Обработка туннелей и обогащение окружающей среды для повторной плетизмографии всего тела у мышей

Краткое содержание

Этот протокол описывает процедуры обработки туннеля и обогащения окружающей среды для повторной плетизмографии всего тела с целью снижения респираторной вариабельности, связанной со стрессом, во время продольных исследований у мышей.

Аннотация

Повторная плэтизмография всего тела (БКП) широко используется для продольной оценки дыхательной функции у мышей. Однако стресс, вызванный обработкой, может привести к физиологической вариабельности, которая сбивает с толку эффекты лечения и снижает воспроизводимость экспериментов. Традиционные методы обращения с хвостом могут вызывать устойчивые стрессовые реакции и плохую привычку при повторяющихся сессиях, что потенциально влияет на результаты экспериментов. Этот протокол описывает усовершенствованные методы обработки и размещения, интегрирующие обработку туннелей и обогащение окружающей среды для повторных сессий WBP. Шесть диких мышей типа 129S1/SvImJ (3 самца, 3 самки) получили обработку туннелей и непрерывное обогащение окружающей среды в течение 10-недельного исследования. Животные проходили повторные сеансы WBP, а периоды акклиматизации анализировались на начальном, раннем, среднем и позднем этапе исследования. Частота дыхания при начальном размещении камеры (F, 0–2 мин) и стабильная базовая линия (F, 8–10 мин) были количественно оценены для оценки продольных паттернов акклиматизации. Прогрессивные изменения наблюдались на протяжении всего срока исследования при реализованных условиях. Средняя начальная частота дыхания снизилась с 345 ± 111 SD/мин на исходном уровне до 267 ± 43 SD вдохов в минуту в поздних сессиях исследования, сопровождаясь снижением коэффициента вариации (32% до 16%). Исходные измерения дыхательных частот также снизились с 255 ± 67 до 193 ± 43 вдоха в минуту (p = 0,033), что соответствует улучшению стабильности измерений в последующих сессиях. Поведенческие наблюдения показали спокойную адаптацию с минимальным количеством дефекации, мочеиспускания или возбуждения. Этот протокол предоставляет практический подход для лабораторий, проводящих повторные респираторные оценки у мышей. Обработка туннеля и обогащение окружающей среды были связаны с прогрессирующей акклиматизацией и снижением респираторной вариабельности в ходе продольных исследований WBP.

Введение

Плетизмография всего тела (WBP) позволяет проводить неинвазивную оценку дыхательных функций у сознательных, неограниченных грызунов и стала незаменимым инструментом для лонгитюдных исследований в области респираторной физиологии, ингаляционной токсикологии и моделирования заболеваний ^1,2. Основные преимущества метода, включая неинвазивный характер и пригодность для многократных измерений, делают её особенно ценной для отслеживания респираторных изменений в зависимости от прогрессирования заболевания, терапевтических вмешательств или времени воздействия. Глааб и^{Браун 2} подчеркнули, что неинвазивная плетизмография головного тела является надёжным методом многократных измерений функции лёгких у сознательных мышей, предоставляя необходимые инструменты для трансляционных исследований заболеваний дыхательных путей, включая новые респираторные инфекции. Однако качество и воспроизводимость измерений WBP критически зависят от достижения состояний низкой частоты дыхания, соответствующих поведенческому покойному состоянию, которое может быть нарушено стрессом, вызванным обработкой процесса. Обработка стресса представляет собой хорошо известный, но часто недооценённый источник экспериментальной вариабельности, который может запутать физиологические измерения и снижать качество данных. Стандартная лабораторная практика обычно включает обращение с хвостом, при котором мышей хватают за хвост для транспортировки и манипуляции ^3,4.

