Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Метаболомный анализ ядерного магнитного резонанса в отработанных средах культуры человеческого эмбриона: валидация методов и технические аспекты

98 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71285

⸱

31 июля 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Reproductive Medicine and Gynaecological Endocrinology, University Medical Centre Maribor, 2Faculty of Medicine, University of Ljubljana, 3National Institute of Chemistry, 4EN-FIST Centre of Excellence, 5Faculty of Chemistry and Chemical Technology, University of Ljubljana, 6Department of Reproductive Science, Manipal Academy of Higher Education

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол по сбору, подготовке и анализу использованной среды человеческой эмбриональной культуры с использованием спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР), что позволяет воспроизводимо обнаруживать низкомолекулярные метаболиты из образцов микролитрового масштаба в рутинных клинических условиях.

Аннотация

Отработанные человеческие эмбриональные культурные среды содержат метаболиты с низкой молекулярной массой, которые могут обеспечивать неинвазивное представление о физиологии эмбриона до имплантации. Однако метаболомный анализ этих образцов на основе ядерного магнитного резонанса (ЯМР) технически сложен, поскольку рутинные условия культуры эмбрионов включают микролитровые объёмы, добавление белков и наложения парафинового масла, которые создают фоновые сигналы и нарушают спектральное качество. Здесь мы представляем оптимизированный рабочий процесс метаболомики ЯМР для отработанных эмбриональных культурных сред, включающий контролируемый сбор капель для минимизации загрязнения нефти, фторированные этилен-пропиленовые (FEP) пробирки для химической изоляции образца от внешнего эталонного отчёта (TMSP) с учётом микролитровых объёмов, а также получение с помощью импульсной последовательности Карра-Пёрселла-Мейбума-Гилла для подавления макромолекулярных фоновых сигналов. Протокол обеспечивает последовательное выявление и количественную оценку низкомолекулярных метаболитов из индивидуально культивируемых человеческих эмбрионов и поддерживает воспроизводимый анализ в рутинных лабораторных условиях. Из-за множества технических сложностей метод должен быть должным образом проверен, прежде чем его можно будет использовать в исследовательских или клинических целях.

Введение

Во время преимплантационной разработки in vitro эмбрионы непрерывно потребляют и высвобождают низкомолекулярные метаболиты в окружающую среду. Таким образом, состав отработанной среды для культуры эмбриона (SECM) отражает метаболическую активность эмбриона и обеспечивает неинвазивное функциональное описание физиологии эмбриона и его способности развития 1,2. Анализ этого метаболического следа может дополнить традиционные методы оценки и улучшить стратегии отбора эмбрионов в технологиях вспомогательнойрепродукции 3,4. В частности, изменения в обороте аминокислот и углеводов связаны с потенциалом развития эмбрионови жизнеспособностью 5,6,7.

Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) широко используется для профилирования нецеленаправленных метаболитов различных биологических образцов, включая отработанные эмбриональные культурные среды 8,9,10. Однако анализ этих образцов остаётся аналитическисложным 11. В рутинной клинической практике эмбрионы культивируются в определённых микросредах, предназначенных для имитации физиологических состояний. Культурные среды дополняются белками, обычно альбумином, для стабилизации осмотического давления, связывания токсичных соединений и обеспечения молекул-носителей липидов и факторов роста, поддерживающих нормальноеразвитие 12. Чтобы предотвратить испарение и поддерживать постоянную концентрацию растворённых веществ, капли культуры накладывают стерильное парафиновоемасло 13.

Липиды, происходящие из наложенных масляных и белковых компонентов, генерируют широкие фоновые сигналы, которые заглушают узкие резонансы низкомолекулярных метаболитов, таких как глюкоза, пируват и аминокислоты. Кроме того, анализ объёмов образца в стандартных 5-мм ЯМР-трубках требует значительного разбавления для достижения активного объёма РЧ-катушки. Это снижение концентрации анализируемых веществ резко снижает отношение сигнал/шум (S/N), маскируя малочисленные метаболиты и затрудняя воспроизводимую количественную оценку. Хотя многие исследования применяли метаболомику на основе ЯМР к отработанных средам культуры человеческих эмбрионов, отсутствие стандартизированных и воспроизводимых протоколов сбора и подготовки ограничило воспроизводимость и сопоставимость междуисследованиями 8,9,11.

