Анализ Protoperithecia количественно оценивает фотопериодические реакции у Neurospora crassa , измеряя формирование протоперитеков в рамках очерчённых циклов света и тьмы. Этот метод на основе пластин предлагает простой и масштабируемый подход для сравнения реакций развития, зависящих от фотопериода, в экспериментальных условиях.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Пластинчатый визуализационный анализ для количественной оценки фотопериодических реакций у Neurospora crassa с использованием развития протоперитеций
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Neurospora crassa — хорошо зарекомендовавший себя модельный организм для изучения биологического времени и светорегулируемого развития. Анализ протоперитеков (PPA) — это метод визуализации на основе пластин для количественной оценки фотопериодических реакций путем измерения формирования протоперитеций как результата развития. Цель этого протокола — обеспечить воспроизводимый и масштабируемый рабочий процесс для оценки того, как определённые циклы света и тьмы влияют на сексуальное развитие грибов. В этом анализе грибные культуры выращиваются на синтетической среде для скрещивания в условиях контролируемого фотопериода, после чего стандартизируется удаление поверхностных конидий для улучшения визуализации. Протоперитеки количественно измеряются ручным подсчётом на основе изображений, а средние показатели на пластину используются для статистических сравнений в условиях фотопериода. В отличие от предыдущих подходов, PPA интегрирует стандартизированные условия культуры, контролируемую экспозицию фотопериода и квадрантную визуализацию для воспроизводимых количественных сравнений между штаммами. Этот рабочий процесс выходит за рамки базового протокола, создавая согласованную и масштабируемую структуру для измерения результатов развития, зависящего от фотопериода, при определённых экспериментальных условиях. Метод занимает примерно одну неделю от инокуляции до анализа и может применяться к нескольким штаммам в определённых условиях окружающей среды. PPA предоставляет простую и доступную платформу для сравнительного анализа фотопериод-зависимого развития грибов в контролируемых лабораторных условиях.
Введение
Анализ протоперитеций (PPA) количественно оценивает фотопериодические реакции у гриба Neurospora crassa. Многие организмы измеряют продолжительность дня и ночи для координации биологических процессов в явлении, известном какфотопериодизм 1,2,3,4,5,6,7,8. В этом анализе развитие женской половой структуры — протоперитеция — служит измеримым, светозависимым показат....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Используемые реагенты, программное обеспечение и оборудование перечислены в Таблице материалов.
1. Подготовка материалов и носителей
(Ориентировочное время: 1–1,5 часа активного времени; ночное охлаждение по необходимости)
- Подготовка синтетических перекрёстных сред (SC)
- Приготовьте среду SC: 0,2% сахарозы, 5 мкг/л биотина, 1,5% агара и соли Вестергаарда (pH 6,5 при 1 N NaOH)15.
- Автоклав — медиум. Дайте ей остыть до 50–55 °C, пока она не достигнет состояния, пригодного для наливания.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
После инокуляции диким штаммом конидии покрывали поверхность SC за 36–48 час. После 7 дней фотопериода экспозиции образовался плотный конидиальный слой, который удалялся увлажнённым бумажным полотенцем, пропитанным 70% этанолом (рисунок 1). Этот этап обнажил подлежащие протоперитеки, не нарушая их структуру. При микроскопии протоперитеки выглядели как тёмные, круглые структуры, распределённые по поверхности пластины. Эти структуры имели сферическую морфологию и отличались от окружающих гиф. .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Цель PPA — использовать половое развитие у грибов как показатель для определения, воспринимает ли организм конкретный фотопериод. Количественно оценивая среднее количество протоперитеций, образующихся в различных световых циклах, можно оценить и сравнить фотопериодические ответы между условиями. В соответствии с предыдущими наблюдениями 4,16, N. crassa демонстрирует более высокую продукцию протоперитеций в фотопериодах, .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не заявляют о конкурирующих интересах.