Стандартная лабораторная практика обычно включает обращение с хвостом, при котором мышей хватают за хвост для транспортировки и манипуляции. Гувейя и^{Хёрст 3} показали, что захват хвоста вызывает тревогу у мышей, при этом у животных с руками наблюдается повышенное поведение, похожее на тревожность, в лабиринте с поднятым плюсом по сравнению с контролями с туннельными ручками. Эта тревожная реакция связана с изменёнными физиологическими параметрами. Расид и ^др.4 использовали WBP для количественной оценки респираторных эффектов рутинных лабораторных процедур, выяснив, что сдержанность и обращение значительно изменяют миниатюрный объём в зависимости от пола, при этом эффекты сохраняются до 24 часов после процедуры. Величина и продолжительность этих эффектов, вызванных обращением, подчёркивают, что измерения дыхания, полученные вскоре после обработки хвоста, могут отражать физиологию острого стресса, а не стабильную исходную функцию.

Более широкая литература по сдерживанию и управлению стрессом показывает влияние, выходящее за рамки непосредственных поведенческих реакций. Буйницкий и^{Мостофский 5} рассмотрели обширное влияние стресса сдерживания на физиологические, иммунологические, эндокринные и развивающиеся процессы, подчеркнув, что стрессовые факторы часто недостаточно документированы в научных статьях. Для респираторных исследований проблема усугубляется необходимостью повторных измерений. Каждое событие обработки может сбрасывать стрессовую реакцию, ограничивая прогрессивную привычку и приводя к непоследовательным исходным измерениям в продольных временных точках. ДеЛорм и^{Мосс 1} сравнили методы ограниченной и неограниченной плетизмографии у мышей с известными физиологическими различиями между деформациями, выяснив, что хотя неограниченные однокамерные системы обеспечивают улучшенный анализ реактивности дыхательных путей, проблема получения воспроизводимых исходных измерений оставалась.

Обработка туннелей, при которой мыши добровольно заходят в туннель для транспортировки, стала доказательной альтернативой, которая значительно снижает тревогу, вызванную обращением. Эффективность метода была продемонстрирована в различных штаммах и экспериментальных контекстах. Гувейя и^{Хёрст 3} показали, что мыши с туннельной ручкой проявляли большую готовность к взаимодействию с кураторами и снижали тревожное поведение при повышенном уровне и лабиринте по сравнению с мышами с хвостовой ручкой, при этом преимущества наблюдались даже в незнакомых туннелях. Важно, что эти преимущества распространяются и не только на период после обработки. Сенсини и ^др.6 исследовали влияние техники обращения и частоты обращения между полами, выяснив, что частое обращение с хвостом снижает поведение, связанное с благополучием, такое как рытьё, и увеличивает поведение, похожее на отчаяние, у мужчин, тогда как обращение с туннелем предпочиталось обоими полами и ассоциировалось с более позитивным подходом и меньшим числом защитных реакций. Кроме того, Дэвис и ^др.7 показали, что преимущества работы без хвоста сохраняются и при сложных процедурах. Мыши, подвергавшиеся обращению с хвостом на протяжении всего лабораторного опыта, включая процедуры по удержанию, показали повышенную реакцию на воздействия окружающей среды и снижение простоты обращения по сравнению с мышами, работающими исключительно с помощью бушек или туннеля.

Помимо выбора методов, систематическая привычка к экспериментальным процедурам может дополнительно снизить изменчивость, вызванную стрессом. Сорли и ^др.8 исследовали обучение мышей для плетизмографии с головой наружу — системы ограничения — и обнаружили, что пять последовательных дней тренировки улучшают толерантность, при этом мыши демонстрируют улучшение поведенческой стабильности уже на второй день, хотя параметры дыхания стабилизировались в течение 5 минут во всех сессиях. Аналогично, Уэно и ^др.9 показали, что повторяющееся мягкое обращение с самцами мышей C57BL/6 до поведенческого тестирования снижало тревожное поведение при повышенном плюс лабиринтном тестировании и улучшало пространственное познавание, что свидетельствует о том, что повторный контакт с кураторами может вызывать измеримый эффект привыкания. Эти результаты свидетельствуют о том, что сочетание методов неаверсивного обращения с систематическими протоколами привыкания может дать совокупную пользу для снижения физиологической вариабельности при повторных измерениях.

