Методическая статья

Пластинчатый визуализационный анализ для количественной оценки фотопериодических реакций у Neurospora crassa с использованием развития протоперитеций

DOI:

10.3791/71271

⸱

9 июня 2026 г.

 , 
1Center for Computational and Integrative Biology (CCIB) Rutgers, The State University of New Jersey, 2Rutgers University-Camden, Department of Biology Rutgers, The State University of New Jersey, 3Institute for Empowering Equitable Education in STEM (E3-STEM)

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ Protoperithecia количественно оценивает фотопериодические реакции у Neurospora crassa , измеряя формирование протоперитеков в рамках очерчённых циклов света и тьмы. Этот метод на основе пластин предлагает простой и масштабируемый подход для сравнения реакций развития, зависящих от фотопериода, в экспериментальных условиях.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurospora crassa — хорошо зарекомендовавший себя модельный организм для изучения биологического времени и светорегулируемого развития. Анализ протоперитеков (PPA) — это метод визуализации на основе пластин для количественной оценки фотопериодических реакций путем измерения формирования протоперитеций как результата развития. Цель этого протокола — обеспечить воспроизводимый и масштабируемый рабочий процесс для оценки того, как определённые циклы света и тьмы влияют на сексуальное развитие грибов. В этом анализе грибные культуры выращиваются на синтетической среде для скрещивания в условиях контролируемого фотопериода, после чего стандартизируется удаление поверхностных конидий для улучшения визуализации. Протоперитеки количественно измеряются ручным подсчётом на основе изображений, а средние показатели на пластину используются для статистических сравнений в условиях фотопериода. В отличие от предыдущих подходов, PPA интегрирует стандартизированные условия культуры, контролируемую экспозицию фотопериода и квадрантную визуализацию для воспроизводимых количественных сравнений между штаммами. Этот рабочий процесс выходит за рамки базового протокола, создавая согласованную и масштабируемую структуру для измерения результатов развития, зависящего от фотопериода, при определённых экспериментальных условиях. Метод занимает примерно одну неделю от инокуляции до анализа и может применяться к нескольким штаммам в определённых условиях окружающей среды. PPA предоставляет простую и доступную платформу для сравнительного анализа фотопериод-зависимого развития грибов в контролируемых лабораторных условиях.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ протоперитеций (PPA) количественно оценивает фотопериодические реакции у гриба Neurospora crassa. Многие организмы измеряют продолжительность дня и ночи для координации биологических процессов в явлении, известном какфотопериодизм 1,2,3,4,5,6,7,8. В этом анализе развитие женской половой структуры — протоперитеция — служит измеримым, светозависимым показателем фотопериодического ответа. Хотя фотопериодизм хорошо характеризуется у растений с помощью экспериментов сночным выходом 3, существует меньше стандартизированных подходов для количественного определения фотопериодических реакций у нефотосинтезирующих эукариот, таких как грибы. N. crassa обеспечивает управляемую модельную систему для этой цели благодаря хорошо определённой генетике и светочувствительным путям развития. Регуляция времени размножения, зависящая от фотопериода, наблюдалась уорганизмов 1,2,3,4,5,6,7,8, что подтверждает значимость световых физиологических реакций; Однако механистические исследования на грибах остаются ограниченными отсутствием воспроизводимых анализов.

Протоперитеции — это преждевременные женские половые структуры у N. crassa. Они происходят из аскогоний, которые развивают свернутые трихогины, сливающиеся с гифами или конидиями противоположного типаспаривания 9. После слияния ядра «мужского» партнёра попадают в протоперитеций. Количество образующихся протоперитеков регулируется сезонно и сильно индуцированосветом — 10. Фотопериодическая регуляция играет ключевую роль в экологии, хронобиологии и физиологии грибов, поскольку многие процессы, управляемые часами, зависят от света. Свет влияет на множество генетических путей, включая фоторецепторы, киназы и механизмы светопередачи, связанные с половымразвитием 11. Протоперитеки хорошо подходят для измерения фотопериодического выхода, так как их легко визуализировать под микроскопом, и они чувствительно реагируют на свет.

Несмотря на важность фотопериодизма у грибов, существует немного стандартизированных и воспроизводимых анализов для количественной оценки образования протоперитеций при контролируемых световых циклах. Среднепроизводительный, пластинчатый анализ ценен, поскольку грибы являются недорогими и легко поддерживаемыми модельными организмами, что позволяет систематически анализировать светоиндуцированное сексуальное развитие и функции генов. Большинство исследований фотопериодизма сосредоточены на растениях, тогда как эквивалентные количественные рамки для грибных систем остаются ограниченными. У других организмов, включая насекомых, светлозависимые явления, такие как диапауза, хорошоописаны 7, но сопоставимые подходы у грибов отсутствуют. Этот разрыв ограничивает воспроизводимое сравнение фотопериодических реакций между штаммами и экспериментальными условиями.

