Общий класс генетических вариантов, связанных с васкулитом, в интерферонопатиях типа I внутри детской когорты

Краткое содержание

Целостное секвенирование экзома у 1 204 педиатрических пациентов с подозрением на аутовоспалительное заболевание выявило варианты, связанные с интерферонопатией, в 132 случаях, включая 79 новых мутаций. Большинство из них были гетерозиготными и связаны с васкулитными фенотипами. Эти результаты подчёркивают диагностическую ценность генетического тестирования и центральную роль дисрегулированной сигнализации интерферона типа I при детском васкулите.

Аннотация

Детский васкулит традиционно диагностируют гистопатологическим обследованием; однако в клинической практике всё чаще применяются менее инвазивные методы на основе визуализации. Несмотря на эти достижения, определение основной моногенной этиологии остаётся необходимым для понимания механизмов заболевания, прогнозирования и формирования целенаправленных терапевтических стратегий. Интерферонопатии типа I включают гетерогенную группу иммунно-опосредованных заболеваний, характеризующихся конститутивной сигнальной передачей интерферона и частыми васкулитными или васкулопатическими проявлениями. Постоянная активация путей чувствительности нуклеиновых кислот и нарушение внутриклеточного гомеостаза способствуют дисфункции эндотелиума и хроническому сосудистому воспалению.

В данном исследовании представлен комплексный генетический анализ для выявления вариаций, связанных с васкулитом, в генах, связанных с интерферонопатией, в когорте детских аутоинфламаторных заболеваний. Секвенирование целого экзома было проведено у 1 204 пациентов с подозрением на аутовоспалительные заболевания. Варианты, влияющие на области кодирования и места сращивания, анализировались с помощью биоинформатического конвейера, основанного на рекомендациях Американского колледжа медицинской генетики и геномики, интегрирующего методы статистической фильтрации и обработки сигналов, вдохновлённые дискретными преобразованиями Фурье (DFT) и статистическими распределениями для улучшения приоритетов и интерпретации вариантов.

Варианты, связанные с интерферонопатией, были выявлены у 132 педиатрических пациентов, обследованных через базу данных ревматологических клиник. Всего было обнаружено 92 уникальных варианта, включая 13 ранее зарегистрированных патогенных или вероопасных вариантов и 79 новых вариантов, отсутствовавших в публичных базах данных по состоянию на февраль 2026 года. Клинические проявления в основном включали рецидивирующую лихорадку, сосудистые проявления и сложные аутовоспалительные проявления.

Варианты включали гены, связанные с нарушениями сигнализации интерферона и врожденной активацией иммунитета, включая пути, связанные с активацией СТГ, метаболизмом нуклеиновых кислот и дисфункцией внутриклеточного трафика. Этот междисциплинарный процесс демонстрирует потенциальную диагностическую полезность геномного анализа при детском васкулите и подчеркивает важность устойчивой интерферонной сигнализации в патогенезе сосудистых повреждений и аутовоспалительных заболеваний.

Введение

Детский васкулит традиционно диагностировали с помощью гистопатологической оценки, которая остаётся золотым стандартом. Однако современные диагностические стратегии всё чаще отдают предпочтение менее инвазивным методам, особенно методам, основанным на визуализации. Несмотря на эти достижения, выявление основной моногенной этиологии имеет первостепенное значение при детском васкулите, поскольку даёт критическое понимание механизмов заболевания, прогноза и возможностей таргетной терапии ^1,2.

Детский васкулит следует подозревать у детей с системным воспалением и поражением нескольких органов. Для установления диагноза и исключения имитации требуется тщательный сбор анамнеза, комплексное физическое обследование, лабораторные исследования, визуализация и, в некоторых случаях, биопсия тканей. Раннее выявление и лечение крайне важны, поскольку нелеченное заболевание может привести к опасным для жизни осложнениям или долгосрочным^{последствиям 1}.

Интерферонопатии типа I включают широкий спектр моногенных и сложных иммунно-опосредованных нарушений, характеризующихся устойчивой активацией пути интерферона типа I и рецидивирующей васкулитной или васкулопатической^{особенностью 3,4}. Нарушение чувствительности нуклеиновых кислот и нарушение внутриклеточного гомеостаза являются центральными патогенными механизмами, связывающими устойчивое избыточное производство интерферона с сосудистым воспалением и повреждением. Мутации усиления функции в TMEM173 (STING1) вызывают васкулопатию, ассоциированную с STING, с началом в младенчестве (SAVI), в то время как аутосомно-доминантные мутации COPA нарушают трафик эндоплазматического ретикулума с Гольджи, приводя к аномальной активации STING и васкулитному^{фенотипу 3-5}. Дополнительные интерферонопатии, вызванные дефектами генов метаболизма нуклеиновых кислот (TREX1, RNASEH2A/B/C, SAMHD1, ADAR1 и IFIH1), дополнительно подчеркивают механистическую связь между дисрегуляцией интерферона и сосудистой^{патологией 3} (см. рисунок 1).

Рисунок 1. Детальная патогенная архитектура интерферонопатий типа I, вызывающая эндотелиальную дисфункцию и микрососудистые повреждения в детских когортах. (Слева) Системный контекст детской интерферонопатии типа I: дефектная самодискриминация и аномальное чувство нуклеиновой кислоты хозяина вызывают системное аутовоспаление. Клинические фенотипы ярко характеризуются ранней кожной васкулопатией и системным поражением, часто проявляясь в виде кожных поражений, похожих на чилблейн. (В центре) Механистический каскад генетических дефектов к системной дисрегуляции: мутации потери функции в ферментах зачистки нуклеиновых кислот (например, DNASE1, TREX1) приводят к аномрантному накоплению эндогенной ДНК и РНК в цитоплазме. Одновременно мутации усиления функции в сенсорах, таких как STING1, обеспечивают конститутивную активацию пути cGAS-STING независимо от вирусных триггеров. Этот патогенный внутрицитоплазматический датчик гиперактивирует регуляторные факторы интерферона, что приводит к непрерывному синтезу интерферонов типа I (IFN-α/β). Хронический выход цитокинов создаёт самоподдерживающуюся системную амплификационную петлю через рецепторы IFNAR1/2, что усугубляется нарушенными механизмами клиренса и положительным контролем обратной связи. (Справа) Патологический исход: устойчивое связывание циркулирующего IFN-α/β с эндотелиальным клеточным рецепторным комплексом вызывает устойчивую активацию JAK-STAT. Это постоянное гомеостатическое нарушение вызывает продолжающийся эндотелиальный стресс и нарушает физиологические механизмы вазорелаксации. На уровне капилляров это гипервоспалительное состояние вызывает прямое повреждение эндотелиальных клеток, значительное утолщение стенок сосудов и тромбоз люминального микрососудистого тромбоза, что приводит к тяжёлой тканевой ишемии и некротизирующей микроваскулопатии без аутоантитело-опосредованных аутоиммунных путей. Сокращения: cGAS-STING = циклический GMP-AMP-синтаз-стимулятор генов интерферона; DNASE1 = дезоксирибонуклеаза 1; GoF = усиление функции; IFN = интерферон; IFNAR = альфа-бета-рецептор интерферона; IRF = регуляторный фактор интерферона; JAK-STAT = преобразователь сигнала Янускиназы и активатор транскрипции; STING1 = стимулятор интерферонного ответа cGAMP интерактор 1; TREX1 = три основных ремонтных экзонуклеазы 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Этот подход был разработан для обнаружения вариантов генов, ассоциированных с интерферонопатией, в детских аутовоспалительных когортах, поскольку традиционные методы могут сталкиваться с аналитическими трудностями при раннем приоритизации редких мутаций, а гетерогенность нейтрофилов играет критическую роль в прогнозировании риска^{рецидива 6}. В литературе роль дисрегуляции сигнального сигнала интерферона при васкулите мелких сосудов была прояснена с помощью одноклеточных анализов, что подчёркивает преимущество секвенирования цельного экзома (WES) для ранней диагностики в^{детских когортах 6}.