Обогащение окружающей среды является дополнительным фактором, который может влиять на чувствительность к стрессу и исходную физиологию, хотя его эффекты сложны и зависят от контекста. Хотя обогащение обычно способствует положительному благополучию, чрезмерное или непредсказуемое обогащение может парадоксально увеличивать физиологическую изменчивость и поведение, связанное со стрессом, в некоторых экспериментальных^{контекстах 10,11}. Сбалансированный подход, поддерживающий стабильные элементы ядра, такие как материал для вложения, при этом обеспечивая управляемую новизну за счёт периодической ротации предметов обогащения, может оптимизировать благополучие без введения смешанных^{вариаций 12}. Взаимодействие между обогащением, методом обработки и протоколами привычки остаётся недостаточно изученным в контексте повторных измерений дыхания, что подчёркивает необходимость интегрированных протоколов, охватывающих все три фактора одновременно.

Несмотря на растущее признание влияния обработки на физиологические измерения, стандартизированные протоколы, специально разработанные для минимизации стресса во время повторных сеансов WBP, остаются ограниченными. Существующие протоколы WBP обычно используют длительный период акклиматизации (10–30 минут на сеанс), чтобы позволить стресс-индуцированному тахипноэ ослабеть, но редко решают основной метод обработки или систематически оценивают, происходит ли прогрессивная привычка между сессиями. Кроме того, большинство исследований не оценивают, достигают ли животные физиологических состояний, соответствующих поведенческому покойному состоянию, например, частоты дыхания, приближающиеся к диапазонам, сообщаемым в литературе как связанные с состояниями покоя или сном, или же переходят от острого стресса к хроническому низкоуровневому возбуждению. Здесь мы представляем протокол, объединяющий управление туннелями, сбалансированное обогащение окружающей среды и повторные сеансы WBP в течение 10-недельного лонгитюдного исследования. Мы описываем подход, связанный с прогрессивными изменениями частоты дыхания, соответствующими привыкающим процессуатуре, включая снижение начальных частот дыхания во время сессий и исходные измерения, приближающиеся к диапазонам, о которых в литературе сообщается как связан с состояниями покоя или сном. Важно отметить, что этот протокол представлен не только как уточнение благополучия животных, но и как экспериментальное проектирование, которое может помочь снизить вариабельность и улучшить согласованность при продольных измерениях дыхания.

Протокол

Выполнять все процедуры в соответствии с протоколами, утверждёнными Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC Protocol #23-103) в Университете Майами. Содержать мышей в аккредитованном AAALAC вивариевом объекте с поддержанием экологических условий в соответствии с институциональными стандартами.

1. Отбор животных и условия содержания

1. Выберите и подготовьте животных к исследованию
   1. Выбирайте животных из устоявшейся племенной колонии или приобретайте их у коммерческого продавца. Для этого исследования используйте шесть мышей дикого типа 129S1/SvImJ (3 самца, 3 самки).
   2. Содержание животных в условиях SPF (специфических свободных от патогенов) в аккредитованном AAALAC учреждении с регулярным мониторингом здоровья в соответствии с институциональными стандартами.
   3. Подтвердите, что животным на момент начала исследования возраст примерно 6 месяцев (молодые взрослые).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши в данном исследовании ранее сталкивались с туннельным обслуживанием в рамках рутинного содержания. Для наивных мышей внедрите период подготовки перед началом занятий WBP (см. шаг 3.2).
2. Начинайте экспериментальные процедуры, когда мыши достигнут возраста, соответствующего целям исследования. В этом исследовании мыши были примерно в возрасте 6 месяцев (молодые взрослые) на момент начала занятий WBP. Для воспроизводимости используйте мышей в определённом возрастном диапазоне (например, ±1 месяц) и указывайте конкретный возраст, так как возраст может влиять на исходные респираторные параметры и кинетику привыкания.

