите отверстие в автоматический режим. Установите таблицу поиска дисплея (LUT) на индикатор насыщенности.
   4. Отрегулировать мощность лазера и усиление детектора TH-канала до тех пор, пока минимальное количество рассеянных, дискретных пункт внутри ПАМ-нейронов не будет насыщено. Отрегулируйте настройки канала DAPI , чтобы получить яркий, чистый ядерный сигнал без насыщения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: оптимальный коэффициент увеличения варьируется. Различия в сжатии тканей могут наблюдаться как между экспериментальными партиями, так и между отдельными мозгами в одной партии.
   5. Получить и сохранить изображения в RAW-формате с 12-битным или 16-битным в папке ввода (например, D:\Confocal\images). Вернитесь к режиму живого просмотра, сбросьте зум и просматривайте промежутки в поисках следующего мозга, не переключаясь на уменьшенное увеличение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе не сохраняйте, не экспортируйте и не конвертируйте первичные файлы данных в формат обработанного .tif. Сохранение исходных исходных метаданных крайне важно для последующей обработки изображений.

2. Обработка и количественная оценка изображений

1. Преобразование файлов изображений и разделение TH-каналов
   1. Преобразуйте исходные изображения, расположенные в папке входа, в формат, совместимый с программным обеспечением для анализа 3D-изображений, используя соответствующий конвертер файлов (Таблица материалов). Поместите конвертированные файлы в конвертированную папку (например, D:\Confocal\converted)
   2. Откройте Fiji и перейдите к File | Новинка | Сценарий. В редакторе скриптов нажмите Файл | Открыть для загрузки макрофайл ImageFolder_Split_ChannelAndSaveMacro_UltimateDepth.ijm (Дополнительный файл 1). Нажмите «Запустить » в нижней части окна редактора (если кнопка скрыта, нажмите на маленький треугольный значок, чтобы показать её).
   3. В диалоговом меню настройки нажмите «Просмотр » и выберите конвертированную папку. В разделе «Конвенция именования» выберите вариант 3. В разделе «Канал для экспорта» выберите индекс канала, соответствующий TH. Нажмите OK , чтобы разделить TH-канал по пакетам; экспортированные TH-стеки будут автоматически сохраняться в папке с заканчивающимися ChannelSplitOut.
2. Обучение классификатора Labkit
   1. Подготовка учебного набора данных
      1. Выберите 20 репрезентативных стеков, которые фиксируют диапазон интенсивности сигнала и фоновые вариации сэмплов из папки стека TH. Скопируйте выбранные файлы в папку выбора (например, D:\Confocal\selection).
      2. Запустите макрос Fiji ImageFolder_UniCropZStack_ToThinestLayers.ijm (Дополнительный файл 2). При запросе выберите папку с обучающими изображениями. Макрос обрезает каждый стек до одинакового количества Z-срезов и объединяет их в таймлапс-TIFF-файл для обучения.
   2. Интерактивная тренировка пиксельного классификатора
      1. Запустите Labkit через Fiji Plugins | Labkit | Откройте текущее изображение с помощью Labkit (таблица материалов). На панели инструментов нажмите кнопку 3D Box , чтобы переключиться в режим Slice View для навигации по Z-срезам (ползунок справа) и по сэмплам (ползунок внизу).
      2. Нажмите S , чтобы открыть панель яркости и контраста , и отрегулируйте ползунок Max для оптимальной визуализации нейронов ^TH+ . Задайте подходящий размер кисти (например, 5 пикселей). Нажмите «Настройки », чтобы расширить панель инструментов. Оставьте режимы отображения по умолчанию (Fused, Source, Nearest).
      3. Нажми «Рисовать». В панели маркировки выделите «Фон» и используйте несколько неклеточных областей; выделить передний план и использовать внутреннюю часть нескольких нейронов TH⁺.
      4. Увеличивайте и уменьшайте поле с помощью Ctrl + Shift + Scroll. Переходите к другим Z-срезам с помощью вертикального ползунка и к другим обучающим образцам с помощью нижнего слайдера. Повторяйте рисование несколько раз, чтобы обеспечить надёжную тренировку классификаторов.
      5. Нажмите на классификацию пикселей. Нажмите на треугольник «Начать обучение », чтобы запустить тренировку и ленивое предсказание, которое позже даёт обратную связь сегментации в реальном времени при навигации между образцами, срезами или позициями (правый клик и перетягивание) в любое время.
      6. Нажмите «Рисовать », чтобы добавить корректирующие аннотации там, где прогноз неточен, с опциональным включением видимости прогноза и метки в панели Sources и переобучению. Итерайте до тех пор, пока классификатор не будет надёжно отличать нейроны TH⁺ от фона, затем сохраняйте классификатор через сегментацию | Сохраните классификатор перед закрытием Labkit.
