Методическая статья

Конструкция органоидов рака молочной железы у человека и количественная оценка повреждения ДНК, вызванной доксорубицином, с помощью кометного анализа

67 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71299

⸱

28 июля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Life Science, North China University of Science and Technology, 2Jiangsu Province Engineering Research Center of Development and Translation of Key Technologies for Chronic Disease Prevention and Control, Suzhou Vocational Health College, 3School of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 4Thyroid and Breast Surgery, Wuzhong People's Hospital of Suzhou City, 5Department of Radiation Oncology, The Affiliated Hospital of Soochow University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол устанавливает модель человеческих органоидов рака молочной железы (БКО) и количественно оценивает повреждение ДНК, вызванное доксорубицином, с помощью кометного анализа. Демонстрируется возможность применения кометного анализа к БКО, а также предоставляется воспроизводимый, масштабируемый и оперативный рабочий процесс для обнаружения повреждения ДНК, вызванного DOX, в БКО.

Аннотация

Рак молочной железы является самым распространённым злокачественным заболеванием среди женщин во всём мире и демонстрирует значительную гетерогенность. Доксорубицин (DOX) широко используется в лечении рака молочной железы, и его основной механизм действия заключается в индукции разрывов двойной цепи ДНК и стимулировании гибели клеток. В этом протоколе была создана модель БКО человека для количественной оценки повреждения ДНК, вызванного DOX. Первичные клетки рака молочной железы были выделены из опухолевых тканей, полученных пациентами, посредством механической и ферментативной диссоциации, а затем культивированы в трёхмерном матриксе для получения БКО. Органоиды затем обрабатывались 8 мкм DOX в течение 2 часа. Повреждения ДНК оценивались через 2 часа лечения. После обработки органоиды диссоциировали на отдельные клетки, встраивались в агарозу с низкой температурой плавления и подвергались электрофоресу в щелочных условиях. После электрофореза паттерны миграции ДНК визуализировались в виде структур комет в флуоресцентной микроскопии и количественно анализировались с помощью программного обеспечения OpenComet для определения процента ДНК хвоста (% хвостовой ДНК). Анализ кометы успешно обнаружил повреждение ДНК в БКО. По сравнению с контрольной группой, БКО, подвергшиеся воздействию 8 мкм DOX в течение 2 часа, демонстрировали удлинённые хвосты кометы после органоидной диссоциации и электрофореза. Количественный анализ показал, что процент ДНК хвоста был значительно выше в обработанной группе, что указывает на индукцию повреждения ДНК. Этот высокочувствительный метод поддерживает токсикологические и фармакодинамические исследования DOX и предоставляет надёжную техническую платформу для оценки повреждения ДНК в системах БКО, полученных от пациентов.

Введение

Рак молочной железы — это злокачественная опухоль, возникающая в эпителиальных тканях молочной железы из-за генетических изменений, гормональной дисрегуляции и других патогенных факторов. Это самое распространённое злокачественное заболевание среди женщин во всём мире и отличается уникальными эпидемиологическими характеристиками и значительной внутриопухолевойгетерогенностью 1,2. DOX, химиотерапевтический препарат первой линии, ингалируется в ДНК, ингибирует активность топоизомеразы II и вызывает разрывы цепочек ДНК, что в конечном итоге вызывает апоптоз в опухолевыхклетках 3. Традиционные двумерные системы клеточных культур ограничены в своей способности воспроизводить сложную клеточную организацию и гетерогенность опухолей молочной железы. В отличие от этого, БКО — это трёхмерные структуры, полученные из тканей опухоли пациента, которые сохраняют ключевые характеристики исходной опухоли, включая клеточный состав, архитектуру тканей и молекулярные фенотипы. В частности, модели BCO демонстрируют высокую согласованность с клиническими ответами лекарств; для конкретного терапевтического препарата согласованность отрицательного ответа достигает 100%, а положительная — 98% между БКО и соответствующимпациентом 4.