2. Протокол обогащения окружающей среды

1. Обеспечить постоянный материал для гнездования
   1. При каждой замене клетки помещайте по одному сжатому хлопковому квадрату (примерно 5 см × 5 см, ~2,5 г).
   2. При замене переносите большую часть существующей структуры гнезда в новую клетку обеими руками.
   3. Если накопленный гнездовой материал превышает примерно 10 г (примерно вдвое больше исходной массы), удалите самые старые и уплотнённые части снизу, сохраняя внешнюю купольную структуру.
   4. Добавьте один свежий хлопковый квадрат (5 см × 5 см) в чистую клетку для дальнейшего строительства и ухода за гнездом.
   5. Заменять материал для гнездования можно только в случае видимой влажности (загрязнение мочой >25% поверхности) или если гнездо было уничтожено и не восстановлено в течение 48 часов (рисунки 1A и 1C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраняйте структуру гнезда, чтобы минимизировать стресс, связанный с изменениями клетки, и поддерживать стабильные обонятельные и тактильные сигналы на протяжении всего исследования. Качество гнезда служит показателем благополучия и состояния здоровья животных¹³.
2. Оценивайте строительство гнезда еженедельно по следующей стандартизированной процедуре
   1. При каждой замене клетки аккуратно переносите целое гнездо на чистую поверхность обеими руками, не нарушая конструкцию.
   2. Сфотографируйте гнездо прямо сверху с камерой, расположенной перпендикулярно поверхности 30–40 см, чтобы визуализировать общую структуру и формирование кратера.
   3. Сфотографируйте гнездо сбоку на уровне гнезда, чтобы зафиксировать целостность стены и характеристики купола.
   4. Оценивайте гнездо по стандартизированной 5-балльной шкале^{диакона 13}, где 1 = материал для гнезда, в основном нетронутый и 5 = куполообразное гнездо с прозрачным кратером. См. рисунки 1A–1C для примеров гнёзд с оценкой 5.
   5. Аккуратно верните гнездо в чистую клетку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Еженедельные фотографии гнезда обеспечивают объективную документацию качества гнезда на протяжении всего исследования. Ухудшение состояния гнезда может указывать на болезни, стресс или другие проблемы с благополучием, требующие ветеринарного вмешательства.
3. Предоставляйте ротационное обогащение, меняемое еженедельно
   1. Выберите один предмет для обогащения и поместите его в клетку. Используйте измельченную бумагу (обычную белую бумагу, порцию размером на горсть), бумажные полотенца (2–3 листа, без запаха, белые, сложенные или помятые бумаги) или бумажные укрытия (картонные трубки или маленькие коробки).
   2. Еженедельно меняйте материалы по заранее установленному графику (например, неделя 1: измельченная бумага; Неделя 2: бумажные полотенца; 3-я неделя: картонная трубка; 4-я неделя: повторяю), чтобы сохранить приемлемую новизну.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Еженедельная ротация даёт новизну без перегрузки мышей. Избегайте пластиковых предметов, таких как пластиковые хижины, шары или жёсткие конструкции, которые могут повысить физиологическую^{изменчивость 11}. Меняйте все предметы обогащения при каждой замене клетки.

Рисунок 1. Внедрение протокола и показатели благополучия во время исследований продольной плетизмографии всего тела (WBP). (A) Представительное высококачественное гнездо (балл Дикона 5) из женской клетки, демонстрирующее хорошо сформированную куполообразную структуру с чётко выраженным кратером. (B) Прозрачный тоннель для обработки поликарбоната (примерно 10 см длиной × 5 см внутреннего диаметра), интегрированный с материалом для гнездования в домашней клетке. Тоннели постоянно оставались в клетках для обогащения и обработки на протяжении всего исследования. (C) Репрезентативное качество гнезда на поздних этапах исследования (неделя 10), показывающее устойчивое строительство гнезда с результатом 5 как в клетках самцов, так и в самках. (D) Результаты качества Nest в течение 10-недельного учебного периода. Каждая точка данных отражает недельный балл гнезда для клетки по стандартизированной 5-балльной шкале^{Дикона 13}, где 1 = нетронутый гнездовой материал и 5 = полное куполообразное гнездо с кратером. Обе клетки сохраняли стабильное качество гнезда с оценкой 5 на всех этапах исследования. Затемненная зелёная область обозначает баллы, связанные с оптимальными условиями благополучия (оценки 4–5). Фазы исследования обозначаются цветными фоновыми областями, соответствующими исходному уровню (неделя 0), ранней стадии обучения (недели 2–3), середине исследования (недели 5–7) и позднему обучению (недели 8–10). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

