Мы представляем неинвазивный, в реальном времени метод мониторинга здоровья митохондрий с использованием резонансной рамановской спектроскопии (RRS). Мы использовали RRS для количественной оценки окислительно-окислительных состояний митохондрий и разработали метрику состояния митохондрий — резонансное раманское соотношение митохондрий (3RMR), которая показывает более быструю реакцию на изменения оксигенации по сравнению с традиционными анализами крови и газов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Неинвазивная оценка функции митохондрий в реальном времени с использованием резонансной рамановской спектроскопии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Хотя митохондрии играют центральную роль в патогенезе и прогрессировании заболевания, механистическое понимание динамики здоровья митохондрий остаётся дорогостоящим и недоступным. Для устранения этого пробела в исследовании используется резонансная рамановская спектроскопия (RRS) для оценки функции митохондрий с помощью портативной системы, которая обеспечивает в реальном времени, неинвазивные и количественные измерения окислительно-окислённых состояний митохондриального цитохрома в печени крыс. В этом протоколе мы демонстрируем применение этой технологии, включая настройку, сбор данных и обработку данных. В данном исследовании представлен эксперимент с подтверждением концепции, который подчёркивает способность RRS измерять изменения в режиме окислительно-окислительного стана митохондрий в реальном времени — а значит, и функции митохондрий. Кратковременно устройство RRS было подключено к лазерному насосу, а также к компьютеру сбора данных и размещалось на расстоянии 1 см от печени крысы. Параметры получения были выбраны в соответствии с протоколом печени крыс; Окислительно-окислённые состояния измерялись в оксигенированных и ишемических условиях с помощью кислородного стресс-теста. Изменения в окислительно-восстановительном состоянии митохондрий отслеживались на протяжении всего теста на кислород.
Введение
Митохондрии играют ключевую роль в работе клетки и гомеостазе. Митохондрии являются основными драйверами клеточного метаболизма, регулируя образование АТФ посредством окислительного фосфорилирования. Они также служат сигнальными органеллами, определяющими судьбу клетки, регулируя апоптотические пути, а также ROS и Ca+2 сигналы 1. Таким образом, дисфункция митохондрий может привести к различным нейродегенеративным, мышечным и сердечно-сосудистымзаболеваниям 2,3. Несмотря на ключевую роль митохондрий в прогрессировании заболевания, оценка функц....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все животные, участвовавшие в экспериментах, содержались в соответствии с руководящими принципами Национального исследовательского совета и были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) в Массачусетской общей больнице (Бостон, Массачусетс, США).
1. Настройка и использование RRS
- Описание устройства:
ПРИМЕЧАНИЕ: Портативная система RRS (Pendar Technologies; продукт предназначен только для исследовательских целей) использует лазер диаметром 441 нм благодаря резонансному усилению раманского спектра митохондриальных цитохромов с этой длиной во....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Свежие печени подвергались периодам ишемии и реперфузии с помощью кислородного стресс-теста. Затем изменения в реальном времени в 3RMR сравнивались на протяжении стресс-теста с уровнем потребления кислорода, оттоком лактата и калия, полученными в результате анализа перфусата приT 0,T 5,T 10,T 15. При здоровых условиях ожидается значение 3RMR от 10% до 30% (рисунок 5A). Как и ожидалось, значения 3RMR приT 0
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этом исследовании выделяется неинвазивный, в реальном времени и высокочувствительный метод количественной оценки состояния митохондрий с помощью портативной системы резонансной рамановской спектроскопии, состоящей из лазера в компактном зонде, соединённого оптоволоконным кабелем с лазерным насосом. Этот метод использовал лазер диаметром 441 нм для возбуждения митохондрий, которые генерируют уникальные спектральные сигналы в зависимости от степени окисления. Таким образом, RRS способна .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют о конкурирующих интересах. У S.N.T и P.R. есть предварительные патентные заявки, относящиеся к данному исследованию. П.Р. является сотрудником и акционером Pendar Technologies. S.N.T. управляются MGH and Partners HealthCare в соответствии с их политикой по конфликту интересов. Конкурирующие интересы J.N.K. регулируются политикой BCH по вопросам конфликта интересов. В этом исследовании использовались следующие запатентованные технологии: US2020/0281474A1 Мониторинг клеточных энергетических систем in vivo с использованием рамановской спектроскопии (применение). Были поданы дополнительные патентные заявки на использование в офтальмологии, жизнеспособности тканей и оценке ожогов с использованием резонансной рамановской спектроскопии, где Р.Дж. также является изобретателем.
Благодарности
Эта работа была поддержана щедрым финансированием S.N.T. от Национальных институтов здравоохранения США (R01DK134590). Мы также с благодарностью признаем финансирование S.N.T от Национального института здравоохранения США (K99/R00 HL1431149; R01HL157803; R24OD034189), Национальный научный фонд (EEC 1941543), Фонд семьи Польски и Shriners Children's Boston (грант #BOS-85115). Кроме того, мы признаём финансирование
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 16 G Catheter | BD Insyte Authoguard | 381454 | Используется для канюлирования воротной вены |
| Activated Charcoral | Vet Equip Vapor Guard Activated Charcoal | 931401 | Используется для фильтрации избыточных паров во время анестезии |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | Состав перфузата |
| Bubble Trap | Radnoti | 130149 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | Состав перфузата |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Состав перфузата |
| Masterflex L/S Precision Pump Tubing (24 G) | Fisher Scientific | 13-200-292 | Используется для пропускания перфузата через печень |
| Masterflex peristaltic pumps | Cole Parmer, Vernon Hill, IL | 7528-30 | Используется для пропускания перфузата через печень |
| Membrane Oxygenator | Radnoti | 130144 | Используется для окисления перфузата. |
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458 | Состав перфузата |
| RAPIDPoint 500 Blood Gas System | Siemens Healthineers | 41115805 | Для анализа газов крови |
| Resonance Raman System | Pendar Technologies | A4D441 | Свяжитесь с Pendar Technologies для получения информации об этом продукте |
Ссылки
- San-Millán I. The key role of mitochondrial function in health and disease. Antioxidants (Basel). 2023;12(4):782.
- Rossmann MP, et al. Mitochondrial function in development and disease. Dis Model Mech. 2021;14(6):dmm048912.
- Chen W, Zhao H, Li Y. Mitochondrial dynamics in health and disease: mechanisms and potential targets. Signal Transduct Target Ther. 2023;8:333.
- Acin-Perez R, et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. EMBO J. 2020;39(13):e104073.
- Sharma E, et al. Overview of methods that determine mitochondrial function in human disease. Metabolism. 2025;170:156300.
- Kowaltowski ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
