Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Неинвазивная оценка функции митохондрий в реальном времени с использованием резонансной рамановской спектроскопии

96 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71290

⸱

7 августа 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1Center for Engineering in Medicine and Surgery, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Shriners Hospital for Children, 3Pendar Technologies

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем неинвазивный, в реальном времени метод мониторинга здоровья митохондрий с использованием резонансной рамановской спектроскопии (RRS). Мы использовали RRS для количественной оценки окислительно-окислительных состояний митохондрий и разработали метрику состояния митохондрий — резонансное раманское соотношение митохондрий (3RMR), которая показывает более быструю реакцию на изменения оксигенации по сравнению с традиционными анализами крови и газов.

Аннотация

Хотя митохондрии играют центральную роль в патогенезе и прогрессировании заболевания, механистическое понимание динамики здоровья митохондрий остаётся дорогостоящим и недоступным. Для устранения этого пробела в исследовании используется резонансная рамановская спектроскопия (RRS) для оценки функции митохондрий с помощью портативной системы, которая обеспечивает в реальном времени, неинвазивные и количественные измерения окислительно-окислённых состояний митохондриального цитохрома в печени крыс. В этом протоколе мы демонстрируем применение этой технологии, включая настройку, сбор данных и обработку данных. В данном исследовании представлен эксперимент с подтверждением концепции, который подчёркивает способность RRS измерять изменения в режиме окислительно-окислительного стана митохондрий в реальном времени — а значит, и функции митохондрий. Кратковременно устройство RRS было подключено к лазерному насосу, а также к компьютеру сбора данных и размещалось на расстоянии 1 см от печени крысы.  Параметры получения были выбраны в соответствии с протоколом печени крыс; Окислительно-окислённые состояния измерялись в оксигенированных и ишемических условиях с помощью кислородного стресс-теста. Изменения в окислительно-восстановительном состоянии митохондрий отслеживались на протяжении всего теста на кислород.

Введение

Митохондрии играют ключевую роль в работе клетки и гомеостазе. Митохондрии являются основными драйверами клеточного метаболизма, регулируя образование АТФ посредством окислительного фосфорилирования. Они также служат сигнальными органеллами, определяющими судьбу клетки, регулируя апоптотические пути, а также ROS и Ca+2 сигналы 1. Таким образом, дисфункция митохондрий может привести к различным нейродегенеративным, мышечным и сердечно-сосудистымзаболеваниям 2,3. Несмотря на ключевую роль митохондрий в прогрессировании заболевания, оценка функции митохондрий может быть инвазивной, дорогостоящей и ограниченной.

Ключевые показатели функции митохондрий, такие как скорость потребления кислорода, окисляющее фосфорилирование и активность различных комплексов в цепи переноса электронов (ETC), измеряются с помощью респирометрии. ETC состоит из четырёх комплексов (I–IV), встроенных во внутреннюю митохондриальную мембрану (IMM). Эти комплексы с помощью других коферментов передают электроны из восстановленных субстратов, таких как NADH и FADH2, к конечному акцептору электроновO2, который затем восстанавливается до воды. Большинство современных респирометрических анализов, таких как Seahorse и Orobros O2k, требуют обработки тканей, что ограничивает их применение в трансляционныхисследованиях 4,5. Измерение мембранного потенциала митохондрий (MMP) — это ещё один метод оценки дисфункции митохондрий, который использует катионные липофильные флуорофоры, такие как JC-1, а также микроскопическую визуализацию, где связанные (здоровые) и несвязанные (повреждённые) митохондрии флуоресцируют с разными длинамиволн 6. Однако эти анализы могут иметь низкуючувствительность 5. Сам краситель также может обладать высокой цитотоксичностью привысоких концентрациях 5. Наконец, подобно измерениям респирометрии, эта техника требует обработки тканей. Методы на основе спектроскопии в последнее время используются как неинвазивные методы оценки состояния митохондрий. Например, фосфорная магнитно-резонансная спектроскопия (P-MRS), метод, оценивающий клеточный метаболизм путём измерения концентраций фосфорсодержащих метаболитов, используется для характеристики инженерной адипогенной ткани, подвергающейсядифференцировке 7. Однако эта техника также требует специализированного оборудования и обучения.

Наша группа недавно продемонстрировала в реальном времени, неинвазивную и очень специфическую технику измерения состояния митохондриального редокса как маркера жизнеспособности органов с помощью резонансной рамановской спектроскопии (RRS). RRS использует неупругое рассеяние фотонов для количественной оценки редокс-состояний митохондриальных цитохромов. Кольца порфирина в гемных группах молекул, таких как митохондриальные цитохромы, гемоглобин и миоглобин, образуют характерный рамановский спектр в зависимости от их степени окисления при возбуждении лазером с длинойволны 441 нм. Хотя система RRS использует длину волны 441 нм, могут использоваться лазеры с длинами волн 420 нм и 405 нм, каждый из которых предпочтительно усиливает отдельный цитохромный комплекс. Спектр, полученный из неизвестного интересующего образца, сверяется с заранее зафиксированными библиотеками полностью окисленных или восстановленных целостных митохондрий, что даёт соотношение редуцированных к полным митохондриям или среднему редокс-состоянию цитохромов in situ ETC. Это соотношение определяется как резонансное раманское редуцированное митохондриальное соотношение (3RMR).