3. Сегментация Batch Labkit
   1. Откройте случайное изображение из папки TH стека на Фиджи. Запустите Labkit и нажмите Удалить всё, затем загрузите предобученный классификатор через Segmentation | Откройте классификатор , чтобы сегментировать изображение. Визуально проверьте качество для проверки обобщённости классификаторов, затем закройте окно.
   2. Повторите версию 2.3.1 на нескольких других случайных изображениях. Закрывайте окно после каждого осмотра, кроме последней.
   3. Создайте папку вывода Labkit (например, D:\Confocal\LabkitOut). Начните пакетную обработку через Others > Batch Segment Images. Установите Input Directory в папку стека TH , а Output Directory — в папку выхода Labkit, затем нажмите OK , чтобы начать пакетную обработку.
   4. Для будущих экспериментов с тем же антителом к TH и сопоставимыми конфокальными настройками пропустите 2.2 и используйте повторный классификатор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы также предоставляем предварительно обученный классификатор для целей тестирования (Дополнительный файл 3).
4. Создание точек DAPI и TH⁺ Квантификация нейронов
   1. Поместите XT_Jove_Labkit_TH.m (Дополнительный файл 4) в папку скриптов (например, D:\scripts). Откройте 3D-программное обеспечение и перейдите в раздел Файл | В настройках, затем выберите Пользовательские инструменты. В панели папки XTension нажмите Добавить... чтобы выбрать папку скриптов и нажать OK.
   2. Для каждого конвертированного файла скрипт автоматически выполняет следующие последовательные операции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот пояснительный раздел не содержит действий для пользователя, но является необходимым для перехода к следующим шагам.
      1. Канал DAPI обрабатывается с помощью фонового вычитания и гауссового фильтра для оптимизации идентификации точек DAPI.
      2. Сегментационная маска Labkit уточняется путём снятия шума и заполнения отверстий и присоединяется как масочный канал к набору данных. Из маскового канала формируется усовершенствованный объект поверхности TH. Объект поверхности TH дополнительно генерирует усовершенствованную маску для перезаписи канала маски.
      3. Канал преобразования расстояний создаётся из поверхности TH, где воксели внутри поверхности устанавливаются на 0, а воксели снаружи поверхности получают значения с плавающей запятой, представляющие их евклидово расстояние до ближайшей поверхности TH.
      4. Используйте профиль интенсивности каждого DAPI-пятна в канале преобразования расстояния как метрику для идентификации нейронов TH⁺ . Точки DAPI, расположенные внутри или рядом с регионами TH⁺ , имеют низкие значения расстояния. Этот критерий помогает избежать ложноотрицательных результатов, таких как реальные ядра нейронов DA, расположенные непосредственно снаружи, но непосредственно рядом с несовершенной областью переднего плана, предсказанной Labkit.
   3. Ручная оптимизация качества для создания спотовых данных DAPI
      1. Откройте случайный образец из конвертированной папки в 3D-программе. Перейти к редактированию | Свойства изображения и проверьте, равен ли размер вокселя Z в панели координат 0,340 мкм. Если нет, ручно измените на 0.340 мкм.
      2. Примените фоновое вычитание к каналу DAPI, нажав Обработка изображений | Пороговое измерение | Фоновое вычитание. В диалоговом диалоге поставьте галочку только на канал DAPI, установить ширину фильтра на 3 и нажмите OK. Повторите этот шаг ещё раз, а затем повторите третий раз с шириной фильтра 1.
      3. Примените гауссовское сглаживание, нажав Обработка изображения | Сглаживание | Гауссов фильтр. Поставьте галочку только на канал DAPI, установите ширину фильтра на 0.2 и нажмите OK.
      4. В Surpass Scene нажмите Add New Spots, чтобы запустить мастер создания Spots. Выберите канал DAPI и введите предполагаемый XY диаметр 1,2 мкм. Следуя мастеру, добавьте фильтр «Качество выше» и тонко настройте порог, чтобы он надёжно выявил одно пятно для каждого ядра.
      5. Повторите шаги 2.4.3.1–2.4.3.4 на нескольких случайно выбранных выборках и окончательно определите пороговые значения, которые надёжно работают по выборкам.
   4. Откройте скрипт XT_Jove_Labkit_TH.m (Дополнительный файл 4) в текстовом редакторе, чтобы изменить следующие пользовательские параметры.
      1. Установите ims_Folder на путь преобразованной папки; установить LabkitOut_Folder на путь папки вывода Labkit. Установите Ch_DAPI в индекс канала DAPI для всех файлов в конвертированной папке (например, 1, если DAPI — первый канал, 2 — если DAPI — второй канал).