PPA основывается на исследовании 2004 года, в котором измерялась протоперитеция при увеличении продолжительности суток — от постоянной темноты до постоянного освещения — в мутанте с полосой (BD) (ras-1bd), что использовалось в циркадныхисследованиях 4,12. В этом фоне наблюдались фотопериодно-зависящие изменения в производстве протоперитеков. Текущий рабочий процесс адаптирует и расширяет этот подход, используя эталонный штамм FGSC 2489, который ассоциируется с секвенированием целого генома и нокаут-ресурсами13,14. Анализ количественно оценивает среднее количество протоперитеков, образующихся в течение определённых фотопериодов в течение одной недели, как прокси фотопериодического ответа. Этот подход стандартизирует условия культуры, визуализацию и количественную оценку, что позволяет воспроизводимо сравнивать между экспериментальными условиями и штамми. Ключевые методологические достижения включают стандартизированные условия культуры на основе пластин, определённые параметры экспозиции фотопериода, квадрантную визуализацию и воспроизводимый рабочий процесс количественной оценки.

Этот протокол количественно оценивает фотопериодические реакции у N. crassa путём измерения образования протоперитеций после воздействия определённых циклов светло-тёмный. Для каждого фотопериодического состояния используются четыре биологические реплики, каждая из которых состоит из одной независимо инокуленной синтетической кроссинговой пластины (SC). На одну пластину собираются четыре изображения и усредняются для получения одного значения на биологическую реплику для статистического анализа. Пластины инкубируются в течение семи дней под калиброванными фотопериодами (например, 12 ч:12 ч или 8 ч:16 ч светло-тёмных циклов).

Внутри камеры роста размещается регистратор данных, который непрерывно фиксирует интенсивность света, температуру и влажность, тем самым проверяя стабильные условия окружающей среды. Интенсивность света сохраняется выше 1000 люкс, так как низкие уровни снижают производство протоперитеций. Избегается чрезмерное освещение, чтобы предотвратить повышение температуры камеры и запутанные тепловые эффекты. После инкубации макроконидии аккуратно удаляют увлажнённым бумажным полотенцем, пропитанным 70% этанолом. Четыре равномерно расположенных квадранта по периметру каждой пластины снимаются с увеличением 40× с помощью стереомикроскопа при ярком освещении. Протоперитеки подсчитываются вручную с помощью пакета обработки изображений, а средние показатели на пластину используются для статистических сравнений между фотопериодами.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Используемые реагенты, программное обеспечение и оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовка материалов и носителей

(Ориентировочное время: 1–1,5 часа активного времени; ночное охлаждение по необходимости)

  1. Подготовка синтетических перекрёстных сред (SC)
    1. Приготовьте среду SC: 0,2% сахарозы, 5 мкг/л биотина, 1,5% агара и соли Вестергаарда (pH 6,5 при 1 N NaOH)15.
    2. Автоклав — медиум. Дайте ей остыть до 50–55 °C, пока она не достигнет состояния, пригодного для наливания.
      ВНИМАНИЕ: Используйте термостойкие перчатки при извлечении колб из автоклава.
  2. Наливать тарелки
    1. Пипетте 10 мл расплавленной среды в чашки Петри диаметром 60 мм с помощью одноразовой пипетки.
    2. Дайте пластинам затвердеть при комнатной температуре в течение 30–45 минут.
    3. Храните тарелки вверх дном при 4 °C до 4 недель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте гидратацию пластин. Не храните тарелки более 4 недель при 4 °C.
  3. Подготовьте грибковые штаммы
    1. Выращивайте каждый штамм в маленьких стеклянных пробирках с полным или минимальным материалом, приготовленным согласно инструкциямлабораторного руководства 15.
    2. Инкубировать трубки в постоянной темноте (DD) при 30 °C, пока на поверхности трубки не образовается видимое мицелическое покрытие (обычно 2–3 дня).
      ВНИМАНИЕ: Обрабатывайте грибковые культуры с использованием стандартных микробиологических методов и работайте в шкафу для минимизации загрязнения.