Существует 3 различных расчёта/типа 3RMR: митохондриальный 3RMR (мито-3RMR), комплекс III 3RMR (cIII-3RMR) и комплекс IV 3RMR (cIV-3RMR). Каждый из этих индексов вычисляется за счёт доли сведённой к общему числу данной компоненты. Например, 3RMR cIII — это отношение редуцированного cIII к общему числу cIII в ткани (cIII-R/(cIII-O+CIII-R). Та же схема применяется и к cIV. Таким образом, 3RMR-cIII будет относиться к отношению редуцированного cIII к общему объёму cIII, а 3RMR-cIV — к отношению уменьшенного cIV к общему объёму cIV. С помощью регрессионного анализа либо вычисляются митохондриальные редокс-состояния (мито-3RMR) с использованием спектральных библиотек целостных митохондрий, либо отдельные комплексные окислительно-окислительные состояния (cIII-3RMR и cIV-3RMR) с использованием спектральных библиотек cIII и cIV. Недавняяпубликация 9 показала, что мито-3RMR является репрезентативным для взвешенных средних для cIII и cIV редокс-состояний (или cIII-3RMR и cIV-3RMR). Важно отметить, что cI и cII не являются раман-активными и не резонансно усилены через длину волны 441 нм. Следовательно, они не вычисляются при вычислении мито-3RMR.

Используя такие типы 3RMR, мы определяем оптимальный диапазон 3RMR. В «здоровых» органах митохондрии целы и имеют достаточное количество кислорода. В отличие от этого, повреждённые органы могут иметь недостаточную доставку или использование кислорода, что приводит к накоплению электронов в комплексах ETC. Накопление электронов вызывает «редуктивное напряжение», смещая митохондрии из окисленного в редукционированное состояние и увеличивая значения 3RMR. Несколько исследований 8,9,10,11,12, охватывающих сердца и печень в моделях грызунов и свиней, начали проливать свет на оптимальный «здоровый» диапазон для 3RMR, который предполагается в диапазоне от 10 до 30. Например, Перри и др. подвергали сердца млекопитающих гипоксии, где 3RMR в 30% обеспечивал оптимальный баланс чувствительности и специфичности для обнаружения гипоксическойткани 8. Эта тенденция была дополнительно подтверждена в дополнительных исследованиях с сердечнойтканью 11,12 и печеночныхтрансплантатов 10. Кроме того, Нюген и др.9 продемонстрировали, что значения 3RMR падают до очень низких (окисленных) значений для тканей, в которых метаболизм остановился: уровень 3RMR (7,667 ±± 4,926) у нетрансплантируемых теплоишемических печеней после 3 часа перфузии нормотермической машины, по сравнению с 3RMR выше 10 (~12–15) для свежей и трансплантируемой теплоишемическойпечени 9.

Помимо этих демонстраций того, как 3RMR может измерять жизнеспособность тканей, чувствительность, специфичность и простота использования RRS делают его очень применимым во многих других областях, где затронуты клеточный метаболизм и функция митохондрий. В предыдущих исследованиях RRS использовался для выявления макулярной дегенерации и глаукомы у мышей путём оценки метаболической активности немиелинизированных аксонов ганглиозных клеток сетчатки на головке зрительногонерва 13. Кроме того, он использовался для выявления коарктации аорты (CoA) в модели врождённого сердечного заболевания у крыс — диагноз, который часто упускается при кардиологических скринингахноворождённых 12. Эта технология была использована для понимания функции и жизнеспособности органов в различных экспериментальных условиях, важных в области трансплантации органов, включая исследования, оценивающие жизнеспособность органов при перфузии ex vivo машины 10,11, оценку реоксигенации после статического холодногохранения 14 или смягчение реперфузионных повреждений теплоишемическойпечени 9.

В данной статье направлен на то, чтобы утвердить RRS как чувствительный инструмент в реальном времени для оценки состояния митохондрий. Целая печень из модели крыс подвергалась различным уровням ишемии и реперфузии кислорода в рамках стресс-теста для оценки митохондриального ответа. В этом тесте на кислород свежие печени подвергаются 5 минут начальной перфузии, 5 минут ишемии и 5 минут реперфузии. На протяжении всего стресс-теста проводились измерения 3RMR, а также лактат, K+, парциального давления кислорода (pO2). С помощью 3RMR наблюдалась более высокая реакция на изменения в оксигенации по сравнению с традиционными анализами газов крови. В этих экспериментах использование RRS подчёркивается не только для механистических исследований, но и как диагностический метод, а также как терапевтический испытательный стенд. Таким образом, общий протокол может быть полезен для различных исследователей, работающих с митохондриями. В целом, RRS, благодаря своему неинвазивному, актуальному и высокоспецифическому характеру, может существенно повлиять на клеточный метаболизм.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все животные, участвовавшие в экспериментах, содержались в соответствии с руководящими принципами Национального исследовательского совета и были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) в Массачусетской общей больнице (Бостон, Массачусетс, США).