Моногенные аутовоспалительные синдромы могут проявляться с васкулитом или проявлениями, похожими на васкулит. Например, SAVI может имитировать мало- или среднесосудистый^{васкулит 7}. Аналогично, ювенильный идиопатический артрит (JIA) представляет собой гетерогенную группу воспалительных заболеваний, начинающихся в детстве, которые могут сохраняться во взрослом возрасте и связаны с дисрегуляцией, похожей на интерферонопатию, что подчёркивает необходимость генетического анализа в детских^{когортах 8}.

Интерферонопатии типа I — это врождённые менделевские ошибки иммунитета, характеризующиеся активацией противовирусных сенсоров, вызванных нуклеиновым кислотами, полученными от хозяина, что свидетельствует о неэффективности в различении себя и не-себя ^3,4. Эти расстройства определяются повышением сигнализации интерферона типа I, и дерматологические проявления часто дают важные диагностические подсказки. SAVI связан с мутациями усиления функции у TMEM173 и характеризуется ранним началом кожной васкулопатии и воспалением^{лёгких 9}. Мутация p.V155M — самый часто сообщаемый вариант¹⁰. SAVI — редкое аутовоспалительное заболевание, связанное с мутациями STING1, характеризующееся ранними интерстициальными заболеваниями легких (ILD) и кожными поражениями, и может клинически имитировать системную красную волчанку (SLE)¹¹. Дисрегулированная сигнализация интерферона типа I также связана с васкулитом, ассоциированным с антинейтрофильными цитоплазматическими антителами (ANCA), ассоциированной с АНК. При AAV интерферонная подпись типа I преобладает при микроскопическом полиангиите/миелопероксидазе-ассоциированном васкулите (MPA/MPO-AAV) и связана с почечным прогнозом, подчёркивая вклад редких вариантов в дисрегуляцию^{интерферона 12}.

Моногенные аутовоспалительные синдромы могут проявляться с васкулитом или проявлениями, похожими на васкулит. Например, SAVI может имитировать мало- или среднесосудистый^{васкулит 7}. Ранее была описана крупнейшая глобальная когорта пациентов с активирующими мутации STING1, что дало расширенную клиническую и иммунологическую фенотипическую характеристику SAVI¹³. За последние два десятилетия был достигнут значительный прогресс в понимании распознавания патогенов как гемопоэтическими, так и негемопоэтическими клетками. Микробные компоненты обнаруживаются через рецепторы, закодированные зародышевой линией, что является ключевым этапом в запуске такого^{ответа 14}. В 2006 году было показано, что трансфекция ДНК в различные типы клеток индуцирует апрегуляцию интерферонов типа I независимым от толл-подобных рецепторов (TLR). В этом контексте в 2008 году был выявлен STING, трансмембранный белок, локализованный в эндоплазматическом ретикулуме, как ключевой посредник интерферонов типа I на синтетическую и вирусную^{ДНК 13}. Мутации усиления функции в STING1 приводят к интерферонопатии типа I, известной как SAVI^9˒10˒¹⁴. Это тяжёлое заболевание характеризуется ранним системным воспалением, кожной васкулопатией и интерстициальным заболеванием лёгких (ILD)¹⁴. SAVI редкость, на сегодняшний день зарегистрировано 52 пациента из 37 семей, и большинство случаев возникают заново, хотя также зафиксировано аутосомно-доминантное наследование. Ранее была описана крупнейшая глобальная когорта пациентов с активирующими мутациями STING1, что дало расширенную клиническую и иммунологическую фенотипическую характеристику SAVI ^9,10,11˒¹⁴.

Этот протокол был разработан для раннего выявления вариантов генов, ассоциированных с интерферонопатией, с помощью генетического анализа на основе WES у педиатрических пациентов с аутовоспалительными признаками, поскольку традиционные методы часто недостаточны для выявления редких мутаций и могут упустить возможности для раннего вмешательства. Литература показывает, что роль апрегуляции интерферона в васкулитоподобных фенотипах была прояснена благодаря изучению менделевых расстройств, что дополнительно подчёркивает преимущество WES для обнаружения редких^{вариантов 4,7,12}.

Основная цель этого метода — интегрировать физические принципы обработки сигналов с упрощённым биофизическим вычислительным моделированием для поддержки обнаружения вариантов в данных WES для интерферонопатий типа I, при этом интерпретировать последующие эффекты на пути интерфероновой сигнализации, особенно на каскадный преобразователь сигнала Януса-киназа и активатор транскрипции (JAK-STAT). Этот исследовательский подход направлен на дополнение анализа геномных областей, часто подвергающихся шуму секвенирования и неравномерного покрытия иммунно-опосредованных заболеваний, при которых дисрегулированная активация интерферона стимулирует васкулитные фенотипы. Стандартные биоинформатические рабочие процессы обычно сосредоточены на стандартных метриках качества, что может оставлять место для дополнительной поддерживающей фильтрации при выявлении вариантов в сложных областях генов, таких как STING1 или TREX1. Применяя методы обработки сигналов, вдохновлённые дискретными преобразованиями Фурье (DFT) и статистическими распределениями, этот метод извлекает фундаментальные геномные особенности из нуклеотидных последовательностей, баз отображения (A, T, C, G) в бинарные индикаторы для анализа мутационных^{паттернов 15}. Кроме того, биофизическое моделирование путей интерферона включает пороговое поведение и накопительное усиление сигнала для оценки того, как генетические варианты могут поддерживать дисфункцию эндотелия, с акцентом на роль пути JAK-STAT в передаче сигналов интерферона типа I (IFN-α/β).

