Неинвазивная оценка функции митохондрий в реальном времени с использованием резонансной рамановской спектроскопии

Краткое содержание

Мы представляем неинвазивный, в реальном времени метод мониторинга здоровья митохондрий с использованием резонансной рамановской спектроскопии (RRS). Мы использовали RRS для количественной оценки окислительно-окислительных состояний митохондрий и разработали метрику состояния митохондрий — резонансное раманское соотношение митохондрий (3RMR), которая показывает более быструю реакцию на изменения оксигенации по сравнению с традиционными анализами крови и газов.

Аннотация

Хотя митохондрии играют центральную роль в патогенезе и прогрессировании заболевания, механистическое понимание динамики здоровья митохондрий остаётся дорогостоящим и недоступным. Для устранения этого пробела в исследовании используется резонансная рамановская спектроскопия (RRS) для оценки функции митохондрий с помощью портативной системы, которая обеспечивает в реальном времени, неинвазивные и количественные измерения окислительно-окислённых состояний митохондриального цитохрома в печени крыс. В этом протоколе мы демонстрируем применение этой технологии, включая настройку, сбор данных и обработку данных. В данном исследовании представлен эксперимент с подтверждением концепции, который подчёркивает способность RRS измерять изменения в режиме окислительно-окислительного стана митохондрий в реальном времени — а значит, и функции митохондрий. Кратковременно устройство RRS было подключено к лазерному насосу, а также к компьютеру сбора данных и размещалось на расстоянии 1 см от печени крысы.  Параметры получения были выбраны в соответствии с протоколом печени крыс; Окислительно-окислённые состояния измерялись в оксигенированных и ишемических условиях с помощью кислородного стресс-теста. Изменения в окислительно-восстановительном состоянии митохондрий отслеживались на протяжении всего теста на кислород.

Введение

Митохондрии играют ключевую роль в работе клетки и гомеостазе. Митохондрии являются основными драйверами клеточного метаболизма, регулируя образование АТФ посредством окислительного фосфорилирования. Они также служат сигнальными органеллами, определяющими судьбу клетки, регулируя апоптотические пути, а также ROS и Ca^{+2 сигналы 1}. Таким образом, дисфункция митохондрий может привести к различным нейродегенеративным, мышечным и сердечно-сосудистым^{заболеваниям 2,3}. Несмотря на ключевую роль митохондрий в прогрессировании заболевания, оценка функции митохондрий может быть инвазивной, дорогостоящей и ограниченной.

Ключевые показатели функции митохондрий, такие как скорость потребления кислорода, окисляющее фосфорилирование и активность различных комплексов в цепи переноса электронов (ETC), измеряются с помощью респирометрии. ETC состоит из четырёх комплексов (I–IV), встроенных во внутреннюю митохондриальную мембрану (IMM). Эти комплексы с помощью других коферментов передают электроны из восстановленных субстратов, таких как NADH и FADH2, к конечному акцептору электронов_O2, который затем восстанавливается до воды. Большинство современных респирометрических анализов, таких как Seahorse и Orobros O2k, требуют обработки тканей, что ограничивает их применение в трансляционных^{исследованиях 4,5}. Измерение мембранного потенциала митохондрий (MMP) — это ещё один метод оценки дисфункции митохондрий, который использует катионные липофильные флуорофоры, такие как JC-1, а также микроскопическую визуализацию, где связанные (здоровые) и несвязанные (повреждённые) митохондрии флуоресцируют с разными длинами^{волн 6}. Однако эти анализы могут иметь низкую^{чувствительность 5}. Сам краситель также может обладать высокой цитотоксичностью при^{высоких концентрациях 5}. Наконец, подобно измерениям респирометрии, эта техника требует обработки тканей. Методы на основе спектроскопии в последнее время используются как неинвазивные методы оценки состояния митохондрий. Например, фосфорная магнитно-резонансная спектроскопия (P-MRS), метод, оценивающий клеточный метаболизм путём измерения концентраций фосфорсодержащих метаболитов, используется для характеристики инженерной адипогенной ткани, подвергающейся^{дифференцировке 7}. Однако эта техника также требует специализированного оборудования и обучения.

Наша группа недавно продемонстрировала в реальном времени, неинвазивную и очень специфическую технику измерения состояния митохондриального редокса как маркера жизнеспособности органов с помощью резонансной рамановской спектроскопии (RRS). RRS использует неупругое рассеяние фотонов для количественной оценки редокс-состояний митохондриальных цитохромов. Кольца порфирина в гемных группах молекул, таких как митохондриальные цитохромы, гемоглобин и миоглобин, образуют характерный рамановский спектр в зависимости от их степени окисления при возбуждении лазером с длиной^волны 441 нм. Хотя система RRS использует длину волны 441 нм, могут использоваться лазеры с длинами волн 420 нм и 405 нм, каждый из которых предпочтительно усиливает отдельный цитохромный комплекс. Спектр, полученный из неизвестного интересующего образца, сверяется с заранее зафиксированными библиотеками полностью окисленных или восстановленных целостных митохондрий, что даёт соотношение редуцированных к полным митохондриям или среднему редокс-состоянию цитохромов in situ ETC. Это соотношение определяется как резонансное раманское редуцированное митохондриальное соотношение (3RMR).

Существует 3 различных расчёта/типа 3RMR: митохондриальный 3RMR (мито-3RMR), комплекс III 3RMR (cIII-3RMR) и комплекс IV 3RMR (cIV-3RMR). Каждый из этих индексов вычисляется за счёт доли сведённой к общему числу данной компоненты. Например, 3RMR cIII — это отношение редуцированного cIII к общему числу cIII в ткани (cIII-R/(cIII-O+CIII-R). Та же схема применяется и к cIV. Таким образом, 3RMR-cIII будет относиться к отношению редуцированного cIII к общему объёму cIII, а 3RMR-cIV — к отношению уменьшенного cIV к общему объёму cIV. С помощью регрессионного анализа либо вычисляются митохондриальные редокс-состояния (мито-3RMR) с использованием спектральных библиотек целостных митохондрий, либо отдельные комплексные окислительно-окислительные состояния (cIII-3RMR и cIV-3RMR) с использованием спектральных библиотек cIII и cIV. Недавняя^{публикация 9} показала, что мито-3RMR является репрезентативным для взвешенных средних для cIII и cIV редокс-состояний (или cIII-3RMR и cIV-3RMR). Важно отметить, что cI и cII не являются раман-активными и не резонансно усилены через длину волны 441 нм. Следовательно, они не вычисляются при вычислении мито-3RMR.

Используя такие типы 3RMR, мы определяем оптимальный диапазон 3RMR. В «здоровых» органах митохондрии целы и имеют достаточное количество кислорода. В отличие от этого, повреждённые органы могут иметь недостаточную доставку или использование кислорода, что приводит к накоплению электронов в комплексах ETC. Накопление электронов вызывает «редуктивное напряжение», смещая митохондрии из окисленного в редукционированное состояние и увеличивая значения 3RMR. Несколько исследований ^8,9,10,11,12, охватывающих сердца и печень в моделях грызунов и свиней, начали проливать свет на оптимальный «здоровый» диапазон для 3RMR, который предполагается в диапазоне от 10 до 30. Например, Перри и др. подвергали сердца млекопитающих гипоксии, где 3RMR в 30% обеспечивал оптимальный баланс чувствительности и специфичности для обнаружения гипоксической^{ткани 8}. Эта тенденция была дополнительно подтверждена в дополнительных исследованиях с сердечной^{тканью 11,12} и печеночных^{трансплантатов 10}. Кроме того, Нюген и ^др.9 продемонстрировали, что значения 3RMR падают до очень низких (окисленных) значений для тканей, в которых метаболизм остановился: уровень 3RMR (7,667 ±± 4,926) у нетрансплантируемых теплоишемических печеней после 3 часа перфузии нормотермической машины, по сравнению с 3RMR выше 10 (~12–15) для свежей и трансплантируемой теплоишемической^{печени 9}.