1. Настройка и использование RRS

  1. Описание устройства:
    ПРИМЕЧАНИЕ: Портативная система RRS (Pendar Technologies; продукт предназначен только для исследовательских целей) использует лазер диаметром 441 нм благодаря резонансному усилению раманского спектра митохондриальных цитохромов с этой длиной волны. Лазер работает от 4 мВт до 8 мВт.
    1. Подключите лазерный источник возбуждения к специально изготовленному зонду с помощью оптоволоконного кабеля. Зонд направляет лазерное пятно диаметром 2 мм на ткань, а также собирает излучаемый спектр. Далее спектр проходит через полосный фильтр и собирается массивом устройств, связанных с зарядом (CCD). Спектр собирается каждую секунду в течение 180-х секунд и усредняется для создания сырого, сниженного по уровня шума спектра для анализа.
    2. Программное обеспечение сравнивает полученный спектр с заранее измеренными спектральными библиотеками с помощью регрессионного анализа.
  2. Процедура для библиотек предварительной записи
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов, представленных в этой статье, были созданы и использованы восстановленные и окисленные формы библиотек митохондрий, комплекса III, комплекса IV, гемоглобина и миоглобина. Сигналы RRS всех библиотек принимались в чёрном ящике при комнатной температуре (21 °C). Эти библиотечные файлы предоставляются отдельно с программным обеспечением для анализа. Однако, в зависимости от интересующей ткани и наличия других раман-активных молекул можно создать и другие библиотеки, соответствующим образом адаптировав следующий протокол. Необработанные спектры RRS библиотек гемоглобина, миоглобина и окисленного/восстановленного комплекса III/IV представлены в Дополнительный рисунок 1.
    1. Библиотеки гемоглобина (дополнительный рисунок 1C):
      1. Собирайте свежую кровь грызунов с помощью эксклюзии крови животных. Насыщайте собранную кровь кислородом с помощью 100% кислорода или деоксигенируйте с помощью 100% азота в стеклянном кювете, добавляя натрий дитионат.
      2. Измерьте RRS в каждом состоянии через стеклянную стенку кюветы в течение 10 минут, при этом датчик RRS расположен в 9 мм от стеклянного кювета.
      3. Используйте спектральные пики на 1356 см-1 для подтверждения деоксигенированного состояния, а пики на 1376 см-1 — для подтверждения оксигенированного состояния.
    2. Восстановленные/окисленные митохондриальные библиотеки (рисунок 1)
      1. Изолировать митохондрии из гомогенизированных и очищенных сердец грызунов в стеклянном кюветте. Разместите рамановский зонд на расстоянии 9 мм от стеклянной кюветы и измерьте спектры этих митохондрий через стеклянную стенку.
      2. Создайте полностью окисленные условия, обеспечивая 100% поток кислорода в митохондрии. Проверьте окислённое состояние по отсутствию сниженного пика RR на уровне 1357 см-1.
      3. Создайте полностью восстановленные условия, подвергая митохондрии воздействию 100% азота с небольшим количеством сероводорода. Проверьте сниженные условия за счёт отсутствия окисленного пика маркера RR на уровне 1371 см-1.
    3. Окисленный/восстановленный комплекс III/IV (дополнительный рисунок 1A,B):
      1. Изолировать комплекс III и IV, как описано вдругих местах 9,15,16,17. Кратко, используйте стандартный образец изолированных митохондрий (соответствующий 200 наномолям цитохрома а) в качестве исходного материала.
      2. Разведите митохондрии до 10 нмоль цитохрома A/mL в ледяном буфере C (50 мМ Tris, 1 мMMgSO 4, pH 8,45). Затем добавьте по 10% с n-β-D-додецил-мальтозидом (ДМ) капля за каплями до конечной концентрации 1%, аккуратно смешивая на льду.
      3. Центрифугуйте экстракт при 40 000 × г в течение 40 минут при 4 °C. Нанесите супернатант на стеклянную колонку диаметром 2,5 см × 20 см, ранее упакованную обменной смолой, уравновешенной 5 колонками буфера C (содержащего 0,02% с ДМ).
      4. После промывки буфером C двумя столбцами элют митохондриальные комплексы, применяя линейный градиент NaCl 0–400 мМ в том же буфере, и собирают элюту в фракции по 4 мл.
      5. Зелёные дроби, содержащие комплекс IV, элююировались близко к середине градиента (~180 мл NaCl), перед красноватыми фракциями, содержащими комплекс III. Концентрируйте объединённые фракции, содержащие каждый комплекс, до 20–30 нмоль цитохрома a/mL.
      6. После выделения отдельных комплексов каждый подвергается окисляющему и восстанавливающему состоянию. Уменьшить образец комплекса III объемом 11 мм в трисбуфере с использованием 2 мл аскорбата (1 м) для уменьшения цитохрома c1 и 2 мл HS (гидросульфита) для полного восстановления цитохромов b, L и bH.
      7. Уменьшить образец комплекса IV объемом 18,67 мМ в Tris-буфере в несколько этапов, поскольку комплекс IV проходит многоступенчатый каталитический процесс окисления. Для полного сокращения комплекса IV добавьте два 2 мл H2O2 (10 мМ), затем 2 мл HS.
      8. Собирайте библиотечные спектры после каждого сложения, чтобы фиксировать каждый этап цикла. Добавьте полностью окисленные и восстановленные спектры в итоговую справочную библиотеку для представления устойчивых состояний комплекса IV.
      9. Подготовьте все образцы в стеклянном флаконе объёмом 1 мл, держите их в фиксированном положении на расстоянии 9 мм от линзы зонда и заключите в чёрный ящик для предотвращения светового загрязнения. Соберите спектры RRS на 600 с для каждого комплекса и окислённого состояния.
      10. Подтвердить чистоту изолированных cIII и cIV, как описаноранее, 17, и подтвердить адекватность изолированных cIII и cIV спектральных библиотек для объяснения полных митохондриальных спектров, как описано в недавней статье9.
    4. Библиотеки миоглобина (дополнительный рисунок 1D):
      1. Используя аналогичные потоки кислорода и азота (с растворённым натриевым дитионитом), насыщение экстракта миоглобина миокарда варьируется в диапазоне от 0% до 100%. Проверьте рамановские спектры с помощью маркерных пиков на 1355 см-1 и 1376 см-1.

ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство спектральных компонентов, описанных выше, таких как гемоглобин или окисленные/восстановленные митохондрии, являются молекулами, содержащими гем, и возбуждаются одной и той же длиной волны. Эта система RRS избегает перекрытия сигналов, создавая регрессионную библиотеку для каждой молекулы на основе её уникального спектрального сигнала. Полученные рассеянные спектры запускаются через регрессионный алгоритм против выбранных библиотек. Регрессионный алгоритм даёт коэффициент для каждого библиотечного спектра, который представляет собой наилучшую оценку его относительного вклада в записанный спектр и, следовательно, относительной концентрации в ткани. Поскольку алгоритм использует наилучшее соответствие в диапазоне волновых чисел, небольшие различия в положении или интенсивности спектральных пиков различных компонентов библиотеки позволяют регрессии различать даже близкородственные хромофори. С помощью алгоритма регрессии и спектральных библиотек система RRS может разбить общий рассеянный сигнал на различные компоненты в зависимости от их уникальных спектральных пиков, избегая перекрытия сигналов у молекул, содержащих гем. Для демонстрации взаимосвязи между гемоглобином и митохондриями прилагается дополнительный рисунок 2 , на котором представлены изображения спектров, взятых при перфузии печени, разбитых на измеренный сигнал, линию наилучшего соответствия и необъяснимый остаточный эффект, возникающий из-за различий в отдельных спектральных пиках. В панели A выбираются библиотеки регрессии ренормированного и окисленного гемоглобина, а также восстановленных и окисленных митохондрий. Линия наилучшего соответствия, курируемая через библиотеки и регрессионный анализ, аккуратно пересекается с измеренным сигналом, и остаётся мало необъясненных остаточных наследств. В панели B выбираются только окисленные и восстановленные библиотеки митохондрий. Поскольку существует большая необъяснимая остаточная структура, спектральный пик митохондрии смещён на несколько волновых чисел по сравнению с пиком гемоглобина, который не был включён в регрессионный анализ. Кроме того, в дополнительных рисунках Нгуен и др.9 авторы объясняют взаимосвязь между митохондриями и отдельными комплексами (cIII и cIV), а также взаимосвязь между отдельнымикомплексами 16, при которых комплекс III демонстрирует более резкие, низкочастотные пики, тогда как комплекс IV — более широкие, смещающиеся вверх полосы. Кроме того, авторы показывают, что редуцированные библиотеки комплекса III и IV полностью объясняют измеренный спектр восстановленных целых митохондрий, что приводит к минимальному необъяснимому остаточному состоянию.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Спектральные библиотеки полностью окисленных и восстановленных митохондрий. Спектры библиотеки RRS были получены после того, как изолированные митохондрии получили (A) 100% кислорода или 100% азота (B) для достижения соответственно окислённого и восстановленного состояний. Эти состояния подтверждались наличием пиков маркеров RR (C), насыщенных кислородом и сниженных (D) маркеров. Сдвиг этих пиков соответствует изменениям молекулярных колебательных мод в присутствии кислорода. Интенсивность каждого пика нормализуется до 1 произвольной единицы интенсивности (AU), поскольку усиление редуцированного состояния становится сильнее при использовании этой длины волны возбуждения 441 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