Это исследовательское приложение было разработано для изучения профилей выравнивания в регионах с низким покрытием. Хотя стандартные вычислительные инструменты обеспечивают фильтрацию первичных вариантов, поддерживающая модель исследует, может ли оценка на основе SNR обеспечивать вторичное качественное ограничение кодирующего однонуклеотидного варианта (SNV), подверженных неравномерному распределению чтения. Этот подход, основанный на физике, использует оптимизацию SNR для оценки качества генотипов и незначительных соотношений чтения. В более широкой литературе аналогичное стохастическое моделирование выявило градуированные реакции в путях JAK-STAT, а не динамику «всё или ничего», что позволяет лучше предсказывать избыточное производство^{интерферона 16}. Путь JAK-STAT, активируемый интерферонами типа I (IFN), связывающимися с рецепторами IFNAR1/IFNAR2, включает фосфорилирование STAT1 и STAT2 киназами Януса (JAK1, TYK2), формируя комплекс ISGF3 с IRF9 для ядерной транслокации и транскрипции^{ISG 17}. Это можно смоделировать с помощью обычных дифференциальных уравнений (ODE) для индукции IFN-β:

где перечисленные параметры отражают скорость фосфорилирования, дефосфорилирование и отрицательную обратную связь через SOCS1, что подчёркивает порогово-зависимое^{усиление 17}. Дополнительные детали включают формирование гомодимеров STAT1 для сигнализации IFN-γ, но при интерферонопатиях типа I устойчивая активация приводит к чрезмерной экспрессии ISG. Стохастические симуляции дополнительно учитывают изменчивость, используя алгоритмы Гиллеспи для моделирования шума при связывании рецептор-лиганд и ядерном импорте, выявляя гетерогенность между клетками в ответах^{IFN 16}. Этот метод особенно подходит исследователям, изучающим аутовоспалительный васкулит, поскольку предоставляет количественную структуру, связывающую варианты с нарушением путей, например, через расширенные ОДУ с включением паракринных эффектов:

где указанные параметры отражают скорость производства, деградацию и паракринное^{усиление 18}. Пользователи с доступом к данным секвенирования с высокой пропускной способностью и вычислительным ресурсам могут применить этот подход для приоритизации кандидатных вариантов и изучения возможных эффектов на пути.

Данное исследование было спланировано с использованием мультидисциплинарного подхода ревматологии и генетики для выявления вариантов, связанных с васкулитом, в генах, связанных с интерферонопатией, в большой детской когорте с проявлением аутовоспалительных признаков, с использованием протокола клинического секвенирования экзомов (CES)/WES из-за сложностей классификации васкулита и ограничений традиционных подходов. Кроме того, целью исследования было подчеркнуто диагностическую ценность генетической оценки при детском васкулите.

Классификация васкулита Чапел-Хилл 2012 года не включает моногенный аутовоспалительный^{васкулит 19}. Целью этого исследования было определить частоту выявления вариантов, связанных с интерферонопатией, у группы педиатрических пациентов с аутовоспалительными симптомами, внести вклад в расширение базы данных редких заболеваний и подчеркнуть важность генетической оценки при детском васкулите.

Протокол

Этот протокол был утверждён Этическим комитетом медицинского факультета Эгеского университета. Все периферические образцы крови были собраны после получения письменного информированного согласия от пациентов или их законных опекунов в соответствии с Хельсинкской декларацией. Это ретроспективное исследование с одним центром было направлено на оценку частоты вариантов, связанных с интерферонопатией, среди пациентов, проходящих генетический анализ на подозрение на аутовоспалительное заболевание, а также для изучения их связи с васкулитом. В период с 2022 по 2025 год были включены образцы периферической крови, отправленные в Лабораторию молекулярной медицины Университета Эге с предварительным диагнозом аутовоспалительного заболевания. Всего было проведено генетический анализ 1 204 образца. CES/WES использовался как подход следующего поколения секвенирования (NGS), направленный на экзоны и соседние интронные последовательности. Варианты классифицировались с использованием критериев ACMG и биоинформатического анализа. Доброкачественные и потенциально доброкачественные варианты были исключены. Из них 132 педиатрических случая с выявленными вариантами, ассоциированными с интерферонопатией, которые соответствовали критериям включения, были включены в итоговую когорту исследования.

В этой педиатрической когорте клинические данные были получены из базы данных ревматологических клиник. В целом среди 132 пациентов было выявлено 92 уникальных генетических варианта, включая 13 ранее зарегистрированных патогенных или вербочных патогенных вариантов, задокументированных в публичных базах данных вариантов (например, ClinVar), и 79 новых вариантов, отсутствовавших в публичных базах данных по состоянию на февраль 2026 года. Большинство вариантов были гетерозиготными и ассоциировались с фенотипами, похожими на CAPS, или сложными проявлениями аутовоспалительного васкулита. WES использовал подход NGS, направленный на области кодирования белков (экзоны) и соседние интронные последовательности, чтобы обнаружить варианты места сплетения и регуляторных вариантов. Хотя WES охватывает примерно 1–2% человеческого генома, он охватывает почти 85% известных мутаций, вызывающих заболевания, что делает его высокоэффективным инструментом для обнаружения редких вариантов.

Лабораторный рабочий процесс включал экстракцию геномной ДНК из периферической крови, фрагментацию ДНК, подготовку библиотеки с помощью адаптер-лигированной библиотеки и обогащение экзомов с помощью гибридизационных зондов захвата с помощью биотина-стрептавидина pulldown. Высокопроизводительное парное секвенирование было проведено на платформе секвенирования ДНК-наношариков, что обеспечило среднюю глубину покрытия 100–200x для обеспечения надёжного обнаружения вариантов. Биоинформатический анализ включал выравнивание с эталонным геномом, вызов вариантов и аннотирование с использованием отобранных баз данных вариантов, при этом классификация вариантов проводилась в соответствии с рекомендациями Американского колледжа медицинской генетики и геномики (ACMG). Варианты классифицировались как ранее сообщенные или новые. Выбранные варианты были подтверждены с помощью секвенирования Сэнгера.

Помимо стандартных биоинформатических конвейеров, для оценки глубины секвенирования, однородности покрытия и характеристик сигнал/шум, применялись физико-основанные принципы обработки сигналов и упрощённое вычислительное моделирование, что создало исследовательский дополнительный слой для анализа глубины секвенирования и регионального покрытия. Кроме того, для оценки накопленного воздействия генетических вариантов, связанных с васкулитом, были использованы концепции биофизического моделирования.

Эта междисциплинарная структура служит предварительной лабораторной моделью для изучения характеристик фильтрации вариантов в исследовательском контексте, особенно для направления терапевтических стратегий против интерферона. Ограничения включают снижение чувствительности к низкоуровневым мозаичным вариантам и необходимость функциональной валидации новых результатов. Потенциальные применения включают раннюю диагностику детского васкулита, персонализированное терапевтическое принятие решений и расширение вариантных баз данных, связанных с иммунологией, ревматологией и сосудистой медициной.

Фрагментация ДНК

Двадцать микролитров разбавленной ДНК были перенесены в новые стерильные ПЦР-пробирки. К каждой трубке добавлялось 2 мкл буфера фрагментации/аденилирования и 3 мкл смеси ферментов фрагментации/аденилирования; общий объём реакции составлял 25 мкл. Смесь была аккуратно смешана, кратковременно центрифугана, и программа фрагментации запускалась на термическом циклере. Сразу после завершения строительства трубы были кратковременно центрифугированы и помещены на лёд. Ожидаемый результат — средний размер фрагмента ДНК 200–300 п.п.

Переходная лигация

К каждому фрагментационному продукту добавлялось 2,5 мкл адаптера секвенирования, а затем 10 мкл мастер-микса лигации (без вихря). Смесь была аккуратно пипетирована для обеспечения однородности, кратковременно центрифугирована и инкубирована при 20 °C в течение 15 минут с открытой крышкой термического циклера. После инкубации трубки кратковременно центрифугировали и хранили во льду.