Помимо этих демонстраций того, как 3RMR может измерять жизнеспособность тканей, чувствительность, специфичность и простота использования RRS делают его очень применимым во многих других областях, где затронуты клеточный метаболизм и функция митохондрий. В предыдущих исследованиях RRS использовался для выявления макулярной дегенерации и глаукомы у мышей путём оценки метаболической активности немиелинизированных аксонов ганглиозных клеток сетчатки на головке зрительного^{нерва 13}. Кроме того, он использовался для выявления коарктации аорты (CoA) в модели врождённого сердечного заболевания у крыс — диагноз, который часто упускается при кардиологических скринингах^{новорождённых 12}. Эта технология была использована для понимания функции и жизнеспособности органов в различных экспериментальных условиях, важных в области трансплантации органов, включая исследования, оценивающие жизнеспособность органов при перфузии ex vivo ^{машины 10,11}, оценку реоксигенации после статического холодного^{хранения 14} или смягчение реперфузионных повреждений теплоишемической^{печени 9}.

В данной статье направлен на то, чтобы утвердить RRS как чувствительный инструмент в реальном времени для оценки состояния митохондрий. Целая печень из модели крыс подвергалась различным уровням ишемии и реперфузии кислорода в рамках стресс-теста для оценки митохондриального ответа. В этом тесте на кислород свежие печени подвергаются 5 минут начальной перфузии, 5 минут ишемии и 5 минут реперфузии. На протяжении всего стресс-теста проводились измерения 3RMR, а также лактат, K+, парциального давления кислорода (pO2). С помощью 3RMR наблюдалась более высокая реакция на изменения в оксигенации по сравнению с традиционными анализами газов крови. В этих экспериментах использование RRS подчёркивается не только для механистических исследований, но и как диагностический метод, а также как терапевтический испытательный стенд. Таким образом, общий протокол может быть полезен для различных исследователей, работающих с митохондриями. В целом, RRS, благодаря своему неинвазивному, актуальному и высокоспецифическому характеру, может существенно повлиять на клеточный метаболизм.

Протокол

Все животные, участвовавшие в экспериментах, содержались в соответствии с руководящими принципами Национального исследовательского совета и были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) в Массачусетской общей больнице (Бостон, Массачусетс, США).

1. Настройка и использование RRS

1. Описание устройства:
   ПРИМЕЧАНИЕ: Портативная система RRS (Pendar Technologies; продукт предназначен только для исследовательских целей) использует лазер диаметром 441 нм благодаря резонансному усилению раманского спектра митохондриальных цитохромов с этой длиной волны. Лазер работает от 4 мВт до 8 мВт.
   1. Подключите лазерный источник возбуждения к специально изготовленному зонду с помощью оптоволоконного кабеля. Зонд направляет лазерное пятно диаметром 2 мм на ткань, а также собирает излучаемый спектр. Далее спектр проходит через полосный фильтр и собирается массивом устройств, связанных с зарядом (CCD). Спектр собирается каждую секунду в течение 180-х секунд и усредняется для создания сырого, сниженного по уровня шума спектра для анализа.
   2. Программное обеспечение сравнивает полученный спектр с заранее измеренными спектральными библиотеками с помощью регрессионного анализа.
2. Процедура для библиотек предварительной записи
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов, представленных в этой статье, были созданы и использованы восстановленные и окисленные формы библиотек митохондрий, комплекса III, комплекса IV, гемоглобина и миоглобина. Сигналы RRS всех библиотек принимались в чёрном ящике при комнатной температуре (21 °C). Эти библиотечные файлы предоставляются отдельно с программным обеспечением для анализа. Однако, в зависимости от интересующей ткани и наличия других раман-активных молекул можно создать и другие библиотеки, соответствующим образом адаптировав следующий протокол. Необработанные спектры RRS библиотек гемоглобина, миоглобина и окисленного/восстановленного комплекса III/IV представлены в Дополнительный рисунок 1.
   1. Библиотеки гемоглобина (дополнительный рисунок 1C):
      1. Собирайте свежую кровь грызунов с помощью эксклюзии крови животных. Насыщайте собранную кровь кислородом с помощью 100% кислорода или деоксигенируйте с помощью 100% азота в стеклянном кювете, добавляя натрий дитионат.
      2. Измерьте RRS в каждом состоянии через стеклянную стенку кюветы в течение 10 минут, при этом датчик RRS расположен в 9 мм от стеклянного кювета.
      3. Используйте спектральные пики на 1356 ^см-1 для подтверждения деоксигенированного состояния, а пики на 1376 ^см-1 — для подтверждения оксигенированного состояния.
   2. Восстановленные/окисленные митохондриальные библиотеки (рисунок 1)
      1. Изолировать митохондрии из гомогенизированных и очищенных сердец грызунов в стеклянном кюветте. Разместите рамановский зонд на расстоянии 9 мм от стеклянной кюветы и измерьте спектры этих митохондрий через стеклянную стенку.
      2. Создайте полностью окисленные условия, обеспечивая 100% поток кислорода в митохондрии. Проверьте окислённое состояние по отсутствию сниженного пика RR на уровне 1357 ^см-1.
      3. Создайте полностью восстановленные условия, подвергая митохондрии воздействию 100% азота с небольшим количеством сероводорода. Проверьте сниженные условия за счёт отсутствия окисленного пика маркера RR на уровне 1371 ^см-1.
   3. Окисленный/восстановленный комплекс III/IV (дополнительный рисунок 1A,B):
      1. Изолировать комплекс III и IV, как описано в^{других местах} 9,15,16,17. Кратко, используйте стандартный образец изолированных митохондрий (соответствующий 200 наномолям цитохрома а) в качестве исходного материала.
      2. Разведите митохондрии до 10 нмоль цитохрома A/mL в ледяном буфере C (50 мМ Tris, 1 мM_{MgSO 4,} pH 8,45). Затем добавьте по 10% с n-β-D-додецил-мальтозидом (ДМ) капля за каплями до конечной концентрации 1%, аккуратно смешивая на льду.
      3. Центрифугуйте экстракт при 40 000 × г в течение 40 минут при 4 °C. Нанесите супернатант на стеклянную колонку диаметром 2,5 см × 20 см, ранее упакованную обменной смолой, уравновешенной 5 колонками буфера C (содержащего 0,02% с ДМ).
      4. После промывки буфером C двумя столбцами элют митохондриальные комплексы, применяя линейный градиент NaCl 0–400 мМ в том же буфере, и собирают элюту в фракции по 4 мл.
      5. Зелёные дроби, содержащие комплекс IV, элююировались близко к середине градиента (~180 мл NaCl), перед красноватыми фракциями, содержащими комплекс III. Концентрируйте объединённые фракции, содержащие каждый комплекс, до 20–30 нмоль цитохрома a/mL.
      6. После выделения отдельных комплексов каждый подвергается окисляющему и восстанавливающему состоянию. Уменьшить образец комплекса III объемом 11 мм в трисбуфере с использованием 2 мл аскорбата (1 м) для уменьшения цитохрома c1 и 2 мл HS (гидросульфита) для полного восстановления цитохромов b_{, L} и b_H.
      7. Уменьшить образец комплекса IV объемом 18,67 мМ в Tris-буфере в несколько этапов, поскольку комплекс IV проходит многоступенчатый каталитический процесс окисления. Для полного сокращения комплекса IV добавьте два 2 мл H_2O2 (10 мМ), затем 2 мл HS.
      8. Собирайте библиотечные спектры после каждого сложения, чтобы фиксировать каждый этап цикла. Добавьте полностью окисленные и восстановленные спектры в итоговую справочную библиотеку для представления устойчивых состояний комплекса IV.
      9. Подготовьте все образцы в стеклянном флаконе объёмом 1 мл, держите их в фиксированном положении на расстоянии 9 мм от линзы зонда и заключите в чёрный ящик для предотвращения светового загрязнения. Соберите спектры RRS на 600 с для каждого комплекса и окислённого состояния.
      10. Подтвердить чистоту изолированных cIII и cIV, как описано^{ранее, 17}, и подтвердить адекватность изолированных cIII и cIV спектральных библиотек для объяснения полных митохондриальных спектров, как описано в недавней статье⁹.
   4. Библиотеки миоглобина (дополнительный рисунок 1D):
      1. Используя аналогичные потоки кислорода и азота (с растворённым натриевым дитионитом), насыщение экстракта миоглобина миокарда варьируется в диапазоне от 0% до 100%. Проверьте рамановские спектры с помощью маркерных пиков на 1355 ^см-1 и 1376 ^см-1.

ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство спектральных компонентов, описанных выше, таких как гемоглобин или окисленные/восстановленные митохондрии, являются молекулами, содержащими гем, и возбуждаются одной и той же длиной волны. Эта система RRS избегает перекрытия сигналов, создавая регрессионную библиотеку для каждой молекулы на основе её уникального спектрального сигнала. Полученные рассеянные спектры запускаются через регрессионный алгоритм против выбранных библиотек. Регрессионный алгоритм даёт коэффициент для каждого библиотечного спектра, который представляет собой наилучшую оценку его относительного вклада в записанный спектр и, следовательно, относительной концентрации в ткани. Поскольку алгоритм использует наилучшее соответствие в диапазоне волновых чисел, небольшие различия в положении или интенсивности спектральных пиков различных компонентов библиотеки позволяют регрессии различать даже близкородственные хромофори. С помощью алгоритма регрессии и спектральных библиотек система RRS может разбить общий рассеянный сигнал на различные компоненты в зависимости от их уникальных спектральных пиков, избегая перекрытия сигналов у молекул, содержащих гем. Для демонстрации взаимосвязи между гемоглобином и митохондриями прилагается дополнительный рисунок 2 , на котором представлены изображения спектров, взятых при перфузии печени, разбитых на измеренный сигнал, линию наилучшего соответствия и необъяснимый остаточный эффект, возникающий из-за различий в отдельных спектральных пиках. В панели A выбираются библиотеки регрессии ренормированного и окисленного гемоглобина, а также восстановленных и окисленных митохондрий. Линия наилучшего соответствия, курируемая через библиотеки и регрессионный анализ, аккуратно пересекается с измеренным сигналом, и остаётся мало необъясненных остаточных наследств. В панели B выбираются только окисленные и восстановленные библиотеки митохондрий. Поскольку существует большая необъяснимая остаточная структура, спектральный пик митохондрии смещён на несколько волновых чисел по сравнению с пиком гемоглобина, который не был включён в регрессионный анализ. Кроме того, в дополнительных рисунках Нгуен и ^др.9 авторы объясняют взаимосвязь между митохондриями и отдельными комплексами (cIII и cIV), а также взаимосвязь между отдельными^{комплексами 16}, при которых комплекс III демонстрирует более резкие, низкочастотные пики, тогда как комплекс IV — более широкие, смещающиеся вверх полосы. Кроме того, авторы показывают, что редуцированные библиотеки комплекса III и IV полностью объясняют измеренный спектр восстановленных целых митохондрий, что приводит к минимальному необъяснимому остаточному состоянию.

Рисунок 1: Спектральные библиотеки полностью окисленных и восстановленных митохондрий. Спектры библиотеки RRS были получены после того, как изолированные митохондрии получили (A) 100% кислорода или 100% азота (B) для достижения соответственно окислённого и восстановленного состояний. Эти состояния подтверждались наличием пиков маркеров RR (C), насыщенных кислородом и сниженных (D) маркеров. Сдвиг этих пиков соответствует изменениям молекулярных колебательных мод в присутствии кислорода. Интенсивность каждого пика нормализуется до 1 произвольной единицы интенсивности (AU), поскольку усиление редуцированного состояния становится сильнее при использовании этой длины волны возбуждения 441 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