Благодарности
Авторы выражают благодарность Кэтирн Майензе, Мё Тинзару Хтин Аунгу, Айе Тинзару Хтин Аунгу и Моргану Бартлсону за их поддержку, помощь и вклад в этот проект. Авторы также выражают признательность кафедре биологии Университета Рутгерса в Кэмдене и Центру вычислительной и интегративной биологии (CCIB) за предоставление институциональной поддержки, исследовательских возможностей и ресурсов.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Agar | BD | 90000-786 | Для синтетической среды скрещивания/Минимальной среды |
| Alcohol burner flame | Wards | 470346-104 | Для стерилизации петли для инокуляции |
| Ammonium iron sulfate hexahydrate | Supelco | FX0245-1 | Для синтетической среды скрещивания/Минимальной среды |
| Ammonium nitrate (NH4NO3) | BeanTown Chemical | BT134170-250G | Для минимальной среды |
| Autoclave | VWR International | 76683-456 | Для стерилизации стеклянной посуды и среды |
| Biological Safety Cabinet | ThermoFischer Scientific | 1323TS | Для уменьшения загрязнения пластин и лаборатории. |
| Biotin | VWR | 97061-444 | Для синтетической среды скрещивания |
| Boric acid (H3BO3) | Electron Microscopy Sciences | 100503-696 | Для синтетической среды скрещивания/Минимальной среды |
| Calcium chloride (CaCl2) | AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLC | JT1311-1 | Для синтетической среды скрещивания |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | 223506-25G | Для минимальной среды |
| Citric acid monohydrate (C6H8O7·H2O) | Sigma-Aldrich | 1002440500 | Для синтетической среды скрещивания/Минимальной среды |
| Copper sulfate pentahydrate (CuSO4·5H2O H2O) | BeanTown Chemical | BT121245-1KG | Для синтетической среды скрещивания/Минимальной среды |
| Ethanol | Decon Labs | 71001-754 | Используется для удаления конидий с поверхности пластинки и стерилизации петли для инокуляции |
| FIJI/ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | N/A | Для анализа изображений/подсчета |
| Gloves | SW Safety Solutions | 76382-944 | Для безопасности |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | N/A | Для проведения статистических тестов и создания графиков |
| Growth Chamber | Caron Products & Services | 6320 & 6340 Series | Программируемый для фотопериодных циклов |
| HOBO Data Logger | Onset Computer Corporation | MX2202 | Для регистрации интенсивности света и температуры |
| Inoculation loop | VWR International | 10806-354 | Для переноса грибного материала на чаши Петри |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | BeanTown Chemical | BT145380-1KG | Для синтетической среды скрещивания/Минимальной среды |
| Manganese sulfate monohydrate (MnSO4·H2O H2O) | Sigma-Aldrich | 1059410250 | Для синтетической среды скрещивания/Минимальной среды |
| Microscope (Leica S6 D Greenough Stereo Microscope) | Leica Microsystems | 10446297 | Для изображений |
| Neurospora crassa FGSC 2489 | Fungal Genetics Stock Center | 74-OR23-1VA, JCM19069 | Штамм грибов |
| Paper Towels | Kimberly-Clark Professional, Scott and Kleenex | 6666114 | Для наполнения среды |
| Permanent Marker | Sharpie | 30072 | Для маркировки пластин |
| Petri Dishes | VWR International | 25384-164 | Для наполнения синтетической среды скрещивания |
| Pipettes | VWR International | 75816-090 | Для наполнения среды |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | BeanTown Chemical | BT225070-500G | Для синтетической среды скрещивания/Минимальной среды |
| Potassium nitrate (KNO3) | Sigma-Aldrich | 221295-100G | Для синтетической среды скрещивания |
| Small Disposable Glass Test Tubes | VWR International | 470211-698 | Для начальной культивации грибов |
| Sodium chloride (NaCl) | VWR International | BDH9286-500G | Для синтетической среды скрещивания |
| Sodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7·2H2O) | VWR | 97061-008 | Для минимальной среды |
| Sodium hydroxide (NaOH) | AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLC | JT5635-2 | Для синтетической среды скрещивания |
| Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O) | Supelco | 1.06524.1000 | Для синтетической среды скрещивания/Минимальной среды |
| Sucrose | VWR International | BDH9308-500G | Для синтетической среды скрещивания/Минимальной среды |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O) | BeanTown Chemical | BT122545-500G | Для синтетической среды скрещивания/Минимальной среды |
Ссылки
- Wood SH et al. Circadian clock mechanism driving mammalian photoperiodism. Nat Commun. 2020;11:4291.
- Wikelski M et al. Avian circannual clocks: adaptive significance and possible involvement of energy turnover in their proximate control. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008;363:411-23.
- Wang Q et al. Plants distinguish different photoperiods to independently control seasonal flowering and growth. Science. 2024;383:eadg9196.
- Tan Y, Merrow M, Roenneberg T. Photoperiodism in Neurospora crassa. J Biol Rhythms. 2004;19:135-43.
- Kumar V. Photoperiodism in higher vertebrates: an adaptive strategy in temporal environment. Indian J Exp Biol....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