Здесь мы представляем рабочий процесс метаболомики на основе ЯМР (рисунок 1), разработанный для преодоления технических сложностей, связанных с отбором проб и анализом среды культуры человеческих эмбрионов. Этот подход сочетает контролируемое собирание капель для снижения переноса нефти, микролитровое накопление с использованием фторированных этиленпропиленовых (FEP) вкладышей для предотвращения артефактов разбавления и ослабление макромолекулярного сигнала с помощью импульсной последовательности Карра-Пёрселла-Мейбума-Гилла (CPMG).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Это исследование проводилось с января по апрель 2023 года на кафедре репродуктивной медицины и гинекологической эндокринологии Университетского медицинского центра Мариборя, Словения. ЯМР-анализ проводился в Национальном институте химии в Любляне, Словения. Письменное информированное согласие было получено от всех участников. Он получил одобрение как от Институционального комитета по этике (No UKC-MB-KME-1/21), так и от Национального комитета по медицинской этике (No 0120-37/2021/15).

1. Дизайн исследования

ПРИМЕЧАНИЕ: В исследовании анализировали отложенные эмбриональные культурные среды человека с использованием метаболомики на основе ЯМР.

  1. Сбор образцов после длительной культуры эмбриона после интрацитоплазматической инъекции спермы (ICSI). Соберите равное количество неиспользованных инкубированных контрольных образцов.

2. Сбор образцов

  1. Сбор образцов отработанных сред культуры эмбриона (SECM) после инкубации эмбриона, как показано на рисунке 2.
  2. После удаления эмбриона из капли аккуратно аспирируете избыточное масло поверхности чаши для посевов, не нарушая среду (рисунок 2, шаг 1).
  3. Используя стерильную пипетку, аспирируйте примерно 35 мкл культурной среды из исходной капли, оставляя примерно 5 мкл, чтобы избежать втягивания остаточного поверхностного масла. Перенесите этот объём в стерильную чашку Петри, чтобы получить новую каплю (рисунок 2, шаг 2).
  4. Под стереомикроскопом визуально осмотрите вновь образовавшуюся каплю. Аккуратно аспирируйте примерно 30 мкл из этой капли, снова оставляя примерно 5 мкл, чтобы минимизировать перенос масла. Перенесите этот объём во второе стерильное место, чтобы получить более чистую каплю (рисунок 2, шаг 3).
  5. Визуально осмотрите вторую каплю с увеличением. Определите области, где капли масла наиболее выражены. Вставьте кончик пипетки в эту область и аспирируйте примерно 25 мкл среды, снова оставляя примерно 5 мкл для минимизации переноса масла (рисунок 2, шаг 4).
  6. Немедленно перенесите собранные 25 мкл в стерильную микроцентрифугальную трубку без РНаз. Избегайте прикосновения к внутренним стенкам пробирки при подаче образца, чтобы предотвратить загрязнение и потерю образца. Немедленно заморозьте все собранные образцы в жидком азоте и храните при -80 °C до проведения ЯМР-анализа (рисунок 2, шаг 5).
  7. Собирать соответствующие неиспользованные инкубационные контрольные капли (средне, инкубированные без эмбрионов), подготовленные, инкубированные и обработанные в одинаковых условиях культуры, используя те же чаши для культуры, накладку масла, продолжительность инкубации, окружение инкубатора и процедуру обращения, описанные выше, чтобы минимизировать изменчивость окружающей среды и потенциальную систематическую смещенность.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Строгое соблюдение последовательной передачи капель и визуальный осмотр значительно снижают загрязнение масла. На этом этапе эксперимент может быть приостановлен и возобновлён перед дальнейшей обработкой образца для получения ЯМР.

3. Подготовка образца для ЯМР-анализа

  1. Разморозьте образцы при комнатной температуре в течение ~10 минут.
  2. Приготовьте ЯМР-смесь:
    1. Пересадите 25 мкл SECM в микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл. Добавьте 200 мкл D₂O. Вооружите его в вихрь на 10 секунд, затем центрифугайте при 1000 × г в течение 10 секунд при комнатной температуре.
  3. Вставка нагрузки: пересадить 225 мкл смеси в вкладыш FEP.
  4. Подготовьте внешнюю опорную трубку.
    1. Заполнить ЯМР-трубку диаметром 5 мм 150 мкл D₂O, содержащего 1 мМ 3-(триметилсилил)пропион-2,2,3,3-d4 кислотной натриевой соли (TMSP-d4).
  5. Соберите образец: вставьте вставку FEP в ЯМР-трубку и запечатайте парапленкой.

