Мультимодальное поведенческое фенотипирование состояний, похожих на депрессию, вызванную стрессом, у Drosophila melanogaster

Краткое содержание

Этот протокол служит основой для оценки поведенческих изменений, вызванных стрессом, у Drosophila melanogaster. Комбинирование дополнительных анализов позволяет количественно оценивать активность, исследование и принятие решений для отдельных мух. Подход гибок и может быть адаптирован для широкого спектра исследований, изучающих биологию стресса, метаболизм и нейроповеденческие функции.

Аннотация

Метаболические, нейродегенеративные и связанные со стрессом расстройства часто сопровождаются изменённой локомоцией, нарушением принятия решений и снижением поведенческой гибкости. Однако доступные мультимодальные поведенческие рамки для количественной оценки этих фенотипов у Drosophila melanogaster остаются ограниченными. Здесь представлен протокол, объединяющий принудительное плавание, поведение и движение рук в Y-образном лабиринте, фототаксис и оценку активности в системе FlyVac, исследование на открытых полях и долгосрочный мониторинг движения с использованием мониторинга активности Drosophila . Эти дополнительные анализы охватывают множество измерений поведения, включая моторный выход, мотивацию, структуру принятия решений и поведенческую вариабельность, как функциональные показатели нейронных и метаболических состояний. Конвейер масштабируем, воспроизводимый и адаптирован к фармакологическим, генетическим и экологическим манипуляциям, обеспечивая универсальную основу для обнаружения поведенческих фенотипов, связанных со стрессом, метаболизмом и нейродегенерацией у дрозофилы.

Введение

Поведенческие изменения, такие как изменения в передвижении, принятии решений и исследовательской активности, широко используются как индикаторы нейронного и физиологического состояния на уровне организма. В разных таксонах нейронная дисфункция часто проявляется в виде измененной структуры движений, снижения исследовательской мотивации, нарушенного сенсорно-ориентированного поведения при принятии решений и изменений в предсказуемости поведения. Поскольку эти результаты на уровне организма интегрируют нейронное, метаболическое и физиологическое состояние, они обеспечивают масштабируемые показания для выявления фенотипов, связанных с заболеваниями. Однако, несмотря на широкое использование Drosophila melanogaster в молекулярной генетике и нейронауке, стандартизированные мультимодальные поведенческие рамки, одновременно отражающие работу локомоторов, структуру принятия решений и поведенческую вариабельность, остаются ограниченными.

Модельные организмы необходимы для изучения механизмов, лежащих в основе стрессовых и нейропсихиатрических фенотипов, поскольку контролируемая экспериментальная манипуляция часто невозможна у человека. Поведенческие синдромы, связанные со стрессом, встречаются у многих таксонов, включая насекомых, и включают консервативные нейромодуляторные системы, такие как серотонин и дофамин, а также метаболические сигнальные пути. Таким образом, плодовая мушка стала мощной системой для связи молекулярной дисфункции с поведенческими исходами на уровне организма благодаря короткому времени генерации, генетической управляемости и сохранению болезненных^{путей 1,2}.

В то же время многие поведенческие анализы у дрозофилы обычно применяются в изоляции, что затрудняет различие между общими эффектами болезни, моторными нарушениями, мотивационными изменениями и поведенческими изменениями на уровне принятия решений. Кроме того, одни средние поведенческие показатели могут скрывать биологически значимые фенотипы, поскольку нейромодуляторные и развивающиеся возмущения часто изменяют поведенческую вариабельность, а не средний результат поведения. Поэтому необходим мультимодальный поведенческий подход, сочетающий локомоторные, исследовательские, сенсорные и принимающие решения анализы для формирования надёжных фенотипических сигнатур на уровне^{организмов 3}.