2. Сбор данных с использованием RRS

  1. Настройка устройства:
    1. Подключите блок спектрометра (размещённый в компактной коробке) к блоку питания постоянного тока (DC) и к адаптеру питания с помощью предоставленных кабелей. Спектрометрический блок имеет одну круглую вилку с выравнивающими вмятинами.
    2. Выровняйте вмятины на круглой вилке с отверстиями кабеля, который подключается к адаптеру питания. Перед подключением портов чистка не требуется (рисунок 2).
    3. Подключите компьютер, выполняющий анализ, к тому же адаптеру питания, который подключает спектрометр и блок питания, используя предоставленные кабели.
    4. Поместите лазерный зонд в держатель зонда. Скорректируйте положение этого зонда в начале эксперимента.
    5. Откройте программное обеспечение управления спектрометром (Cellular Energetics Software).
  2. Настройка программного обеспечения:
    ПРИМЕЧАНИЕ: В системе предоставляются файлы настроек и регрессионные библиотеки для различных типов тканей. Эти файлы содержат информацию о том, какие библиотеки система RRS должна включать в регрессию, сколько спектров включено в окно регрессии и другие параметры, такие как мощность лазера. Настройки по умолчанию можно изменить, а для будущих экспериментов сохранить новый файл настроек. Скриншоты программного обеспечения, описанные ниже, представлены на дополнительном рисунке 3.
    1. При открытии программного обеспечения управления спектрометром появляется график, показывающий процент 3RMR, насыщение кислородом (StO 2) и насыщение миоглобина. Именно на этом экране эти метрики будут отображаться, если они выбраны, в реальном времени на протяжении всех измерений. Нажмите на вкладку «Настройки » в левом нижнем углу страницы.
    2. Во вкладке «Информация » введите информацию о сессии в разделе «Название сессии» и все необходимые детали во вкладке «Описание сессии ».
    3. Существует два режима сбора данных. Используйте режим точечной проверки для накопления спектров до достижения заданных метрик качества (например, целевого сигма или регрессионного окна/количества спектров), затем прекратите запись. Используйте непрерывный режим для записи спектров до нажатия кнопки остановки. В обоих режимах все данные, как результаты 3RMR, так и отдельные спектры, сохраняются автоматически. В этом эксперименте используется непрерывный режим.
    4. Когда вся информация о сессии введена, нажмите на вкладку «Система ».
    5. В разделе «Файл настроек» выберите подходящий для проекта протокол (для бесклеточных перфузий печени крыс выберите протокол Rat Liver Acellular ). Это автоматически регулирует тип измерения, среднюю длину измерения (окно регрессии), а также целевую сигму.
      1. Чтобы создать новый файл настроек, настройте любой из перечисленных выше компонентов, затем нажмите кнопку «Сохранить ». Это должно сохранить эти параметры в отдельном файле настроек, который затем можно импортировать в систему.
      2. Чтобы импортировать новый файл настроек, нажмите на выпадающее меню рядом с Default (Mod) и выберите Import New Settings File. Нажмите на новый файл настроек для импорта.
    6. В разделе регрессионных библиотек выберите и подтвердите комбинацию библиотек для сбора и анализа данных. Для этого эксперимента были выбраны библиотеки для восстановленных и окисленных митохондрий [только Мито]. Другие пользователи могут выбрать библиотеки, которые также включают гемоглобин, миоглобин или другие комплексы из раздела Расширенная библиотека.
    7. Выберите и подтвердите предпочтительный режим ширины окна.
      1. Режим адаптивной ширины: Используйте режим адаптивной ширины для добавления отдельных спектров к усредненному спектру до достижения максимальной цели сигма. Если сигма-цель не достигнута, запись прекратится, когда достигнет верхнего предела установленного регрессионного окна (то есть максимального количества спектров, которые ей было приказано записать). Результаты измерений будут отображаться на экране после достижения минимальной цели сигма.
      2. Режим фиксированной ширины: используйте режим фиксированной ширины для добавления отдельных спектров к усредненному спектру до включения целевого количества спектров (установленного ниже средней длины).
    8. После завершения настроек системы нажмите на вкладку «Плот».
    9. В разделе «Основная серия» выберите компоненты, которые будут отображаться и отображаться на экране во время измерений.
    10. Убедитесь, что все выбранные компоненты измерения соответствуют интересуемому протоколу.
  3. Сбор данных:
    ПРИМЕЧАНИЕ: Измерения Рамана следует делать в тёмном пространстве. Перед началом сбора данных убедитесь, что рабочее пространство максимально защищено от света. Если комнату нельзя полностью защитить от света, система RRS оснащается чёрной крышкой с прямоугольным отверстием в центре (показано в Рисунок 2), через который можно разместить лазерный зонд. Коробка может покрывать образец/участок органа, с которого проводятся измерения RRS. При работе с лазером RRS избегайте прямого или длительного воздействия глаз. Не направляйте лазер прямо в глаз или на отражающие поверхности. Активируйте лазер только если он расположен непосредственно на интересующей ткани. Лазер RRS — это лазер класса 3R при использовании на мощности 4 мВт и класса 3B при 10 мВт. Лазер безопасен для контакта с тканями.
    1. Выберите подходящие заранее сохранённые настройки, параметры записи и файлы библиотеки.
    2. Разместите лазерный зонд прямо над тканью/органом, который вас интересует. Расположите зонд максимально перпендикулярно и на расстоянии 1 см от ткани. Используйте линейку, чтобы точно измерить 1 см от поверхности органа. Настройте зонд, чтобы он был расположен ближе чем на 1 см, если сигнал нечистый. Однако убедитесь, что зонд никогда не касается ткани.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Датчик можно держать в руках, но рекомендуется использовать держатель/стойку, которую можно регулировать и которая остаётся стабильной. Расположите зонд максимально перпендикулярно и на расстоянии 1 см от ткани. Линейка могла точно измерять 1 см от поверхности органа. Зонд можно было настроить так, чтобы он располагался ближе чем на 1 см, если сигнал нечистый. Однако зонд никогда не должен касаться ткани.
    3. Убедитесь, что лазерное пятно находится на левой латеральной доле, как можно ближе к воротной вене.
    4. Убедитесь, что все выбранные библиотеки, настройки регрессии, целевая сигма, окно регрессии и режимы получения корректны и соответствуют требованиям.
      1. Убедитесь, что комната как можно темнее. Проверьте, нет ли на окне загрязнения, особенно крови. В случае загрязнения используйте безворсную, неабразивную салфетку с 70% изопропиловым спиртом для очистки кварцевого окна, затем тщательно высушите сухой салфеткой перед продолжением.
      2. В случае сильного загрязнения протирайте зонд как можно тщательнее, как описано выше. Затем откалибруйте устройство, поместив лазер в тёмный корпус с черной лентой и нажав кнопку Take Dark . Калибровка занимает около 5–10 минут. Независимо от загрязнения, калибруйте устройство раз в месяц, и оно будет отправлять автоматические напоминания.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Объяснения каждой метрики контроля качества, примеры таких метрик контроля качества и сырой спектральный сигнал, полученный из оптимальных и субоптимальных записей (Дополнительный файл 1, Рисунок 3, Дополнительный рисунок 3). Эти критерии контроля качества были оптимизированы для целых печеней из модели крыс. Любой новый протокол с использованием другой модели органа или животных должен уточнять и корректировать эти метрики соответствующим образом.
    5. На главной странице нажмите кнопку «Старт », чтобы начать собирать данные. В зависимости от выбранных настроек программа будет записывать до тех пор, пока не достигнет целевого значения ошибки (сигма) или 180 с. Сбор данных теперь завершен.
      1. Определить качество сигнала RRS по этим графикам и значениям, чтобы позволить корректировать положение зонда или условия измерения (см. рисунок 3). Если полученный сигнал RRS не соответствует этим критериям контроля качества, отрегулировать зонд, чтобы он был максимально перпендикулярен и примерно на 9 мм от поверхности до окна зонда.
    6. После завершения сбора данных/экспериментального протокола выбросьте всю печень/ткань в контейнер биологической опасности. Очистите любые системы или поверхности, которые контактировали с органом/тканью, 70% этанолом.
      1. Если вы работаете с перфузионной системой, используйте DI-воду, смешанную с ферментативным очищающим средством (7,8 мл, разбавленной в 1 л деионизированной [DI] воды), затем чистой DI-водой.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая запись сохраняется как отдельный аналитический файл под новым сессионным файлом. Результаты по 3RMR и силе сигнала митохондрий (r3RMR) отображаются в основном окне. Также можно отображать необработанный спектр. Другие метрики проверки качества, такие как остаточная сила сигнала и общая мощность сигнала, будут отображаться во вкладке Spectrum .
  4. Анализ данных:
    1. После завершения сбора данных нажмите папку «Обзор » внизу экрана, чтобы открыть экспериментальный файл и увидеть результаты.
    2. Или откройте текстовый файл с результатами. Выберите интересующий вас файл сессии. Откроется аналитический файл со всеми полученными измерениями. Каждый параметр и его сигма-значение имеют отдельный столбец. Например, значения 3RMR, получаемые каждую секунду, будут отображаться в столбце «3RMR», а сигма-значение — под «sigma_3RMR».
    3. Последняя строка каждого столбца содержит окончательные значения для каждого параметра этого сессионного файла. Используйте это значение для построения графика.
    4. Повторяйте шаги для каждого сессионного файла/каждой записи. Построить полученные значения по желанию.

