Количественное изображение живой клетки формы ядра и динамики хроматина во время развития и воздействия стресса окружающей среды в корне Arabidopsis thaliana

Summary

Этот процесс использует конфокальную микроскопию в сочетании с флуоресцентно маркированной линией ядра и маркера хроматина у Arabidopsis thaliana для одновременной фиксации динамики ядра и хроматина в корнях Arabidopsis и изучения изменений этой динамики в ответ на факторы развития и окружающей среды.

Abstract

Ядро является характерной органеллой эукариотических организмов. В отличие от классического учебного взгляда на статические ядра, форма ядра в живых клетках динамична. Изменённая или деформированная форма ядра является характерным признаком рака в клетках животных и стресса окружающей среды у растений. Белки ядерной оболочки взаимодействуют с хроматином для регулирования экспрессии генов. К сожалению, мало что известно о влиянии абиотического напряжения на форму, движение и динамику хроматина. Чтобы решить эту проблему, мы разработали конвейер с использованием конфокальной микроскопии и программного обеспечения для отслеживания частиц для количественной оценки динамики ядра и хроматина в корнях Arabidopsis под контролем и условии абиотического стресса. Этот метод конфокальной визуализации использует двойную флуоресцентно маркированную линию — белок ядерной оболочки и хроматин — для проведения живой клеточной визуализации корня в модельном растении Arabidopsis thaliana в условиях контроля и соляного стресса. Эти захваченные фильмы анализируются для количественной оценки динамики ядра и хроматина с помощью открытого программного обеспечения для обработки изображений Fiji/ImageJ с помощью плагина TrackMate. Для подтверждения этого метода мы сфотографировали и количественно измерили движение хроматина в контрольных и солёных корнях, выявив снижение скорости хроматина в условиях солёного стресса. Этот метод позволяет проводить количественное изображение живых клеток формы ядра корня и динамики хроматина во время развития растений и экологического стресса, что позволяет анализировать изменения в динамике ядра и хроматина, вызванные абиотическими стрессорами.

Introduction

Форма ядра варьируется в зависимости от типов клеток и в процессе развития у корней Arabidopsis thaliana ^1,2. Например, форма ядра сферически в активно делящихся меристематических областях. В отличие от меристематической области, ядра в зоне перехода корня и удлинения менее сферические. Кроме того, ядра в дифференцированных клетках, таких как корневые волоски, проходят через плотное основание корневых волосков и активно превращаются в удлинённые^{ядра 3,4,5}. Динамические изменения формы и движения ядра имеют решающее значение для функционирования ячейки ^6,7. Дефекты формы ядра приводят к функциональным нарушениям, таким как снижение движения^{ядра 1,3}. В клетках млекопитающих изменения формы клеток и ядра напрямую связаны с изменениями экспрессии генов и синтеза^{белка 8}.

Во время интерфазы ДНК клетки организована как хроматин. ДНК хроматина связана вокруг гистонов, которые могут затягивать и ослаблять ДНК для изменения экспрессии. Аналогично, расположение хроматина относительно ядерной оболочки и близость к периферии ядерного ядра также важны для экспрессии^{генов 9}. Стресс окружающей среды, такой как осмотический стресс, изменяет форму ядра и, следовательно, меняет экспрессию набора чувствительных к прикосновению генов в корнях A. thaliana ¹⁰. В этом контексте важно изучать форму ядра и динамику хроматина с помощью таймлапс-визуализации живых клеток. Одним из важных аспектов ядерной динамики является скорость движения ядер, поскольку позиционирование ядра внутри клетки определяет экспрессию генов, а репозиционирование ядра требует перемещения^{ядер 11}. Скорость движения хроматина внутри ядра столь же важна, поскольку расположение генов внутри ядра критически важно для определения экспрессии^{генов 12}.

