Методическая статья

Автоматизированное оперантное прерывистое употребление алкоголя у мышей с социальным содержанием с помощью системы тестирования интелликажа

156 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71345

⸱

5 июня 2026 г.

 ,  ,  , 
1Section on Neurobiology of Compulsive Behaviors, National Institute on Mental Health, Intramural Research Program, National Institutes of Health

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол предлагает методы высокопроизводительной, автоматизированной оценки алкогольного поведения у мышей, находящихся в социальных помещениях, запускаемых через систему тестирования IntelliCage. Представлена подробная методология оперантной, периодической парадигмы употребления алкоголя, а также экспериментальные файлы и код для анализа полученных данных.

Аннотация

Несмотря на известные ошибки социальной изоляции в поведении грызунов, многие исследователи полагаются на мышей с одиночным содержанием для оценки предпочтения алкоголя в доклинических моделях расстройства употребления алкоголя (AUD). Этот протокол описывает задачу социального употребления алкоголя, которая позволяет проводить высокопроизводительную, автоматизированную оценку поведения, употребляющего алкоголь у мышей без негативных эффектов стресса, вызванного социальной изоляцией. Система тестирования IntelliCage позволяет исследователям одновременно оценивать оперантное поведение при употреблении алкоголя у до 16 однополых мышей, каждая из которых уникально идентифицирована с помощью подкожно имплантированного радиочастотного идентификационного (RFID) транспондера. Доступ к бутылкам с сипером управляется программным обеспечением и может регулироваться индивидуально для каждой мыши. В этой хронической, периодической парадигме употребления алкоголя мыши добровольно проводят оперантные носовые уколы, чтобы получить доступ к бутылочкам с 20% алкоголя в течение шести недель подряд. Бутылки с алкоголем доступны только через день в течение 24 часов подряд и могут быть дополнены хинином для оценки нечувствительного к наказанию алкоголя. Посещения каждого оперантного угла, носовых углов и данных о лизании автоматически фиксируются для каждой мыши. Подробные экспериментальные методы и открытый исходный код для анализа записанных данных позволят исследователям оценивать поведение, связанное с употреблением алкоголя, характерное для AUD, всё более эффективной и этологически значимой.

Введение

Исследования на доклинических моделях имеют решающее значение для более глубокого понимания нейробиологических механизмов, лежащих в основе поведения, похожих на расстройства употребления алкоголя (AUD). Тем не менее, многие традиционные показатели употребления алкоголя у грызунов, такие как двухбутылочныйвариант 1,2 и тесты на питьев темноте 3,4,5, требуют ручного измерения объёма жидкости у грызунов, содержащихся в одном помещении, что является низкопроизводительным и подверженным ошибкам методу. Недавнее внедрение систем с открытым исходным кодом, использующих емкостнуютехнологию 6,7,8,9,10 или фотоэлектрические 11,12 для автоматизации подсчёта лизаля, представляет собой значительный прогресс в производительности, точности и технической чувствительности методов употребления алкоголя. Однако большинство систем ликометра в домашних клетках по-прежнему требуют одиночного содержания грызунов, что вызывает изоляционноенапряжение 13,14. Хотя сообщаемые результаты сильноразличаются 15,16, грызуны, как правило, предпочитают алкоголь приодиночном содержании 17,18,19,20. Однако влияние социальной изоляции на употребление алкоголя варьируется в зависимости от возраста животных, пола, условий проживания и предыдущегостресса 20,21,22. Социальная изоляция может значительно взаимодействовать с экспериментальными манипуляциями, чтобы ограничить достоверность оценённых поведенческих результатов, похожих на AUD.

Новые полностью автоматизированные системы мониторинга домашних клеток, такие как система тестирования IntelliCage (TSESystems 23, 24, 25) или альтернативы с открытым исходным кодом LIQ PARTI20 иFARESHARE 26, решают эту проблему, сочетая ликометрию с радиочастотным идентификационным (RFID) отслеживанием множественных животных, содержащихся в группах. Эти системы мониторинга в домашних клетках позволяют более эффективно и воспроизводимо количественно оценивать алкогольное поведение, не испытывая стресса, вызванного социальной изоляцией. Таким образом, они идеально подходят для высокопроизводительных, подтверждающих исследований экспериментальных манипуляций, влияющих на уязвимость к поведению, подобным AUD. Среди них уникальна система тестирования IntelliCage тем, что включает программируемые оперантные углы для доступа к бутылочкам с поиперами, что позволяет исследователям оценивать поведение поиска при отсутствии доступа к наркотикам, модулировать соотношение оперантов для отдельных животных и многое другое.