Здесь представлен мультимодальный поведенческий конвейер, интегрирующий экспозицию принудительного^{плавания 4,5}, поведение и управление руками в образе Y-образного лабиринта ^6,7,8,9, фототаксис и оценку активности с использованием системы FlyVac^10,11, открытое исследование¹² и долгосрочный мониторинг движения с использованием мониторинга активности дрозофилы ^5,13 (рисунок 1). Каждый анализ в этой структуре отражает особое поведенческое измерение, относящееся к фенотипам, связанным со стрессом. Тест принудительного плавания измеряет пассивное поведение при преодолении подвижности, при котором более ранний переход к неподвижности отражает снижение мотивации поддерживать реакции на побег. Тесты открытого поля и DAM количественно оценивают общую локомоторную активность и циркадную структуру, предоставляя базовые показатели моторного выхода и возбуждения. Y-лабиринт отражает структуру принятия решений через последовательности лево-правых выборов, позволяя оценивать как смещение поворота (латерализация), так и поведенческую вариабельность как меру предсказуемости. Наконец, анализ FlyVac оценивает сенсорно управляемое принятие решений и поведение при избегании подхода посредством повторяющихся фототактических решений. Вместе эти анализы предоставляют дополняющие показатели, различающие изменения в активности, мотивации и поведении на уровне принятия решений.

Этот протокол охватывает взаимодополняющие аспекты моторного выхода, мотивации, структуры принятия решений и поведенческой вариабельности, предоставляя масштабируемую основу для выявления поведенческих фенотипов, связанных со стрессом, метаболизмом и нейродегенерацией у D. melanogaster¹⁴. Основная цель данного исследования — создать мультимодальную поведенческую фенотипизацию, интегрирующую дополнительные анализы для охватки множества аспектов поведенческих изменений, вызванных стрессом. Парадигма напряжения используется здесь как стандартизированное возмущение для демонстрации чувствительности и применимости фреймворка.

Протокол

Принудительный анализ плавания проводился в соответствии с принципами 3R (замена, уменьшение и уточнение). Замена была достигнута с помощью модели Drosophila melanogaster в качестве модели беспозвоночных, тем самым избежав парадигм принудительного плавания позвоночных, которые всё больше ограничиваются по этическим причинам. Снижение было поддержано высокой пропускной способностью анализа, который позволяет делать надёжные поведенческие выводы из относительно небольших когорт, минимизируя использование животных. Совершенствование было достигнуто за счёт ограничения воздействия плавания до 2 минут — продолжительности, которая предотвращает усталость или утопление и позволяет полностью восстановить нормальное движение сразу после тестирования. В совокупности эти соображения гарантируют, что анализ предоставляет значимые поведенческие данные, минимизируя потенциальный стресс и максимизируя этическую приемлемость, в том числе в образовательных учреждениях.

1. Индукция состояния, похожего на депрессию у дрозофил (протокол вибрационного напряжения)

1. Собрать самца D. melanogaster в течение 24 часов после эклозии под лёгкой анестезией CO₂. Все детали указаны в Таблице материалов.
2. Поместите мухи группами по 10 штук в полипропиленовые или акриловые флаконы (длиной 95 мм × внутренним диаметром 25 мм), запечатанными хлопковыми пробками.
3. Подвергайте мух воздействию механической вибрации (300 Гц) с помощью вибрационной платформы.
4. Применяйте повторные циклы, включающие 45 минут вибрации и 15 минут восстановления в флаконах со стандартной пищей.
5. Продолжайте циклы вибрации в общей сложности 6 часов в день.
6. Повторяйте протокол стресса три дня подряд.
7. Поддерживайте управляющие мушки в одинаковых условиях без вибраций.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем протоколе использовались только самцы мух для снижения вариабельности, связанной с физиологическими и поведенческими различиями, характерными для пола, включая репродуктивное состояние и гормональные влияния. Эта стандартизация способствует выявлению поведенческих эффектов, вызванных стрессом, в контролируемых условиях. Тем не менее, протокол полностью применим к самокам мух, и половые реакции представляют собой важную область для будущих исследований. Учитывая, что чувствительность к фенотипам, связанным со стрессом и депрессией, может варьироваться в зависимости от пола и возраста у разных таксонов, включая Drosophila, расширение этой системы на разные демографические группы может дать дополнительное биологическое понимание. Эта парадигма адаптирована на основе установленных моделей неконтролируемых вибрационных стрессов, которые вызывают изменения мотивации и активности у мух.

2. Принудительный тест на плавание у Drosophila melanogaster

ВНИМАНИЕ: Додецилсульфат натрия (SDS) является раздражителем. При подготовке и обращении с решениями SDS носите соответствующие средства индивидуальной защиты (например, перчатки и защитную защиту глаз). Избегайте контакта кожи и глаз. Утилизировать отходы, содержащие SDS, в соответствии с институциональными рекомендациями по химической безопасности.