3. Реализация обработки туннелей

1. Подготовьте тоннели для обработки
   1. Используйте прозрачные поликарбонатные тоннели (длиной 100 мм или 130 мм × внутренним диаметром 50 мм) с гладкими, округлыми краями (см. рисунок 1B).
   2. Разместите по одному тоннелю в каждой домашней клетке в рамках обогащения клетки.
   3. Не удаляйте туннели между событиями обработки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держание тоннеля в домашней клетке позволяет ему приобретать знакомые запахи клетки и ассоциироваться с домашней средой, а не с процедурами обработки. Мыши часто используют туннели как убежища или места для гнездования.
   4. При каждой замене клетки протирайте внутреннее пространство туннеля небольшим количеством использованной подстилки из предыдущей клетки, прежде чем положить её в чистую клетку.
   5. Автоклавные туннели или промывайте их тем же дезинфицирующим средством, что и для дезинфекции клеток, если между использованием требуется дезинфекция. Тщательно промыйте и дайте туннелям высохнуть на воздухе, прежде чем вернуть их в клетку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание обонятельной непрерывности помогает минимизировать стресс, связанный с незнакомыми запахами. Тоннели можно проходить автоклавом и многократно использовать.
2. Подготовьте мышей к работе с туннелем
   1. Для наивных взрослых мышей внедрите период тренировки не менее 1–2 недель перед началом сеансов^{WBP 14, 15}.
   2. Разместите прозрачные поликарбонатные тоннели (см. шаг 3.1) навсегда в домашней клетке и подождите 3–7 дней для пассивного знакомства.
   3. После пассивной экспозиции проводите ежедневные аккуратные занятия. Поощряйте мышей добровольно войти в туннель, затем поднимите туннель горизонтально на 30–60 секунд, прежде чем вернуть мышь в клетку.
   4. Оценить успешное привыкание по следующим критериям: добровольный вход в туннель в течение 10–30 секунд, спокойное поведение внутри туннеля без попыток побега или вокализации, а также спонтанное использование туннеля для отдыха или исследования во время рутинных наблюдений в^{клетке 14,15}.
   5. Начинайте занятия WBP, когда все критерии привычки выполнены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши в этом исследовании ранее сталкивались с туннельным обслуживанием в рамках рутинного ухода до начала сеансов WBP.
3. Выполнение неаверсивной обработки
   1. При всех процедурах обращения носите перчатки без порошка.
   2. Используйте туннельную обработку в качестве основного метода обработки. Если мышь находится внутри туннеля, поднимите туннель горизонтально, поддерживая основание одной рукой.
   3. Если мышь находится вне туннеля, разместите отверстие в тоннеле в пределах 5–10 см от мыши и дайте 10–30 секунд для добровольного входа без преследования или принуждения.
   4. Если мышь не входит в течение 30 секунд, поощряйте движение к тоннелю с помощью сложенной руки, расположенной позади мыши, не соприкасаясь с ней.
   5. Если мышь не входит после двух попыток (максимальное количество 60 секунд), используйте метод баночного режима. Положите расплющённую руку рядом с мышью, позвольте свободно подойти на 10–20 секунд, затем аккуратно подхвативайте мышь обеими руками, избегая захвата хвоста.
   6. Используйте метод обращения, который приводит к спокойному поведению, определяемому как отсутствие вокализации, попытки побега или стрессовая дефекация.
4. Перенос мышей в камеру плетизмографии
   1. Перенесите мышь из туннеля в сложенные ладони перед тем, как положить её в камеру.
   2. Держите туннель горизонтально и наклоните заднюю часть (хвостовую сторону) вверх примерно на 10–20°.
   3. Позвольте мыши выйти из туннеля, задними лапами вперёд, на сложенные руки.
   4. Опустите обе руки в камеру и позвольте мыши добровольно ступить на пол камеры в течение 5–10 секунд.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот способ передачи туннеля — руки в камеру обеспечивает улучшенное управление при установке патронника.
   5. Или переместите мышь прямо из туннеля в камеру, наклонив туннель над отверстием камеры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Прямой перенос из туннеля в камеру обеспечивает меньший контроль во время установки и использовался реже в этом исследовании.
   6. Никогда не переворачивайте туннель вертикально и не трясите его.
   7. Запечатайте крышку камеры сразу после установки мыши и верните туннель в домашнюю клетку.
      КРИТИЧЕСКИЙ ШАГ: Никогда не хватайте мышей за хвост ни в один момент исследования. Если мышь не входит в туннель в течение 30 секунд или не подходит к сложенной руке, поощряйте движение мягкой подстилкой, не преследуя и не принуждая к взаимодействию. Позвольте мыши выбирать туннельный или ручной подход в зависимости от индивидуальных предпочтений. Терпение на первых сессиях помогает установить положительные ассоциации с неаверсивным^{обращением 3,7}.