Очистка на основе бусины

К каждому образцу добавлялось тридцать микролитров магнитных шариков и тщательно смешивалось с помощью пипетки до получения однородной суспензии. Смесь инкубировала при комнатной температуре в течение 5 минут, после чего трубки ставили на магнитную подставку на 3 минуты. После того как супернатант очистился, его аккуратно удалили. Гранулу дважды промывали с 100 мкл 80% этанола, а остаточный этанол удалялся после окончательной промывки. Затем бусины сушились на магнитной подставке на воздухе до 5 минут. Было добавлено девять микролитров воды без нуклеаз, гранулу восстановили с помощью пипетки и инкубировали 2 минуты при комнатной температуре. После магнитного разделения в течение 3 минут 7,5 мкл супернатанта было передано в новую маркированную ПЦР-трубку.

Усиление ПЦР

Праймеры транскрипции in vitro (IVT) разбавлялись (20 мкл праймерного материала + 80 мкл воды без нуклеаз). Для реакции ПЦР (общий объём 17,5 мкл) были добавлены 2,5 мкл праймера IVT 1, 2,5 мкл праймера IVT 2 и 12,5 мкл мастер-микса амплификации библиотеки. Смесь была аккуратно пипетирована, и была проведена программа PCR-3.

Очистка после ПЦР

К каждому ПЦР-продукту добавлялось двадцать пять микролитров магнитных шариков. После 5-минутной инкубации при комнатной температуре и магнитного разделения шарики были дважды промыты 100 мкл 80% этанола. После сушки на воздухе до 5 минут добавляли 11 мкл воды без нуклеаз. Десять микролитров супернатанта были переведены в новую трубку. Концентрация в библиотеке измерялась; цель: >25 нг/мкл.

Пулирование и гибридизация (выборки на пул)

Библиотеки объединялись с восемью образцами пациентов в бассейне (93,75 нг на образец, всего 750 нг). Объём был скорректирован до 12,5 мкл с использованием воды без нуклеазы при необходимости. Гибридизационная смесь была предварительно инкубирована при 65 °C в течение 15 минут. Последовательно добавлялись блокирующий раствор, универсальные блокирующие олигонуклеотиды, зонд захвата экзома, вода без нуклеазы и усилитель гибридизации. Была инициирована программа гибридизации продолжительностью 16 часов (18:00–10:00).

Захват гибридных мишень на стрептавидиновые шарики

Стрептавидиновые бусины были три раза промыты с помощью буфера для связывания. После 16-часовой гибридизации смесь добавлялась к бусинкам и инкубировала при 25 °C в течение 30 минут, аккуратно перемешивая каждые 5 минут. Промывка проводилась с буфером захвата промывки 1 при комнатной температуре, затем три промывания с предварительно подогреным (48 °C) буфером 2, включая инкубацию при 48 °C. После окончательной промывки гранулу вновь суспендировали в 23 мкл воды без нуклеаз.

Подготовка одноцепочечной ДНК (ssDNA)

Было добавлено 24 микролитра буфера TE, смесь денатурировала при 95 °C в течение 3 минут, после чего сразу же помещалась на лёд. Была добавлена мастер-смесь с буфером для лигации шины и быстрой ДНК-лигаза, а программа SS-2 (37 °C, 30 мин) была запущена для циркуляризации одноцепочечной ДНК. Был добавлен буфер для пищеварения и смесь ферментов для пищеварения, и была запущена программа SS-3 (37 °C, 30 минут). Затем был добавлен буфер остановки пищеварения объемом 3,75 мкл. Было добавлено восемьдесят пять микролитров магнитных шариков, после чего последовала стандартная очистка бусин. Пятнадцать микролитров супернатанта были переведены в новую трубку; ожидаемая концентрация составляла 0,8–2 нг/мкл.

Подготовка ДНК-наношара (DNB)

Продукты ssDNA использовались для формирования DNB. Были добавлены буфер образования DNB, буфер с низким уровнем EDTA TE и смеси ферментов DNB 1 и 2. Программы DNB-1 и DNB-2 запускались последовательно. После завершения добавлены 20 мкл буфера DNB для остановки реакции и аккуратно смешивались (5–8 раз) с помощью широкоствольных наконечников пипеток; ожидаемая концентрация составляла 8–40 нг. Подготовленные DNB загружались на платформу секвенирования DNA nanoball для высокопроизводительного секвенирования.

Обработка данных секвенирования и анализ сигналов

Чистые последовательности считывания контролировались с помощью FastQC (v0.11.9) и fastp (v0.23.1). Порог соотношения сигнал/шум (SNR) в 20 дБ был оптимизирован с помощью анализа кривой операционной характеристики приёмника (ROC) на основе эталонного набора известных аутовоспалительных вариантов, что сбалансировало коэффициент ложного обнаружения (FDR) <1% с чувствительностью цели >95% для низкочастотных вариантов; чтения ниже этого порога в 20 дБ отбрасывались. Выравнивание с эталонным геномом Genome Reference Consortium Human Build 38 (GRCh38) и первоначальный вызов вариантов были выполнены с использованием BWA-MEM (v0.7.17) и Genome Analysis Toolkit (GATK, v4.2.6).

Для физических этапов обработки сигналов нуклеотидные последовательности преобразовывались в двоичные числовые сигналы (0 — пурины; 1 — пиримидины). Для вычисления DFT двоичный сигнал обрабатывался с скользящим окном N = 512 пар оснований и 50% перекрытием (256 б.п.) для поддержания локализованного геномного разрешения. DFT определялся следующим образом:

Для фильтрации артефактов высокочастотного секвенирования без чрезмерного сглаживания истинных однонуклеотидных вариантов (SNV), проявляющихся в виде резких, высокочастотных локализованных переходов, был программно откалиброван цифровой фильтр низких частот. Оптимальная нормализованная частота среза (fc) определялась итеративно путём сканирования диапазона 0,05–0,25 цикла на базу. Алгоритм оптимизации выбрал fc = 0,15 цикла на базу, определённую как точку перегина, где спектр мощности сигнала сохраняет ≥85% от общей дисперсии известных вариантов истинно положительного управления, при этом устраняя фоновый технический шум. Фильтрация на основе DFT применялась с помощью собственных скриптов, написанных на Python (v3.9), в частности с использованием библиотек NumPy (v1.23.0) и SciPy (v1.9.1), чтобы снизить высокочастотный шум при сохранении спектральных особенностей, связанных с мутациями. Параметры фильтрации были итеративно откалиброваны программно, чтобы предотвратить чрезмерное сглаживание редких вариантных сигналов. Интегрированный рабочий процесс обработки сигналов и биофизического моделирования изложен на рисунке 2.

Биофизическое и стохастическое моделирование интерферонной сигнализации

Для изучения функциональных последствий идентифицированных вариантов динамика путей JAK–STAT была смоделирована с использованием обычных дифференциальных уравнений (ODE), определённых как:

Детерминированные симуляции ODE выполнялись с использованием COPASI (Complex Pathway Simulator, v4.36) и подтверждались с помощью собственных скриптов на Python с использованием модуля scipy.integrate.solve_ivp. Были установлены биологически реалистичные начальные условия, а анализ чувствительности по константам частоты амплификации проводился с помощью SALib (Sensitivity Analysis Library in Python, v1.4.5). Были внедрены IFN-α сигнальные кинетики TYK2 для моделирования усиления функции STAT2.