2. Сбор данных с использованием RRS

1. Настройка устройства:
   1. Подключите блок спектрометра (размещённый в компактной коробке) к блоку питания постоянного тока (DC) и к адаптеру питания с помощью предоставленных кабелей. Спектрометрический блок имеет одну круглую вилку с выравнивающими вмятинами.
   2. Выровняйте вмятины на круглой вилке с отверстиями кабеля, который подключается к адаптеру питания. Перед подключением портов чистка не требуется (рисунок 2).
   3. Подключите компьютер, выполняющий анализ, к тому же адаптеру питания, который подключает спектрометр и блок питания, используя предоставленные кабели.
   4. Поместите лазерный зонд в держатель зонда. Скорректируйте положение этого зонда в начале эксперимента.
   5. Откройте программное обеспечение управления спектрометром (Cellular Energetics Software).
2. Настройка программного обеспечения:
   ПРИМЕЧАНИЕ: В системе предоставляются файлы настроек и регрессионные библиотеки для различных типов тканей. Эти файлы содержат информацию о том, какие библиотеки система RRS должна включать в регрессию, сколько спектров включено в окно регрессии и другие параметры, такие как мощность лазера. Настройки по умолчанию можно изменить, а для будущих экспериментов сохранить новый файл настроек. Скриншоты программного обеспечения, описанные ниже, представлены на дополнительном рисунке 3.
   1. При открытии программного обеспечения управления спектрометром появляется график, показывающий процент 3RMR, насыщение кислородом (_{StO 2}) и насыщение миоглобина. Именно на этом экране эти метрики будут отображаться, если они выбраны, в реальном времени на протяжении всех измерений. Нажмите на вкладку «Настройки » в левом нижнем углу страницы.
   2. Во вкладке «Информация » введите информацию о сессии в разделе «Название сессии» и все необходимые детали во вкладке «Описание сессии ».
   3. Существует два режима сбора данных. Используйте режим точечной проверки для накопления спектров до достижения заданных метрик качества (например, целевого сигма или регрессионного окна/количества спектров), затем прекратите запись. Используйте непрерывный режим для записи спектров до нажатия кнопки остановки. В обоих режимах все данные, как результаты 3RMR, так и отдельные спектры, сохраняются автоматически. В этом эксперименте используется непрерывный режим.
   4. Когда вся информация о сессии введена, нажмите на вкладку «Система ».
   5. В разделе «Файл настроек» выберите подходящий для проекта протокол (для бесклеточных перфузий печени крыс выберите протокол Rat Liver Acellular ). Это автоматически регулирует тип измерения, среднюю длину измерения (окно регрессии), а также целевую сигму.
      1. Чтобы создать новый файл настроек, настройте любой из перечисленных выше компонентов, затем нажмите кнопку «Сохранить ». Это должно сохранить эти параметры в отдельном файле настроек, который затем можно импортировать в систему.
      2. Чтобы импортировать новый файл настроек, нажмите на выпадающее меню рядом с Default (Mod) и выберите Import New Settings File. Нажмите на новый файл настроек для импорта.
   6. В разделе регрессионных библиотек выберите и подтвердите комбинацию библиотек для сбора и анализа данных. Для этого эксперимента были выбраны библиотеки для восстановленных и окисленных митохондрий [только Мито]. Другие пользователи могут выбрать библиотеки, которые также включают гемоглобин, миоглобин или другие комплексы из раздела Расширенная библиотека.
   7. Выберите и подтвердите предпочтительный режим ширины окна.
      1. Режим адаптивной ширины: Используйте режим адаптивной ширины для добавления отдельных спектров к усредненному спектру до достижения максимальной цели сигма. Если сигма-цель не достигнута, запись прекратится, когда достигнет верхнего предела установленного регрессионного окна (то есть максимального количества спектров, которые ей было приказано записать). Результаты измерений будут отображаться на экране после достижения минимальной цели сигма.
      2. Режим фиксированной ширины: используйте режим фиксированной ширины для добавления отдельных спектров к усредненному спектру до включения целевого количества спектров (установленного ниже средней длины).
   8. После завершения настроек системы нажмите на вкладку «Плот».
   9. В разделе «Основная серия» выберите компоненты, которые будут отображаться и отображаться на экране во время измерений.
   10. Убедитесь, что все выбранные компоненты измерения соответствуют интересуемому протоколу.
3. Сбор данных:
   ПРИМЕЧАНИЕ: Измерения Рамана следует делать в тёмном пространстве. Перед началом сбора данных убедитесь, что рабочее пространство максимально защищено от света. Если комнату нельзя полностью защитить от света, система RRS оснащается чёрной крышкой с прямоугольным отверстием в центре (показано в Рисунок 2), через который можно разместить лазерный зонд. Коробка может покрывать образец/участок органа, с которого проводятся измерения RRS. При работе с лазером RRS избегайте прямого или длительного воздействия глаз. Не направляйте лазер прямо в глаз или на отражающие поверхности. Активируйте лазер только если он расположен непосредственно на интересующей ткани. Лазер RRS — это лазер класса 3R при использовании на мощности 4 мВт и класса 3B при 10 мВт. Лазер безопасен для контакта с тканями.
   1. Выберите подходящие заранее сохранённые настройки, параметры записи и файлы библиотеки.
   2. Разместите лазерный зонд прямо над тканью/органом, который вас интересует. Расположите зонд максимально перпендикулярно и на расстоянии 1 см от ткани. Используйте линейку, чтобы точно измерить 1 см от поверхности органа. Настройте зонд, чтобы он был расположен ближе чем на 1 см, если сигнал нечистый. Однако убедитесь, что зонд никогда не касается ткани.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Датчик можно держать в руках, но рекомендуется использовать держатель/стойку, которую можно регулировать и которая остаётся стабильной. Расположите зонд максимально перпендикулярно и на расстоянии 1 см от ткани. Линейка могла точно измерять 1 см от поверхности органа. Зонд можно было настроить так, чтобы он располагался ближе чем на 1 см, если сигнал нечистый. Однако зонд никогда не должен касаться ткани.
   3. Убедитесь, что лазерное пятно находится на левой латеральной доле, как можно ближе к воротной вене.
   4. Убедитесь, что все выбранные библиотеки, настройки регрессии, целевая сигма, окно регрессии и режимы получения корректны и соответствуют требованиям.
      1. Убедитесь, что комната как можно темнее. Проверьте, нет ли на окне загрязнения, особенно крови. В случае загрязнения используйте безворсную, неабразивную салфетку с 70% изопропиловым спиртом для очистки кварцевого окна, затем тщательно высушите сухой салфеткой перед продолжением.
      2. В случае сильного загрязнения протирайте зонд как можно тщательнее, как описано выше. Затем откалибруйте устройство, поместив лазер в тёмный корпус с черной лентой и нажав кнопку Take Dark . Калибровка занимает около 5–10 минут. Независимо от загрязнения, калибруйте устройство раз в месяц, и оно будет отправлять автоматические напоминания.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Объяснения каждой метрики контроля качества, примеры таких метрик контроля качества и сырой спектральный сигнал, полученный из оптимальных и субоптимальных записей (Дополнительный файл 1, Рисунок 3, Дополнительный рисунок 3). Эти критерии контроля качества были оптимизированы для целых печеней из модели крыс. Любой новый протокол с использованием другой модели органа или животных должен уточнять и корректировать эти метрики соответствующим образом.
   5. На главной странице нажмите кнопку «Старт », чтобы начать собирать данные. В зависимости от выбранных настроек программа будет записывать до тех пор, пока не достигнет целевого значения ошибки (сигма) или 180 с. Сбор данных теперь завершен.
      1. Определить качество сигнала RRS по этим графикам и значениям, чтобы позволить корректировать положение зонда или условия измерения (см. рисунок 3). Если полученный сигнал RRS не соответствует этим критериям контроля качества, отрегулировать зонд, чтобы он был максимально перпендикулярен и примерно на 9 мм от поверхности до окна зонда.
   6. После завершения сбора данных/экспериментального протокола выбросьте всю печень/ткань в контейнер биологической опасности. Очистите любые системы или поверхности, которые контактировали с органом/тканью, 70% этанолом.
      1. Если вы работаете с перфузионной системой, используйте DI-воду, смешанную с ферментативным очищающим средством (7,8 мл, разбавленной в 1 л деионизированной [DI] воды), затем чистой DI-водой.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая запись сохраняется как отдельный аналитический файл под новым сессионным файлом. Результаты по 3RMR и силе сигнала митохондрий (r3RMR) отображаются в основном окне. Также можно отображать необработанный спектр. Другие метрики проверки качества, такие как остаточная сила сигнала и общая мощность сигнала, будут отображаться во вкладке Spectrum .
4. Анализ данных:
   1. После завершения сбора данных нажмите папку «Обзор » внизу экрана, чтобы открыть экспериментальный файл и увидеть результаты.
   2. Или откройте текстовый файл с результатами. Выберите интересующий вас файл сессии. Откроется аналитический файл со всеми полученными измерениями. Каждый параметр и его сигма-значение имеют отдельный столбец. Например, значения 3RMR, получаемые каждую секунду, будут отображаться в столбце «3RMR», а сигма-значение — под «sigma_3RMR».
   3. Последняя строка каждого столбца содержит окончательные значения для каждого параметра этого сессионного файла. Используйте это значение для построения графика.
   4. Повторяйте шаги для каждого сессионного файла/каждой записи. Построить полученные значения по желанию.