БКО служат продвинутой моделлю in vitro, которая воспроизводит ключевые структурные и функциональные особенности первичных опухолей и широко применяется для изучения опухологенеза, прогрессирования заболевания и терапевтическойустойчивости 5. Инициация опухоли при раке молочной железы обычно основана на кооперативной инактивации множества генов-супрессоров опухоли, таких как TP53, PTEN, RB1 и NF1, поскольку одногенные изменения недостаточны для стимулирования злокачественной трансформации нормального эпителия молочной железы. Этот процесс сопровождается потерей полярности клеток, архитектурной дезорганизацией и неконтролируемойпролиферацией 6,7,8.

Анализ кометы (также называемый одноклеточным гель-электрофорезом, SCGE) — это классический метод оценки повреждения ДНК на уровне одной клетки. Этот метод был впервые введён Ридбергом и Йохансоном в 1978 году, а затем усовершенствован Остлингом и Йохансоном, которые установили нейтральный кометный анализ для обнаружения разрывов двухцепочечной ДНК. В 1988 году Сингх и коллеги включили условия щелочного электрофореза, что позволило обнаруживать разрывы одноцепочечной ДНК, абазовые участки и щелочно-лабильные поражения, значительно расширив применимость анализа9. Основной принцип анализа кометы заключается в том, что электрофоретическая подвижность ДНК зависит от её целостности. После вложения агарозы и лизиса для удаления клеточных мембран и белков, повреждённые фрагменты ДНК мигрируют к аноду во время электрофореза, образуя «хвост кометы», тогда как целая ДНК остаётся рядом с местом загрузки, формируя «голову кометы»10. Параметры, такие как длина хвоста, процент ДНК хвоста (% ДНК хвоста) и момент оливового хвоста, позволяют полуколичественно или количественно оценивать повреждения ДНК, а экспериментальные конструкции с временным ходом могут использоваться для оценки способности к восстановлению ДНК. Благодаря высокой чувствительности, низким требованиям к вводу образца и относительной процедурной простоте, кометный анализ широко используется в генетической токсикологии, биологии рака и исследованиях ответа на лекарства, особенно для оценки повреждений ДНК, вызванного химиотерапевтическими агентами и лучевой терапией, а также механизмов устойчивости опухолевых клеток. Анализ очень чувствителен к экспериментальным условиям и процедурной изменчивости, а воспроизводимость и межлабораторная сопоставимость зависят от стандартизированных рабочих процессов и автоматизированного анализаизображений 11. В последние годы внедрение высокопроизводительного программного обеспечения для визуализации, моделей органоидов и систем редактирования генов дополнительно повысило полезность анализа комет для изучения механизмов повреждения и восстановления ДНК, а также в оценке реакций на лечение опухолей.

По сравнению с традиционными анализами повреждения ДНК, такими как иммунофлуоресцентное окрашивание γ-H2AX или проточная цитометрия, анализ кометы предоставляет прямое средство для количественной оценки разрывов физических цепочек ДНК на уровне одной клетки. Поскольку эта методология работает независимо от специфической экспрессии белков или специфичности антител, она эффективно исключает ложноотрицательные результаты, возникающие из-за изменений состояний клеточного цикла или аберраций в путях ответа на повреждениеДНК 12. Кроме того, в отличие от обычных двухмерных монослойных культур, трёхмерная органоидная модель, использованная в этом исследовании, более точно воспроизводит сложную пространственную архитектуру, взаимодействия внеклеточного матрикса и градиенты лекарственного прохождения опухолей in vivo. Хотя традиционные модели клеточных линий часто переоценивают генотоксичность из-за искусственного чрезмерного воздействия лекарств, платформа органоидов оценивает повреждение ДНК, вызванное DOX, в микросреде, которая тесно отражает клинические физиологические условия, тем самым значительно повышая надёжность и трансляционную ценность этой парадигмыскрининга 13.