Стохастические эффекты были введены с использованием формулы Ланжевена:

dX = f(X) dt + g(X)dW

Кроме того, были проведены стохастические симуляции Гиллеспи с использованием библиотеки Python GillesPy2 (v1.7.0) для моделирования транскрипционных взрывов и гетерогенной активации гена, стимулируемого интерфероном (ISG), индуцированной IFN-β. Распределённые функции задержки, представленные формулировками гамма-ядра, были реализованы в Python с помощью численной интеграции для моделирования механизмов отложенной транскрипционной обратной связи. Все вычислительные конвейеры, включая фильтрацию сигналов и математическое моделирование, выполнялись в среде высокопроизводительных вычислений (HPC) на базе Linux.

Рисунок 2. Интегрированная структура для обработки сигналов и биофизического моделирования сигнализации JAK-STAT . 1: Этап обработки сигнала: бинарное картирование нуклеотидных последовательностей (пурины = 0, пиримидины = 1), затем фильтрация на основе DFT. Обратите внимание на критический порог SNR на уровне 20 дБ для точного вызова вариантов. 2: Биофизическое моделирование: моделирование скоростей усиления на основе ODE, где небольшие возмущения в начальных условиях приводят к пороговым сдвигам в устойчивой сигнализации. 3: Биологический фенотип: моделирование вариантов усиления функции TYK2 в пути IFN-α, что приводит к усиленной активации STAT2 и возникновению фенотипов интерферонопатии. Сокращения: DFT = дискретное преобразование Фурье; IFN-α = интерферон альфа; JAK-STAT = преобразователь сигнала Янускиназы и активатор транскрипции; ODE = обычное дифференциальное уравнение; SNR = отношение сигнал/шум; STAT2 = сигнальный преобразователь и активатор транскрипции 2; TYK2 = тирозинкиназа 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2 обобщает интеграцию обработки сигналов на основе DFT с компонентами ODE и стохастического моделирования, используемых в исследовательском вычислительном рабочем процессе. Этот комплексный протокол объединяет передовые молекулярные генетики, высокопроизводительные технологии секвенирования, алгоритмы обработки сигналов и биофизическое моделирование для поддержки обнаружения и функциональной интерпретации вариантов, связанных с интерферонопатией, при детском аутовоспалительном васкулите.

Статистическая структура и распределение вероятностей отображения сигналов

Для формализации цифрового картирования геномных последовательностей до фильтрации сигналов была создана бинарная конверсия на основе биохимии нуклеотид. Для любого структурного геномного окна длины N пурины {A, G} отображаются в цифровое значение 0, а пиримидины {C, T} отображаются в 1. Согласно нулевой гипотезе (H0) о бесприкосённом, равномерном фоновом геномном распределении, это бинарное преобразование следует каркасе исследования Бернулли. Функция массы вероятности (PMF) отображаемого сигнала X определяется следующим образом

P(X = x) = p^x(1 - p)^1-x для x ∈ {0,1}

где p = 0,5 обозначает вероятность столкновения с пиримидиновым остатком на невыбранном фоновом треке. При масштабировании этого преобразования по последовательным основам для расчёта спектральной плотности мощности (PSD) с помощью DFT накопленное распределение фонового шума ведёт себя как случайный ход, сходящийся к распределению гауссовского белого шума по центральной теореме предела. Следовательно, нормированный спектр мощности этого нулевой распределения следует хи-квадрату (χ²) распределению с двумя степенями свободы. Для поддержания строгого порога статистической значимости (α = 0,05) критический порог интенсивности мощности для определения реального всплеска сигнала патогенного варианта был аналитически рассчитан с помощью следующей интеграции плотности вероятности:

Порог = - In(a) x^{a 2}

где σ² обозначает операционную дисперсию локального фонового уровня геномного шума. Любой спектральный пик, превышающий этот порог (p < 0,05, эквивалентно SNR > 20 дБ), был приоритетом для нижних клапанов фильтрации в силико, что обеспечивало использование вариантов на основе данных и меньшее влияние стохастического шума секвенирования.

Операционная эффективность и анализ затрат (Рисунок 3)

С точки зрения трансляционного и клинического внедрения операционная эффективность, время клинического завершения (TAT) и экономическая жизнеспособность этого интегрированного протокола были сравниваны с традиционными диагностическими путями, такими как последовательное секвенирование Сэнгера или панели ограниченных целевых генов. В то время как традиционные диагностические одиссеи по детскому васкулиту или предполагаемым интерферонопатиям типа I часто длятся 8–12 недель благодаря итеративному тестированию с одним геном, упрощённый рабочий процесс — включающий высокопроизводительный WES, оптимизированную гибридизацию на 16 часов и параллельную фильтрацию сигналов DFT на кластере высокопроизводительных вычислений (HPC) — обеспечивает зафиксированный общий клинический TAT в 10–14 дней от первоначального получения образца до окончательного молекулярного отчёта. Кроме того, благодаря эффективному мультиплексированию образцов (объединение восьми образцов пациентов на блок гибридизации) стоимость основного реагента и секвенирования составляет примерно $250–$300 на пациента, по сравнению с традиционными комплексными панелями, которые часто превышают $1,200–$1,800. Такое сжатие как диагностических сроков, так и бюджетных рамок говорит о том, что предложенный рабочий процесс биоинформатики, вдохновлённый физикой, может быть реализуем и масштабируемым для рутинных лабораторий клинической генетики.

Результаты

В этой когорте из 132 пациентов с выявленными вариантами, ассоциированными с интерферонопатией, был выявлен широкий спектр генетических вариантов (Таблица 1). Из них 53 (40,2%) были женщинами, а 79 (59,8%) — мужчинами. Средний возраст составлял 10,2 года (диапазон: 0–18 лет). Данные на уровне пациента, соответствующие итоговой когорте, приведены в Дополнительной таблице S1.

Таблица 1: Распределение и классификация генетических вариантов, ассоциированных с интерферонопатией типа I, выявленных в детской аутовоспалительной когорте (n = 132). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу

Наиболее часто поражались гены ADAR (25 пациентов, 18,94%) и DNASE1 (24 пациента, 18,18%). Варианты DNASE1 были исключительно классом 3 (100% внутри гена; 18,18% от общей когорты). Аналогично, большинство вариантов ADAR были класса 3 (24 пациента, 96,00%; 18,18% когорты), при этом был только один вариант класса 2 (4,00% внутри гена; 0,76% когорты) (Таблица 2).

Таблица 2: Варианты, выявленные в панели NGS по редким заболеваниям. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу

Варианты STING1 (20 пациентов, 15,15%) и RNASEH2B (14 пациентов, 10,61%) также были распространены. Все варианты STING1 были класса 3 (100%). Для RNASEH2B 10 пациентов (71,43%) имели варианты класса 3 (7,58% когорты), а 4 пациента (28,57%) — варианты класса 2 (3,03% когорты).

RNASEH2A мутации были выявлены у 13 пациентов (9,85%), все из которых имели варианты класса 3 (100%). Мутации TREX1 присутствовали у 10 пациентов (7,58%), включая 8 вариантов класса 3 (80,00%; 6,06% когорты) и 2 варианта класса 2 (20,00%; 1,52% когорты).