      2. Set reVoxelSizeX, reVoxelSizeY, reVoxelSizeZ. Если размеры вокселей верны в свойствах изображения (см. шаг 2.4.3.1), оставьте ответы в виде пустых скобок []. В противном случае введите соответствующие значения вручную (например, 0.130, 0.130, 0.340 соответственно), которые будут применены ко всем файлам в конвертированной папке.
   5. Окончательно определить параметры создания спот-спот.
      1. Настраивайте несколько версий параметров в массиве ячеек SpotsParameterAss , где каждая строка указывает одну версию. Это включает определение предполагаемого диаметра XY (мкм) для обнаружения пятен DAPI в левой части каждой строки и определение строки фильтра , состоящей из фильтров критериев в правой части каждой строки, содержащего порог качества из шага 2.4.3.4 и/или порог интенсивности на канале очищенной маски из шага 2.4.2.2 или канал с преобразованным расстоянием из шага 2.4.2.3.
      2. Установите «Центр интенсивности Ch=aSizeC+1» выше 0.5 , чтобы сохранить только те точки, чей геометрический центр находится в усовершенствованном канале TH маски с версии 2.4.2.2 (воксельное значение > 0.5). Это самый прямой и строгий критерий для точечной фильтрации ^TH+ DAPI.
      3. Установите «Intensity Average Ch=aSizeC+2» ниже [порога], чтобы сохранить участки, средняя интенсивность в канале дистанционного преобразования из шага 2.4.2.3 ниже заданного порога. Нижние пороги выбирают точки, расположенные внутри или крайне близко к поверхности TH; Более высокие пороги включают постепенно удалённые места. Это позволяет эмпирически определить допустимую близость для присвоения ^TH+.
      4. Заранее настроенный пример:
         SpotsParameterAss = {
         1.2, [''Качество' выше 94,5,"Центр интенсивности Ch=aSizeC+1" выше 0,5'];
         1.2, [''Качество' выше 94,5,"Средняя интенсивность Ch=aSizeC+2" ниже 0.0001'];
         1.2, [''Качество' выше 94,5,"Средняя интенсивность Ch=aSizeC+2" ниже 0,001'];
         1.2, [''Качество' выше 94.5,«Средняя интенсивность Ch=aSizeC+2" ниже 0.01'];
         ... Больше комбинаций фильтров предоставляется в скрипте.
         };
      5. Для будущих экспериментов с теми же антителами ТГ и настройками конфокалей используйте прежние комбинации параметров. Удалить те неэффективные комбинации, которые дают спот-счёты, существенно отклоняющиеся от фактических чисел, тем самым снижая ненужную вычислительную нагрузку.
   6. Создание партийных точек
      1. Сохраните все вышеуказанные изменения в скрипте XT_Jove_Labkit_TH.m. Откройте новое окно 3D-программного обеспечения. Нажмите меню Обработка изображений | PAM_TH_processing выполнять скрипт пакетно.
      2. Сначала обратите внимание на несколько минут, что для каждой комбинации фильтров скрипт создаёт объект Spots с именем, отражающим его параметры, а файлы из конвертированной папки обрабатываются и сохраняются как копии в новой выходной папке с суффиксом «processed». Оставьте компьютер без присмотра.
      3. После завершения будет создана таблица. Обратите внимание на первый столбец с именами файлов и последующие столбцы с DAPI-счётами, соответствующие каждой комбинации фильтров, при этом заголовки столбцов указывают предполагаемый диаметр XY и используемую строку фильтра .
   7. Валидация после обработки
      1. После завершения шага 2.4.6 ручно откройте несколько случайных файлов из папки «обработанные» и изучите различные объекты Spots в наложении на исходный TH-канал. На основе визуального осмотра выберите один или два оптимальных фильтра, которые дают наиболее точное представление истинного количества нейронов TH⁺ . Экспортировать соответствующие столбцы из таблицы для дальнейшего статистического анализа и подготовки рисунков.
      2. Чтобы исправить ошибки точечного подсчёта в предпочтительной комбинации фильтров, выберите соответствующий объект(ы) Spots в сцене Surpass и нажмите на вкладку Edit . Ручно удаляйте ошибочные места или добавляйте пропущенные места по необходимости, нажав Shift и кликнув по экрану. Сохраняйте обновления с помощью Store as/Export as/Save as , чтобы перезаписать соответствующий файл в папке «обработанный» с тем же именем.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Не удаляйте, не добавляйте, не переименовывайте и не перетаскивайте и не перемещайте объекты Spots — редактируйте только предпочтительные. Изменения в скрипте не требуются; Просто запустите скрипт заново, чтобы мгновенно сгенерировать обновлённую таблицу с ручными доработками. Для согласованности либо не оставляйте их отредактированными, либо редактируйте предпочтительный объект(ы) Spots для всех образцов в эксперименте.