Рисунок 2: Настройка устройства RRS. Схема системы RRS. Зонд подключён оптоволоконным кабелем к системе RRS, которая содержит источник возбуждения лазера и спектрометр. Эта система затем подключается к любому ноутбуку, в котором есть приложение управления спектрометром для сбора и анализа данных. И компьютер, и спектрометр подключены к розетке. Измерения RRS следует проводить в темноте. Если комнату нельзя полностью защитить от света, система RRS оснащена чёрной крышкой с прямоугольным отверстием в центре, куда можно разместить лазерный зонд. Коробка покрывает образец/участок органа, с которого проводятся измерения RRS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Примеры трасс и метрики контроля качества неоптимального качества и оптималных трассировок качества .Остаточный сигнал (шум) отмечается оранжевым скобкой, а митохондриальный — зелёной скобой. (A) Пример трассы из неоптимального рамановского сигнала. Остаточный сигнал слишком велик, чтобы отличить его от митохондриального сигнала. Спектральные пики неразличимы на протяжении всего измеряемого сигнала. (B) Пример трассы из оптимального раманского сигнала. Митохондриальный сигнал заметно больше и отличается от остаточного сигнала. Спектральные пики полученных измерений различимы. (C) метрики качества, полученные из каждого сигнала. В целом, общий сигнал, полученный при субоптимальном показании, меньше оптимального. В оптимальной записи измеряется больше митохондриального сигнала по сравнению с неоптимальной записью, при этом митохондриальный сигнал составляет соответственно 17% и 14% от общего числа сигнала. Сигнал измерялся с ошибкой 4,3% в оптимальном показании, в отличие от 18,5% при субоптимальном показании. Аналогично, необъяснимый остаточный сигнал составляет 11% от общего сигнала в субоптимальной записи, а в оптимальном — 3,6%. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

3. Оценка состояния митохондрий с помощью RRS

ПРИМЕЧАНИЕ: Технология резонансной рамановской спектроскопии (RRS) была использована для разработки метрики жизнеспособности митохондрий (3RMR), указывающей на жизнеспособность трансплантационных органов. Цель данного исследования — показать, как изменения в насыщении кислородом — и, следовательно, в клеточном дыхании — отражаются в тенденциях 3RMR по сравнению с традиционными биомаркерами повреждения, такими как лактат и K⁺. Здесь используется кислородный стресс-тест, при котором после 5 минут непрерывной перфузии кислородный перфузионный поток приостанавливается на 5 минут, а затем возобновляется на 5 минут. В течение всего испытания берутся измерения RRS, а также образцы перфусата на входе и выходе.

1. Закупка печени:
   1. Успокоить животных в индукционной камере с использованием 3%–5% изофлурана. Фильтруйте лишний пар активированным углём.
   2. Проведите полную гепатэктомию самцам крыс Льюиса (150 г). Перевязать ветви портальной вены. Введите 50 U гепарина натрия через IVC. Во время операции канюлировать портальную вену катетером 16 G и промыть печень 50 мл физиологического раствора.
   3. Поместите приобретённую печень на лёд в чашку Петри с 30 мл раствора Университета Висконсина (UW).
2. Установка субнормотермической машинной перфузии (SNMP) и резонансные измерения Рамана:
   1. Настройте устройство RRS, как было описано ранее. Установите Acellular-Rat Liver Protocol на программном обеспечении управления спектрометром, который автоматически устанавливает режим ширины на адаптивную ширину, среднюю длину на 180, а целевой сигму на 1,5. Он также выбирает 3RMR и флуоресценцию в качестве параметров измерения, а также только Mito в качестве регрессионной библиотеки. Установите режим получения на непрерывный режим.
   2. Настройте систему SNMP, как описано в^{другом месте 18}.
      1. Кратко, убедитесь, что перфузионная система состоит из камеры перфузии, перистальтического насоса, мембранного оксигенатора и пузырьковой ловушки.
      2. Доставка кислорода атмосферной смесью (95%_O2 и 5%_CO2); Держите_{pO 2} в диапазоне от 400 до 500 мм рт. ст. Контролируйте внутрипеченочное давление с помощью датчика давления и поддерживайте его в диапазоне от 3 до 5 мм рт. ст. Собирайте образцы через отборочные порты.
   3. После настройки программного обеспечения и перфузионной системы подключите канюлю, проходящую через фотоэлектрический канал, к входящей трубке перфузионного аппарата. Держите орган, перфузию и перфузию при комнатной температуре (21 °C) без использования водяной бани.
   4. Подайте перфузат в орган через канюлю в фотоэлектрической системе с помощью перистальтического насоса.
      1. Для приготовления перфусата смешайте 500 мл фенола-красного Williams' Medium с 5 г бычий сывороточный альбумин (BSA), 12 мг водорастворимого дексаметазона, 5 мл пенициллин-стрептомицина, 5 мл L-глутамина, 2,5 мкл инсулина и 1000 U гепарина.
      2. Перемешайте все компоненты на тарелке примерно 20 минут, или пока все компоненты не растворятся. Увеличить потоки перфузии до давления 3–5 мм рт. ст.
   5. Затем поместите источник лазера RRS в держатель зонда и расположите его на 1 см выше самой большой доли печени, как можно ближе к PV. Приостановите перфузионный поток через 5 минут (_{T 5}) и возобновите его через 10 минут (T₁₀). Проведите стресс-тест через 15 минут (Т₁₅).
   6. Проводите измерения RRS на протяжении всего стресс-теста; Измерять приток и расход каждые 5 минут, начиная с_{T 0} (рисунок 4). Постройте значения 3RMR, а также уровни оттока K⁺ и уровень лактата для T₀,_{T 5},_{T 10}, T₁₅ (n = 3) (Рисунок 5).
   7. Рассчитайте скорость потребления кислорода (OCR) при T₀,_{T 5},_{T 10},_{T 15} , умножив парциальное давление кислорода (_{pO 2}) на коэффициент растворимости кислорода в плазме (0,00314). Постройте OCR для T₀,_{T 5},_{T 10},_{T 15} (рисунок 5).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Показаны образцовые резонансные рамановские спектральные следы при перфузии (_{T 5}), ишемическом (T₁₀) и реперфузии (T₁₅) состояниях одной печени (Рисунок 6)

Рисунок 4: Диаграмма, изображающая экспериментальный поток. Полная гепатэктомия была проведена самкам крыс Льюиса. Полученная печень проходила субнормотермическую перфузию и в течение первых 5 минут подавала кислородный перфусат. Перфузия поступает в печень через портальную вену и рециркулирует через перистальтический насос (перфузионный поток, изображённый синими стрелками). Кислородная перфузия была приостановлена на следующие 5 минут на T5 и возобновлена ещё на 5 минут при T10. 3RMR-измерения, проводимые на протяжении всего стресс-теста (изображаемые как лазер). Образцы перфусата были получены при T0, T5, T10 и T15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Результаты

Свежие печени подвергались периодам ишемии и реперфузии с помощью кислородного стресс-теста. Затем изменения в реальном времени в 3RMR сравнивались на протяжении стресс-теста с уровнем потребления кислорода, оттоком лактата и калия, полученными в результате анализа перфусата при_{T 0},_{T 5},_{T 10},_{T 15}. При здоровых условиях ожидается значение 3RMR от 10% до 30% (рисунок 5A). Как и ожидалось, значения 3RMR при_{T 0} и_{T 5} попадают в этот диапазон, поскольку печень постоянно снабжалась кислородным перфусатом между этими временными точками (рисунок 5A). Однако значение 3RMR в конце ишемического периода (T₁₀) выходит за пределы оптимального диапазона (рисунок 5A). Это увеличение свидетельствует о смещении митохондрий в редукциированное состояние, поскольку электроны накапливаются по всей транспортной цепи из-за деоксигенации. На_{T 10} кислородный поток возобновляется; Начинается период реперфузии. В конце реперфузионного периода (_{T 15}) значения 3RMR возвращаются к оптимальным уровням (рисунок 5A), поскольку активность ETC восстанавливается с повторным введением кислорода в качестве окончательного акцептора электронов. Эти изменения в потоке кислорода видны и в сырых спектрах. Необработанные спектры RRS на T₀ и_{T 15} имеют спектральные характеристики, схожие с окисленными митохондрий (рисунок 6A,C), например, пик спектрального маркера на расстоянии 1371 ^см-1 (рисунок 6D,F). Аналогично, сырые рамановские спектры на T₁₀ (рисунок 6B) показывают сниженные RR-маркеры, такие как пик спектрального маркера на 1357 ^см-1 (рисунок 6E). В заключение, RRS в реальном времени идентифицирует сдвиги в митохондриальных редокс-состояниях, что демонстрируется как в исходном спектральном сигнале, так и в метрике состояния митохондрий (3RMR).

