Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Исследовательская статья
* These authors contributed equally
В данном исследовании сочетается модель глазной гипертензии у крыс с экспериментами in vitro механического напряжения, агониста/ингибитора и siRNA в склеральных фибробластах человека, чтобы показать, что экспрессия Piezo1 повышается во время ремоделирования склерального внеклеточного матрикса и функционально участвует в дифференцировке миофибробласта.
Механическая дифференциация миофибробласта, вызванная деформацией, является ключевым механизмом, лежащим в основе ремоделирования склерального внеклеточного матрикса (ECM) при глаукоме. Однако преобразование механических деформаций в биохимические сигналы внутри склеральных фибробластов остаётся недостаточно разъясненным. В данном исследовании была направлена изучение роли пьезо1 в клеточной пролиферации и дифференциации в контексте механической деформированной дифференцировки миофибробласта во время ремоделирования склерального ЭКМ. Дизайн исследования сочетает наблюдения экспрессии in vivo из недельной модели глазной гипертензии у крыс с in vitro механистическими анализами с использованием циклического механического растяжения (10% при 0,5 Гц до 24 часов) и фармакологической модуляции Piezo1 (агонист Yoda1, ингибитор GsMTx4 и siRNA knockdown) в первичных склеральных фибробластах человека (клетки HSF). Наши результаты показывают, что Piezo1 экспрессируется в склеральной ткани и клетках HSF. В группе in vivo наблюдалось значительное повышение уровня белка Piezo1 в склере глазных гипертонических крыс через неделю, что совпало с повышенной экспрессией коллагена типа I (COL1) и актина α-гладкой мышцы (α-SMA). В экспериментах in vitro механическое растяжение (8–24 часа) повышало экспрессию пьезо1 в клетках HSF. Кроме того, активация Piezo1 с Yoda1 (24 часа) способствовала пролиферации клеток HSF и усиливала экспрессию α-SMA и COL1. Напротив, подавление или торможение Piezo1 подавляло экспрессию COL1 и затрудняло дифференцировку миофибробласта под механическим напряжением. Кроме того, активация Piezo1 приводила к повышению экспрессии белка, ассоциированного с Yes (YAP), тогда как экспрессия YAP, вызванная механическими штаммами, снижалась при снижении или ингибировании Piezo1. В заключение, наши результаты свидетельствуют о том, что Piezo1 играет роль в механической экспрессии ключевых компонентов ECM в склере при глаукоме и может представлять потенциальную терапевтическую цель, требующую дальнейшей валидации in vivo.
Глаукома является одной из ведущих причин необратимой слепоты, характеризующейся прогрессирующей дегенерацией ганглиозных клеток сетчатки (RGC) и аксонов головки зрительного нерва (ONH), затронув 76 миллионов человек по всему миру в 2020году 1,2. Повышенное внутриглазное давление (ВГД) является наибольшим фактором рискаглаукомы 3, и снижение ВГД в настоящее время является единственным доступным способом задержки развития и прогрессированияглаукомы 4. ONH, структура, в которой аксоны RGC выходят из глаза, является основным объектом повреждения глаукомы. Повышение ВВС вызывает механическое напряжение и смещение в ONH, что приводит к дегенерации аксонов RGC внутри ламинарной криброзы (LC), что в конечном итоге приводит к глаукоматозной оптическойневропатии 5,6.
Перипапиллярная склера (ППС) является основной несущей тканью ONH, при этом механические свойства PPS определяют реакцию ONH на механическое напряжение, вызванноеИОП, 7,8. Конечное моделирование элементов и ex vivo исследования подтвердили, что биомеханический штамм LC зависит от склеральной жёсткости, а повышенная жёсткость PPS способствует снижению деформации вLC 9,10. Затем вариации жесткости 11,12 и толщины13 PPS могут изменять биомеханические свойства, связанные с ВГД, что дополнительно изменяет восприимчивость к глаукоматозному повреждению зрительногонерва 14,15. В биомеханических исследованиях жёсткость глаукоматозной склеры глаз была выше нормальной склеры у посмертных глаз человека 16,17, а перипапиллярное склерационное ужесточение стабильно наблюдалось как при глаукоме человека, так и у экспериментальных животныхмоделей 18,19,20. Эти данные свидетельствуют о том, что ужесточение склеры может быть защитным ответом за счёт уменьшения деформации ONH, вызванной ВГД, во время глаукомы.