Результаты

Исходные данные, собранные с программного обеспечения, размещены в публичном репозитории и доступны по следующему адресу DOI: 10.5281/zenodo.19814348. Чтобы продемонстрировать использование этого полуавтоматического конвейера количественной оценки, мы применили его к хорошо зарекомендовавшей себя модели Drosophila с использованием паннейронной экспрессии человеческого α-синуклеина (nSyb-QF2>QUAS-SNCA). Управляющие мушки держали только драйвера nSyb-QF2 . Оба генотипа выдерживали при 29 °C в течение 3 недель, после чего мозг был вскрыт, иммунокрашен на ТХ и снимок для ПАМ-кластера. Как показано на рисунке 3E, полуавтоматизированный конвейер обнаружил значительное снижение количества нейронов PAM TH⁺ у мух, экспрессирующих α синуклеин, по сравнению с контрольными группами (тест Стьюдента , p < 0,0001), демонстрируя, что метод может фиксировать различия, зависящие от генотипа внутри одной и той же экспериментальной партии. В следующих разделах описывается конфигурация крепления (рисунок 1), интерфейс обучения Labkit (рисунок 2) и шаги обработки изображений (рисунок 3), позволяющие эту количественную оценку.

Рисунок 1 иллюстрирует конфигурацию накопления вскрытых мозгов дрозофилы и её влияние на PAM-кластерную визуализацию. После вскрытия мозг иногда наблюдает изгиб или наклон ткани, расположенной рядом с перерезанным вентральным нервным мозгом. Это поднятие в вентральной части мозга изменяет перспективу под стереоскопом, что приводит к изменению проекции стереотипной борозды в дорсальном контуре и изменению относительной перспективы вентральных ориентиров. (Рисунок 1B,C). Эта деформация часто происходит в момент отделения мозга от тела. Такая деформация влияет на ориентацию кластера PAM во время монтажа, что, следовательно, влияет на необходимую глубину Z-стека (рисунок 1C,D). При оптимальных условиях крепления однослойный скотч-спейсер создаёт адекватное сжатие центральной области мозга, заставляя дорсально расположенный кластер PAM принимать горизонтальное положение непосредственно рядом с покрытием. Эта конфигурация даёт Z-стеки из 15–25 срезов с интервалом 0,34 мкм (рисунок 1D). В другом случае кластер PAM сохраняет наклонное положение, что требует более глубоких Z-стеков (рисунок 1D). Аналогично, использование двухслойного ленточного прокладки не обеспечивает достаточное сжатие, оставляя PAM-кластер в своей родной, наклонённой форме и увеличивая глубину Z-стека (рисунок 1D). Рисунок 1E показывает репрезентативные боковые проекции Z-стеков с TH-окрашенностью как при оптимальном расположении, так и при наклоне.

На рисунке 2 представлен интерфейс пользователя Labkit и репрезентативный рабочий процесс обучения. Имея лишь несколько редких аннотаций каракули на одном образце (рисунок 2A), начальный классификатор пикселей уже даёт удивительно разумную сегментацию (рисунок 2B). Однако крайне важно подчеркнуть, что такой минимальной аннотации недостаточно для надёжной, обобщаемой производительности по всему набору данных. Для создания классификатора, который надежно сегментирует ^{нейроны} TH+ по всему набору данных, требуется значительно более итеративное маркировка — охватывающее несколько Z-срезов, образцов и вариаций окрашивания. Стоит отметить, что несколько обучающих образов объединены по временной (кадровой) размерности, а не накладываются вдоль оси Z. Такая конструкция сохраняет пространственную целостность каждого отдельного объёма мозга, обеспечивая работу 3D-фильтров исключительно внутри биологических образцов, а не через них. Если бы образцы были вертикально сложены в один толстый Z-стек, Z-срезы на границах соседних образцов стали бы пространственно смежными, что привело бы к тому, что воксели из разных мозгов будут рассматриваться как соседние структуры, что увеличило бы риск ненужных ручных коррекций (рисунок 2C). Конкатенация вдоль оси времени предотвращает такое перекрёстное загрязнение образцов, при этом обеспечивая эффективное многообразное обучение за одну сессию Labkit.

Рисунок 3 иллюстрирует конвейер постобработки и итоговую количественную оценку. Массовые сегментационные маски Raw Labkit (рисунок 3A) содержат множество мелких ложноположительных пятен и внутренних отверстий. После применения морфологического дешума и операций заполнения отверстий (рисунок 3B) строится сглаженная поверхность TH, которая используется для создания усовершенствованной бинарной маски (рисунок 3C). Улучшение, достигнутое этой доработкой, визуализируется в виде наложения, сравнивающего начальную и конечную маски (рисунок 3D, верхняя часть). Примечательно, что некоторые области, богатые TH, иногда сохраняются в конечной маске; однако эти участки почти всегда лишены ядер, окрашенных по DAPI, и поэтому незначительно влияют на итоговое количество нейронов. Опытные пользователи могут дополнительно корректировать морфологические параметры в предоставленном скрипте пакетной обработки, чтобы тонко устранить такие остаточные артефакты. Рисунок 3D (внизу) показывает финальные пятна DAPI (пурпурная), наложенные на TH-канал (зелёный) с максимальной интенсивной проекцией. Рисунок 3D также показывает редкий тип ложноположительных результатов, иногда наблюдаемый в нашем трубопроводе: ядро, окрашенное по DAPI, расположенное в области неврита, богатой TH, может быть ошибочно классифицировано как пятно TH⁺, если сигнал нейрита сильно перекрывается с ядром. Однако, как показано на рисунке 3C, DAPI-положительные ядра вблизи нейритов обычно редкие. Более того, немногие сигналы DAPI, присутствующие рядом с такими нейротными областями, часто остаются правильно классифицированными как истинно отрицательные (то есть не считаются TH⁺), поскольку они не ошибочно идентифицируются конвейером. Рисунок 3E демонстрирует практическую полезность метода: трёхнедельные nSyb-QF2>SNCA мухи демонстрируют значительное снижение количества нейронов PAM ^TH+ по сравнению с контролями nSyb-QF2 по нескольким фильтрам (тест Стьюдента , p < 0,0001). Хотя абсолютное количество пятен может варьироваться в разных комбинациях фильтров и метод не обеспечивает идеальной точности по одному пятну, относительная разница между экспериментальной и контрольной группами остаётся значимой. Для нескольких протестированных фильтров статистический результат сравнения групп в значительной степени сохраняется между фильтрами в одной и той же экспериментальной партии. Соответственно, результат следует интерпретировать как внутрипартийное сравнительное считывание, а не как безошибочный абсолютный счёт нейронов PAM.