Несмотря на значительные преимущества органоидно-интегрированного анализа комет, установленного в данном исследовании для оценки повреждения ДНК, его практическая реализация требует тщательного рассмотрения ряда технических ограничений и параметров применимости, связанных с входом образцов. Протокол требует тщательной, но мягкой ферментативной диссоциации органоидов для получения высокоэффективной одноклеточной суспензии. Плотность посева в 15 000–20 000 первичных клеток рака молочной железы на 100 мкл матрицы базальной мембраны (~200 клеток/1 мкл) поддерживает межклеточную паракриновую сигнализацию, необходимую для устойчивого формирования сфер, одновременно предотвращая центральный некроз, вызванный гиперплотностью и быстрым истощением питательных веществ. Что касается терапевтического окна, этот анализ требует тщательной калибровки концентрации DOX и длительности воздействия для предотвращения чрезмерной гибели клеток (>20–30%). Супралетальное воздействие препаратов приводит к образованию множества «ёжиков» комет, которые затрудняют подлинные сигналы повреждения ДНК и запутывают интерпретацию данных. Что касается ограничений анализов, то изначально низкая пропускная способность стандартного щелочного кометного анализа делает его недостаточным для высокопроизводительного скрининга на наркотики. Кроме того, эта техника требует строгой стандартизации экспериментальных процедур — включая стабильность сцепления геля, продолжительность щелочного размотки и электрофоретическую равномерность — поскольку даже незначительные операционные отклонения могут привести к значимым системным ошибкам.

В заключение, этот протокол устанавливает человеческие БКО и демонстрирует возможность применения кометного анализа для количественной оценки повреждения ДНК, вызванного DOX. После обработки полностью установленных БКО с DOX длительностью 8 мкм повреждение ДНК оценивалось с помощью кометного анализа. Такой подход позволяет стабильно и непосредственно оценить повреждения ДНК, вызванного DOX.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Исследование было одобрено Этическим комитетом Сучжоу-Учжунской народной больницы (Одобрение No 20251w03) и проведено в соответствии с медицинскими этическими стандартами. Все участники этого исследования предоставили письменное информированное согласие.