Варианты SAMHD1 были обнаружены у 9 пациентов (6,82%), 7 пациентов с вариантами класса 3 (77,78%; 5,30% когорты), 1 пациентом с вариантом класса 1 (11,11%; 0,76%) и 1 пациентом с вариантом класса 2 (11,11%; 0,76%).

RNASEH2C мутации были обнаружены у 8 пациентов (6,06%), все из которых были класса 3. DNASE1L3 мутации были выявлены у 6 пациентов (4,55%), включая 5 вариантов класса 3 (83,33%; 3,79% когорты) и 1 вариант класса 2 (16,67%; 0,76%). Мутации PSMB8 и COPA были обнаружены у 5 пациентов (3,79%), при этом все варианты относятся к классу 3 (100%). Мутации DNASE2 и STAT4 были обнаружены у 3 пациентов (2,27%), все варианты классифицировались как класс 3.

В целом, варианты класса 3 составляли преобладающий класс вариантов почти во всех генах когорты. Специфические вариантные сайты, включая детальные нуклеотидные замещения и соответствующие изменения аминокислот в целевых генах, каталогизированы в таблице 3.

Исследовательский анализ производительности обработки сигналов

Для изучения устойчивости и чувствительности конвейера обработки сигналов на основе DFT был проведён сравнительный бенчмарк со стандартным рабочим процессом вызова вариантов только GATK, с акцентом на геномные области с низким покрытием (глубина < 30x). В предварительном бенчмаркинге интегрированная схема фильтрации DFT показала потенциальную тенденцию к улучшению приоритетов в отдельных регионах с низким покрытием, что позволяет оценить исследовательскую оценку восстановления до 96,8% в этих специфических условиях лабораторного контроля. Важно, что эти параметры и численные показатели эффективности представляют собой предварительные, исследовательские результаты, откалиброванные в контексте конкретной институциональной когорты, а не универсально валидированный клинический конвейер. Конвейер также восстановил ранее отброшенные варианты с истинным положительным результатом в районах с высоким уровнем шума. Кроме того, FDR был снижен с 6,4% до 1,2%, что подчёркивает потенциальную устойчивость низкочастотного фильтра для устранения артефактов высокочастотного секвенирования. Среди новых вариантов, выявленных в когорте, 14 вариантов (составляющих 17,7% новых результатов), преимущественно расположенных в регионах с неравномерным покрытием STING1 и TREX1, изначально классифицировались как артефакты низкого качества по стандартным алгоритмическим порогам, но были успешно восстановлены и проверены с помощью секвенирования Сэнгера с использованием протокола улучшения сигнал-шум. Это аналитическое наблюдение показывает, что оценка характеристик физических сигналов может быть полезным инструментом в исследовательских рабочих процессах.

Сравнительный бенчмаркинг с стандартными рабочими процессами

Для оценки сравнительной производительности этой интегрированной структуры был проведён параллельный анализ бенчмаркинга по двум стандартным конвейерам вызова: рабочим процессу GATK Best Practices (BWA-MEM + GATK HaplotypeCaller v4.2.6) и DeepVariant (v1.5). Показатели эффективности рассчитывались с использованием подмножества валидации с высокой уверенностью когорты, оцениваемого по регионам с низким покрытием (глубина < 30x) и высокошумными геномными регионами. Сравнительная архитектура изложена в таблице 4.

Количественная параметризация и валидация вычислительных моделей

Для количественного обоснования биофизических и стохастических рамок моделирование ODE и моделирования Гиллеспи были параметризованы с использованием эмпирических кинетических значений, откалиброванных с учётом экспериментальных контрольных условий. Непрерывные моделирования ОДУ отслеживают абсолютную концентрацию фосфорилированного STAT2 ([STAT2p]) на протяжении 720 минут после смоделированного воздействия интерферона типа I. В вычислительной модели дикого типа (WT) сигнальный каскад демонстрировал быстрое гомеостатическое затухание, характеризующееся пиком активации на t = 45 мин, за которым следовал быстрый клиренс, вызванный программированной отрицательной обратной связью (k3 = 0,45 мин-1) с помощью имитированной экспрессии SOCS1. В отличие от этого, моделирование вариаций усиления функции (GoF) в путях STING1 и TYK2 выявило серьёзные пороговые сдвиги, что приводило к устойчивому, не ослабляющему гипервоспалительному состоянию. Период полураспада сигнала (t1/2) и изменения в стационарных складках суммированы в таблице 5.

Заявление о доступности данных

https://doi.org/10.5281/zenodo.20378497https://github.com/drgulnarahmedova-pixel/DFT-WES-Pediatric-Cohort-MethodologyPatient-level клинические данные, соответствующие финальной когорте, приведены в Дополнительной таблице S1. Дискретные пороги обработки цифровых сигналов, математические формулировки, настройки программной среды и вычислительные параметры, необходимые для воспроизведения фильтрации DFT и симуляции биофизических путей (ODE и стохастическое моделирование), стали публично доступны. Чтобы обеспечить постоянный и беспрепятственный доступ для читателей, эта фреймворк репликации был размещён на GitHub и навсегда архивирован в Zenodo через DOI: https://doi.org/10.5281/zenodo.20378497. GitHub: https://github.com/drgulnarahmedova-pixel/DFT-WES-Pediatric-Cohort-Methodology. Стандартные библиотеки программного обеспечения с открытым исходным кодом и численные вычислительные платформы, используемые в этом рабочем процессе, такие как NumPy, SciPy и COPASI, доступны для широкого доступа.

Рисунок 3. Операционная раскадровка и архитектура конвейера, основанного на данных, для идентификации и биофизического моделирования вариантов, связанных с интерферонопатией типа I. Схема описывает хронологический четырёхуровневый экспериментальный и вычислительный рабочий процесс, интегрирующий клинический когортный анализ с биологической обработкой сигналов. (A) Стратификация когорты и конвейер NGS: рабочий процесс для детской аутовоспалительной когорты (n = 132), проходящей WES. Вставка отображает репрезентативные исходные треки Phred с контролем качества FastQ, переходя к вызову вариантов GATK/DeepVariant и финальной генерации матриц VCF. (B) Обработка сигналов на основе DFT: алгоритмический перевод геномного текста в численные геномные сигналы для снижения шума. Встроенный граф, основанный на данных, отображает распределение спектра мощности, определяя частоты патогенных вариантов (скачки сигнала) на фоне геномного фона с порогом SNR >20 дБ. (C) In silico curation gate: многослойная воронка приоритизации, интегрирующая 5-уровневые рекомендации ACMG по патогенности, перекрёстные проверки HGMD и Infever для приоритизации 79 новых и 13 зарегистрированных вариантов. (D) Валидация функционального биофизического моделирования: слой биологической валидации. Детерминированная структура ОДР и стохастические кривые моделирования Гиллеспи интегрированы в графические компоненты, отображая 720-минутный период восстановления и устойчивую сигнализацию кинетики дикого типа и симулированной мутантной клеточной кинетики. Сокращения: ACMG = Американский колледж медицинской генетики и геномики; DFT = дискретное преобразование Фурье; GATK = Набор инструментов для анализа генома; HGMD = База данных мутаций человеческих генов; NGS = секвенирование следующего поколения; ODE = обычное дифференциальное уравнение; SNR = отношение сигнал/шум; VCF = вариантный формат вызова; WES = секвенирование целого экзома. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 3: Комплексное аннотирование и контроль базы данных локусов, выявленных генетических вариантов, ассоциированных с интерферонопатией типа I, в детской когорте (n = 132). Критерии ACMG (из рекомендаций ACMG/AMP 2015 года): коды доказательств ACMG/AMP были сгруппированы по силе доказательств. Очень сильные доказательства включают PVS1, который относится к предсказанным вариантам потери функции в генах, где потеря функции является установленным механизмом заболевания. Сильные доказательства включали PS1–PS4, охватывающие ранее установленные изменения аминокислот, подтверждённое de novo явление, подтверждающие функциональные доказательства и повышенную частоту вариантов у поражённых пациентов. Умеренные доказательства включали PM1–PM6, включая расположение в критическом домене или мутационной горячей точке, отсутствие или очень низкую частоту в популяционных базах данных, распространение транс при рецессивных расстройствах, изменения длины белка, новые ошибочные изменения в остатках с известной патогенной вариативностью и предполагаемое de novo явление. Подтверждающими доказательствами были PP1–PP5, включая косегрегацию, геноспецифическое ограничение missense, доказательства in silico , специфичность фенотипа и надёжные предыдущие сообщения о патогенности при отсутствии независимых данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу

Таблица 4: Сравнение производительности вариантных вызовных конвейеров в геномных областях с высоким уровнем шума. Оценка бенчмаркирования проводилась в зонах с низким покрытием (<30x) для оценки эффективности физически основанного фильтра DFT низкочастотного фильтра при устранении шума секвенирования и защиты истинно положительных сигналов по сравнению со стандартными алгоритмическими конфигурациями. Сокращения: DFT = дискретное преобразование Фурье. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу

Таблица 5: Количественные кинетические параметры и стационарные вариации сигнализации JAK-STAT на следующей линии. Краткое изложение границ моделирования ОДУ и стохастического Гиллеспи за 720-минутный временной цикл, подчёркивающее неспособность клеточного гомеостатического ослабления в моделях с патогенными вариациями STING1 и TYK2. Сокращения: JAK-STAT = Янускиназный сигнальный преобразователь и активатор транскрипции; ODE = обычное дифференциальное уравнение; STING1 = стимулятор интерферонного ответа cGAMP интерактор 1; TYK2 = тирозинкиназа 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу

Дополнительная таблица S1. Набор данных на уровне пациентов для детской когорты с вариантами, ассоциированными с интерферонопатией. Таблица содержит данные на уровне пациентов, соответствующие итоговой когорте из 132 пациентов, проанализированной в рукописи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Критически важные этапы протокола включают фрагментацию ДНК, лигирование адаптеров, амплификацию ПЦР и циркуляризацию одноцепочечной ДНК (ssDNA). На этих этапах необходимо тщательное выполнение для минимизации риска заражения. Точные промывки этанола и соответствующее время инкубации магнитной стойки при очистке на основе шариков обязательны, так как отклонения могут привести к снижению выхода продукта или пропущенному обнаружению вариантов. При совместной подготовке библиотеки требуется точный расчет 93,75 нг на пациента и тщательная корректировка объёма.

Для оптимизации протокола и устранения неполадок, измерения низкой флюорометрической количественной оценки, особенно концентрации ssDNA ниже порога 0,8–2 нг/мкл, могут потребовать увеличения глубины секвенирования или сокращения времени сушки бусинок для повышения чувствительности к вызову вариантов. В случаях предполагаемых вариантов мозаики интеграция технологий секвенирования с длинным чтением может повысить точность обнаружения. Кроме того, быстрая переноска образцов на лёд после ферментативного переваривания критически важна для поддержания стабильности продукта^12,13. Во время подготовки DNB медленное и бережное пипетирование вместе с аккуратным добавлением стоп-буфера сохраняет целостность наношарика. Это особенно важно для установления корреляций генотипа и фенотипа в ранних интерферонопатиях, таких как^{SAVI 6,11}.

Этот генетический анализ на основе WES предоставляет основу для оценки вариантов, связанных с интерферонопатией, у педиатрических пациентов с аутовоспалительными признаками и васкулитом. Выявляя варианты ключевых генов, таких как DNASE1, ADAR, STING1, RNASEH2A/B/C, TREX1, SAMHD1 и COPA, исследование выявляет генетическую гетерогенность, лежащую в основе васкулитических фенотипов, управляемых интерфероном. Частота вариантов в метаболизме нуклеиновых кислот и сенсорных генах, особенно DNASE1 и ADAR, в этой когорте соответствует центральной роли дисрегулированной сигнализации интерферона типа I в патогенезе детского васкулита и аутовоспалительных заболеваний. Эти результаты согласуются с предыдущими отчетами, связывающими эти гены с интерферонопатиями и васкулитическими^{проявлениями 4,5,7}.

Выясняя васкулитоподобные проявления моногенных аутовоспалительных синдромов, таких как кожное и интерстициальное поражение легких, наблюдаемое при SAVI, этот подход может способствовать ранней диагностике и помогать направлять антиинтерферон-таргетные терапии ^4,5,7. Моногенные интерферонопатии могут клинически имитировать ассоциированный с ANCA васкулит и другие васкулиты детства, что подчёркивает важность генетического тестирования в атипичных или устойчивых к лечению^{случаях 9,10,11}. Ранняя генетическая диагностика также может позволить своевременно начать таргетные методы лечения, такие как ингибиторы JAK, которые показали клиническую пользу у пациентов с мутациями, связанными с интерфероном^{STING1 7,13,14}.

Это исследование также подтверждает, что значительная часть педиатрических пациентов с комплексным аутовоспалительным васкулитом обладает редкими или новыми вариантами генов, связанных с интерферонопатией. Выявление 79 новых вариантов в этой большой когорте расширяет известный генетический спектр и может способствовать улучшению корреляции генотипа и фенотипа при детском васкулите.

Операционным аспектом в этом исследовательском процессе является оценка пороговых пределов, поскольку отклонения в параметрах исследовательского SNR могут влиять на выход фильтрации. Например, фильтрация распределения нуклеотидов на основе DFT помогает очищать шум, но требует калибровки для предотвращения чрезмерного сглаживания сигналов мутации; Устранение неполадок включает итеративную корректировку параметров бинарного отображения (0 для пуринов, 1 для пиримидинов) для оптимизации извлечения^{признаков 15}. В биофизическом моделировании крайне важно определить начальные условия для ООД, поскольку небольшие нарушения скоростей усиления могут изменить пороговое поведение, потенциально недооценивая устойчивую интерферонную сигнализацию. Расширенные детали JAK-STAT включают моделирование роли TYK2 в сигнализации IFN-α, где варианты усиления функции усиливают активацию STAT2, что приводит к появлению фенотипов^{интерферонопатии 20}.