Рисунок 1. Диссекция мозга и расположение мозга у дрозофилы. (A) Схематическая схема крепления мозга. Жёлтые полосы обозначают проставки скотча. Увеличенная схема мозга указывает приблизительное расположение кластера PAM (фиолетовый). (B) Боковые схемы поперечного сечения, соответствующие пунктирной плоскости в букве A, изображающие две распространённые морфологии мозга после вскрытия: оптимально расположенные (верх) и наклонённые (внизу). (C) Два вскрытых мозга мух, рассмотренных под стереоскопом: оптимально расположенные (слева) против наклонённых (справа). Жёлтые стрелки указывают на стереотипную борозду вдоль дорсального контура. Синие пунктирные линии соединяют два соответствующих ориентира с левой и правой стороны нижней части. Синие стрелки подчёркивают резкий сдвиг в относительной перспективе этих вентральных ориентиров. Шкала = 500 мкм. (D) Схематическая иллюстрация, показывающая, как морфология мозга и толщина спейсера ленты (однослойные) влияют на вертикальное положение кластера PAM и, соответственно, на необходимую глубину Z-стека. (E) Репрезентативные боковые виды (Y-проекция) конфокальных Z-стеков с TH-окрашением при оптимально расположенных (верхних) и деформированных (нижних) условиях монтажа. Шкала = 5 мкм. Аббревиатура: PAM = протоцеребральное переднее медиальное. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2. Обучение с лабораторными наборами и интерактивная сегментация. (A) Графический интерфейс Labkit. Аннотации (каракули) представлены в двух классах: передний план (красный) и задний план (синий). (B) Результат сегментации, полученный сразу после обучения на каракулях, показанных в A. Красный — цвет переднего плана; синий — цвет фона. Шкала = 5 мкм. (C) Перекрёстная связь между соседними Z-срезами. Изображения митохондрий с флуоресцентными белками из разных мозгов мух были соединены вдоль оси Z. Срезы 1 и 3 являются идентичными копиями одного и того же изображения, а срезы 2 и 4 происходят из разных мозгов. Жёлтые стрелки, предсказание переходит из среза 2 в срез 1. Зелёные стрелки, предсказание переходит из среза 4 в срез 3. Шкала = 3 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3. Постобработка сегментационных масок Labkit и количественная оценка нейронов TH⁺. (A) Исходная бинарная маска Labkit (голубая, верхняя) и наложение на исходный TH-канал (нижний). Обратите внимание на обильное количество мелких пятен и неполное заполнение нейронных клеток. (B) Маска после морфологического обезшумления и заполнения отверстий (пурпурная, верхняя часть); наложение с TH-каналом (нижняя). (C) Очищенная бинарная маска (красная, верхняя) из сглаженной TH-поверхности для B и повторного маскирования; наложение с TH-каналом (нижняя). (D) Верх: наложение на необработанные (циан) и очищенные (красные) маски, выделяя области, скорректированные при постобработке. Нижняя: Максимальная интенсивность проекции, показывающая финальные пятна DAPI (маджента), наложенные на TH-канал (зелёный). Обратите внимание, что две точки в верхнем правом углу начинаются от контралатерального кластера PAM. Для иллюстрации использовался фильтр 4. (E) Количественная валидация в модели болезни Паркинсона с использованием нескольких комбинаций фильтров. Трёхнедельные мухи nSyb-QF2>SNCA (модель PD) демонстрируют значительное снижение количества нейронов PAM ^TH+ по сравнению с контролями nSyb-QF2 в нескольких фильтрах (вверху). Исходные данные предоставляются в таблице (внизу). фильтр 1: 1.2, ['"Качество" выше 94.5,"Средняя интенсивность Ch=aSizeC+2" ниже 0.0001']; фильтр 2: 1.2, [«Качество» выше 94.5, «Средняя интенсивность Ch=aSizeC+2» ниже 0.001']; фильтр 3: 1.2, [''Качество' выше 94.5,,"Средняя интенсивность Ch=aSizeC+2" ниже 0.01']; фильтр 4: 1.2, ['"Качество" выше 94.5,"Средняя интенсивность Ch=aSizeC+2" ниже 0.05']; фильтр 5: 0.6, [''Качество' выше 94.5,,"Средняя интенсивность Ch=aSizeC+2" ниже 0.001']; фильтр 6: 0.6, [''Качество' выше 94.5,"Средняя интенсивность Ch=aSizeC+2" ниже 0.01']; фильтр 7: 0.9, ['"Качество" выше 94.5,"Средняя интенсивность Ch=aSizeC+2" ниже 0.01']; n = 57 мозгов (контроль), n = 65 мозгов (PD); Тест t, p < 0.0001 (****). Мухи культивировались при температуре 29 °C. Полосы масштаба = 5 мкм (A–D). Данные представлены в виде среднего ± SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Дополнительный файл 1. Fiji макрос для разделения TH-канала из конвертированных файлов изображений и сохранения выходных стеков.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 2. Макрос Fiji для обрезки обучающих Z-стеков до общей глубины Z-срезов и объединения их в таймлапс-файл TIFF для обучения классификаторов Labkit.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 3. Предварительно обученный классификатор Labkit, используемый для тестирования процесса сегментации PAM TH.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 4. Скрипт MATLAB для пакетной обработки масок Labkit, генерации DAPI-пятен, применения комбинаций фильтров и экспорта количества нейронов TH⁺ .Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Количественная оценка DA-нейронов в кластере PAM Drosophila исторически была серьёзной задачей. Здесь мы представляем полуавтоматический рабочий процесс, который интегрирует классификацию пикселей на основе машинного обучения с программным обеспечением для анализа изображений для решения этой давней проблемы. Этот метод позволяет на уровне пакетов обнаруживать вариации нейронов ^TH+ в кластере PAM между группами в одном эксперименте, поддерживая сравнительные исследования в моделях болезни^{Паркинсона 18}.