2. Инокуляция пластин

(Оценочное время: 15–30 минут на набор тарелок)

  1. Переносные грибные конидии
    1. Инокуляция каждой пластины SC с помощью стерильной техники и инокуляционной петли.
    2. Разместите конидии в центр пластины для равномерного роста (рисунок 1A). Конидии выглядят как порошкообразные, светлые споры, покрывающие поверхность колонии.
    3. Примените примерно 1–2 мкл концентрированной конидиальной суспензии (или эквивалентную петлю) для стандартизации инокуляции по пластинам.
  2. Подготовьте тарелки к инкубации
    1. Плотно закрывайте пластины, чтобы предотвратить загрязнение и обеспечить газообмен.
    2. Маркируйте каждую пластину названием штамма, датой и состоянием фотопериода.

3. Установка фотопериода обработки

(Ориентировочное время: 10 минут подготовки + 7-дневная инкубация)

  1. Калибровка камеры роста
    1. Установите температуру камеры на 25 °C.
    2. Установить влажность на 50% (допустимый диапазон: 40%–60%), чтобы предотвратить высыхание на тарелке.
    3. Циклы фотопериода программы: эквалайзер (равноденствие): 12 часов света / 12 часов темноты и SDP (короткий день): 8 ч света / 16 часов темноты
    4. Установите интенсивность света на >1 000 люкс на уровне пластины с помощью калиброванного экспонометра. Избегайте интенсивности, повышающих температуру камеры выше 25 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что лампы в камере не перегревают салон.
      ВНИМАНИЕ: Не используйте парапленку или пластиковые пакеты для поддержания влажности, так как они ограничивают газообмен и мешают росту грибков. Если система контроля влажности недоступна, установите резервуар для воды внутри камеры.
  2. Поместить пластины в камеру
    1. Равномерно расставьте тарелки на полках для равномерного освещения.
    2. Разместите регистратор данных внутри камеры для постоянного мониторинга температуры и влажности, а также проверки стабильных условий окружающей среды.
  3. Начинайте анализ
    1. Инкубировать пластины под запрограммированным фотопериодом в течение 7 дней без помех.

4. Мониторинг и подготовка пластин для визуализации

(Оценочное время: 15–20 минут на одну тарелку)

  1. Вынимите пластины из камеры
    1. Удаляйте пластины через 7 дней инкубации.
    2. Осмотреть пластины на предмет роста конидий и формирования протоперитеций.
  2. Чистые пластины для видимости
    1. Удалите поверхностные конидии с крышки пластины и агарной поверхности с помощью порванных бумажных полотенец (рисунок 1B).
    2. Смочите бумажное полотенце 1–2 мл 70% этанола. Аккуратно промокните поверхность пластины 3–5 раз, чтобы удалить конидии. Дайте пластинам высохнуть на воздухе 1–3 минуты перед съёмкой (рисунок 1C).
      ВНИМАНИЕ: Этанол горючий; Держитесь подальше от источников тепла.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте чрезмерного давления. Не проводите полотенце по поверхности агара, так как это может повредить среду или нарушить протоперитеции.

5. Визуализация протоперитеций

(Оценочное время: 5 минут на тарелку)

  1. Готовьтесь к визуализации
    1. Установите микроскоп с равномерным освещением и увеличением (обычно 40×).
    2. Убедитесь, что поверхность пластины сухая и свободна от мусора.
  2. Захват изображений
    1. Снимите четыре равномерно расположенных квадранта по периметру плиты с использованием равномерного увеличения.
    2. Обозначьте каждое изображение деформацией, состоянием фотопериода, номером пластины и положением квадранта.
    3. Сохраняйте изображения в единообразном формате (например, TIFF) для анализа.

6. Количественная оценка и анализ данных

(Оценочное время: 10–20 минут на одну пластину для подсчёта; 15–25 минут для анализа)

  1. Граф протоперитеки
    1. Открывайте каждое изображение в пакете для обработки изображений.
    2. Используйте плагин Cell Counter, чтобы вручную подсчитать протоперитеки. Исключайте пузырьки, артефакты по краям и неоднозначные структуры. Подсчёт кластерные протоперитеки как отдельные, различимые единицы.
    3. Запишите счётчики для каждого квадранта и рассчитайте среднее значение на пластину.
  2. Анализ данных
    1. Импортировать количественные данные в программное обеспечение для статистического анализа.
    2. Проведите статистический анализ с использованием t-теста Уэлча для сравнений, показанных на рисунке 2.
    3. Создавайте графики, сравнивающие фотопериодные обработки, сортировки или реплики.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