RRS также может рассчитывать значения 3RMR на основе окислительных состояний cIII и cIV. Похожая картина наблюдалась в значениях cIII и cIV 3RMR (рисунок 5B). При_{T 0} наблюдались полностью окисленные значения 3RMR для cIV и значения 3RMR в оптимальном диапазоне для cIII. Этот окислительно-окислительный баланс между комплексами физиологический, поскольку электроны переходят из cIII в cIV для быстрого окисления. С началом ишемии наблюдалось повышение уровня 3RMR для каждого комплекса. В ишемическом периоде накопление электронов через ETC увеличивает редукционное напряжение на cIII и cIV, что, соответственно, увеличивает cIII-3RMR и cIV-3RMR. Однако при повторном введении кислорода значения 3RMR обоих комплексов снижаются до оптимальных уровней: полностью окисленного cIV и физиологически восстановленного cIII (рисунок 5B). Тенденции 3RMR в обоих комплексах показывают, что прекращение подачи кислорода влияет на всю ETC, и ни один отдельный комплекс не является особенно уязвимым к ишемии без потока.

С другой стороны, изменения в динамике оксигенации не отражались в биомаркерах повреждений и анализах крови и газа, полученных в результате анализа перфузатов. При начале ишемии ожидается повышение уровня лактата и K⁺ , поскольку клетка начинает полагаться на аэробное дыхание и постепенно разлагается, высвобождая межклеточный K⁺. Мы также ожидаем снижения OCR, так как клетки не вырабатывают достаточно энергии для продолжения клеточного дыхания. Даже после периода безтечной ишемии расход кислорода не показывал признаков повреждений. Отток лактата и уровня K⁺ остаются относительно стабильными на протяжении всего стресс-теста, несмотря на изменения в насыщении кислородом (рисунок 5D–E).

Рисунок 5: Изменения биомаркеров 3RMR и повреждения на протяжении всего теста на кислород и стресс .Начало ишемии и периодов реперфузии показаны пунктирными линиями на 5-й и 10-й минутах соответственно. Кроме того, периоды насыщенного кислородом выделены синими линиями, а периоды ишемии — красными линиями. (A) 3RMR по всему митохондриальному анализу. Значения 3RMR увеличиваются при приостановке кислородного потока и возвращаются к оптимальным уровням при возобновлении потока. (B) 3RMR для комплекса III и IV. Прекращение течения приводит к уменьшению обеих комплексов. (C) Средние значения выхода K⁺ на протяжении всего стресс-теста. Значения K⁺ остаются неизменными на протяжении всего стресс-теста, несмотря на изменения в динамике оксигенации. (D) Средний уровень оттока лактата на протяжении всего стресс-теста. Выброс лактата остаётся стабильным на протяжении всего стресс-теста. (E) Расход кислорода при T₀,_{T 10}, T₁₅. Поскольку значения_pO2 являются измерениями, основанными на потоке, OUR невозможно было рассчитать для периода ишемии без потока. Значимых изменений не наблюдалось (p-значение: 0,2500) (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6: Примерные необработанные спектральные следы свежей печени крысы на протяжении всего стресс-теста. Полные спектральные профили печени в (A) окислённых, (B) ишемических и (C) реперфузионных состояниях. Сдвиг от оксигенного маркера RR к уменьшенному RR маркера заметен при увеличении спектрального пика митохондрий, отмеченной красной рамкой в каждом спектральном профиле. (D–F) Окисленные пики RR-маркеров (1371 ^см-1) присутствуют в (D) окисленном и (F) реперфузированных состояниях и отмечены красной пунктирной линией. Сниженный пик маркера RR (1357 ^см-1) присутствует в ишемическом состоянии (E) и отмечен синей пунктирной линией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Дополнительный рисунок 1: Спектральные следы восстановленного и окисленного комплекса III, комплекса IV, гемоглобина и миоглобина. (A) Cомплекс III, (B) комплекс IV, (C) гемоглобин и (D) миоглобин. Регрессионный анализ сравнивает собранные спектры с этими спектральными библиотеками (если они выбраны), давая коэффициент для каждого библиотечного спектра, который представляет собой наилучшую оценку его относительного вклада в записанный спектр и, следовательно, относительной концентрации в ткани. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Пример использования регрессионных библиотек для разложения перекрывающихся молекул с гемом (гемоглобин и окисленные/восстановленные митохондрии). (A) Были отобраны сырые спектральные следы печеночных тканей, пронизанных клеточным перфусатом, со всеми необходимыми регрессионными библиотеками, такими как гемоглобин, окисленный гемоглобин, восстановленные митохондрии и окисленные митохондрии. Очевидно, что линия наилучшего соответствия, выведенная из библиотек и регрессионного анализа, аккуратно пересекается с измеренным сигналом, с минимальным необъяснимым остаточным исходом. (B) Сырые спектральные следы из той же ткани, но с выбранными только окисленными и восстановленными митохондрийными библиотеками. Поскольку существует большая необъяснимая остаточная структура, очевидно, что митохондриальный спектральный пик смещён на несколько волновых чисел по сравнению с гемоглобинам, который не был включён в регрессионный анализ. Этот рисунок показывает, что высокоразрешающий спектрометр и регрессионный анализ по всему спектру способны различать близкородственные спектры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 3: Скриншот программного обеспечения. (A) Главное окно, отображающее значения измерений во времени. 3RMR, StO2 и любые другие выбранные серии будут отображаться здесь во время измерения. Кроме того, сила сигнала каждой серии отображается в виде пунктирной линии на графике и значения внизу справа на экране. Например, сплошная линия, зафиксированная здесь, представляет собой 3RMR ткани, а пунктирная линия — r3RMR (силу сигнала 3RMR). Если кто-то хотел увидеть качество записанных спектров, можно было нажать на вкладку «Показать спектр » (обведённую фиолетовым). (B) Экран, отображающий необработанные спектры ткани. Это вкладка, где можно оценить качество сигнала по силе измеряемых спектров по сравнению с остаточным шумом. (C) Вкладка, показывающая тенденции в сериях по всему эксперименту. Если, например, вы проводите несколько измерений 3RMR в ходе эксперимента, каждое измерение будет отображаться во времени в этой вкладке. Тренды в других сериях, если они будут выбраны, также будут отображаться здесь. Эту вкладку можно было открыть, нажав кнопку «Тенденции » на главном экране (обведена зелёным на А). (D) Вкладка информации , куда можно ввести экспериментальную информацию, такую как название сессии и описание. (E) Системная вкладка, куда можно загружать заранее заданные протоколы. Например, при выборе протокола LiverContAcell этот протокол устанавливает регрессионную библиотеку, целевое окно регрессии и сигму в соответствии с протоколом бесклеточной перфузии для печени крыс. Чтобы импортировать протокол, можно нажать «Импортировать настройки из файла » и импортировать интересующий протокол. Если кто-то хочет создать собственный протокол, он может выбрать необходимые библиотеки из выпадающего меню (F) Regression Library , отрегулировать целевую сигму и окно регрессии, а также тревоги, и нажать на кнопку Сохранить (отображается диском) в левом нижнем углу. (F) Вкладка графика , где можно выбрать, какую серию отображать в главном окне. Если вы переанализируете спектр и хотите добавить новые ряды к предыдущим измерениям, можно выбрать интересующую рядовую из раздела «Отступление ». Во время повторной калибровки (Recal) программное обеспечение повторно анализирует измеренные исходные спектры и отображает результаты новых выбранных рядов. Также можно выбрать отображение силы сигнала выбранных серий на этой вкладке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 1: Объяснения каждого показателя контроля качества.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