Биомеханические характеристики ткани склеры обусловлены составом внеклеточного матрикса, синтезируемогофибробластами 21. Недавние данные свидетельствуют о том, что механическое напряжение, возникающее при повышении ВГ, способно активировать склеральные фибробласты, находящиеся всклере 22, способствовать дифференцировки миофибробласта23 и приводить к ремоделированиюЭКМ 24,25. Механическое преобразование миофибробласта, вызванное деформацией, является ключевым процессом при ремоделировании склеральной ЭКМ при глаукоме, однако неясно, как механическое напряжение превращается в биохимические сигналы и клеточные ответы в склеральных фибробластах.
Piezo1 является одним из представителей нового уникального семейства неселективных катионных механочувствительных каналов, участвующих в фиброзе нескольких органов, включая сердечно-сердечную и легкуюкожу 26,27. Механическое напряжение может активировать клеточные каналы Piezo1, что приводит к увеличению притокаCa2+ 28, тем самым вызывая кальциевые сигналы для регулирования различных клеточных активностей, включая пролиферацию, подвижность и дифференцировкуфибробластов 29,30. Недавние исследования показали, что при механическом напряжении Piezo1 стимулирует фиброзные процессы в коже, стимулируя пролиферацию, подвижность и дифференцировкуфибробластов 31. Это исследование включает два дополняющих компонента: описательное in vivo исследование экспрессии Piezo1 в модели глазной гипертензии у крыс и механистическое исследование in vitro с использованием первичных человеческих склеральных фибробластов под циклическим механическим напряжением. Мы выдвинули гипотезу, что механический штамм активирует Piezo1, который способствует дифференцировки миофибробласта и экспрессии компонентов ECM в склеральных фибробластах, возможно, через сигнализацию YAP.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Самцов крыс рода Спраг-Доули (8 недель) добывали из Центра экспериментальных животных Детской больницы Университета Фудань. Все крысы находились ad libitum и содержались в условиях SPF при 22±1 °C и с 12-часовым дневно-ночным циклом. Все эксперименты на животных соответствовали Заявлению ARVO по использованию животных в офтальмологических и зрительных исследованиях и были одобрены Институциональным обзорным советом и Этическим комитетом Детской больницы Университета Фудань (2022JS-EKYY-019). Склеральные ткани человека, используемые для получения первичных человеческих склеральных фибробластов, были получены из донорской склеры в соответствии с институциональными рекомендациями, а все связанные процедуры были одобрены Институциональным обзорным советом Фуданьского университета (2024-YS-187).
Экспериментальная конструкция
В настоящем исследовании использовались как in vivo, так и in vitro подходы, концептуально связанные механической деформациями, для изучения вклада Piezo1 в склеральное ремоделирование ЭБМ. In vivo мы использовали модель глазной гипертензии у крыс для изучения экспрессии Piezo1 при повышенном ВМ. In vitro мы подвергли первичные склеральные фибробласты человека циклическому механическому растяжению для моделирования механического напряжения, испытываемого склерой при глаукоме, и манипулировали активностью Piezo1 с помощью фармакологического агониста (Yoda1), ингибитора (GsMTx4) и снижения siRNA.
Экспериментальная модель хронической глазной гипертензии (OHT)
Всего использовалось 18 самцов SD крыс. У каждой крысы правый глаз получал инъекцию карбомера для индуцирования глазной гипертензии (ОГТ), при этом контралатеральный левый глаз выступал в качестве контрольной группы (НТ). Было проведено три независимых биологических повторения всего эксперимента, что дало всего 18 глаз на группу. Экспериментальной единицей был индивидуальный глаз. Исследователи, проводящие измерения ВМС и вестерн-блот-анализ, были ослеплены к распределению групп.
Была создана экспериментальная модель хронического ГГТ у крыс, как описаноранее, 25. Кратковременно крыс анестезировали с помощью 10% хлоралгирата, а после расширения зрачков тропикамидом в переднюю глазную камеру вводили раствор карбомера (0,3%, 20 мкл). Для предотвращения инфекции применялся гидрохлорид хлортетрациклина. Измерения ВВС проводились с помощью отскочного тонометра через 3 и 7 дней. Ткани из склеры были собраны через неделю после того, как модель считалась установленной.
Склеральные ткани были выделены, как подробно описановыше 25. После анестезии крыс перфузировались транскардиально с 4% формальдегидом в PBS. Посторонняя орбитальная ткань была рассечена из глобуса, а передние сегментные структуры (роговица, радужка, хрусталик) и стекловидное тело были аккуратно удалены. Сетчатка и хориоидная часть были аккуратно соскребли с внутренней склеральной стенки. Задние ткани склеры были собраны и идентифицированы патологическим окрашиванием H&E.