Ранее форма ядра и динамика хроматина изучались и количественно измерялись отдельно; В результате связь между формой ядра и динамикой хроматина осталась неизученной. При одновременном визуализации ядер и хроматина можно наблюдать их положение относительно друг друга, что может выявить такие движения, как вращение ядра и внутриядерное движение хроматина, которые иначе трудно или невозможно продемонстрировать. В этом методе мы представляем метод визуализации живых клеток для визуализации и количественного определения формы ядра с помощью флуоресцентно маркированного белка внешней ядерной оболочки WPP доменно-взаимодействующего белка 1 (WIP1)¹³ и хроматина с помощью динамики центромерного гистона H3 (CENH3⁾ 14 одновременно в условиях контроля и соляного стресса, с целью анализа изменений динамики ядра и хроматина, вызванных абиотическими стрессорами. Для реализации этого метода мы сгенерировали линию WIP1-GFP/CENH3-mRFP A. thaliana. Кроме того, мы количественно изучали динамику хроматина, используя плагин TrackMate из открытого программного обеспечения ImageJ/Fiji. Мы протестировали методы двойной флуоресцентной линии и динамики хроматина, представленные здесь, в условиях соляного напряжения, и обнаружили изменение морфологии и динамики центромерных фокусов из-за условий напряжения. Этот простой и воспроизводимый метод идеально подходит для высокопроизводительного отслеживания динамики ядра и хроматина в корнях Arabidopsis в различных условиях абиотического напряжения.

Protocol

1. Выращивание всходов A. thaliana

1. Подготовка среды для роста
   1. Налейте 800 мл чистой воды в стакан объёмом 1 л на тарелке для помешивания. Добавьте батончик для перемешивания в стакан.
   2. Включите размешивательную пластину на 600 об/мин.
   3. Добавьте 10 г сахарозы в стакан.
   4. Добавьте в стакан 2,16 г растительной среды Murashige и Skoog (MS).
   5. Добавьте по 5 мг агар в каждую из двух бутылок медиа по 1 л.
   6. Маркируйте одну бутылку как «1/2 MS», а другую — как «100 mM NaCl».
   7. Маркируйте обе крышки бутылки автоклавной лентой.
   8. Добавьте 5,84 г NaCl в бутылку с надписью «100 mM NaCl».
   9. Наполните стакан 1 литром чистой воды.
   10. Верните стакан на тарелку для перемешивания и дождитесь, пока сахароза и рассеянный склероз растворятся.
   11. Вылейте содержимое стакана в градуированный цилиндр объёмом 1 л.
   12. Налейте 500 мл градуированного содержимого цилиндра в каждую бутылку.
   13. Среда для роста автоклава и 250 мл чистой воды с жидким циклом 60 минут при 121 °C.
       ПРИМЕЧАНИЕ: При автоклавировании среды и воды убедитесь, что крышки свободны, чтобы избежать возможных взрывов.
   14. Закрутите крышки для формального материала.
   15. Переверните бутылки для выращивания 7 раз, чтобы гарантировать полное распределение агару.
   16. Храните растительные средства в холодильнике при температуре 4 °C до необходимости и разогревайте в микроволновке для жидкости.
2. Установка растенных пластин и семян
   1. В вытяжке с помощью пипеточного пистолета нанесите 50 мл растительной среды в каждую из десяти пластин (рисунок 1A).
   2. Пока среда затвердевает, очистите семена WIP1-GFP x CENH3-mRFP, заливая их в микроцентрифугную трубку с 1 мл этанола 70% в течение 10 минут (рисунок 1B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с этанолом убедитесь, что рядом нет открытого пламени.
   3. Через 10 минут, в вытяжке, удалите этанол и дважды промывайте семена 1 мл автоклавной воды (рисунок 1C).
   4. После того как среда застыла, используйте пипетку объёмом 1000 мкл, чтобы разместить очищенные семена на выращивающих пластинах двумя рядами по 14 семян на тарелке (рисунок 1D).
   5. Маркируйте пластины перманентным маркером и запечатайте их микропоровой лентой перед выходом из вытяжки (рисунок 1E).
3. Прорастающие всходы
   1. Оберните пластины для роста в алюминиевую фольгу и холодно стратифицируйте их в холодильнике при температуре 4 °C минимум на 2 дня (рисунок 1F).
   2. После холодной стратификации вынимите тарелки из холодильника и оставьте их вертикально под лампами для роста (~80 мкмоль/^м²/с) минимум на 4 дня (рисунок 1G).
   3. Перенесите половину пластин в среду для роста NaCl объемом 100 мМ в вытяжной вытяжке, затем запечатайте и маркируйте пластины (рисунок 1H).
   4. Выращивайте тарелки под лампами для выращивания в течение 2 дней перед съёмкой (рисунок 1I).