Модификации метода могут включать интеграцию стохастических элементов для шумных клеточных сред, например, добавление шумовых терминов Ланжевена в ОДУ:

dX = f(X)dt + g(X)dW

где dW перечисленный термин обозначает шум процесса Винера, повышая реализм при моделировании изменчивости^{JAK-STAT 21}. Стохастические моделирования путей интерферона с использованием алгоритмов Гиллеспи фиксируют гетерогенность экспрессии IFN-β из-за отрицательных обратных связей, где различия между клетками в уровнях транскрипционных факторов приводят к бимодальному распределению активации^{ISG 22,23}. Диагностика моделей путей включает валидацию по экспериментальным данным IFN-β; Если амплификация расходится, отрицательные контроли, такие как скорости активации фосфатазы, могут быть перекалиброваны или включены распределённые задержки для транскрипции:

с гамма-ядром для задержки процессов.

По сравнению с секвенированием целого генома (WGS), этот подход, ориентированный на WES, может быть экономически эффективным, но менее комплексен для неэкзонных^{областей 24,25}. Сфера деятельности этой предварительной рамки ограничивается предоставлением поддерживающей биохимической модели, чтобы оценить, как математические вариации коррелируют с предполагаемым поведением интерферонной сигнализации, как это видно в пороговых моделях, где кумулятивные эффекты превышают критические значения, приводящие к повреждению сосудов. Ограничения метода включают возможность упускать из виду низкоуровневые варианты мозаики и требование функциональной валидации новых^{результатов 6}.

Этот метод имеет потенциал применения в иммунологии и сосудистой медицине, включая руководство антиинтерферонными терапиями путем моделирования воздействия вариантов на пути и обогащения баз данных для диагностики редких заболеваний¹⁹. Стохастические расширения могут дополнительно позволить предсказывать гетерогенные реакции в интерферонопатиях, что способствует персонализированной медицине.

В этом исследовании акцент делается на генетической оценке при детском васкулите, наряду с традиционными диагностическими инструментами, такими как гистопатология и методы визуализации. В целом это исследование подчёркивает важность генетической оценки при детском васкулите, одновременно подчёркивая частоту выявления вариантов, связанных с интерферонопатией, среди пациентов, проходящих генетический анализ по подозрению на аутовоспалительные заболевания. Оценивая влияние этих вариантов на сигнальные пути интерферона и подчёркивая важность ранней диагностики при детском васкулите, эта работа способствует обогащению баз данных редких заболеваний, связанных с васкулитными и аутовоспалительными заболеваниями, и предоставляет инсайты для будущих исследований, изучающих патогенность вариантов и популяционно-специфические полиморфизмы.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Переменные пипетки (P2, P10, P20, P200, P1000)	Любой поставщик		Для точной работы с жидкостями
Настольный центрифуг	Любой поставщик		Для кратковременной центрифугации пробирок для ПЦР
Equinox Library Amp Mix	MGI Tech/ NEB	7K0014-096 (или эквивалент)	PCR амплификационный мастер микс
Этанол (молекулярно-биологического града)	Любой поставщик		Используется для приготовления 80% раствора этанового мойки
IVT Primer 1 & IVT Primer 2	MGI Tech	Входит в комплект или отдельно	Праймеры для амплификации библиотеки
Пробирочки для ПЦР с низким сцеплением (0,2 мл)	Любой поставщик		Стерильные пробирки для ПЦР
Магнитный штатив / Магнитная решетка	Любой поставщик		Для разделения магнитных частиц
MGI DNBSEQ-G400	MGI Tech Co., Ltd.	900-000641-00	Настольный последовательный секвенатор нового поколения с использованием технологии DNBSEQ (секвенирование на ДНК-наношаров); поддерживает несколько длин считывания (например, SE50 до PE300); высокопроизводительный выход до 1440 Гб за запуск; идеален для приложений WES, WGS и целевой секвенации.
MGIEasy Circularization Kit	MGI Tech Co., Ltd.	1000020570 (Dual Barcode, 16 RXN) или 1000005260 (V2.0)	Кит для циркуляции для получения одноцепочечной круговой ДНК (ssCirDNA); версия с двойным штрих-кодом уменьшает индексный хоппинг; важный шаг после подготовки библиотеки для образования ДНК в рабочем процессе секвенирования MGI.
MGIEasy DNA Clean Beads	MGI Tech Co., Ltd.	1000005279	Магнитные частицы для очистки ДНК
MGIEasy DNB Prep Kit/ DNB Make Kit	MGI Tech Co., Ltd.	1000020570 (интегрированный с Dual Barcode Circularization) или соответствующий DNB Make (например, 940-000036-00 Onestep DNB)	Модуль для подготовки ДНК-наношаров (DNB); включает циркуляцию и генерацию наношаров для загрузки в потоковую ячейку; последний шаг в обработке библиотеки для секвенаторов DNBSEQ (часто сочетается с Circularization Kit).
MGIEasy Exome Capture Accessory Kit	MGI Tech Co., Ltd.	1000009657 (или эквивалент)	Содержит блокирующий раствор, универсальные блокировщики MGI, энхансер, буфер связывания, буфер мойки 1 & 2 и стрептавидиновые частицы
MGIEasy Exome Capture V4 Probes (или Twist CES Probes, совместимые с MGI/DNBSEQ)	MGI Tech Co., Ltd. (для MGIEasy) или Twist Bioscience (для Twist)	1000007745 (набор V4 проб, 16 RXN) или 1000007740 (пробы); Twist: на заказ / специфичный для панели (заказной, нет стандартного номера)	Гибридизационные зондные наборы для захвата всего экзома; целевые ~59 Мб кодирующих регионов (CCDS, RefSeq, GENCODE, miRBase); предназначены для высокоэффективного обогащения в WES рабочих процессах на платформах DNBSEQ; используются с MGIEasy Accessory Kit для гибридизации (предварительная инкубация при 65°C, 16 часов в ночи при 65°C), добавления блокировщика, захвата стрептавидиновыми частицами (буфер связывания, буфер мойки 1/2 при 48°C), элюции и последующей ПЦР амплификации (совместим с смесь Equinox).
MGIEasy Fast Hybridization and Wash Kit	MGI Tech Co., Ltd.	940-001974-00 (16 RXN)	Реагенты для гибридизации и мойки
MGIEasy FS DNA Library Prep Kit	MGI Tech Co., Ltd.	1000006987 (набор 16 RXN) или 1000005256 (базовый набор 96 RXN)	Комплект для подготовки библиотеки ДНК на основе быстрой фрагментации; ферментативная фрагментация с входом гДНК от 5 до 400 нг; совместим с платформами DNBSEQ для эффективного построения библиотеки WGS/WES.
Безнуклеазной воды	Любой поставщик		Молекулярно-биологического града
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	Для количественного определения библиотеки
Qubit ssDNA Assay Kit (опционально)	Thermo Fisher Scientific	Q10212	Для количественного определения ssDNA после циркуляции
Стрептавидиновые магнитные частицы	MGI Tech	Входит в комплект аксессуаров	Для гибридного захвата
Буфер TE (pH 8,0)	Любой поставщик		Для стадии денатурации
Термоциклер	Различные (Bio-Rad, Thermo и т. д.)		Используется для фрагментации, лигирования, ПЦР и программ DNB
Вихревой миксер	Любой поставщик		Для смешения образца
Широкие пипетки	Любой поставщик		Необходимы для приготовления DNB