В этом исследовании выделяется неинвазивный, в реальном времени и высокочувствительный метод количественной оценки состояния митохондрий с помощью портативной системы резонансной рамановской спектроскопии, состоящей из лазера в компактном зонде, соединённого оптоволоконным кабелем с лазерным насосом. Этот метод использовал лазер диаметром 441 нм для возбуждения митохондрий, которые генерируют уникальные спектральные сигналы в зависимости от степени окисления. Таким образом, RRS способна количественно оценивать каждое состояние митохондрий с помощью их спектральных сигнатур и сравнивать испущенные спектры с заранее измеренными спектральными библиотеками с помощью регрессионного анализа. Затем был создан показатель состояния митохондрий на основе отношения редуцированных к общей митохондрии: Соотношение митохондрий по редукции резонанса Рамана (3RMR).

В данной статье сосредоточена на демонстрации изменений в реальном времени в 3RMR как функции насыщения кислородом родной ткани без необходимости обработки образцов. Это было достигнуто с помощью кислородного стресс-теста: после 5 минут непрерывной кислородной перфузии поток перфузии приостанавливался на 5 минут и возобновлялся ещё на 5 минут. В течение всего стресс-теста проводились измерения 3RMR. Модель стресс-теста, при которой мы переходим между ишемическим и оксигенированным периодами, позволяет отслеживать непрерывные изменения в окислительно-восстановительных состояниях митохондрий — а значит, и функцию митохондрий. Другими словами, кислородный стресс-тест позволяет отслеживать тенденции 3RMR в зависимости от оксигенации. Наша группа связывает рост значений 3RMR с ишемическими условиями, что нарушает перфузионный поток, что приводит к накоплению электронов, проходящих через ETC, поскольку_O2 недоступен в качестве конечного акцептора электронов. Это накопление электронов приводит к снижению состояния, что приводит к увеличению значений 3RMR. Однако при повторном введении_O2 здоровые митохондрии должны возобновить активность ETC и восстановиться до физиологического окислительно-восстановительного состояния, поскольку их структурные и функциональные элементы сохраняются.

Как и ожидалось, в настоящей статье наблюдалось постоянное увеличение 3RMR в реальном времени на протяжении всего ишемического периода (рисунок 5A). Аналогично, 3RMR постепенно возвращается к оптимальным уровням в течение реперфузионного периода (рисунок 5A). Это изменение в режиме реального времени в митохондриальных редокс-состояниях также видно на спектральном графике, поскольку митохондриальный пик смещается с окисленного (1371 ^см-1) состояния в редукционированное (1357 ^см-1) состояния на протяжении ишемического периода и возвращается к окисленному состоянию в конце реперфузии (см. рисунок 6). Другие сниженные пики маркеров RR также появляются в ишемическом периоде. В отличие от традиционных анализов здоровья митохондриальных исследований, резонансный раман достаточно чувствителен, чтобы количественно оценивать редокс-состояния комплекса III и IV, что могло бы и дало механистическое понимание специфического влияния ишемии-реперфузионных повреждений на ETC. В здоровых митохондриях электроны проходят через различные комплексы в ETC, начиная с комплекса I, пока не достигнут_O 2 в качестве конечного акцептора электронов. Пауза в потоке кислорода может сдвинуть каждый комплекс в редуцированное состояние, поскольку электроны откапливаются вдоль ETC. Как и ожидалось, в реальном времени наблюдалось увеличение значений 3RMR cIII и cIV с началом ишемии. Это указывает на то, что отсутствие_O2 влияет на всю ETC, а не на конкретный комплекс (рисунок 5B). Как мы обсудим ниже, чувствительность RRS способствует проведению детальных механистических исследований и способствует разработке таргетных терапий для IRI.

Традиционно мы также ожидаем повышенный уровень лактата в ишемических органах, поскольку они зависят от анаэробного метаболизма при отсутствии кислорода для выработки АТФ. Аналогично, ожидалось повышение уровня K⁺ в повреждённых органах, поскольку целостность мембран клеток нарушается, что позволяет вытекать межклеточный K⁺. Наконец, сильно повреждённые клетки могут иметь более низкий метаболизм, поскольку их метаболические пути подвергаются влиянию метаболических отходов и ROS, вызванных ишемией, что приводит к снижению потребления кислорода. Однако изменений в потреблении лактата, K⁺ или кислорода во время или после ишемического периода не наблюдается. На самом деле значения не указывают на прекращение подачи кислорода, так как они остаются относительно стабильными на протяжении всего стресс-теста (рисунок 5B–D). По сути, используя тест на кислород, это исследование показывает, что значения 3RMR быстрее, в реальном времени и более чувствительно отражают сдвиги в митохондриальных редокс-состояниях во время ишемии-реперфузии (рисунок 5). Мы признаём, что в данном исследовании сравнивалась динамика 3RMR с косвенными показателями состояния митохондрий, такими как лактат и OCR, а не с более прямыми нижними сравнительными факторами, такими как NAD+/NADH и АТФ. Хотя это исследование явно не коррелирует изменения 3RMR с концентрациями АТФ/НАДГ, предыдущие исследования ^9,14 показали, что 3RMR предсказывает изменения этих биомаркеров по низу. Например, Нгуен и ^др.9 показали, что печень с теплоишемической (WI) длительностью 3 часа с низкими значениями 3RMR (<10%) имеет значительно более низкие концентрации АТФ и соотношение NAD/NADH по сравнению с печенью с 1 чом WI (значения 3RMR ~15%). Кроме того, Джайн и ^др.14 не обнаружили значимых различий в соотношении NAD+/NADH или EC в группах, у которых не было значимых различий в 3RMR. Они также наблюдали, что соотношение NAD+/NADH и EC значительно отличаются в печени с холодной ишемией (ДИ) при бесклеточной перфузии по сравнению с клеточной перфузией, которая также показала статистически значимые значения 3RMR. В совокупности эти результаты демонстрируют значения 3RMR, отражающие изменения в более прямых измерениях функции митохондрий и ETC.