Здесь авторы представляют оперантную парадигму интермиттного употребления алкоголя, реализованную через систему тестирования IntelliCage среди мышей, находящихся в социальныхпомещениях 27,28. Эта парадигма позволяет проводить долгосрочную автоматизированную оценку употребления алкоголя у до 16 однополых мышей, каждая из которых уникально идентифицируется с помощью подкожно имплантированных RFID-транспондеров. Как описано ниже, мышей обучают оперально тыкать носом по фиксированному соотношению (FR)-3 для доступа к бутылочкам с сипером. После короткого периода обучения бутылки с сипером в двух из четырёх углов оперантов заменяются на 20% спирта (95% этанола [190 proof] в водопроводной воде, v/v). Мыши имеют постоянный доступ к воде, но с периодическим доступом к алкоголю через день в течение 24 часов (с 12:30 до 12:30). Алкогольные облизывания измеряются в течение шести недель, с помощью двухдневного теста на фальсификацию хинина (0,5 мМ, 1,0 мМ) на середине эксперимента для оценки нечувствительного к наказанию алкоголя. Данные посещения, носового пока и лизания записываются для каждой мыши (рисунок 1), извлекаются с помощью проприетарного программного обеспечения TSE и затем анализируются с помощью открытого конвейера29 для получения информации о поведениях, подобных AUD.

Этот протокол дополняет другие опубликованные применения системы тестирования IntelliCage для оценки поведения, похожих наAUD, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, а также других поведенческих расстройств, связанных с употреблениемпсихоактивных веществ 40, 41, 42. В соответствии с сообщениями, указывающими, что графики прерывистого доступа увеличивают добровольное потребление алкоголя у грызунов 1, 43, 44, 45, 46, этот протокол обеспечивает высокий уровень добровольного употребления алкоголя у большинства мышей. Тем не менее, как отмечают авторы на протяжении всего протокола, экспериментальные параметры легко модифицируются для решения экспериментальных вопросов. В целом эта методология предоставляет эффективное и гибкое решение для исследователей по изучению механизмов, лежащих в основе AUD.

figure-introduction-1
Рисунок 1: Полностью автоматизированное отслеживание визитов мышей, уколов и облизывания с помощью уникальной RFID-идентификации. (A) Мультяшная диаграмма имплантации RFID-транспондера мышей. RFID-транспондеры имплантируются подкожно в дорсоцервикальную область для обеспечения индивидуального отслеживания в автоматизированной системе мониторинга домашней клетки. (B) Схема фаз сбора данных в рамках автоматизированной, оперантной прерывистой парадигмы алкоголя. Считывается идентификация животного, а посещение в углу фиксируется с помощью двойной антенны RFID-кольца и показаний температурного датчика, которые должны быть положительными для записи визита (слева). После этого мышей обучают использовать носовой укол по расписанию FR-3, чтобы получить доступ к бутылочкам с посипером (в середине). Успешное уколывание носом даёт доступ к бутылочке в течение 5 секунд, после чего облизывания мыши фиксируются с помощью ликкометра на основе ёмкости (справа). Мультфильмы, созданные по модифицированным шаблонам BioRender Люси Андерсон, лицензированных под CC BY 4.0 (https://BioRender.com/ko79xuy). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Протокол

Все экспериментальные процедуры были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных NIH (IACUC) и соответствовали политике Службы общественного здравоохранения по гуманному уходу и использованию лабораторных животных.