4. Протокол сессии WBP

1. Подготовьте систему плетизмографии
   1. Калибруйте плетизмограф всего тела один раз в день перед сбором данных.
   2. Когда камеры опустошены и герметичны, инициируйте автоматическую калибровочную последовательность через программное обеспечение респираторного анализа FinePointe (цель: 18–22 см H₂O). Подтверждайте успешную калибровку, когда эффективный диапазон потока в коробке превышает ±40 мл/с на участок.
   3. Установите смещённый поток на 1,0 л/мин на камеру.
   4. Постоянно контролируйте температуру камеры (22°C–24°C) и влажность с помощью цифровых датчиков.
   5. Размещайте камеры в тихом месте с равномерным освещением и минимальной вибрацией.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте постоянное состояние камеры на всех сессиях. Колебания температуры изменяют дыхательные паттерны и запутывают продольные^{сравнения. 1}.
2. Проводите сеансы WBP в течение постоянной циркадной фазы
   1. Проведите все измерения в течение одного и того же временного окна светового цикла.
   2. Проводите сессии с 08:00 до 10:00 (свет включается в 06:00) и избегайте первых двух часов после включения света, когда циркадные ритмы меняются.
3. Транспортируйте мышей в экспериментальную комнату
   1. Транспортируйте домашние клетки в экспериментальную комнату на тележке примерно за 15 минут до начала сессии.
   2. Позвольте мышам привыкнуть к экспериментальной комнате, оставаясь в привычной домашней клетке.
   3. Размещайте домашние клетки рядом с камерами для плетизмографии.
   4. Используйте туннельную обработку (см. шаги 3.3–3.4), чтобы переместить каждую мышь из домашней клетки в руки с чашками, а затем в камеру.
   5. Обращайтесь с мышами спокойно и минимизируйте резкие движения во время переноса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Индивидуальная передача мыши занимает всего несколько секунд.
4. Положите мышь в камеру
   1. Аккуратно перенесите мышь из сложенных рук в камеру (см. шаг 3.4).
   2. Запечатайте крышку камеры в пределах 5 секунд от положения мыши.
5. Начните адаптацию и запись
   1. Начните записывать дыхательные сигналы с помощью программного обеспечения для анализа дыхательных путей.
   2. Дайте 10 минут на адаптацию без помех или вмешательства.
6. Мониторинг стабильности поведения во время акклиматизации
   1. Наблюдайте за мышью непрерывно на протяжении всего периода адаптации.
   2. Записывайте чрезмерные движения, устойчивую неподвижность с признаками стресса (например, жёсткая осанка) или повторяющиеся попытки побега без периодов спокойного поведения в журнале сессии.
   3. Признать, что такие сессии могут всё равно предоставлять действительные начальные данные f; Однако базовые измерения Fмогут быть ненадёжными.
   4. Отмечайте сессии без наблюдаемых периодов спокойствия в окне акклиматизации для возможного исключения из базовых анализов согласно критериям, специфичным для исследования.
   5. Сохраняйте все сессии в данном исследовании, так как ни одна из них не соответствовала критериям исключения на основе акклиматизационного поведения.
      КРИТИЧЕСКИЙ ШАГ: 10-минутный период адаптации необходим для оценки привыкания. Хотя некоторые протоколы используют 20–30-минутные периоды акклиматизации, хорошо привыкшие мыши в данном исследовании достигли стабильных дыхательных паттернов в течение 8–10 минут, что делает длительную акклиматизацию ненужной и потенциально контрпродуктивной из-за увеличения движения.
7. Наблюдайте поведение мышей во время акклиматизации