Культивирование клеток
Первичные склеральные фибробласты человека (клетки HSF) были ранее установленной клеточной линией от донорскойсклеры 32. Для каждого эксперимента использовались три независимых биологических реплики (клетки трёх разных доноров). Клетки HSF содержались в DMEM с дополнением 15% плодовой сыворотки крупного рогатого рогатого скота и 1% пенициллин-стрептомицином в стандартных условиях культуры (37 °C, 5% CO2, увлажнённая атмосфера). Культуры делились каждые четыре дня, а для всех экспериментов использовались клетки HSF между проходами 5 и 9. Клетки HSF были подтверждены с помощью иммунофлуоресценции с использованием маркеров актиновых клеток коллагена типа I и α гладкой мышцы.
Применение механической стимуляции
Циклическая механическая система растяжения использовалась для получения механического циклического растяжения. Плотность посева составляла 2×10 5 клеток/мл для клеток HSF, покрытых в пластинах с шестью колодцями и гибким дном, покрытым коллагеном. Клетки группы растяжения подвергались воздействию циклического растяжения с амплитудой 10% и 0,5 Гц, как описано в нашем предыдущемисследовании 32. Клетки, культивируемые в растяжённых пластинах, но оставленные статическими, служили контролем. Эксперимент по knockdown siRNA Piezo1: клетки получили 48-часовую трансфекцию Piezo1 siRNA или отрицательного контрольного siRNA перед механическим растяжением. После трансфекции клетки подвергались циклическому механическому растяжению в течение 24 часов. Были включены четыре группы: (A) контрольные клетки, трансфектируемые сиРНК, без растяжения; (B) контролировать клетки, трансфектируемые сиРНК, с помощью растяжения; (C) Пьезо1-сиРНК-трансфектированные клетки без растяжения; (D) Пьезо1 сиРНК-трансфектированные клетки с растяжением. Эксперимент с ингибитором пьезо1 (GsMTx4): клетки обработаны 5 мкм GsMTx4 до и во время механического растяжения. Были включены четыре группы: (A) необработанные клетки без растяжения; (B) необработанные клетки с растяжением; (C) клетки, обработанные GsMTx4, без растяжения; (D) клетки, обработанные GsMTx4, с растяжением (с присутствием GsMTx4 по всему материалу). Эксперимент с агонистом Piezo1 (Yoda1): клетки культивировались в присутствии 5 мкм Yoda1 в течение 24 часов. Были включены две группы: (A) необработанное (транспортное) управление; (B) Клетки, обработанные Yoda1.
Вестерн блоттинг
Уровни белка оценивались методом Western Blotting в соответствии с рутинными процедурами. Кратко мы провели образцы склеральных или культивированных фибробластов в буфере RIPA. Белок (20 мкг) был разложён SDS-PAGE и впоследствии нанесен на мембраны нитроцеллюлозы. Мембраны затем блокировались 5% BSA на 1 час при температуре окружающей среды, после чего проводилась ночная инкубация при 4 °C с соответствующими первичными антителами. Использовались антитела: Piezo1, коллаген типа I, актин α-гладкая мускулатура, YAP и GAPDH. Антитело Piezo1 было проверено производителем на вестерн-блот и иммунофлуоресценцию в тканях крыс и человека, при этом данные о нокауте/нокдауне доступны на листе продукта. После трёх промываний с TBST мы инкубировали мембраны соответствующими вторичными антителами, конъюгированными HRP (антикроличьими или мышиными) в течение 1 часа при комнатной температуре. Интенсивность полосы затем измерялась с помощью программного обеспечения для анализа изображений, и сигнал каждой целевой полосы нормализовался до сигнала GAPDH с одной и той же полосы. Полученные данные представлены как fold-change относительно управляющего условия.
Клеточная пролиферация
Клеточная пролиферация оценивалась с помощью колориметрического теста жизнеспособности согласно предоставленному протоколу. Мы добавили соединение тетразолия (10 мкл/мл) в каждую скважину и инкубировали пластины в течение 2 часов в стандартных условиях культуры (37 °C, 5% CO2). Затем поглощание считывалось на 450 нм.