1. Подготовка аппарата

ПРИМЕЧАНИЕ: Каждое оборудование системы тестирования IntelliCage состоит из большой пластиковой домашней клетки (39 см x 58 см x 21 см), в которой могут находиться до 16 однополых мышей. Предыдущие группы составляли от 8 до 16 мышей в клетке. Устройство оснащено четырьмя оперантными углами, все из которых подключаются к центральному микропроцессору на верхней крышке. Корм для грызунов доступен через большой металлический бункер, установленный в центре крышки. Внутри клетки мыши свободно перемещаются между углами оперантов и центральным жилым пространством, оборудованным подстилкой и материалами для обогащения. Каждый угол оперантов имеет небольшой круглый вход, в который физически входит только одна мышь за раз. Идентификация мыши считывается и записывается на основе двойных RFID-антенн и показаний температурного датчика, которые должны быть положительными для записи визита. В каждом оперантном углу мыши имеют два порта для носовых участков, каждый из которых управляет доступом к одной из двух моторных дверей. Эти программируемые моторизованные двери обеспечивают доступ к одной из двух бутылок с поипером. Исследователи вручную программируют условия доступа к бутылочкам-сиперу, а также чувствительность ликометров на основе ёмкостности. Данные посещения, носового покана и лизания записываются индивидуально для каждой мыши и передаются через центральный микропроцессор на компьютер, на который загружается проприетарная программа TSE. Хотя в этом протоколе это не обсуждается, каждая оперантная камера также содержит программируемый клапан воздуха для использования в аверсивном кондиционере.

  1. Оснастить пластиковую домашнюю клетку пятью сжатыми хлопковыми подушками (15,24 x 25,4 см), двумя небольшими хлопковыми квадратами (5,08 x 5,08 см) и четырьмя пластиковыми рыбельными конструкциями для подстилки и обогащения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование сжатых хлопковых подушек рекомендуется по двум причинам: (1) чтобы избежать возможной пыли или хлопьев от часто используемых материалов подстилки, мешающих работе двери, и (2) чтобы облегчить обнаружение драк между животными.
  2. Поместите верхнюю крышку с оперантными углами в пластиковую домашнюю клетку.
  3. Если он отключён, подключите все оперантные углы к центральному микропроцессору с помощью предоставленных кабелей, а затем подключите центральный микропроцессор к компьютеру, предварительно загруженному программным обеспечением TSE с использованием кабелей CAN.
    1. Если используете несколько устройств, подключайте все клетки к одному компьютеру последовательно.
  4. Подключите микропроцессор к источнику питания и убедитесь, что светодиодные лампы в каждом углу включаются, а все восемь моторизованных дверей двигаются.
  5. Наполните восемь бутылок с сипером ~250 мл водопроводной воды (или другой жидкости), надёжно нажмите на крышки для правильного герметизации, а затем аккуратно прокрутите отверстия ликкометра, обеспечив плотное соединение с ликометром.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чувствительность датчиков Visit, Nosepoke и Lick можно опционально оптимизировать с помощью пилотного эксперимента. Чтобы регулировать чувствительность каждого угла, следуйте инструкциям производителя, описанным в файле «Справка» программы «Контроллер». Все исследования использовали следующие параметры: посещение — 816 ВКЛЮЧЕНО/768 ВЫКЛЮЧЕНО; Nosepoke — 21 ON/26 OFF; Ликометр — 69 ВКЛЮЧЕНО/80 ВЫКЛЮЧЕНО/15 тайм-аут.
  6. Наполните контейнер кормом для грызунов.
  7. Включите компьютер, откройте приложение «Контроллер» и загрузите нужный файл эксперимента.

2. Подготовка животных

ПРИМЕЧАНИЕ: Животным следует имплантировать RFID-транспондеры как минимум за неделю до начала поведенческого тестирования, чтобы обеспечить достаточное время восстановления. Используйте мышей, выдержанных не менее ~50 дней, с весом тела более 15 г. Имплантация маленьких мышей увеличивает риск травмы мыши во время инъекции. В зависимости от линии мышей агрессивность может стать проблемой в условиях группового содержания, особенно у самцов. Снизите этот риск, разместив всех мышей вместе в подростковом возрасте. Авторы не наблюдали значимой агрессии в исследованиях с взрослыми мышами дикого типа C57BL/6 (~PND 80–150), но это не гарантирует обобщаемости данного протокола на другие генотипы, возрасты или жилищные структуры.