1. Создание человеческих БКО

  1. Транспорт и хранение тканей рака молочной железы
    1. Немедленно поместите свежерезированную человеческую ткань рака молочной железы в предварительно охлаждённый раствор для сохранения тканей (4 °C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что ткань полностью погружена во время транспортировки.
  2. Механическая диссоциация ткани рака молочной железы
    1. Выполняйте все процедуры в шкафе для биобезопасности. Поместите ткань рака молочной железы в 6-сантиметровую посевную чашу и удалите видимую жировую ткань с помощью стерильных скальпелей и щипцов.
    2. Добавьте 3 мл PBS в 6-сантиметровую миску и трижды промой салфетку.
    3. Аспирируйте и сбросьте фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS).
    4. Повторите шаги 1.2.2 и 1.2.3 ещё два раза.
    5. Переместите ткань рака молочной железы в микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл с помощью стерильных хирургических ножниц и разрежьте ткань на мелкие фрагменты размером примерно 2 x 5 мм.
  3. Ферментативное пищеварение тканей рака молочной железы
    1. Добавьте 1 мл раствора для диссоциации органоидов в микроцентрифугальную трубку объемом 1,5 мл и перенесите суспензию в 15-мл центрифугную трубку.
    2. Добавьте дополнительно 8 мл раствора для диссоциации органоидов в 15 мл центрифугной трубки.
    3. Инкубировать 15 мл центрифугной трубки при 37 °C в течение 40 минут.
    4. Перемешивайте трубку на шейкере по 1 минуте каждые 10 минут во время пищеварения.
    5. Через 40 минут добавьте 6 мл PBS в 15 мл центрифугной трубки, чтобы прекратить пищеварение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте PBS напрямую в смесь для пищеварения, чтобы остановить ферментативную активность.
  4. Выделение первичных опухолевых клеток молочной железы и органоидное вложение
    1. Поставьте сито с элементами 100 мкм на трубку центрифугы объемом 50 мл.
    2. Добавьте 1 мл полной среды для культивирования клеток на ситечко клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте полную клеточную культурную среду с использованием 500 мл базальной среды, 50 мл сыворотки плода и 5 мл пенициллин-стрептомицина.
    3. Аспирируйте 1 мл суспензии переваренной ткани из 15 мл центрифугной трубки и нанесите её на клеточное сито.
    4. Повторяйте шаг 1.4.3, пока вся подвеска не пройдёт через сито.
    5. Промывайте ситечко дополнительно 1 мл полной среды для клеточной культуры.
    6. Центрифугуйте 50 мл центрифугной трубки при 350 × г в течение 3 минут при 4 °C.
    7. Аспирируйте и отвергайте супернатант.
    8. Ресуспензировать клеточную гранулу в 1 мл полной среды для культивирования клетки и перенести её в микроцентрифугную трубку объемом 1,5 мл.
    9. Центрифугуйте подвеску при 370 × г в течение 5 минут при 4 °C.
    10. Аспирируйте и отвергайте супернатант.
    11. Добавьте 100 мкл матрици базальной мембраны в микроцентрифугную трубку объемом 1,5 мл и тщательно перемешайте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживать плотность посева от 15 000 до 20 000 первичных клеток рака молочной железы на 100 мкл матрца базальной мембраны (200 клеток/1 мкл). Это поддерживает межклеточную паракринную сигнализацию для устойчивого формирования сфер и предотвращает центральный некроз.
    12. Впустите 25 мкл смеси матричной мембраны и ячейки в каждую яме пластины с 24 лунками.
    13. Инвертируйте пластину с 24 лунками и инкубуйте её при 37 °C в течение 10 минут, чтобы обеспечить полимеризацию матрицы базальных мембран.
    14. Добавьте 500 мкл культурной среды BCO в каждую скважину пластины с 24 лунками.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Культурные БКО используют коммерческую готовую среду с собственной формулой.
    15. Инкубировать пластину в увлажнённом инкубаторе при 37°C с 5% CO₂.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После посева в внеклеточном матриксе БКО культивировали в течение 7–10 дней для правильного 3D-структурного развития. Органоиды считались полностью устоявшимися и готовыми к медикаментозному лечению, когда демонстрировали плотную, сферическую 3D-морфологию и достигали среднего диаметра примерно 50–100 мкм, без признаков центрального некроза. После выполнения этих критериев БКО впоследствии обрабатывались DOX.

2. Обнаружение повреждения ДНК, вызванного DOX, в БКО с помощью кометного анализа

Экспериментальный протокол был адаптирован из установленных рекомендаций и дополнительно оптимизирован с учётом конкретных лабораторныхусловий 14.

ВНИМАНИЕ: Выполняйте все процедуры обработки DOX — включая взвешивание сухого порошка, приготовление запасного раствора и последовательное разбавление рабочих растворов — исключительно в сертифицированном биологическом шкафе II класса или вытяжной вытяжке для химических выхлопов. Строго избегайте любых манипуляций на открытых лабораторных столах. Надевайте двухслойные нитриловые перчатки и защищайте препарат от света во всех процедурах. Наконец, все расходники, загрязнённые DOX (например, наконечники пипеток и трубки микроцентрифуг) строго разделять как «цитотоксичные отходы» для специализированной утилизации; Никогда не смешивайте эти предметы с обычными биологически опасными отходами.