4. Получение ЯМР и спектральная обработка

  1. Получить 1анализ H-CPMG с помощью импульсной последовательности Bruker cpmgpr1d с: 64 сканирования; 65 536 точек данных; Задержка релаксации: 8 с; Спектральная ширина: 11,9 кГц; Время эхо: 400 мкс× 80 петель (эффективный T₂-фильтр 32 мс); Общее время приобретения: ~15 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективная длительность фильтра CPMG T₂ составляет 64 мс, была выбрана на основе устоявшихся метаболомных протоколов для биологических образцов, содержащих белок, где это значение обеспечивает эффективное подавление макромолекулярных сигналов при сохранении резонансов метаболитов с низкой молекулярноймассой 14.
  2. Выполните спектральную обработку:
    1. Получите спектры преобразования Фурье.
    2. Примените экспоненциальное расширение строк на 0,3 Гц.
    3. Выполните фазовую и базовую коррекцию.
    4. Эталонные спектры на TMSP-d4 при 0 ppm.
    5. Сравните химические сдвиги (δ) на внешний сигналTMSP-d 4 при 0 ppm.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку смесь образца внутри лайнера FEP (225 мкл) и внешний эталонный растворTMSP-d 4 во внешнем коаксиальном зазоре (150 мкл) занимают разные физические геометрии и объёмы в окне обнаружения активной ЯМР-катушки, их абсолютная интенсивность сигнала не масштабируется 1:1. Прямое абсолютное количественное определение с использованием внешнего эталонного параметра требует специфичной для системы геометрической калибровочной кривой. Поэтому, учитывая строго постоянные объёмы выборок и высокую воспроизводимую точность пипетирования этого протокола, исходные интегралы bucket использовались напрямую для отслеживания относительных метаболических вариаций между образцами, исключая необходимость внешней отсылки или нормализации общей суммы интенсивности.
  3. Выполните спектральное бинирование:
    1. Исключить резонансную область воды (например, 4,65–5,00 ppm) и референсную область TMSP-d4 (например, -0,05–+0,05 ppm) до бинирования.
    2. Разделите спектры на переменные по ширине, чтобы избежать разделения пиков.
    3. Для статистического анализа используйте необработанные ведровые интегралы, а не нормализацию внешнего сигнала TMSP-d4, так как эталонный объект физически изолирован во внешнем объёме трубки. Этот подход позволяет избежать ошибок количественной оценки, возникающих из-за разных активных объёмов вставки по сравнению с внешней трубкой.
    4. Экспортировать интегралы bucket в виде числовой матрицы данных для статистического анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждое «ведро» (или бин) представляет собой суммированный числовой интеграл всех ЯМР-сигналов в пределах определённого диапазона ppm. Хотя эти интегралы отражают относительную концентрацию химических групп в этом диапазоне, один ведро может содержать сигналы от нескольких перекрывающихся метаболитов или только часть общего сигнала конкретного метаболита.

5. Статистический анализ

  1. Импорт обработал 1спектр H-CPMG в Python (v3.12) с использованием nmrglue15.
  2. Удалить воду и спектральные области TMSP-d4.
  3. Экспортные интегралы bucket для анализа.
  4. Проведите статистическое тестирование с помощью SciPy (версия 1.14.1):
    1. Оценивайте нормальность каждого спектрального ведра с помощью теста Шапиро–Вилка.
    2. Применяйте односторонний ANOVA (для нормально распределённых данных) или Крускаля-Уоллиса (для непараметрических данных) для выявления ведра с статистически значимыми различиями между неиспользованным инкубированным контролем и использованными средами.
    3. Для ковш, показывающих значительные различия, выполняйте структурное распределение с помощью комбинации одномерных и двумерных ЯМР-экспериментов: 1 H-13CHSQC, 1 H-13CHMBC и 1 H-1HCOSY.
    4. Сравните наблюдаемые двумерные корреляции со стандартными базами данных (например, HMDB), чтобы проверить идентичность метаболитов, вносящих вклад в дискриминационные ведра.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Аналитический рабочий процесс для нецелевого метаболомного профилирования ЯМР-метаболомного профилирования использованной среды культуры эмбриона изложен на рисунке 1.