  1. Подкожно имплантируют мышам RFID-транспондеры в дорсоцервикальную область для уникальной идентификации.
    1. Распечатайте таблицу данных со списком всех экспериментальных животных с пробелом рядом с каждым ID животного, чтобы наклеить наклейку с их RFID-кодом.
    2. Соберите всех животных и необходимые припасы: RFID-транспондеры, перезагружаемый RFID-транспондер и индукционную установку изофлурана.
    3. Поместите первую мышь в индукционную камеру и анестезируйте с помощью испарённого изофлурана (расходомер кислорода: 1,5 мл/мин, изофлуран: 1,5–3,5%), пока мышь не начнёт делать большие, прерывисты вдохи и не реагирует на щелчки пальца.
      1. Пока мышь будет анестезиирована, загрузите RFID-транспондер на инжектор, прикрутив заранее загруженную иглу к основанию инжектора и медленно выведите шприц, пока не увидите движение микрочипа.
      2. Примените штрих-код, идентифицирующий RFID-код, на печатанную таблицу данных рядом с соответствующим идентификатором животного.
    4. Вынимите мышь из индукционной камеры и имплантируйте предварительно загруженный RFID-транспондер подкожно в дорсоцервикальную область.
      1. Предварительно убедившись, что мышь не реагирует на щелчок пальца, используйте большой и указательный пальцы недоминантной руки, чтобы ущипнуть загривку мыши прямо над лопатками.
      2. Используя доминирующую руку, введите иглу инъектора подкожно в задний конец загривки мыши, стараясь держать иглу поднятой выше и параллельно позвоночнику, чтобы не травмировать мышь.
      3. Держа кончик шприца внутри загривки мыши и крепко стабилизированный между большим и указательным пальцами, аккуратно двигайте доминирующей рукой, чтобы человек мог нажать на поршень инжектора.
      4. Вынимите RFID-транспондер, держа пальцы недоминантной руки зажатыми вокруг загривки, чтобы можно было почувствовать, как микрочип выходит из кончика шприца.
      5. Держа защищённую загривку, медленно снимайте инжектор. Отпускайте загривку только после полного снятия инжектора, чтобы не выпадать транспондер.
        ПРИМЕЧАНИЕ: По желанию можно добавить один шовный узел для закрытия кожи во время анестезии.
    5. Вернуть мышь в домашнюю клетку и следить за восстановлением после наркоза до полной передвижения.
    6. Следите за мышью на предмет признаков физического нарушения, включая частичный паралич, хромоту или круговое движение, которые могут указывать на нецелевую инъекцию. Если нарушения сохраняются более 24 часов или сильно влияют на здоровье животных, проводите гуманную эвтаназию.
      1. Наведите считыватель RFID-транспондера выше дорсоцервикальной области мыши и просканируйте для подтверждения успешного размещения.
    7. По желанию возьмите образец ткани для генотипирования.
      1. Повторяйте это со всеми экспериментальными мышами.
  2. На следующий день после первоначальной имплантации RFID-транспондера используйте считыватель RFID-транспондера, чтобы убедиться, что ни одна мышь не потеряла свои RFID-транспондеры. Если у мышей потеряли свои транспондеры, повторите процедуру с новым транспондером и обновите записи соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно, если у мыши должен выпадать RFID-транспондер, это происходит в течение 24 часов после имплантации. Это может произойти из-за неправильного размещения RFID-транспондера и/или груминга/царапания мыши в месте инъекции. Избегайте повторного введения в раны от предыдущих инъекций и исключайте мышей после трёх неудачных имплантаций RFID-транспондеров.
  3. Перед тем как перемещать мышей в аппарат IntelliCage, убедитесь, что все RFID-транспондеры могут быть успешно прочитаны. Взвешивайте и фиксируйте вес тела для всех мышей.

3. Подготовка экспериментальных файлов

ПРИМЕЧАНИЕ: Система тестирования IntelliCage управляется и управляется через графические пользовательские интерфейсы, предоставляемые TSE. Для проведения экспериментов IntelliCage используются три приложения: «Designer», «Controller» и «Analyzer». Разные фазы эксперимента запускаются через разные файлы эксперимента, которые разрабатываются в приложении «Designer» и затем запускаются в приложении «Controller». Подробная информация о том, как проектировать и адаптировать файлы экспериментов, была описанаранее в 48,49. Шаблоны четырёх файлов экспериментов, использованных в исследовании (Habituation.experiment, Water Training.experiment, Intermittent Alcohol.experiment, Open Bar.experiment), были предоставлены для помощи в воспроизведении протокола. В этих файлах фазовые смены происходят в 12:30 дня. Авторы выбрали это время, потому что животные содержались на световом цикле с 6:00 утра до 18:00. Это позволило провести непрерывную тёмную фазу для измерения пьяного поведения. Однако следователи могут захотеть изменить это время, чтобы оно соответствовало другим методам употребления алкоголя, например, процедурам «пить втемноте» 50.