1. Собирайте взрослых мух в течение 24 часов после эклозии и поддерживайте их при постоянном освещении и контролируемых условиях.
2. Подготовьте многокамерные затворы и заполните каждую скважину ~2 мл раствора SDS 0,08% при комнатной температуре.
3. Пересадите по одной мухе в каждую скважину непосредственно перед записью. Анестезия не требуется.
4. Записывайте поведение с помощью верхней камеры в течение 2 минут, чтобы количественно оценить задержку до первой неподвижности.
5. Количественно измерите задержку до первой неподвижности.
6. После записи удалите мух и положите их на впитывающую бумагу, чтобы подтвердить восстановление нормальной передвижения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Неподвижность определяется как прекращение активных движений выхода при сохранении положения на поверхности. Для записи дополнительных параметров, таких как общая продолжительность неподвижности и количество периодов неподвижности, требуется более длинная продолжительность записи (например, 3 минуты). Этот анализ отражает пассивное поведение при преодолении ситуации; Сниженная задержка к неподвижности интерпретируется как снижение мотивации поддерживать реакции на побег. Вариабельность задержки к неподвижности / полной неподвижности между мухами. Этот анализ может вызвать временный стресс или усталость. При использовании в продольных конструкциях проводите его перед другими анализами и обеспечивают достаточное восстановление (например, ≥24 часа) перед последующим тестированием.

3. Долгосрочный мониторинг локомоторной активности с помощью мониторинга активности дрозофил (DAM)

1. Кратковременно анестезируйте плодовых мушек (5 с) с помощью CO₂ для сортировки.
2. Поместите отдельных мух в стеклянные DAM-трубки с едой и хлопковыми^{пробками 17}.
3. Вставьте трубки в систему мониторинга активности Drosophila.
4. Фиксировать двигательную активность непрерывно (48 часов) при контролируемой температуре и светло-тёмных условиях.
5. Сохраняйте подсчёты разрывов луча с помощью программного обеспечения для приобретения.
6. Данные об активности контейнеров в определённые временные интервалы (например, 1–10 минут).
7. Исключайте мух, которые погибают или не проявляют активности после акклиматизации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Непрерывный локомоторный мониторинг в течение 48 часов достаточно для фиксации циркадных паттернов активности. DAM: вариабельность общего расстояния, скорости и структуры движения у разных людей.

4. Открытый двигательный анализ

1. Кратко (5 секунд) анестезируйте плодовых мушек CO₂.
2. Переместите отдельных мух в прямоугольные арены размером 25 x 75 мм (по одной мушке на арену).
3. Позвольте мухам акклиматизироваться (20 минут) к аренной среде перед записью под постоянным, низкоинтенсивным диффузным белым светом.
4. Записывайте поведение при постоянном освещении с помощью автоматизированной системы видеоотслеживания.
5. Анализируйте траектории с помощью программного обеспечения для отслеживания для извлечения:
   Общее расстояние
   Средняя скорость локомотива
   Метрики ускорения и поворота
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ предоставляет базу для интерпретации изменений поведения, связанных со стрессом. Период адаптации минимизирует стресс, вызванный обращением, и позволяет мухам привыкнуть к арене, обеспечивая отражание базового поведения зафиксированной локомоторной активности. Постоянное освещение использовалось для снижения вариативности, связанной с циркадными флуктуациями, и обеспечения согласованных поведенческих условий во всех испытаниях. Траектории можно извлекать с помощью автоматизированного программного обеспечения для отслеживания, такого как EthoVision XT (Noldus Information Technology), или с открытыми альтернативами, такими как Ctrax, idTracker и TrackMate (ImageJ/Fiji), в зависимости от доступности и предпочтений пользователя. Открытый анализ: вариабельность общего расстояния, скорости и структуры участка у разных людей. Чтобы уменьшить эффекты порядка, стандартизируйте условия акклиматизации и освещения по сессиям. Когда проводится несколько анализов на одних и тех же пациентах, поддерживайте постоянную продолжительность воздействия на арене.