  1. Лечение БКО с помощью DOX
    1. Поглощайте и отбрасывайте потраченную культурную среду.
    2. Добавьте в каждую скважину 500 мкл свежей культурной среды BCO.
    3. Удалить и сбросить 4 мкл среды из каждой ямы
    4. Добавьте в каждую скважину 4 мкл раствора DOX объемом 1 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы определить окончательную рабочую концентрацию 8 мкм, определите необходимый объём запаса с помощью стандартного уравнения разбавления: C1V1 = C2V2. Где C1 — начальная концентрация запаса DOX (1 мМ), C2 — целевая концентрация (8 мкм), а V2 — итоговый объём скважины (500 мкл). Решение для V1 даёт 4 мкл. В результате протокол требует добавления 4 мкл 1 мМ запаса DOX к оставшимся 496 мкл культурной среды на скважину, а затем тщательного смешивания для обеспечения однородного распределения.
    5. Инкубировать пластину в инкубаторе при температуре 37°C с 5% CO₂ в течение 2 часов.
  2. Диссоциация БКО
    1. Аспирировать и убрать культурную среду BCO из 24-колодцевой пластины.
    2. Добавьте в каждую скважину 500 мкл раствора для диссоциации органоидов.
    3. Пипетты вверх и вниз многократно, чтобы полностью разрушить матрицу базальной мембраны и органоидные структуры.
    4. Инкубировать пластину при 37 °C с 5% CO₂ в течение 10 минут.
    5. Перенесите 500 мкл получающейся суспензии из каждой скважины в 15-мл-центрифугную трубку.
    6. Центрифугуйте подвеску при 350 × г в течение 3 минут при 4 °C.
    7. Аспирируйте и отвергайте супернатант.
    8. Добавьте 1 мл полной культурной среды в трубку центрифуги на 15 мл для повторного суспензирования клеточной гранулы и затем перенесите полученную суспензию в микроцентрифугную трубку объемом 1,5 мл.
    9. Центрифугуйте подвеску при 350 × г в течение 3 минут при 4 °C.
    10. Аспирируйте и отвергайте супернатант.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования органоидная гранула остаётся в трубке центрифуги.
  3. Ресуспензия клетки и вложение агарозы
    1. Предварительно нагрейте металлический нагревательный блок до 95 °C.
    2. Поместите 1 мл агарозы с низкой температурой плавления (LMP) в металлический нагревательный блок и инкубуйте 10 минут, чтобы обеспечить полное плавление.
    3. Пипетта 100 мкл расплавленного 0,5% с низкой температурой плавления агарозы в микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл с БКО.
    4. Немедленно перенесите образцы в водяную ванну при температуре 37 °C и дайте им уравновеситься в течение 10 минут.
    5. Тщательно перемешайте и немедленно пипетьте 50 мкл суспензии ячейки-агарозы на стекло микроскопа.
  4. Лизис клеток и размотка ДНК
    1. Погрузите препараты в холодный раствор лизиса и инкубуйте при 4 °C в темноте в течение 12 часов.
    2. Вынимите стекли из раствора лизиса и сразу погрузите их в щелочной раствор для размоткивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для подготовки щелочного раствора растворите 0,6 г NaOH в 4,975 мл сверхчистой воды, затем добавьте 250 мкл 200 мМ EDTA. Для подготовки щелочного буфера электрофореза растворите 12 г NaOH в 995 мл сверхчистой воды, затем добавьте 5 мл 200 мМ EDTA.
      ВНИМАНИЕ: NaOH в буфере кометы — это сильно коррозийное крепкое основание, способное вызывать тяжёлые ожоги кожи и глаз. Во время подготовки раствора медленно, постепенно и под непрерывным магнитным перемешиванием добавляйте твёрдые гранулы NaOH в воду. Никогда не заливайте воду непосредственно на сухие гранулы, так как агрессивная экзотермическая реакция может привести к кипению и разбрызгиванию едкой жидкости. Кроме того, весь сухой порошок взвешивают исключительно в химическом выхлопчике, чтобы предотвратить вдыхание коррозийной пыли.
    3. Погрузите препараты в раствор лизиса и инкубируете при температуре 4 °C в темноте в течение 1 часа.
  5. Электрофорез
    1. Перенесите затворы из щелочного раствора для размотки в камеру электрофореза.
    2. Добавьте 1 л щелочного буфера электрофореза в резервуар электрофореза, чтобы обеспечить полное погружение затворов.
    3. Проведите электрофорез при 25 В и 300 мА в течение 30 минут.
  6. Стирка и фиксация слайдов
    1. Погрузите препараты в 5 мл этанола 70% и инкубируем 5 минут при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этанол представляет серьёзную опасность воспламеняемости. При проведении препаратов в больших объемах или обезвоживании тканей поддерживайте прочную вентиляцию в экспериментальной среде. Строго изолировать рабочую зону от всех источников возгорания, включая открытое пламя (например, спиртовые горелки) и электростатические искры. После использования немедленно запечатайте контейнеры с реактивами и закрепите их в специальном взрывоустойчивом шкафе для горючих веществ.
    2. Поставьте слайды в инкубатор при температуре 37 °C и дайте им высохнуть 15 минут.
  7. Окрашивание и визуализация ДНК
    1. Добавьте 1 мкл флуоресцентной окрашивания нуклеиновой кислоты к 10 мл ультрачистой воды.
      ВНИМАНИЕ: Рассматривайте эти агенты, интеркалирующие нуклеиновые кислоты, как потенциальные мутагены, и обращайтесь с ними строгими мерами предосторожности. Чтобы предотвратить перекрёстное загрязнение в рутинных рабочих помещениях, создайте специальную «зону окрашивания нуклеиновой кислотой» с отдельными пипетками. Если вы добавляете расплавленную агарозу красителями, дайте гелю остыть примерно до 60 °C перед добавлением, чтобы предотвратить вдыхание опасных паров, насыщенных красителями. Наконец, все отработанные растворы для окрашивания и гели отходов выбросьте строго в специальные контейнеры для защиты нуклеиновых кислот.
    2. Окуните стекли в раствор для окрашивания, приготовленный в шаге 2.7.1, и инкубуйте 30 минут при комнатной температуре в темноте.
    3. Проведите одну 5-минутную промывку с 5 мл ультрачистой воды.
    4. Сушите стекли на воздухе 15 минут в инкубаторе при температуре 37 °C.
    5. Визуализируйте структуры комет с помощью флуоресцентного микроскопа с зелёным возбуждающим фильтром и обнаружите красную флуоресценцию.