При выборе оптимального фильтра для конкретного эксперимента пользователи могут выбрать фильтр, который лучше всего соответствует визуальному осмотру исходных изображений, либо ссылаться на указанный диапазон и/или среднее число нейронов дикого типа PAM в^{литературе 12,13}. Однако стоит осторожить: только два исследования сообщили о количестве кластеров PAM, ни одно из которых не связано с PD, и представленные значения показывают значительную несоответствие. Кроме того, стандартное отклонение может увеличиваться с возрастом, что ещё больше усложняет сравнения с помощью перекрёстных исследований. Поэтому литературные ссылки должны использоваться только как примерное ориентиро, а не как абсолютный стандарт. Мы признаём, что этот конвейер не даёт абсолютных подсчётов без ошибок (рисунок 3D). Однако, пока сравнения ограничиваются группами в одной экспериментальной партии (то есть не объединяют данные по разным партиям на одном графике), метод можно использовать для выявления относительных различий между генотипами или условиями лечения внутри партии.

По нашему опыту, вторичные антитела, конъюгированные с AF488, следует избегать из-за высокого фона, а AF546 — из-за более высокого затухания сигнала вдоль оси Z. Мы также обнаружили, что тщательная инкубация и промывка DAPI критически важны для достижения высокого отношения сигнал/шум и чистых ядерных сигналов, что напрямую влияет на производительность автоматизированной сегментации. DAPI предпочтительнее Hoechst для этого применения, поскольку его преимущественное окрашивание гетерохроматина создаёт более яркие и чётко очерченные ядерные пятна, что способствует более точному обнаружению.

Обсуждение устранения неполадок для распространённых режимов отказа

Сбои, связанные с пятнами. Навык вскрытия является важным фактором качества данных. Кластер PAM расположен поверхностно и легко повреждается при удалении двух трахеальных мешочков и жирового тела в эту область. Щипцы следует обращаться с осторожностью, чтобы избежать прокола или сжатия области PAM. Вентральная деформация часто происходит в момент перерезания вентрального нервного кана, из-за чего мозг наклоняется или сгибается при размещении на стеклянном слайде; эта деформация может стать навсегда фиксированной после инкубации PFA. Пользователям следует экспериментировать с углами щипца во время разрезания, чтобы найти оптимальную технику. Если после диссекции наблюдается наклон, мягкое давление на приподнятую область может обратить деформацию обратно (приемлемо, если сжатая область не является интересующей областью).

Сбои в сегментации. Плохая сегментация обычно связана с недостаточно разнообразными обучающими данными. Классификатор Labkit должен быть обучен на репрезентативном наборе изображений, охватывающих весь диапазон качества окрашивания внутри партии, включая лучшее, среднее и худшее. Во время итеративной коррекции уделяйте приоритетное внимание аннотированию ложноположительных и ложноотрицательных результатов, в которых вы уверены. Избегайте исправления неоднозначных или неопределённых областей, так как это может ввести классификатор в заблуждение и ухудшить производительность.

Сбои с обнаружением точек. Оптимизация параметров требует систематического исследования небольшой части представительных выборок. Проверьте разные предполагаемые диаметры пятен и порог фильтра по качеству, а также типы фильтров, выходящие за рамки фильтра «Качество выше», используемый в этом протоколе. Мастер создания точек предлагает различные варианты фильтрации (например, интенсивность). Пользователям рекомендуется адаптировать пороги и типы фильтров под свой конкретный набор данных, а также провести эмпирическую настройку перед пакетной обработкой.

Почему ручной подсчёт нейронов кластера PAM остаётся чрезвычайно сложным? Кластер PAM обладает уникальными анатомическими и окрашивающими характеристиками, которые делают традиционные ручные методы подсчёта недостаточными. Во-первых, иммунофлуоресценция TH в цитозоле дофаминергических нейронов Drosophila преимущественно маркирует тонкое цитоплазматическое кольцо, окружающее большую, неокрашенную ядерную пустоту. В результате ядро, окрашённое DAPI, и цитоплазматический компартмент TH⁺ имеют минимальное пространственное перекрытие. Это фундаментальное отсутствие колокализации исключает прямую стратегию классификации «точка DAPI внутри TH-маски». Во-вторых, кластер PAM состоит из более чем 100 плотно упакованных нейронов, расположенных в трёхмерной, виноградной структуре. При навигации по конфокальных Z-стекам нейроны постепенно появляются и исчезают — одни входят в плоскость, другие выходят из неё — создавая высокую когнитивную нагрузку и значительную изменчивость между наблюдателями. Последнее исследование, количественно оценивающее нейроны PAM DA, использовало ручной подсчёт с помощью плагина Cell-Counter от ImageJ. Хотя он полностью подходит для небольших кластеров, таких как PPM1/2 или PPL1, этот подход становится чрезмерно трудоёмким при применении к кластеру PAM, особенно в исследованиях, требующих десятков или сотен образцов.