2. Живая клетка с изображением ядер корня A. thaliana и хроматина

1. Подготовка слайдов
   1. Пипетта 60 мкл чистой воды на стеклянный слайд (рисунок 2A).
   2. Положите в воду 3 корни саженцев A. thaliana возрастом 6 дней (рисунок 2B).
   3. Положите на корни затворную крышку размером 22 мм × 22 мм #1.5, не закрывая листья (рисунок 2C).
2. Настройки конфокального микроскопа
   1. Установите время лазерной экспозиции на 1000 мс (1 с).
   2. В лазерном комбайнере установите лазер 488 нм на 50% для зелёного флуоресцентного белка (GFP) и на 561 нм на 50% для красного флуоресцентного белка (RFP) (см. рисунок 2D). Изображение с объективом 20× без оптического зума. Если запись длится дольше 10 минут, уменьшите интенсивность, чтобы уменьшить фотоотбеливание.
   3. Установите размер шага Z-среза на 0,3 мкм.
   4. Установите интервал на 1 минуту, а общую продолжительность — на 10 минут.
3. Визуализация
   1. Найдите корни, выберите до 20 z-срезов и захватите 16-битные изображения.
   2. Начинайте таймлапс.
   3. Сохраняйте таймлапс в формате TIFF с помощью безпотерьевой компрессии.
   4. Переместить данные на компьютер для анализа.

3. Отслеживание и анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Потребуется фиджийская версия открытого программного обеспечения ImageJ (рекомендуется версия 1.54), которая поставляется с предустановленным TrackMate.

1. Инициализация
   1. Открыть изображение J/Fiji.
   2. Нажмите и перетащите .vsi-файл в основное окно приложения ImageJ/Fiji (рисунок 3A).
   3. Появится подсказка под названием «Опции импорта биоформатов »; нажмите Ок в правом нижнем углу (рисунок 3B).
   4. Появится запрос под названием Bio-Formats Series Options . Убедитесь, что выбран Series 1 , и нажмите Ok в левом нижнем углу (рисунок 3C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Файл может загружаться за минуту, особенно если в нём много Z-слоев или временных точек.
   5. После открытия изображения (рисунок 3D) разделите сигналы, переключившись в основное окно ImageJ на Изображение > цветные > разделённые каналы (рисунок 3E). Это создаст два отдельных окна: одно для ядер, маркированных GFP, и другое для хроматина с меткой RFP (рисунок 3F).
2. Предварительная обработка хроматина
   1. Определите, какое из двух окон соответствует хроматину.
   2. Кликните на окно хроматина (рисунок 3F) и примените операцию Z-проекта, перейдя по основному окну ImageJ к стекам > изображению > проекте Z (рисунок 4A).
   3. Измените тип проекции на Максимальную интенсивность и убедитесь, что Все временные кадры активны, затем нажмите Ок (рисунок 4B).
   4. Откройте меню контраста, нажав Ctrl+Shift+C или переключившись в главное окно ImageJ к изображению > отрегулировать > яркость/контраст (рисунок 4C).
   5. Сдвините вторую планку ( обозначенную как Максимум) влево, чтобы хроматин стал хорошо виден (рисунок 4D).
3. Отслеживание хроматина
   1. Перейти к плагинам (рисунок 5A).
   2. Нажмите вниз на стрелку в меню плагинов, чтобы прокрутить до опции отслеживания (рисунок 5A).
   3. Нажмите трекинг, затем TrackMate.
   4. Появятся начальные настройки. Убедитесь, что настройки калибровки точны, затем нажмите «Далее » (рисунок 5B).
   5. Выберите детектор порога и нажмите Next (рисунок 5C).
   6. В окне изображения переходите к последнему кадру таймлапса (рисунок 5D).
   7. Рядом с порогом интенсивности нажмите «Авто», затем нажмите «Предпросмотр».
   8. Отрегулируйте порог интенсивности и нажмите « Предварительный просмотр». Многократно регулируйте и просматривайте порог до тех пор, пока предпросмотр не включит весь хроматин и не содержит минимальный шум, затем нажмите Next (рисунок 5D).
   9. Происходит первоначальное обнаружение порогов; нажмите «Далее » (рисунок 5E).
   10. Ручной порог, пока не будет видно только хроматин, затем нажмите Next (рисунок 5F).
   11. Эта страница позволяет фильтровать пятна. Игнорируйте это и нажмите «Далее » (рисунок 6A).
   12. Выберите «Простой трекер LAP» и нажмите «Далее» (рисунок 6B). LAP-трекер применяется, когда отслеживаемые объекты не слиются и не разделяются.
   13. Установите максимальное расстояние для связывания в 5 микрон, максимальное расстояние для сокращения разрыва на 15 микрон, а максимальное расстояние для закрытия кадров — на 1. Нажмите далее (рисунок 6C).
   14. Отслеживание будет происходить. Треки будут отображаться в оригинальном окне изображения. Нажмите «Далее » (рисунок 6D).
   15. Эта страница позволяет фильтровать треки. Нажмите зелёную кнопку + в левом нижнем углу, чтобы создать фильтр, затем выберите количество мест в режиме трека и нажмите Auto (рисунок 6E).
   16. Убедитесь, что режим установлен на Выше. Это устранит пятна, которые быстро появляются и исчезают.
   17. Нажмите далее (рисунок 6E).
   18. Страница параметров отображения позволяет экспортировать данные в виде csv-файла. Внизу страницы нажмите кнопку «Треки», затем «Экспортировать в CSV » (рисунок 7A).
   19. Эта страница позволяет строить встроенные графики; игнорируйте это и нажмите «Далее».
   20. На последней странице сохраните видео с помощью наложения Capture и нажмите выполнить. Нажмите на неё, затем перейдите к файлу > сохранить как > GIF (рисунок 7B).
4. Базовый анализ скорости
   1. Откройте CSV треков в программе для создания таблиц.
   2. Удалить все столбцы, кроме TRACK_ID, POSITION_X, POSITION_Y, POSITION_T, FRAME и RADIUS.
   3. Места на каждой дорожке будут не по порядку. Чтобы упорядочить их, сначала заморозьте верхние четыре строки, затем создайте новый столбец с названием TRACK_FRAME и скопируйте и вставьте эту формулу в столбец: =concatenate(A4, "_", if(E4>9, E4, concatenate("0", E4))).
   4. Выберите столбец TRACK_FRAME , кликнете правой кнопкой мыши, затем выберите «Сортировать лист A–Z». Теперь места внутри каждого трека должны быть в порядке.
   5. Чтобы убедиться, что в середине треков нет отсутствующих пятен, создайте новый столбец и используйте такую формулу: =if(E4>E3, E4-E3, «NA»). Убедитесь, что первая точка каждого трека возвращает «NA», а остальные — 1.
   6. Создайте столбец для Speed (микрон/кадр) и вставьте в него следующую формулу: =if(H4="NA", "NA", sqrt((B4-B3)^2 + (C4-C3)^2)). Для вычисления расстояния между двумя точками будет использована теорема Пифагора.
   7. Чтобы преобразовать это в Скорость (микрон/секунда), создайте новый столбец и вставьте в него следующую формулу: =IF(I5="NA", "NA", I5/(D5/E5)). Это найдёт секунды/кадр и соответственно переводит микроны/кадр.