Трансфекция малой интерферирующей РНК
Трансфекция Piezo1 siRNA была выполнена так, как описаноранее 31. Последовательности были следующими: Piezo1-siRNA, 5'-AGAAGAAGAUCCAAGUATT-3' (смысл) и 5'-UACUUGACGAUCUUCUCUTT-3' (антисмысл), отрицательный контроль (NC) siRNA, 5'-GUGAGCGUCUAUAUACCAUTT-3' (смысл) и 5'-AUGGUAUAUAGACGCUCACTT-3' (антисмысл).
Иммунофлуоресценция
Для иммунофлуоресценции культивированные клетки фиксировались 4% параформальдегида (20 мин, комнатной температуры), пермеабилизировали с 0,1% тритона X-100 (40 мин), а затем блокировали 10% BSA. Срезы ткани подвергались ночной фиксации в 4% параформальдегиде при комнатной температуре, после чего следовала проницаемость и блокировка. Образцы инкубировали с первичными антителами против Piezo1 и α-SMA. Впоследствии мы применили вторичные антитела, конъюгированные флуоресцентными красителями: зелёными антимышиными (для α-SMA) и красными маркированными антикроликами (для Piezo1), каждое с разбавлением 1:500. Ядра окрашивались с помощью DAPI, а изображения — с помощью флуоресцентного микроскопа.
Лечение агонистов и ингибиторов
Клетки HSF были обработаны 5 мкм GsMTx4 и 5 мкм агониста Piezo1 Yoda1 на основе предыдущихисследований 33.
Статистический анализ
Каждый эксперимент проводился в тройном экземпляре. Результаты представлены в виде среднего ± стандартного отклонения (SD). Для сравнения между двумя группами мы применили двухсторонний тест Student's t-test. Были проведены многочисленные групповые сравнения с односторонним ANOVA, после чего последовал пост-хок тест Тьюки. Нормальность данных проверялась тестом Шапиро-Уилка, а однородность дисперсий оценивалась с помощью теста Левена. Статистическая значимость была определена как p < 0,05. Все статистические анализы проводились с использованием специального программного обеспечения.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Пьезо1 экспрессируется в тканях склеры крыс и клетках HSF
Сначала мы исследовали экспрессию Piezo1 как в склеральных тканях крыс (in vivo), так и в культивированных склеральных фибробластах человека (in vitro). Для изучения ткани-специфической экспрессии Piezo1 была использована база данных аннотаций геновBioGPS 34. Анализ BioGPS показал, что Piezo1 сильно экспрессируется в различных тканях глаз, включая пигментный эпит...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Повышенное внутриглазное давление (ВГД) вызывает механическую нагрузку в головке зрительного нерва и ламинарной криброзе, способствуя дегенерации ганглиозных клетоксетчатки 38,39. Перипапиллярная склера (ППС) — это основная несущая ткань, влияющая на биомеханикуONH 40. Предыдущие исследования показали, что механическое напряжение индуцирует дифференциацию склерального фибробласта в миофибробласт и ремодели...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (грант No 82401257).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0.3% carbomer solution (Carbomer 940 polymer) | Solarbio, Shanghai, China | — | 20 μL |
| 10% chloral hydrate | Macklin, Shanghai, China | — | 3 mL/kg |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | — | |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-rabbit secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | — | |
| BioFlex six-well culture plates (coated with collagen I) | Flexcell Int Corp, Hillsborough, NC, USA | — | |
| Chlortetracycline hydrochloride | Zhenhua Pharmaceutical, Yunnan, China | — | |
| COL1 primary antibody | Novus Biologicals, CO, USA | — | |
| DMEM | Gibco, Grand Island, NY, USA | — | |
| FBS | Gibco Life Technologies, Australia | — | |
| GAPDH primary antibody | Bioworld, MN, USA | — | |
| GraphPad Prism version 8.4 | Inc., San Diego, CA, USA | — | |
| Nikon Eclipse E800 microscope | Nikon, Melville, NY, USA | — | |
| Nitrocellulose membranes | Pierce, Rockford, IL, USA | — | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone, South Logan, UT, USA | — | |
| Piezo1 primary antibody | Novus Biologicals, CO, USA | — | |
| Rebound tonometer (TonoLab) | Icare, Espoo, Finland | — | |
| RIPA buffer | Thermo Fisher Scientific, Shanghai, China | — | |
| The Flexcell FX-5000 Tension System | Flexcell International Corporation | — | Used to apply mechanical cyclic stretch to HSF cells. |
| Tropicamide | Bausch Lomb Freda, Shandong, China | — | |
| YAP primary antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, USA | — | |
| α-SMA primary antibody | Abcam, Cambridge, UK | — |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.