Почему случайная лесная архитектура Labkit особенно хорошо подходит для сегментации нейронов TH? Labkit реализует случайный лесной классификатор пикселей, который исключительно хорошо адаптирован к специфическим задачам TH-окрашенных PAM-изображений. Алгоритм вычисляет комплексный вектор признаков для каждого пикселя, применяя каскад фильтров преобразований, включая гауссовское размытие (размытие), разность гаусса, градиентную величину гаусса, лапласа гаусса и гессианские собственные значения — каждое оценивается на нескольких сигма-масштабах (1, 2, 4, 8). Это многомасштабное извлечение признаков эффективно отражает текстурные и крайние характеристики, отличающие внутреннюю часть ядра от внеклеточного фона. Важно, что поскольку случайные леса требуют на порядки меньше обучающих данных, чем методы глубокого обучения, пользователи могут итеративно уточнять классификатор, используя редкие аннотации каракулей всего на 20–40 репрезентативных изображениях. Каждая итерация добавляет новые деревья решений в ансамбль, которые вместе голосуют за классификацию каждого пикселя. Этот процесс по своей сути учитывает вариабельность от партии к партии в условиях окрашивания и визуализации — что является критическим преимуществом, учитывая биологическую вариабельность, присущуюся генетическим скрещиваниям Drosophila и исследованиям старения. Используя этот подход, можно обнаружить потерю нейронов ^TH+ в моделях болезни болезни Паркинсона, экспрессирующих α-синуклеин, а влияние генетических энхансеров и супрессоров на количество нейронов кластера PAM можно сравнить внутри экспериментальной партии.

Важно, что для целей обучения обрезанные стеки соединяются вдоль временного измерения, а не по оси Z. Этот выбор конструкции критически важен для оптимального обучения классификаторов. Классификация 3D-пикселей Labkit учитывает воксельную информацию по последовательным Z-срезам, что необходимо для точного определения тонкого цитоплазматического ТГ-кольца, определяющего морфологию нейронов PAM. Если бы отдельные образцы были вертикально сложены в один ультратолстый Z-стек, Z-срезы на границах между соседними образцами стали бы пространственно смежными в стеке. Следовательно, воксели, принадлежащие разным биологическим образцам, будут рассматриваться как соседние структуры в одном и том же трёхмерном объёме. Во время интерактивного обучения каракуля, нарисованная рядом с такой границей, может случайно одновременно захватить признаки из двух разных образцов, что запутает классификатор (Рисунок 2B, стрелки). Более того, ложноположительные сигналы, исходящие из одного образца, могут проецироваться в объём соседнего образца, что приводит к ошибочным корректирующим записям, которые распространяются через последующие обучающие итерации, создавая деревья решений, кодирующие биологически бессмысленные правила. Объединение образцов вдоль оси времени сохраняет пространственную целостность каждого отдельного объёма, позволяя ядрам 3D-фильтра работать исключительно внутри биологических образцов, а не поперек, при этом обеспечивая эффективное многообразное обучение за одну сессию Labkit.

Методологические соображения и ограничения

Стоит обсудить несколько важных оговорок. Во-первых, этот протокол оптимизирован специально для кластера PAM и может не распространяться на другие кластеры DA (например, PPM1/2/3, PPL1) или на нейроны ^TH+ в зрительных долях. Область PAM обладает относительно разрежённой плотностью DAPI, а ядра хорошо расположены в трёхмерном пространстве, что обеспечивает надёжное и однозначное обнаружение точек DAPI. В отличие от этого, этот рабочий процесс не так легко переносится на другие кластеры DA, такие как PPL1 или PPM1/2. В этих областях нейриты с большей вероятностью сопоставлены или перекрываются с ядрами не-DA-клеток, окрашенных по DAPI. Учитывая очень низкое базовое количество нейронов DA в этих небольших кластерах (часто менее 10 клеток на кластер), даже несколько неправильных классификаций могут привести к пропорционально большим ошибкам, делая метод менее надёжным для таких применений. Во-вторых, иммунокрашивание TH также маркирует нейриты и аксональные проекции внутри нейропила. Несмотря на корректирующие аннотации во время обучения, эти волоконные тракты иногда производят сильные сигналы TH и могут ошибочно классифицироваться как передний план. Однако эти области в кластере PAM почти всегда лишены ядер, окрашенных по DAPI; таким образом, ложноположительные воксели в богатой нейритом области кластера PAM минимально влияют на итоговое количество нейронов. В-третьих, классификация пикселей в Labkit работает на локальных текстурных особенностях в конечном окрестности (ядра фильтра по умолчанию реагируют примерно на 16 × 16 окон по 16 пикселей). Такая конструкция обеспечивает вычислительную эффективность и позволяет интерактивную сегментацию в реальном времени, но также означает, что классификатор не может использовать глобальный анатомический контекст. В результате редкие артефакты или нарушения в окрашивании, существенно отклоняющиеся от обучающего набора, могут требовать индивидуальной проверки. Наконец, описанный здесь конвейер пакетной обработки — интеграция сегментации Labkit с обнаружением точек DAPI и преобразованием расстояния — генерирует несколько выходных каналов и комбинаций фильтров. Пользователям следует систематически проверять оптимальные параметры фильтра для своих конкретных экспериментальных условий, а не безкритично принимать стандартные пороги, представленные в этом протоколе.