   1. Наблюдайте за мышами непрерывно в течение 10-минутного периода акклиматизации с помощью визуального мониторинга камер.
   2. Обратите внимание на явные признаки стресса, такие как дефекация, мочеиспускание, продолжительные попытки побега или длительное неподвижность.
   3. После каждого сеанса фиксируйте наличие и приблизительное количество фекальных гранул и мочи в камере.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти наблюдения обеспечивают качественную оценку уровня стресса и прогресса в привыкании, но формально не оценивались с использованием стандартизированной этограммы в данном исследовании.
8. Анализ респираторных показателей в фазе акклиматизации
   1. Используйте программное обеспечение для анализа дыхательных путей для автоматического расчёта частоты дыхания по сигналам давления, используя стандартный алгоритм обнаружения дыхания и стандартные пороговые настройки в этом ПО.
   2. Приобретать дыхательные сигналы при стабильных условиях воздушного потока (см. шаг 4.1) с использованием стандартных параметров приобретения.
   3. Рассчитайте среднюю частоту дыхания за два периода: начальная частота (0–2 мин), отражающая начальную реакцию на стресс и физиологию сразу после обработки, и базовая частота f(8–10 минут), обозначающая стабилизированную базовую частоту дыхания.
   4. Исключать периоды с видимыми артефактами движения, определяемые как отклонения недыхательного давления или неправильные формы волн, связанные с движением животных или нарушениями камеры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Визуально проверьте подмножество записей (примерно 10%), чтобы подтвердить точное обнаружение дыхания с помощью автоматического алгоритма. Ручная валидация подтвердила соответствие между автоматизированным обнаружением и наблюдаемыми дыхательными паттернами.
9. Если применимо к экспериментальному протоколу, если применимо
   1. Продолжайте экспериментальные вмешательства после 10-минутного периода акклиматизации в соответствии с дизайном исследования (например, аэрозольная доставка лекарств, гипоксическое испытание, тестирование упражнений).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время сессий оценки привычки в этом исследовании экспериментальных вмешательств не проводилось. Зарегистрированные респираторные показатели (fначальный и f-базовыйуровень) были получены во время сессий только с акклиматизацией без дополнительных процедур.
10. Верните мышь в домашнюю клетку
    1. Используйте тоннельную обработку или сложенные руки, чтобы перенести мышь из камеры обратно в домашнюю клетку.
    2. Наблюдайте за мышью в течение 5 минут после сеанса, чтобы подтвердить нормальное поведение, включая спонтанные движения, уход за собой, взаимодействие с соседями по клетке, а также исследование пищи и воды.
    3. Продлите наблюдение и проконсультируйтесь с ветеринарным персоналом, если аномальное поведение сохраняется дольше 15 минут, включая длительную неподвижность (>5 мин), затруднённое дыхание, сутулость или отсутствие взаимодействия с соседями по клетке.
       ПРИМЕЧАНИЕ: В данном исследовании не наблюдалось аномальных поведений после сессии.
11. Поддерживайте стабильную частоту сессий
    1. Регулярно проводите сеансы WBP в течение длительного периода изучения (10 недель по этому протоколу).
    2. Проводите занятия с интервалом недели, чтобы отслеживать прогресс привыкания.
    3. Планируйте занятия в одинаковое время суток (см. шаг 4.2), чтобы поддерживать циркадную и процедурную согласованность.