Results

Живая клеточная визуализация ядерной оболочки и динамики хроматина
Мы сгенерировали двойную линию флуоресцентных маркеров, включающую белок внешней ядерной оболочки WIP1-GFP и центромерный хроматин CENH3-mRFP (рисунок 8). Четырёхдневные рассады перемещались на контрольную пластину или пластины с NaCl объемом 100 мМ на 2 дня. Через 2 дня инкубации наблюдается явное подавление роста корней при обработке солью, как ранее^соо...

Discussion

Представленный здесь метод идеально подходит для отслеживания динамики хроматина. По сравнению с прошлыми методами живой клеточной визуализации с отдельной визуализацией, одновременная визуализация ядер и хроматина позволяет исследовать связь между ядерной и хроматиновой динамикой. Это может выявить такие движения, как вращение ядра и внутриядерное движение хроматина, которые в противном случае трудно продемонстрировать.

В качестве метода живой клеточной визуа...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
½ среды Murashige и Skoog (MS)	bioWorld	30630058
3M лента с микропорами	Amazon	A-1530-0
Программное обеспечение для приобретения	Olympus/Evident	CellSens
Агар	bioWorld	40100072
CENH3-mRFP	ABRC	CS799459
Покровное стекло	Genesee	29-116
Стеклянная пластинка	Genesee	29-101
Image/Fiji	Открытый исходный код	https://imagej.net/software/fiji/downloads
Микроскоп	Olympus/Evident	IX83
Хлорид натрия	Fisher Scientific	BP358-212
Спинающий диск	Yokogawa	CSU-W1
Квадратные петри блюдца	Simport	26-275
Сахароза	bioWorld	41900152
WIP1-GFP	ABRC	CS39987