figure-protocol-2
Рисунок 2: Настройка устройства RRS. Схема системы RRS. Зонд подключён оптоволоконным кабелем к системе RRS, которая содержит источник возбуждения лазера и спектрометр. Эта система затем подключается к любому ноутбуку, в котором есть приложение управления спектрометром для сбора и анализа данных. И компьютер, и спектрометр подключены к розетке. Измерения RRS следует проводить в темноте. Если комнату нельзя полностью защитить от света, система RRS оснащена чёрной крышкой с прямоугольным отверстием в центре, куда можно разместить лазерный зонд. Коробка покрывает образец/участок органа, с которого проводятся измерения RRS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-protocol-3
Рисунок 3: Примеры трасс и метрики контроля качества неоптимального качества и оптималных трассировок качества .Остаточный сигнал (шум) отмечается оранжевым скобкой, а митохондриальный — зелёной скобой. (A) Пример трассы из неоптимального рамановского сигнала. Остаточный сигнал слишком велик, чтобы отличить его от митохондриального сигнала. Спектральные пики неразличимы на протяжении всего измеряемого сигнала. (B) Пример трассы из оптимального раманского сигнала. Митохондриальный сигнал заметно больше и отличается от остаточного сигнала. Спектральные пики полученных измерений различимы. (C) метрики качества, полученные из каждого сигнала. В целом, общий сигнал, полученный при субоптимальном показании, меньше оптимального. В оптимальной записи измеряется больше митохондриального сигнала по сравнению с неоптимальной записью, при этом митохондриальный сигнал составляет соответственно 17% и 14% от общего числа сигнала. Сигнал измерялся с ошибкой 4,3% в оптимальном показании, в отличие от 18,5% при субоптимальном показании. Аналогично, необъяснимый остаточный сигнал составляет 11% от общего сигнала в субоптимальной записи, а в оптимальном — 3,6%. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

3. Оценка состояния митохондрий с помощью RRS

ПРИМЕЧАНИЕ: Технология резонансной рамановской спектроскопии (RRS) была использована для разработки метрики жизнеспособности митохондрий (3RMR), указывающей на жизнеспособность трансплантационных органов. Цель данного исследования — показать, как изменения в насыщении кислородом — и, следовательно, в клеточном дыхании — отражаются в тенденциях 3RMR по сравнению с традиционными биомаркерами повреждения, такими как лактат и K+. Здесь используется кислородный стресс-тест, при котором после 5 минут непрерывной перфузии кислородный перфузионный поток приостанавливается на 5 минут, а затем возобновляется на 5 минут. В течение всего испытания берутся измерения RRS, а также образцы перфусата на входе и выходе.