  1. Настройте файлы экспериментов в приложении «Designer».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если работаете с шаблонными файлами, удалите четыре примера животных перед входом в текущую когорту. Также переименовуйте названия групп в соответствии с экспериментальным дизайном и добавляйте группы по необходимости. Убедитесь, что все новые группы начинаются с того же кластера, что и в шаблоне.
    1. Откройте файл Habituation.experiment в приложении «Designer» и аккуратно введите идентификатор животного, код RFID-транспондера и экспериментальную группу/генотип для каждой мыши. Сохраните файл с новым именем, чтобы сохранить шаблон.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если коды RFID-транспондеров введены с ошибкой, данные не будут записываться. Распределение животных в соответствующие экспериментальные группы поможет контролировать их поведение и, в конечном итоге, анализировать данные.
    2. Экспортировать информацию о животном в файл животного.
    3. Для каждого этапа эксперимента откройте соответствующий файл эксперимента и загрузите файл животных. Сохрани и переименуй соответствующе.
    4. Если вы проектируете файлы на отдельном компьютере, скачайте экспериментальные файлы на портативную флешку для транспортировки в комнату поведения.
  2. Скачайте все файлы эксперимента на компьютер, подключённый к устройству IntelliCage, и откройте первый файл в приложении «Контроллер». Проверьте, что вся информация загружается правильно.
  3. На бумаге или в электронном виде создайте экспериментальный журнал, в котором отмечаются дата и время, когда можно начать или остановить разные этапы эксперимента. Это значительно поможет в анализе, поскольку определённые состояния, связанные с наркотиками (например, спирт с фальсификацией с хинином) не фиксируются в архивных файлах IntelliCage.

figure-protocol-1
Рисунок 2: Экспериментальная хронология оперантного, прерывистого режима употребления алкоголя. (A) Схема аппарата IntelliCage с бутылками с алкоголем в двух из четырёх углов. (B) Экспериментальная хронология, отражающая график всех экспериментальных фаз, как это использовалось в предыдущей публикации23. Когорта 1 проводила тест на хинин с фальсифицированным алкоголем после заключения периодического употребления алкоголя, тогда как когорты 2 и 3 вернулись к периодическому употреблению алкоголя после фальсификации. (C) Подробный экспериментальный календарь, отражающий изменения программного обеспечения для всех экспериментальных этапов: привыкание, обучение воде, периодическое употребление алкоголя, тест на хинин с фальсифицированным алкоголем и «открытый бар»/бесплатный доступ к употреблению алкоголя. Замена клетки назначается как минимум раз в неделю после завершения модуля «Доступ к алкоголю ON». Мультфильмы, созданные по модифицированным шаблонам BioRender Люси Андерсон, лицензированных под CC BY 4.0 (https://BioRender.com/ko79xuy). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

4. Проведение эксперимента

ПРИМЕЧАНИЕ: Оперантная, периодическая парадигма употребления алкоголя состоит из пяти этапов: (1) привыкание, (2) обучение воде, (3) периодическое употребление алкоголя, (4) тест на хинин и (5) «открытый бар»/свободный доступ к употреблению алкоголя. Каждая фаза эксперимента проводится на различных файлах эксперимента, за исключением периодического употребления алкоголя и теста на хинин с фальсификацией алкоголя, которые используют параметры, указанные в файле Intermittent Alcohol.experiment . Помимо замены клетки, экспериментаторам следует проверять мышей как минимум три раза в неделю, чтобы оценить состояние животных и убедиться, что программное обеспечение работает корректно. Любые мыши, обнаруженные ранеными или нездоровыми, должны быть исключены из эксперимента. Для примера экспериментального графика см. рисунок 2.