3. Обработка данных

  1. Выполните автоматический количественный анализ изображений кометного анализа с помощью плагина OpenComet на Фиджи (официальное распространение) для получения параметров, связанных с повреждением ДНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Что касается статистического анализа, эта работа включала исключительно высокоразрешённые, чётко изображенные кометы с целостной морфологией и без наложения. В то же время протокол скрининга исключал «ёжиков» или «призрачных» комет, которые демонстрируют уменьшенную голову и обширный хвост, что указывает на тяжёлый апоптоз или некроз), а также изображения с размытыми краями, скоплением клеток или фоновыми артефактами.
    1. Откройте программное обеспечение Fiji (дополнительный рисунок 1A).
    2. Нажмите «Плагины» в строке меню (дополнительный рисунок 1A).
    3. Выберите OpenComet (дополнительный рисунок 1B).
    4. Нажмите «Просмотр» в разделе «Входные файлы» и выберите изображения анализа комет для анализа (дополнительный рисунок 1C).
    5. Нажмите «Просмотр» в каталоге выводов и определите папку назначения для выходных файлов (дополнительный рисунок 1C).
    6. Нажмите «Запустить», чтобы запустить автоматический анализ (дополнительный рисунок 1C). Этот этап завершает рабочий процесс обработки и анализа данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой экспериментальной группы это исследование количественно оценивало процент ДНК хвоста (%Tail DNA) из рандомизированного отбора не менее 50 клеток. Последующий статистический анализ использовал односторонний анализ дисперсии (ANOVA) для сравнения средних групп, при этом p < 0,05 считался статистически значимым.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Создание БКО