Удаление загрязнения нефти во время отбора проб
Рисунок 2 иллюстрирует процедуру последовательной передачи капель, используемую для уменьшения переноса масла наложения. Образцы, собранные без тщательного пипетирования, демонстрировали широкие угл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В данном исследовании мы рассмотрели ключевые аналитические задачи, связанные с идентификацией и количественной оценкой низкомолекулярных метаболитов в отработанных эмбриональных культурных средах с использованием нецеленаправленной ЯМР-метаболомики. Наши результаты показывают, что оптимизированный рабочий процесс позволяет получать высококачественные, насыщенные информацией спектры, подходящие для надежного обнаружения низкомолекулярных метаболитов.

Аккуратны...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Словенским агентством исследований и инноваций (ARIS) [номер проекта P3-0327].

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
5 мм FEP трубчатый вкладышSP Wilmad-LabGlass4682701Внутренняя вставка для коаксиального ЯМР
5 мм ЯМР трубкаSP Wilmad-LabGlass535-PP-7-SBНаружная трубка
6-лунковая культуральная пластинкаOosafeOOPW-SW02Емкость для культивирования эмбрионов
Криогенный жидкий азотMesserОбратитесь к производителюМгновенное замораживание образцов
Дейтерий оксид (D2O)EurisotopD214LРастворитель для ЯМР
Микропипетка (10–100 µL)Eppendorf4924000053Пипетка с регулируемым объемом
Микроцентрифужные пробирки, 1,5 мл, без РНКазыEppendorfN216966NКоллекция и хранение образцов
Минеральное маслоVitrolifeVTL-10029Покрытие культуральной капли
ЯМР спектрометр, 600 МГцBrukerhttps://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr/avance-nmr-spectrometer.htmlПолучение спектров
Пипетка ПастераFalconFAL-357575Перенос капель
Пипетка, одноканальная механическаяSartorius728060Обработка образцов
Стерильные наконечники для пипеточекEppendorf22491148Совместимость с микропипеткой
Стерильные наконечники для пипеточек с фильтромSartorius790201FБарьер от аэрозолей
Последовательная среда для культур G-серииVitrolifeVTL-10143Среда для культивирования эмбрионов
TMSP-d4 (натрий 3-триметилсилилпропионат-d4)Cambridge Isotope LaboratoriesDLM-48-1Эталон химического смещения
Пробирки Safe-LockEppendorf0030121589Хранилища