  1. Изменения в клетке
    ПРИМЕЧАНИЕ: Меняйте клетки как минимум раз в неделю. Во время употребления алкоголя эти изменения выполняйте только после 12:30 во время «Только доступ к воде», чтобы не прерывать употребление алкоголя. Для этого файлы Intermittent Alcohol.experiment и Open Bar.experiment всегда начинаются с «Только доступ к воде». Из-за размеров клеток сложно справляться с занятыми клетками в одиночку. Авторы рекомендуют пригласить хотя бы одного дополнительного исследователя, помогающего с заменой клетки. Проверяйте мышей через 24 часа после каждой смены клетки, чтобы убедиться, что программа работает корректно и не было ли агрессии или драки в ответ на стресс при смене клетки.
    1. Перед началом замены клетки подготовьте новую, чистую пластиковую клетку с новой подстилкой и материалами для гнезда. Наполните каждую из восьми бутылок/клетки ~250 мл водопроводной воды или 20% спирта (95% этанола [190 proof] в водопроводной воде, v/v).
      ПРИМЕЧАНИЕ: По желанию следователи могут добавить небольшое количество старого материала подстилки в новую, чистую клетку. Это минимизирует нарушение установленной групповой иерархии и может снизить риск конфликтов.
    2. Остановить эксперимент в приложении «Controller». Убедившись, что мышей нет в оперантных углах, снимите металлический бункер для еды. Пусть один человек поднимет металлический микропроцессор достаточно высоко, чтобы второй мог вытащить пластиковую клетку из-под него. Проверьте правильное количество мышей.
    3. Выводите мышей одну за другой из грязной клетки, просканируйте RFID-транспондер и запишите вес тела. Визуально осмотрите каждую мышь на наличие признаков травмы или болезни.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Авторы рекомендуют фиксировать вес тела в электронной таблице (csv), чтобы её было легко читать в анализ.
    4. Временно поместите мышей в чистый контейнер после записи веса тела.
    5. Очистите верхнюю часть и углы влажным полотенцем, пропитанным дезинфицирующим средством. Особенно тщательно протирайте поверхность и нижний гребень угловой пластины, чтобы жидкость не попала на электронные детали.
    6. Поднимите металлический микропроцессор достаточно высоко, чтобы поставить новую, чистую пластиковую клетку.
    7. Аккуратно вставляйте новые бутылки с поипером в отверстия ликометра, обеспечивая плотное соединение с ликометром.
    8. Пересадите мышей в новое, чистое оборудование.
    9. Замените контейнер для кормов на новый, чистый кормовой бункер и свежий корм для грызунов.
    10. Заново запустите тот же эксперимент в приложении «Контроллер» или загрузите и начните новый файл эксперимента.
    11. Убедитесь, что программа работает правильно, и что все мыши получают визиты, уколы носом и облизывания правильно записываются.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Программа «Контроллер» автоматически покажет предупреждения, если животное не зафиксировало облизывание в течение 12 часов.
    12. Очистите грязное оборудование. Пластиковые клетки, бутылки с поипером и пластиковые роющие конструкции обычно можно промывать через типичные системы промывания в клетках.
  2. День 0: Привычка
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фаза привычки запускается с помощью файла Habituation.experiment . В этот период все бутылки с поипером содержат водопроводную воду. Мыши имеют свободный доступ ко всем бутылкам без оперантных носовых уколов. Моторизованные двери открываются, когда мыши входят в оперантный угол, открывая доступ к соплам для бутылок.
    1. После проверки наличия RFID-транспондера и записи веса тела мыши наполните все восемь бутылок с сипером ~250 мл водопроводной воды и аккуратно прокрутите в отверстия ликометра.
    2. Поместите до 16 однополых мышей в подготовленный аппарат IntelliCage.
    3. Загрузите файл Habituation.experiment в приложение «Controller» и начните запись.
    4. Убедитесь, что все моторизованные двери открываются правильно, когда мышь входит в оперантный угол, и что все визиты, удары и облизывание успешно фиксируются для каждой мыши. Если в течение 6 часов не было зафиксировано посещения, уколы носом или облизывания, проверьте файл .animal на наличие ошибок.
  3. Дни 1-3: Водная тренировка
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этап тренировки в воде проводится с использованием файла Water Training.experiment . Все бутылки с поипером должны содержать только водопроводную воду. На этой фазе мышей будут тренироваться носом на FR-1, а затем по графику FR-3, чтобы получить доступ к соплам для бутылки. После успешного осмотра в нос открываются моторные двери, обеспечивающие доступ к бутылке с поипером в течение 5 секунд. Когда индивидуальная мышь достигает 60% и выше, её переводят на расписание FR-3 на оставшуюся часть программы. Обычно мыши переходят на расписание FR-3 в течение 24–72 часов. Следите за работой животных в «Контроллере». Если животное не достигает графика FR-3 в течение 72 часов, его исключают из дальнейших экспериментов.
    1. Если все мыши выглядят гидратированными и невредимыми после 24 часов привыкания, прекратите запускать файл Habitatuation.experiment и начните запускать файл Water Training.experiment .
    2. Проверьте, что посещения, уколы и облизывание успешно записываются программным обеспечением для каждой мыши, и что все моторизованные двери открываются правильно.
  4. День 4+: Периодическое употребление алкоголя