Хотя в этой статье RRS используется на протяжении 15-минутной перфузии для демонстрации эффективности системы, другие опубликованные исследования показали полезность RRS в продольных исследованиях. Более конкретно, в предыдущей работе мы показали, что RRS дополняет традиционные биомаркеры при более длительном перфузии органов, поскольку даёт представление о состоянии и функции митохондрий, значительно отличающихся от традиционных методов. Например, в исследовании использовался RRS для оценки жизнеспособности трансплантируемых (24 h SCS) и нетрансплантируемых (72 h SCS) холодно-ишемических печеней крыс на протяжении субнормотермической^{перфузии 10}. Хотя первоначальный ответ на оксигенацию в обеих группах был схожим, 3RMR у нетрансплантируемых печени увеличивался с перфузией, тогда как 3RMR у пересадимой печени оставался стабильным через SNMP. Аналогично, уровень калия и общий набор веса у печени с ДИ 72 часа были выше по всему SNMP по сравнению с печенью с ДИ за 24 часа. Исследование продемонстрировало полезность RRS в дополнении традиционных биомаркеров при длительных перфузиях. В другом исследовании мы использовали RRS для изучения динамики реоксигенации и метаболического восстановления печени крыс с холодной ишемией^(ДИ). Мы перфузировали минимально ишемические (15 минут холодной ишемии) и 24-часовые холодноишемические печени с помощью ацеллюлярного или эритроцитно-упакованного перфузата (pRBC). При перфузии печени с 24-часовым ДИ бесцеллюстровым перфузатом мы наблюдали латентное снижение 3RMR по сравнению с перфузией при использовании РКК. В исследовании это задержанное увеличение 3RMR объяснялось накоплением электронов в митохондриальных цитохромах во время холодной ишемии, которые могут быстро передаваться к обильным молекулам кислорода в случае перфусата на основе пРБК. Однако в сочетании с другими маркерами повреждения мы наблюдаем большее повреждение печени в печени с интервалом 24 часа при ДИ, перфузированных пРК. Исследование пришло к выводу, что измерение оксигенации митохондрий в реальном времени с помощью RRS может дать представление о восстановлении митохондрий, что может быть полезно для оптимизации стратегий длительной перфузии. По сути, результаты показывают, что интеграция традиционных биомаркеров (например, лактата, OCR, АТФ) с данными, основанными на RRS, о состоянии митохондриальных редокс-окислений и динамике оксигенации обеспечивает более комплексную оценку восстановления митохондрий.

Другие исследования использовали RRS в качестве тестового полигона для терапии, которые могут смягчать ишемии-реперфузионное повреждение ETC⁹. В длительных периодах ишемии электроны накапливаются внутри ETC, с способностью электронов выходить через различные комплексы, особенно во время реперфузии. Понимание редокс-состояния отдельных комплексов как функции ишемии-реперфузии может дать более глубокое понимание места повреждения с возможностью более целенаправленных вмешательств. Например, наша группа использовала RRS для разработки терапевтических вмешательств при дисфункции комплекса III у печени свиней с теплоишемией. В исследовании, проведённом Нгуеном и др. (2026)⁹, печени WI 1 и 3 часа были помещены на SNMP на 3 часа. Как уже упоминалось, трёхчасовая печень WI страдает от повреждения ETC, что приводит к переокислению и снижению метаболизма. Хотя значения 3RMR для свежей и 1 ч. WI печени находились в оптимальном диапазоне на протяжении всей перфузии, мы наблюдали непрерывное снижение 3 RMR печени с 3 часами, достигая ниже оптимального диапазона (10%) через 3 часа. Кроме того, мы не обнаружили различий в значениях 3RMR cIV между обеими группами, при этом cIV полностью окислялся в каждой группе. Гиперокисление cIII в сочетании со здоровым окислительным состоянием, наблюдаемым в cIV, указывает на переокисление, вызванное реперфузией, в комплексе III. Вооружившись этими знаниями, Нюген и др. (2026)⁹смогли выбрать терапевтическое средство, способное преодолеть дисфункцию cIII: метиленовый синий (MB), который действует как электронный шаттл между cI и цитохромом c, обходя cIII и передавая электроны непосредственно в cIV. Результаты 3RMR отражали терапевтический эффект MB на митохондрии, поскольку значения 3RMR при SNMP у печени с 3h WI увеличивались, отражая прямую транспортировку электронов в cIV, и возобновление метаболизма печени. Смягчающий эффект MB также был подтвержден снижением оттока лактата и улучшением уровня потребления кислорода. По сути, специфика RRS позволила разработать терапевтический путь, адаптированный к потребностям митохондрий после тёплой ишемии.

В этой статье мы представляем резонансную рамановскую спектроскопию как неинвазивный, в реальном времени и очень специфический метод измерения состояния митохондрий. Исследование демонстрирует, как RRS может измерять тонкие сдвиги в окислительно-восстановительных состояниях, не нарушая ткань до того, как такие физиологические изменения покажут последующие эффекты. Однако важно отметить ряд ограничений системы Резонансного Рамана. Во-первых, RRS требует, чтобы все молекулы, резонансно усиленные в ткани, были выявлены и учтены в регрессии, при этом каждая молекула имеет разные коэффициенты усиления для учёта относительной силы сигнала. Хотя мы создали спектральные библиотеки для всех таких компонентов на заданной длине волны и ткани, пользователю, возможно, потребуется создать и проверить новые библиотеки для каждой интересующей ткани и длины волны. Кроме того, некоторые ткани могут иметь сложные спектральные элементы, что затрудняет измерение митохондриальных цитохромов в меньших концентрациях. Например, печень свиней или человека содержит бета-каротин, а кровь — гемоглобин, которые оба обладают сильными спектральными сигналами, увеличивающими количество спектральных сигнатур, которые RRS необходимо учитывать в регрессии. Наконец, лазер диаметром 441 нм, используемый для этих измерений, имеет диаметр пучка 2 мм и глубину проникновения менее 1 мм. Такие локализованные поверхностные измерения могут способствовать ошибке выборки, поскольку различия в окислительном состоянии в других частях органа могут быть упущены из виду. Для преодоления таких проблем можно было бы взять измерения с помощью биопсий из ядра органа, или многолазерная установка позволила бы проводить измерения на большей площади поверхности для более полного понимания состояния всего органа.

В заключение мы показываем, что резонансная рамановская спектроскопия чувствительна к тонким изменениям динамики митохондрий по сравнению с анализами крови и газа. Подробное объяснение настройки и эксплуатации системы приведено здесь. Мы выделяем неинвазивный, высокоспецифический и оперативный характер оценки RRS и объясняем, как его можно использовать как диагностический и механистический подход. Мы также акцентируем его использование при разработке специфических терапевтических путей для дисфункции митохондрий. Будущие исследования могут быть сосредоточены на адаптации системы RRS для оценки состояния митохондрий с помощью биопсий, точных срезов тканей или других тканевых продуктов, включая человеческую ткань, для трансляционных исследований. Внедрение RRS предлагает мощный подход в метаболических исследованиях, улучшая наше понимание клеточных биоэнергетических процессов с большей простотой, чем традиционные методы.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
16 G Catheter	BD Insyte Authoguard	381454	Используется для канюлирования воротной вены
Activated Charcoral	Vet Equip Vapor Guard Activated Charcoal	931401	Используется для фильтрации избыточных паров во время анестезии
BSA	Sigma-Aldrich	A7906	Состав перфузата
Bubble Trap	Radnoti	130149
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	Состав перфузата
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050061	Состав перфузата
Masterflex L/S Precision Pump Tubing (24 G)	Fisher Scientific	13-200-292	Используется для пропускания перфузата через печень
Masterflex peristaltic pumps	Cole Parmer, Vernon Hill, IL	7528-30	Используется для пропускания перфузата через печень
Membrane Oxygenator	Radnoti	130144	Используется для окисления перфузата.
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458	Состав перфузата
RAPIDPoint 500 Blood Gas System	Siemens Healthineers	41115805	Для анализа газов крови
Resonance Raman System	Pendar Technologies	A4D441	Свяжитесь с Pendar Technologies для получения информации об этом продукте