5. Анализ поведения при превращении в Y-лабиринт и анализ поведенческой вариабельности

1. Кратко анестезируйте (5 с) плодовых мушек CO₂.
2. Поместите отдельные мушки в Y-лабиринтовые^{камеры 8,9}. Лабиринты вырезали на чёрный акрил толщиной 1,6 мм с помощью лазерного гравера. Мы разместили мух в массиве из 95 отдельных лабиринтов, каждый из которых состоял из трёх симметричных рукавов (длиной 12 мм и шириной 3,3 мм).
3. Позвольте мухам свободно исследовать время в течение длительного периода записи (20 минут).
4. Фиксируйте решения по повороту (влево или вправо) во время исследовательской локомоции (1 час).
5. Вычислите индивидуальное смещение поворота как долю поворотов вправо. Рассчитывайте соответствующие метрики, такие как скорость, ускорение, движение без движения, вариации активности^{на основе времени 12,15}.
6. Количественно оценить изменчивость поведения между мухами с помощью медианного абсолютного отклонения (MAD) смещения поворота.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ измеряет локомоторную способность и предсказуемость поведения независимо от общего уровня активности. Последовательности поворотов отражают структуру принятия решений; Смещение поворота отражает латерализацию, а вариабельность между индивидами — поведенческую предсказуемость. смещение = доля правых поворотов (на один пролёт); вариабельность = дисперсия (MADn) смещения между мухами. Для повторных тестов рассмотрите возможность противовеса порядка анализов между индивидами или когортами для контроля эффектов последовательностей.

6. Фототактический выбор: мониторинг активности в аппарате FlyVac

1. Загрузить индивидуальные полёты в камеры^{FlyVac 6, 11} без использования анестезии_CO2.
2. Дайте возможность акклиматизации (10 минут) перед началом испытаний.
3. Покажите каждому мухе повторяющиеся бинарные выборы светлого и тёмного вариантов.
4. Фиксируйте выборы по 40 испытаниям с помощью автоматического обнаружения.
5. Вычислите вероятность выбора света на одну мушку и среднее время между выборами света как показатель активности.
6. Количественно оцените поведенческую вариабельность между людьми с помощью MAD.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Система FlyVac позволяет одновременно оценивать среднюю смещённость принятия решений и межиндивидуальную вариабельность. Поведенческие анализы, описанные в этом протоколе, являются модульными и могут проводиться в различных последовательностях в зависимости от дизайна эксперимента. Однако для минимизации возможных переносных эффектов рекомендуется провести тест принудительного плавания перед другими анализами. Чтобы уменьшить эффекты порядка, стандартизируйте условия акклиматизации и освещения по сессиям.

7. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Поведенческий анализ проводился с использованием отдельных мух в качестве единицы вывода, если не указано иное.

1. Тест на принудительное плавание: Анализируйте видеозаписи вручную или с помощью программного обеспечения для поведенческого оценивания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Неподвижность определялась как отсутствие активных движений для спасения, пока муха оставалась на плаву. За раз извлекались следующие параметры: задержка до первой неподвижности (с). Сравнения групп проводились с использованием непараметрических статистических тестов из-за ненормального распределения поведенческих показателей.
2. Долгосрочная локомоторная активность (DAM): рекорд по прорыву пучка по данным Drosophila Activity Monitor. Экспортируйте и перебирайте с интервалом в 10 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой мухи рассчитывались общие показатели активности и циркадные паттерны. Эти шаблоны можно вычислять в R, Python или Excel — в зависимости от доступного варианта. Мухи, проявляющие неактивность из-за смертности или технических артефактов, были исключены до анализа. Анализ длился 48 часов.
3. Открытый двигательный анализ: обработка данных видеоотслеживания с помощью автоматизированного программного обеспечения для отслеживания. Импортируйте видеофайлы в EthoVision XT. Проводите отслеживание с использованием автоматизированного обнаружения с пороговыми параметрами на основе контраста.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Траектории были сглажены с помощью алгоритма фильтрации по умолчанию. Параметры локомотора за один лёт (расстояние, скорость, ускорение) экспортировались в виде CSV-файлов для дальнейшего анализа. Параметры локомотива на один лёт включали: общее расстояние на промещении (мм), ускорения (^{мм/с 2}). Сводная статистика рассчитывалась на индивидуальном уровне до сравнения групп. Продолжительность этого теста составляла 1 час на каждую группу.
4. Поведение поворота в образе Y-лабиринта: извлекать решения о поворотах из записанных траекторий, классифицировать их как влево или вправо и экспортировать в бинарные последовательности (влево/вправо) для каждого индивида.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой мухи смещение поворота рассчитывалось как доля правых поворотов между всеми зарегистрированными решениями. Изменчивость поведения между мухами количественно оценивалась с помощью масштабированного медианного абсолютного отклонения (MAD_n = 1,4826 × MAD) смещения поворота. Продолжительность этого теста составляла 1 час на каждую группу.
5. Фототактические решения FlyVac: Автоматически фиксируйте бинарные выборы светло-тёмно. Для каждой мухи вычислите вероятность выбора света (LCP) как долю испытаний, в которых была выбрана лёгкая рука. Выражаем фототаксическое смещение как среднее по результатам бинарных испытаний (свет = +1, тёмный = −1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Изменчивость между мухами была количественно измерена с помощью_{MAD n} отдельных индексов фототаксиса.
6. Статистический анализ: Оценить групповые различия в поведенческих показателях с помощью тестов на основе перестановок с 10 000 рандомизационных меток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для сравнения вариабельности были проведены перестановочные тесты на абсолютные различия_{MAD n} между группами. Доверительные интервалы для оценок_{MAD n} были получены с помощью бутстрап-редискретлинга. Для сравнения расстояния, пройденного мухами (мм), и максимального ускорения (мм/^с) использовался двуххвостый непарный t-тест. Для визуализации данных использовались скрипичные графики (в первую очередь для показа плотности, концентрации и наклонности), коробочные диаграммы и столбцовые диаграммы. Статистическая значимость оценивалась в α = 0,05.