В этом исследовании были успешно установлены органоиды рака молочной железы из первичных опухолевых тканей. На начальном этапе культуры было чётко наблюдаемо большое количество отдельных клеток или кластеров мелких клеток, клетки распределялись относительно рассредоточенно и не имели явной трёхмерной сферической организации. Некоторые клетки имели круглые или почти круглые морфологии, что указывает на то, что клетки, происходящие ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Анализ кометы представляет собой значительный прогресс в методах оценки генотоксичности. Благодаря одноклеточному разрешению и прямой визуализации паттернов повреждения ДНК на основе электрофоретической миграции, этот метод обладает явными преимуществами по сравнению с традиционными генотоксичнымианализами 15.

Несколько критически важных этапов экспериментальной процедуры влияют на воспроизводимость и интерпретацию данных. Во-первых, ус...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.

Благодарности

Это исследование было поддержано проектом Инженерного исследовательского центра провинции Цзянсу по молекулярной таргетной терапии и сопутствующей диагностике в онкологии (SGK2202319), инновационной исследовательской командой высшего учебного заведения Цзянсу по науке и технологиям (2021), программой исследовательского центра инженерных технологий профессионального колледжа Цзянсу (2023), Фондом естественных наук высших учебных заведений Китая (грант No 24KJA310008), Ключевые программы Сучжоуского профессионального колледжа здоровья (szwzy202406), проект Государственной ключевой лаборатории радиационной медицины и защиты Университета Сучжоу (No GZK1202506), Программу талантов в области здравоохранения Дунву (DWWS2024002, DWWS2025009, DWWS2025013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
100 μm cell strainerBIOLOGIX15-1100
15 mL centrifuge tubesBIOFILNone15 mL centrifuge tubes
1 mL pipette tipsZhejiang Baidi Biotechnology Co., LTDH808633
200 μL pipette tipsZhejiang Baidi Biotechnology Co., LTDH808214
24-well platesCorning Incorporated3524
50 mL centrifuge tubesBIOFILNone50 mL centrifuge tubes
Breast Cancer Organoid Kit PlusMogenel Biotechnology MA-0807T011LPBCO culture medium
Comet SlideR&D SYSTEMS4250-050-03
Dry-bulb thermostatHangzhou Ruiyi Science and Technology Trading Co., Ltd.DH100-2Heating block
Dulbecco’s Modified Eagle MediumgibcoC11995500BTComplete cell culture medium
EDTATREVIGEN4250-050-04
Electric Constant-Temperature Water BathShanghai Mulang Instrument Manufacturing Co., Ltd.MSY-24Water bath
Electrophoresis apparatusBIO-RAD1645052
Fetal bovine serumEallBio03.U16001DC
Fluorescence microscopeWEIDAIM-300LD4
ForcepsBeyotimeFS019
GelRedBeyotimeD0140
GraphPad Prism 8.0GraphPad SoftwareStatistical analysis software
ImageJNational Institutes of Health, NIH1.54pImage processing software / image
LMA garoseR&D SYSTEMS4250-050-02Low-melting-point agarose 
Low-temperature high-speed centrifugeAnhui Zhongke Zhongjia Scientific Instrument Co., LTDKDC-40Centrifuge
Lysis SolutionTREVIGEN4250-050-01Lysis solution
MatrigelMogenel Biotechnology82755The basement membrane matrix
NaOHDAMAO1588
OpenComet softwareOpen-source ImageJ plugin, National University of Singapore, Singaporev1.3.1
Organoid Dissociation SolutionMogenel BiotechnologyMB-0818L01L
Penicillin – StreptomycinBeyotimeCO22
Phosphate-buffered saline (1x PBS)Fdbio Science Biotech Co.,LtdFD7032PBS
PipettesRaininPipet-Lite XLS
ScissorsBeyotimeFS001
Tissue Digestion SolutionMogenel BiotechnologyMB-0818L06L/MB-0818L06SOrganoid dissociation solution