  1. Закупка печени:
    1. Успокоить животных в индукционной камере с использованием 3%–5% изофлурана. Фильтруйте лишний пар активированным углём.
    2. Проведите полную гепатэктомию самцам крыс Льюиса (150 г). Перевязать ветви портальной вены. Введите 50 U гепарина натрия через IVC. Во время операции канюлировать портальную вену катетером 16 G и промыть печень 50 мл физиологического раствора.
    3. Поместите приобретённую печень на лёд в чашку Петри с 30 мл раствора Университета Висконсина (UW).
  2. Установка субнормотермической машинной перфузии (SNMP) и резонансные измерения Рамана:
    1. Настройте устройство RRS, как было описано ранее. Установите Acellular-Rat Liver Protocol на программном обеспечении управления спектрометром, который автоматически устанавливает режим ширины на адаптивную ширину, среднюю длину на 180, а целевой сигму на 1,5. Он также выбирает 3RMR и флуоресценцию в качестве параметров измерения, а также только Mito в качестве регрессионной библиотеки. Установите режим получения на непрерывный режим.
    2. Настройте систему SNMP, как описано вдругом месте 18.
      1. Кратко, убедитесь, что перфузионная система состоит из камеры перфузии, перистальтического насоса, мембранного оксигенатора и пузырьковой ловушки.
      2. Доставка кислорода атмосферной смесью (95%O2 и 5%CO2); ДержитеpO 2 в диапазоне от 400 до 500 мм рт. ст. Контролируйте внутрипеченочное давление с помощью датчика давления и поддерживайте его в диапазоне от 3 до 5 мм рт. ст. Собирайте образцы через отборочные порты.
    3. После настройки программного обеспечения и перфузионной системы подключите канюлю, проходящую через фотоэлектрический канал, к входящей трубке перфузионного аппарата. Держите орган, перфузию и перфузию при комнатной температуре (21 °C) без использования водяной бани.
    4. Подайте перфузат в орган через канюлю в фотоэлектрической системе с помощью перистальтического насоса.
      1. Для приготовления перфусата смешайте 500 мл фенола-красного Williams' Medium с 5 г бычий сывороточный альбумин (BSA), 12 мг водорастворимого дексаметазона, 5 мл пенициллин-стрептомицина, 5 мл L-глутамина, 2,5 мкл инсулина и 1000 U гепарина.
      2. Перемешайте все компоненты на тарелке примерно 20 минут, или пока все компоненты не растворятся. Увеличить потоки перфузии до давления 3–5 мм рт. ст.
    5. Затем поместите источник лазера RRS в держатель зонда и расположите его на 1 см выше самой большой доли печени, как можно ближе к PV. Приостановите перфузионный поток через 5 минут (T 5) и возобновите его через 10 минут (T10). Проведите стресс-тест через 15 минут (Т15).
    6. Проводите измерения RRS на протяжении всего стресс-теста; Измерять приток и расход каждые 5 минут, начиная сT 0 (рисунок 4). Постройте значения 3RMR, а также уровни оттока K+ и уровень лактата для T0,T 5,T 10, T15 (n = 3) (Рисунок 5).
    7. Рассчитайте скорость потребления кислорода (OCR) при T0,T 5,T 10,T 15 , умножив парциальное давление кислорода (pO 2) на коэффициент растворимости кислорода в плазме (0,00314). Постройте OCR для T0,T 5,T 10,T 15 (рисунок 5).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Показаны образцовые резонансные рамановские спектральные следы при перфузии (T 5), ишемическом (T10) и реперфузии (T15) состояниях одной печени (Рисунок 6)

figure-protocol-4
Рисунок 4: Диаграмма, изображающая экспериментальный поток. Полная гепатэктомия была проведена самкам крыс Льюиса. Полученная печень проходила субнормотермическую перфузию и в течение первых 5 минут подавала кислородный перфусат. Перфузия поступает в печень через портальную вену и рециркулирует через перистальтический насос (перфузионный поток, изображённый синими стрелками). Кислородная перфузия была приостановлена на следующие 5 минут на T5 и возобновлена ещё на 5 минут при T10. 3RMR-измерения, проводимые на протяжении всего стресс-теста (изображаемые как лазер). Образцы перфусата были получены при T0, T5, T10 и T15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Свежие печени подвергались периодам ишемии и реперфузии с помощью кислородного стресс-теста. Затем изменения в реальном времени в 3RMR сравнивались на протяжении стресс-теста с уровнем потребления кислорода, оттоком лактата и калия, полученными в результате анализа перфусата приT 0,T 5,T 10,T 15. При здоровых условиях ожидается значение 3RMR от 10% до 30% (рисунок 5A). Как и ожидалось, значения 3RMR приT 0

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом исследовании выделяется неинвазивный, в реальном времени и высокочувствительный метод количественной оценки состояния митохондрий с помощью портативной системы резонансной рамановской спектроскопии, состоящей из лазера в компактном зонде, соединённого оптоволоконным кабелем с лазерным насосом. Этот метод использовал лазер диаметром 441 нм для возбуждения митохондрий, которые генерируют уникальные спектральные сигналы в зависимости от степени окисления. Таким образом, RRS способна ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют о конкурирующих интересах. У S.N.T и P.R. есть предварительные патентные заявки, относящиеся к данному исследованию. П.Р. является сотрудником и акционером Pendar Technologies. S.N.T. управляются MGH and Partners HealthCare в соответствии с их политикой по конфликту интересов. Конкурирующие интересы J.N.K. регулируются политикой BCH по вопросам конфликта интересов. В этом исследовании использовались следующие запатентованные технологии: US2020/0281474A1 Мониторинг клеточных энергетических систем in vivo с использованием рамановской спектроскопии (применение). Были поданы дополнительные патентные заявки на использование в офтальмологии, жизнеспособности тканей и оценке ожогов с использованием резонансной рамановской спектроскопии, где Р.Дж. также является изобретателем.