Ссылки

  1. Seli E, Botros L, Sakkas D, Burns DH. Non-invasive metabolomic profiling of embryo culture media using proton nuclear magnetic resonance correlates with reproductive potential of embryos in women undergoing in vitro fertilization. Fertil Steril. 2008;90(6):2183-2189.
  2. Vergouw CG et al. Metabolomic profiling by near-infrared spectroscopy as a tool to assess embryo viability: a novel, non-invasive method for embryo selection. Hum Reprod. 2008;23(7):1499-1504.
  3. Eldarov C et al. LC-MS analysis revealed significantly different metabolic profiles in spent culture media of human embryos with distinct morphology, karyotype and implantation outcomes. Int J Mol Sci. 2022;23(5):2706.
  4. Simopoulou M et al. Editorial: The role of metabolomics in ART: from diagnosis to treatment. Front Endocrinol (Lausanne). 2025;16:1558561.
  5. Gardner DK et al. Human and mouse embryonic development, metabolism and gene expression are altered by an ammonium gradient in vitro. Reproduction. 2013;146:49-61.
  6. Sturmey RG, Hawkhead JA, Barker EA, Leese HJ. DNA damage and metabolic activity in the preimplantation embryo. Hum Reprod. 2009;24:81-91.
  7. Sturmey RG, Brison DR, Leese HJ. Assessing embryo viability by measurement of amino acid turnover. Reprod Biomed Online. 2008;17:27-33.
  8. Nadal-Desbarats L et al. Is NMR metabolic profiling of spent embryo culture media useful to assist in vitro human embryo selection? Magn Reson Mater Phy. 2013;26:193-202.
  9. Wallace M et al. 1H NMR-based metabolic profiling of Day 2 spent embryo media correlates with implantation potential. J Assist Reprod Genet. 2014;31:58-63.
  10. Salmerón AM et al. Solution NMR in human embryo culture media as an option for assessment of embryo implantation potential. NMR Biomed. 2021;34:e4536.
  11. Kirkegaard K et al. NMR metabolomic profiling of Day 3 and 5 embryo culture medium does not predict pregnancy outcome in good prognosis patients. Hum Reprod. 2014;29(11):2413-2420.
  12. Otsuki J, Nagai Y, Chiba K. Damage of embryo development caused by peroxidized mineral oil and its association with albumin in culture. Fertil Steril. 2009;91(5):1745-1749.
  13. Martinez CA et al. The overlaying oil type influences in vitro embryo production: differences in composition and compound transfer into incubation medium between oils. Sci Rep. 2017;7:10505.
  14. Beckonert O et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nat Protoc. 2007;2:2692-2703.
  15. Helmus JJ, Jaroniec CP. Nmrglue: an open-source Python package for the analysis of multidimensional NMR data. J Biomol NMR. 2013;55:355-367.
  16. Siristatidis C et al. Why has metabolomics so far not managed to efficiently contribute to the improvement of assisted reproduction outcomes? Diagnostics (Basel). 2021;11(9):1602.
  17. Miao SB et al. Glutamine as a potential non-invasive biomarker for human embryo selection. Reprod Sci. 2022;29(6):1721-1729.
  18. Ferrick L, Lee YSL, Gardner DK. Metabolic activity of human blastocysts correlates with their morphokinetics, morphological grade, KIDScore and artificial intelligence ranking. Hum Reprod. 2020;35(9):2004-2016.
  19. Boyama BA et al. Homocysteine in embryo culture media as a predictor of pregnancy outcome in assisted reproductive technology. Gynecol Endocrinol. 2016;32(3):193-195.
  20. Yazdani A, Halvaei I, Boniface C, Esfandiari N. Effect of cytoplasmic fragmentation on embryo development, quality, and pregnancy outcome: a systematic review of the literature. Reprod Biol Endocrinol. 2024;22:1-40.
  21. Scott R et al. Non-invasive metabolomic profiling of human embryo culture media using Raman spectroscopy predicts embryonic reproductive potential: a prospective blinded pilot study. Fertil Steril. 2008;90:77-83.
  22. Vergouw CG et al. Day 3 embryo selection by metabolomic profiling of culture medium with near-infrared spectroscopy as an adjunct to morphology: a randomized controlled trial. Hum Reprod. 2012;27(8):2304-2311.
  23. Figoli CB et al. A robust metabolomics approach for the evaluation of human embryos from in vitro fertilization. Sci Rep. 2024;14(1):17447.
  24. Olcay IO et al. Non-invasive amino acid turnover predicts human embryo aneuploidy. Gynecol Endocrinol. 2022;38(8):461-466.
  25. Tesarik J. Non-invasive biomarkers of human embryo developmental potential. Int J Mol Sci. 2025;26(10):4928.
  26. Alizadeh Moghadam Masouleh A et al. Embryo metabolism as a novel non-invasive preimplantation test: nutrients turn over and metabolomic analysis of human spent embryo culture media (SECM). Hum Reprod Update. 2025;31(5):405-444.
  27. Hajnajafi K, Iqbal MA. Mass-spectrometry based metabolomics: an overview of workflows, strategies, data analysis and applications. Proteome Sci. 2025;23:5.
  28. Emwas AH et al. NMR spectroscopy for metabolomics research. Metabolites. 2019;9(7):123.
  29. Giera M, Yanes O, Siuzdak G. Metabolite discovery: biochemistry's scientific driver. Cell Metab. 2022;34(1):21-34.
  30. Lippi G et al. Influence of hemolysis on routine clinical chemistry testing. Clin Chem Lab Med. 2006;44:311-316.
  31. An Z, Shi C, Li P, Liu L. Stability of amino acids and related amines in human serum under different preprocessing and pre-storage conditions based on iTRAQ®-LC-MS/MS. Biol Open. 2021;10(2):bio055020.
  32. Fomenko MV, Yanshole LV, Tsentalovich YP. Stability of metabolomic content during sample preparation: blood and brain tissues. Metabolites. 2022;12(9):811.
  33. Wishart DS et al. HMDB 5.0: The Human Metabolome Database for 2022. Nucleic Acids Res. 2022;50(D1):D622-D631.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

МедицинаВыпуск 233Выпуск 233Пустое значениеВыпускЯМР-спектроскопияМетаболомикаЗагрязнение нефтьюCPMG
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.