Результаты

Применение этого протокола обращения с туннелем и обогащения окружающей среды к шести мышам дикого типа 129S1/SvImJ (3 самцов, 3 самки) в ходе 10-недельного продольного исследования WBP дало доказательства прогрессирующей привычки и улучшенной физиологической стабильности. Измерения частоты дыхания были получены во время повторных сеансов WBP, проводимых с регулярными продольными интервалами, при этом данные были проанализированы с четырёх фаз исследования: исходная (неделя 0), раннее из...

Обсуждение

Этот протокол описывает интегрированный подход, сочетающий обработку туннелей, обогащение окружающей среды и повторное воздействие в контексте продольного WBP. В таких условиях измерения частоты дыхания показали прогрессирующую стабилизацию при повторных сеансах, что соответствует снижению возбуждения и прогрессирующей привыканию. Для успешной работы протокола важны несколько факторов внедрения. Во-первых, необходимо внедрить управление туннелем до начала экспериментальных процедур. В эт...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Аспенное щепное постельное бельё	Лабораторные материалы	Aspen 323	Аспенное щепное постельное бельё. Подвергается автоклавированию перед использованием; укладывается на пол клетки толщиной примерно 1 см.
Автоклавированная вода	Поставляется объектом	Не применимо	Автоклавированная коммунальная вода предоставляется ad libitum через стандартные водяные бутылки.
Картонная трубка	Генерируется объектом	Не применимо	Плоская картонная трубка от туалетной бумаги. Используется как вращающийся элемент обогащения и укрытия.
Crink-I-Nest (облученный)	The Andersons / Лабораторные материалы	CNKR	Материал для обогащения из измельчённой бумаги. Гамма-облученный. Предоставляется как вращающийся элемент обогащения на альтернирующей недельной основе.
Программное обеспечение FinePointe	Data Sciences International	Нет каталожного номера	Программное обеспечение для сбора и анализа респираторных данных, версия 3.0. Используется для сбора данных WBP и расчёта параметров.
Сетка для индивидуально вентилируемых клеток (IVC)	Allentown	EP5000E	Сетка IVC с вытяжкой, вместимость 140 клеток. Двухсторонняя система с высокой плотностью с автоматическими вентиляционными соединениями.
Облученный корм для грызунов	Envigo	T.2918.15	Стандартный облученный корм для грызунов. Предоставляется ad libitum через кормушку с проволочной сеткой.
Туннель для перемещения мышей	Braintree Scientific	TRANS-TUBE 100X50MM	Прозрачный поликарбонатный туннель, длиной 100 мм и внутренним диаметром 50 мм. Можно стерилизовать в автоклаве и многократно использовать. Используется для процедур перемещения животных с низким стрессом.
Nestlets (облученные)	Лабораторные материалы	IRR	Сжатые хлопковые гнездовые квадратики (~5 см × 5 см, ~2,5 г каждый). Гамма-облученные. Предоставляются как постоянный элемент обогащения; один на клетку.
Перчатки нитриловые без пудры	Kimberly-Clark	KC500	Фиолетовые нитриловые перчатки без пудры для обследования. Носятся во время всех процедур контакта с животными.
Не тканая марлевая спонжа	Pivetal	21295040	Не стерильная, не тканая марлевая спонжа, 4-слойная, 4 дюйма × 4 дюйма (10,16 см × 10,16 см). Используется как материал для обогащения.
Бумажное полотенце	Tork (Essity)	MB 540A	Белое многослойное полотенце для рук. Используется как вращающийся материал для обогащения.
Камера смартфона	Apple	Нет каталожного номера	Камера смартфона iPhone. Используется для еженедельной документации оценки гнезд.
Система полнотелочной плетизмографии	Data Sciences International	10222C (2-местная); 770621 (4-местная)	Система полнотелочной плетизмографии FinePointe FP Series без ограничений для мышей. Доступна в 2-местной и 4-местной конфигурациях.