Благодарности

Эта работа была поддержана щедрым финансированием S.N.T. от Национальных институтов здравоохранения США (R01DK134590). Мы также с благодарностью признаем финансирование S.N.T от Национального института здравоохранения США (K99/R00 HL1431149; R01HL157803; R24OD034189), Национальный научный фонд (EEC 1941543), Фонд семьи Польски и Shriners Children's Boston (грант #BOS-85115). Кроме того, мы признаём финансирование R.J. грантом #LIFER23-263034 от Американской ассоциации по изучению заболеваний печени. Авторы выражают глубокую благодарность за экспертную поддержку от Патологического центра Гарвардской медицинской школы для изучения гистологии. Мы хотели бы выразить благодарность доктору Роберту Балабану и доктору Армелю Фемну из Национального института сердца, лёгких и крови NIH за их экспертизу в области митохондриальной энергетики и важную помощь в создании библиотеки RRS отдельных митохондриальных комплексов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
16 G Catheter BD Insyte Authoguard381454Используется для канюлирования воротной вены
Activated CharcoralVet Equip Vapor Guard Activated Charcoal931401Используется для фильтрации избыточных паров во время анестезии
BSA Sigma-Aldrich A7906Состав перфузата
Bubble Trap Radnoti130149
DexamethasoneSigma-AldrichD2915Состав перфузата
Glutamax Thermo Fisher Scientific35050061Состав перфузата
Masterflex L/S Precision Pump Tubing (24 G)Fisher Scientific 13-200-292Используется для пропускания перфузата через печень
Masterflex peristaltic pumps Cole Parmer, Vernon Hill, IL7528-30 Используется для пропускания перфузата через печень
Membrane Oxygenator Radnoti130144Используется для окисления перфузата. 
Penicillin-streptomycinSigma-AldrichP4458Состав перфузата
RAPIDPoint 500 Blood Gas SystemSiemens Healthineers41115805Для анализа газов крови
Resonance Raman System  Pendar TechnologiesA4D441Свяжитесь с Pendar Technologies для получения информации об этом продукте

Ссылки

  1. San-Millán I. The key role of mitochondrial function in health and disease. Antioxidants (Basel). 2023;12(4):782.
  2. Rossmann MP, et al. Mitochondrial function in development and disease. Dis Model Mech. 2021;14(6):dmm048912.
  3. Chen W, Zhao H, Li Y. Mitochondrial dynamics in health and disease: mechanisms and potential targets. Signal Transduct Target Ther. 2023;8:333.
  4. Acin-Perez R, et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. EMBO J. 2020;39(13):e104073.
  5. Sharma E, et al. Overview of methods that determine mitochondrial function in human disease. Metabolism. 2025;170:156300.
  6. Kowaltowski AJ, Abdulkader F. How and when to measure mitochondrial inner membrane potentials. Biophys J. 2024;123(24):4150-4157.
  7. Quinn KP, et al. Characterization of metabolic changes associated with the functional development of 3D engineered tissues by noninvasive, dynamic measurement of individual cell redox ratios. Biomaterials. 2012;33(21):5341-5348.
  8. Perry DA, et al. Responsive monitoring of mitochondrial redox states in heart muscle predicts impending cardiac arrest. Sci Transl Med. 2017;9(408):ean0117.
  9. Nguyen KT, et al. Mitochondrial hyperoxidation contributes to warm ischemia-reperfusion injury in rat and pig livers. Commun Med. 2026;6:307.
  10. de Vries RJ, et al. Noninvasive quantification of the mitochondrial redox state in livers during machine perfusion. PLoS One. 2021;16(10):e0258833.
  11. Ajenu EO, et al. Advancing assessment methods for human cardiac grafts during normothermic machine perfusion. Transplantation. 2025;110(2):e374-e384.
  12. Thomas AR, et al. Resonance Raman spectroscopy detects ischemia in experimental coarctation of the aorta in a rodent model. J Cardiovasc Transl Res. 2025;18:566-573.
  13. Cakir B, et al. In vivo noninvasive mitochondrial redox assessment of the optic nerve head to predict disease. PNAS Nexus. 2023;2(5):pgad148.
  14. Jain R, et al. Real-time monitoring of mitochondrial oxygenation during machine perfusion using resonance Raman spectroscopy predicts organ function. Sci Rep. 2024;14:7328.
  15. Covian R, Edwards LO, Balaban RS. Effect of the mitochondrial membrane potential on the absorbance of the reduced form of cytochrome c oxidase. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 2024;1865(3):149048.
  16. Ljungdahl PO, Pennoyer JD, Robertson DE, Trumpower BL. Purification of highly active cytochrome bc1 complexes from phylogenetically diverse species by a single chromatographic procedure. Biochim Biophys Acta. 1987;891(3):227-241.
  17. Covian R, Chess D, Balaban RS. Continuous monitoring of enzymatic activity within native electrophoresis gels: application to mitochondrial oxidative phosphorylation complexes. Anal Biochem. 2012;431(1):30-39.
  18. Haque O, et al. Twenty-four hour ex-vivo normothermic machine perfusion in rat livers. Technology. 2020;8(1-2):27-36.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

234234

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.