Результаты

Применение протокола вибрационного стресса вызвало измеримые поведенческие изменения в различных анализах (рисунок 1), предназначенные для фиксации активности, поведения при преодолении и принятия решений у D. melanogaster.

Индукция, подобная депрессии

Мухи, подвергшиеся повторяющимся механическим вибрациям (рисунок 1A), демонстрировали сниженную исследовательскую активность и изме...

Обсуждение

Настоящий протокол демонстрирует мультимодальный подход к вызову и количественной оценки депрессиоподобных поведенческих состояний у D. melanogaster. Используя парадигму стресса, основанную на вибрациях, в сочетании с дополнительными поведенческими анализами, это исследование показывает, что индукция, похожая на депрессию, может быть обнаружена по показателям поведения при преодолении, локомоторной активности, исследовательской динамике, принятия решений и поведенческой

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Аппаратура для анестезии: напр., Benchtop Flowbuddy, Complete System с Ultimate Flypad	Genesis Scientific, El Cajon, CA, USA	59-122BCU
Многоскоростной вихревой аппарат BioSan MSV-3500	Biosan SIA, Рига, Латвия	BS-010210-TAH	Со всеми платформами
Хлопковые пробки для узких пробирок	Flystuff от Genesee Scientific, El Cajon, CA 92020, США	Номер каталога: 51-101
Монитор активности дрозофилы (DAM2)	TriKinetics Inc, Уолтем, Массачусетс, США	DAM2; RRID: недоступен	32 трубки
Drosophila melanogaster (Oregon-R-modENCODE)	Drosophila melanogaster (Oregon-R-modENCODE)	BDSC:25211; RRID:BDSC_25211
GraphPad Prism	GraphPad Software, Бостон, Массачусетс, США;	Название каталога: GraphPad Prism, RRID:SCR_002798	Версия 11.0.1
Веб-камера Logitech C920 HD Pro, объектив HD 1080p Каталожное название: HD Pro Webcam C920	Logitech Europe S.A., Лозанна, Швейцария	RRID: недоступен	Верхняя камера для записи, используемая для FST
Узкая мухоловка из полипропилена	Flystuff от Genesee Scientific, El Cajon, CA 92020, США	Номер каталога: 32-120BF
Noldus EthoVision XT	Noldus Information Technology, Вагенинген, Нидерланды	RRID: SCR_000441	v. 15.0
Додецилксилфосфат натрия (СДС, ≥99%)	Merck KGaA (Sigma-Aldrich), Дармштадт, Германия	Название каталога: Додецилксилфосфат натрия (реагент ACS, ≥99% чистоты); RRID: недоступен
Стереомикроскоп ZEISS Stemi 508	Carl Zeiss AG, Оберкохен, Баден-Вюртемберг, Германия	15634448