Будущие применения

Помимо модели ПД, продемонстрированной здесь, этот полуавтоматизированный конвейер может быть напрямую применён к любой модели Drosophila , включающей количественную оценку DA-нейронов кластера PAM, включая исследования обучения и памяти, мотивации, регуляции сна и возрастной нейродегенерации. В частности, пакетная обработка этого метода может сделать его подходящим для: (1) средне- и высокопроизводительных скринингов: тестирование нескольких нейропротекторных соединений в разных дозах становится более реалистичным без пропорционального увеличения ручного подсчёта. (2) Скрининги генетических модификаторов: количественное определение количества PAM-нейронов в сотнях генетических скрещиваний (например, РНК-линии, линии переэкспрессии) для выявления энхансеров или супрессоров токсичности α-синуклеина. (3) Исследования продольного старения: отслеживание потери нейронов PAM в нескольких временных точках с уменьшением ручного подсчёта. Кроме того, рабочий процесс сегментации на основе Labkit не ограничивается только TH-окрашиванием; при соответствующей переобучении его можно адаптировать для количественного определения других нейронных популяций в мозге дрозофилы , при условии, что они разделяют две ключевые черты с кластером PAM: относительно низкую плотность ядер, окрашенных DAPI, и минимальное вмешательство от окрашивания неврит. Помимо Labkit и используемого здесь 3D-программного обеспечения, общая логика этого конвейера — классификация пикселей на основе машинного обучения, затем обнаружение точек и преобразование расстояний — может быть реализована в других поддерживаемых платформах для анализа 3D-изображений, что повышает его доступность и гибкость для широкой исследовательской аудитории.

В итоге мы представляем полуавтоматический рабочий процесс для выявления групповых различий в количестве нейронов кластера PAM TH⁺. Сочетая классификацию пикселей на основе Labkit с обнаружением пятен и преобразованием расстояний, этот метод позволяет сравнивать количество нейронов TH⁺ между экспериментальной и контрольной группами в одной партии, одновременно снижая нагрузку на ручной подсчёт по мере увеличения размера выборки. Масштабирование от десятков до сотен выборок пропорционально увеличивает время вычислений, но дополнительные ручные усилия в основном ограничиваются организацией файлов и точной проверкой качества. Хотя кластер PAM до сих пор получил мало внимания в исследованиях PD, это в основном связано с техническими ограничениями, а не с биологической неактуальностью. Предоставляя практический инструмент количественной оценки, наш протокол в будущем облегчит изучение того, деградируют ли и как ПАМ-нейроны в моделях ПД, а также их потенциальный вклад в немоторные симптомы, такие как обонятельные дефициты и снижение мотивации. Мы ожидаем, что этот протокол позволит проводить партийные сравнительные исследования дофаминергической нейродегенерации, синаптической пластичности и скрининга нейропротекторных препаратов в модельной системе Drosophila .

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Программное обеспечение для обработки 3D-изображений — Bitplane Imaris 8.0+	Oxford Instruments	http://www.bitplane.com/	Программное обеспечение для анализа 3D-изображений, используемое в этом исследовании
4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI)	Термо Фишер Сайентифик	62248
D. melanogaster: nSyb-QF2	Центр дрозофилы в Блумингтоне	51960
D. melanogaster: nSyb-QF2>QUAS-SNCA	Центр дрозофилы в Блумингтоне	600605
ДОУСИЛ СИЛГАРД 184	Tat Lee Engineering Pte Ltd	https://www.tatlee.com.sg/
Пинцет Dumont Styple 3C Dumoxel, 0,04/0,08 мм	Науки об электронной микроскопии	72680-D(0203-3C-PO)
FV3000 конфокал	Олимп	https://www.olympus-global.com/
Козий антикроликовый антител IgG (H+L) с перекрёстно адсорбированным вторичным антителом, Alexa Fluor 647	Термо Фишер Сайентифик	A-21244
ImageJ/Fiji (1.53q)	Fiji/ImageJ	https://imagej.net/software/fiji/
Labkit	Fiji/ImageJ	https://imagej.net/plugins/labkit/
Минимальные штифты, нержавеющая сталь, диаметром 0,15 мм	Аустерлиц	https://mothandbeetle.com/products/austerlitz-stainless-steel-minutens.html
Обычная козья сыворотка, лиофилизированная твердая	Сигма-Олдрич	566380
Программное обеспечение для численных вычислений — Python	Python	3.8+
Программное обеспечение для численных вычислений — Matlab	Математическая работа	R2016a+	Программное обеспечение для численных вычислений, используемое в этом исследовании
Октилфенол этоксилат (Тритон X-100)	Био-радиация	1610407
Параформальдегидный раствор 4% в PBS	Санта-Крус Биотехнология	SC-281692
Тарелка для культивирования полистироловых клеток	Nest Scientific	706001
ProLong Gold Антифейд Монтант	Термо Фишер Сайентифик	P36934
Антитирозиновая гидроксилаза (TH) для кроликов	Пел Фриз	P40101-0
Натрий-азид	Сигма-Олдрич	S2002
Стереоскоп	Олимп	SZ51
Sterican Einmalkanü len 27 G grau 0,40 x 12 mm	Sterican	D-34209
Шприц, 1 мл	Тэрумо	DVR-5175
Прозрачная клейкая лента	3M Scotch 600, чисто	600