После инокуляции диким штаммом конидии покрывали поверхность SC за 36–48 час. После 7 дней фотопериода экспозиции образовался плотный конидиальный слой, который удалялся увлажнённым бумажным полотенцем, пропитанным 70% этанолом (рисунок 1). Этот этап обнажил подлежащие протоперитеки, не нарушая их структуру. При микроскопии протоперитеки выглядели как тёмные, круглые структуры, распределённые по поверхности пластины. Эти структуры имели сферическую морфологию и отличались от окружающих гиф. ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цель PPA — использовать половое развитие у грибов как показатель для определения, воспринимает ли организм конкретный фотопериод. Количественно оценивая среднее количество протоперитеций, образующихся в различных световых циклах, можно оценить и сравнить фотопериодические ответы между условиями. В соответствии с предыдущими наблюдениями 4,16, N. crassa демонстрирует более высокую продукцию протоперитеций в фотопериодах, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не заявляют о конкурирующих интересах.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы выражают благодарность Кэтирн Майензе, Мё Тинзару Хтин Аунгу, Айе Тинзару Хтин Аунгу и Моргану Бартлсону за их поддержку, помощь и вклад в этот проект. Авторы также выражают признательность кафедре биологии Университета Рутгерса в Кэмдене и Центру вычислительной и интегративной биологии (CCIB) за предоставление институциональной поддержки, исследовательских возможностей и ресурсов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
AgarBD90000-786Для синтетической среды скрещивания/Минимальной среды
Alcohol burner flameWards470346-104Для стерилизации петли для инокуляции
Ammonium iron sulfate hexahydrateSupelcoFX0245-1Для синтетической среды скрещивания/Минимальной среды
Ammonium nitrate (NH4NO3)BeanTown ChemicalBT134170-250GДля минимальной среды
AutoclaveVWR International76683-456Для стерилизации стеклянной посуды и среды
Biological Safety CabinetThermoFischer Scientific 1323TSДля уменьшения загрязнения пластин и лаборатории.
BiotinVWR97061-444Для синтетической среды скрещивания
Boric acid (H3BO3)Electron Microscopy Sciences100503-696Для синтетической среды скрещивания/Минимальной среды
Calcium chloride (CaCl2)AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLCJT1311-1Для синтетической среды скрещивания
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)Sigma-Aldrich223506-25GДля минимальной среды
Citric acid monohydrate (C6H8O7·H2O)Sigma-Aldrich1002440500Для синтетической среды скрещивания/Минимальной среды
Copper sulfate pentahydrate (CuSO4·5H2O H2O)BeanTown ChemicalBT121245-1KGДля синтетической среды скрещивания/Минимальной среды
EthanolDecon Labs71001-754Используется для удаления конидий с поверхности пластинки и стерилизации петли для инокуляции
FIJI/ImageJNational Institutes of Health (NIH)N/AДля анализа изображений/подсчета
GlovesSW Safety Solutions76382-944Для безопасности
GraphPad PrismGraphPad Software, LLCN/AДля проведения статистических тестов и создания графиков
Growth ChamberCaron Products & Services6320 & 6340 SeriesПрограммируемый для фотопериодных циклов
HOBO Data LoggerOnset Computer CorporationMX2202Для регистрации интенсивности света и температуры
Inoculation loopVWR International10806-354Для переноса грибного материала на чаши Петри
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O)BeanTown ChemicalBT145380-1KGДля синтетической среды скрещивания/Минимальной среды
Manganese sulfate monohydrate (MnSO4·H2O H2O)Sigma-Aldrich1059410250Для синтетической среды скрещивания/Минимальной среды
Microscope (Leica S6 D Greenough Stereo Microscope)Leica Microsystems10446297Для изображений
Neurospora crassa FGSC 2489Fungal Genetics Stock Center74-OR23-1VA, JCM19069Штамм грибов
Paper TowelsKimberly-Clark Professional, Scott and Kleenex6666114Для наполнения среды
Permanent MarkerSharpie30072Для маркировки пластин
Petri DishesVWR International25384-164Для наполнения синтетической среды скрещивания
PipettesVWR International75816-090Для наполнения среды
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)BeanTown ChemicalBT225070-500GДля синтетической среды скрещивания/Минимальной среды
Potassium nitrate (KNO3)Sigma-Aldrich221295-100GДля синтетической среды скрещивания
Small Disposable Glass Test TubesVWR International470211-698Для начальной культивации грибов
Sodium chloride (NaCl)VWR InternationalBDH9286-500GДля синтетической среды скрещивания
Sodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7·2H2O)VWR97061-008Для минимальной среды
Sodium hydroxide (NaOH)AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLCJT5635-2Для синтетической среды скрещивания
Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O)Supelco1.06524.1000Для синтетической среды скрещивания/Минимальной среды
SucroseVWR InternationalBDH9308-500GДля синтетической среды скрещивания/Минимальной среды
Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O)BeanTown ChemicalBT122545-500GДля синтетической среды скрещивания/Минимальной среды

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Видео скоро будет доступно

Похожие статьи