Ссылки

  1. Xiong X, Zheng LW, Ding Y, Chen YF, Cai YW, Wang LP, et al. Breast cancer: pathogenesis and treatments. Signal Transduct Target Ther. 2025;10(1):49.
  2. Giaquinto AN, Sung H, Newman LA, Freedman RA, Smith RA, Star J, et al. Breast cancer statistics 2024. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 2024;74(6):477-95.
  3. Kciuk M, Gielecińska A, Mujwar S, Kołat D, Kałuzińska-Kołat Ż, Celik I, et al. Doxorubicin—An Agent with Multiple Mechanisms of Anticancer Activity. Cells. 2023;12(4):659.
  4. Glibetic N, Bowman S, Skaggs T, Weichhaus M. The Use of Patient-Derived Organoids in the Study of Molecular Metabolic Adaptation in Breast Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 2024;25(19):10503.
  5. Leung D, Kaur J, Richardson G, Jardé T. Breast cancer organoids: Advancements and applications in precision medicine. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 2025;214:104914.
  6. Nik-Zainal S, Davies H, Staaf J, Ramakrishna M, Glodzik D, Zou X, et al. Landscape of somatic mutations in 560 breast cancer whole-genome sequences. Nature. 2016;534(7605):47-54.
  7. Hua Z, White J, Zhou J. Cancer stem cells in TNBC. Semin Cancer Biol. 2022;82:26-34.
  8. Neal JT, Li X, Zhu J, Giangarra V, Grzeskowiak CL, Ju J, et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 2018;175(7):1972-88.e16.
  9. He X, Chen F, Zhou L, Sun Y, Liu Q, Chen W, et al. The comet assay: A contemporary approach for detecting genomic instability. DNA Repair (Amst). 2025;154:103899.
  10. Ladeira C, Moller P, Giovannelli L, Gajski G, Haveric A, Bankoglu EE, et al. The Comet Assay as a Tool in Human Biomonitoring Studies of Environmental and Occupational Exposure to Chemicals-A Systematic Scoping Review. Toxics. 2024;12(4):270.
  11. Moller P, Gajski G, Geric M, Giovannelli L, Azqueta A, Haveric A, et al. The comet assay as a tool in human biomonitoring studies: Effects of confounding factors. Mutat Res Rev Mutat Res. 2025;796:108566.
  12. Collins A, Moller P, Gajski G, Vodenkova S, Abdulwahed A, Anderson D, et al. Measuring DNA modifications with the comet assay: a compendium of protocols. Nat Protoc. 2023;18(3):929-89.
  13. Caipa Garcia AL, Phillips DH. Organoids for Genotoxicity Assessment. Methods Mol Biol. 2026;2986:491-510.
  14. Cardoso R, Dusinska M, Collins A, et al. In vivo mammalian alkaline comet assay: method adapted for genotoxicity assessment of nanomaterials. Front Toxicol. 2022;4:903896.
  15. Kyrylenko S, Chorna I, Klishchova Z, Yanko I, Roshchupkin A, Deineka V, et al. Elucidation of Potential Genotoxicity of MXenes Using a DNA Comet Assay. ACS Applied Bio Materials. 2024;7(12):8351-66.
  16. Rodrigues D, Coyle L, Fuzi B, Ferreira S, Jo H, Herpers B, et al. Unravelling Mechanisms of Doxorubicin-Induced Toxicity in 3D Human Intestinal Organoids. Int J Mol Sci. 2022;23(3):1286.
  17. Bankoglu EE, Schuele C, Stopper H. Cell survival after DNA damage in the comet assay. Arch Toxicol. 2021;95(12):3803-13.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

233233

Похожие статьи