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фаза прерывистого употребления алкоголя проводится с использованием файла Intermittent Alcohol.experiment . В этой фазе бутылки с поипером в двух из четырёх оперантных углов заменяются на 20% спирт. Уголки воды и алкоголя заранее задаются через функцию «Кластеры» в файле эксперимента. В шаблоне вода подаётся в углах один и три (помечены как «нейтральные»), а спирт — во втором и четвёртом углах (помечен как «неправильный»). Мыши имеют постоянный доступ к воде, но с периодическим доступом к алкоголю в течение 24 часов (с 12:30 до 12:30) через день. На FR-3 предусмотрено 5 секунд доступа в бутылках для всех углов. На этом этапе эксперимента проводите смену клеток в периоды «Только доступ к воде», чтобы не прерывать употребление алкоголя. Исследователи должны убедиться, что экспериментальные группы проявляют примерно одинаковое предпочтение ко всем четырём углам во время водного обучения, прежде чем назначать уголки алкоголя для периодического употребления алкоголя. В каждой из когорт экспериментальные группы демонстрировали примерно одинаковые посещения и облизывание по всем четырём углам во время водных тренировок. По этой причине авторы сохраняли фиксированные распределения по углам между группами. Экспериментаторы могут легко увидеть пропорцию ударов и визитов по углам через программу «Контроллер». Обязательно регулярно следите за визитами и анализируйте данные на протяжении всего эксперимента, чтобы избежать проблем (например, неисправности оборудования или «занятия» мышами определённые углы).
    1. После того как все мыши успешно достигли графика FR-3 для доступа к бутылкам с сипером, приготовьте 20% спирта (95% этанола [190 proof] в водопроводной воде, v/v; ~250 мл/бутылка).
    2. Перестаньте запускать файл Water Training.experiment .
    3. Уберите бутылки с сипером из оперантных углов второго и четвёртого (или в тех углах, которые вы указали в экспериментальном файле, если они отличаются) и замените каждую на ~250 мл 20% спирта.
    4. Аккуратно закручивайте новые бутылки с алкоголем в отверстия ликометра, обеспечивая плотное соединение с ликометром.
    5. Загрузите файл Intermittent Alcohol.experiment и начните запись.
    6. Проверьте, что посещения, уколы и облизывание успешно записываются программным обеспечением для каждой мыши, и что все моторизованные двери открываются правильно.
    7. После 12:30 следующего дня убедитесь, что программа успешно переключилась с модуля «Только доступ к воде» на модуль «Доступ к алкоголю ВКЛЮЧЕНО» и что в оперантных углах с алкоголем зафиксированы облизывания.
  5. День 16+: Тест на хинин с фальсифицированным алкоголем
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фаза теста на хинин фальсифицированный спирт проводится с использованием файла Intermittent Alcohol.experiment. На этой фазе бутылки с поипером в двух оперантных углах, ранее содержавших 20% алкоголя, заменяются на 0,5 мМ, а затем 1 мМ хинин содержит 20% алкоголя для оценки нечувствительного к наказанию алкоголя. Эти концентрации хинина, которые равны 0,016% и 0,032% хинина (w/v) соответственно, ранее были установлены как неблагоприятные в тестах групп27, 28 и других.31 мышь имеют постоянный доступ к воде, но прерывистые доступы к алкоголю с хинином в течение 24-часов через день (то есть один день с 0,5 мМ хинина, один день доступа только к воде, один день с 1,0 мМ хинина). Доступ для всех углов осуществляется по расписанию FR-3. В этом исследовании мыши выполняли эту фазу после 16 или 24 последовательных дней чистого периодического употребления алкоголя. Смены клеток не проводились в день воды между тестами на фальсификацию, чтобы избежать запутанных последствий стресса. После этого этапа эксперимента мыши могут либо начать употребление алкоголя с «открытым баром»/свободным доступом, либо вернуться к периодическому употреблению, чтобы оценить отскок после фальсификации.
    1. Приготовьте 0,5 мМ и 1 мМ 20% спирта с хинином (95% этанола [190 proof] в водопроводной воде, v/v; ~250 мл/бутылка).
    2. Сделайте замену клетки, убрав все бутылки с поипером.
    3. Наполните каждую бутылку в уголках спирта ~250 мл раствора 0,5 мМ с хинин с 20% спиртом.
    4. Аккуратно закручивайте новые бутылки с алкоголем в отверстия ликометра, обеспечивая плотное соединение с ликометром.
    5. Загрузите файл Intermittent Alcohol.experiment и начните запись.
    6. Проверьте, что посещения, уколы и облизывание успешно записываются программным обеспечением для каждой мыши, и что все моторизованные двери открываются правильно.
    7. После 12:30 дня убедитесь, что программа успешно переключилась с модуля «Только доступ к воде» на модуль «Доступ к алкоголю ВКЛЮЧЕНО» и что в оперантных углах с алкоголем зафиксированы облизывания.
    8. До 12:30 в следующий алкогольный день замените каждую бутылку в углу спирта на ~250 мл 1 мМ раствора 20% спирта с хинином. Нет необходимости останавливать эксперимент с переключателем бутылки.
    9. До 12:30 в следующий алкогольный день уберите бутылки с фальсифицированным спиртом и замените каждую на ~250 мл чистого 20% алкоголя.
  6. День 20+: «Открытый бар»/бесплатный доступ к употреблению алкоголя
    ПРИМЕЧАНИЕ: по желанию можно провести один день «открытого бара»/бесплатного доступа к употреблению алкоголя в качестве неоперативного контроля. Эта фаза запускается с помощью файла Open Bar.experiment . На этой фазе бутылки с поистером в двух из четырёх оперантных углов содержат 20% алкоголя, к которому мыши имеют доступ в течение одного 24-часового периода (с 12:30 до 12:30). Посещение уголка откроет двери без необходимости уколоть носом. В этом исследовании мыши выполняли эту фазу после периодического употребления алкоголя или тестирования на хинин с фальсифицированным алкоголем.
    1. При необходимости приготовьте 20% спирта (95% этанола [190 proof] в водопроводной воде, v/v; ~250 мл/бутылку).
    2. До 12:30 в следующий день алкоголя прекратите запускать текущий файл эксперимента.
    3. При необходимости уберите бутылки с поипером в уголках спирта и замените каждую на ~250 мл 20% алкоголя.
    4. Аккуратно закручивайте новые бутылки с алкоголем в отверстия ликометра, обеспечивая плотное соединение с ликометром.
    5. Загрузите файл Open Bar.experiment и начните запись.
    6. Проверьте, что визиты, уколы носом и облизывания успешно фиксируются программным обеспечением для каждой мыши, а все моторизованные двери открыты свободно.
    7. После 12:30 дня убедитесь, что программа успешно переключилась с модуля «Только доступ к воде» на модуль «Доступ к алкоголю ВКЛЮЧЕНО» и что в оперантных углах с алкоголем зафиксированы облизывания.

5. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Данные каждого эксперимента хранятся внутренне до тех пор, пока программа не будет остановлена. В этот момент создаётся архивированный архив данных, который хранится на локальном жёстком диске в C:\Documents\NewBehaviour\IntelliCage Plus\Archives. Имя файла состоит из даты и времени запуска программы и заканчивающегося в .zip.  Файлы архива данных содержат всю релевантную информацию об эксперименте, включая посещения углов (время начала, завершение, продолжительность, последовательность визитов), носпоки (время начала, время окончания, продолжительность), лики (время начала, время окончания, продолжительность), время светлого и тёмного времени, а также данные о температуре. Этот архив данных можно читать и анализировать с помощью программы «Analyzer». Хотя существуют и другие открытые пакеты для анализа выходных данных IntelliCage (Ruffini et al., 2021; Gastaldi и др., 2025), авторы создали конвейер анализа данных в R, используя публично доступные пакеты из Tidyverse для анализа данных из парадигмы прерывистого употребления алкоголя. Конвейер включает несколько этапов контроля качества, включая анализ заполненности углов на мышь; средняя частота посещения, укола носом и облизывания по циркадному ритму; скорость облизывания FR-3 на мышь; и ежедневный счёт облизывания на мышь. Кроме того, авторы предоставляют базовый анализ методов измерения употребления алкоголя. Основой служит шаблонный файл блокнота R с использованием языка разметки Quarto, который обрабатывает файлы данных и может быть адаптирован для специфических для животных когортных вариаций. Анализ проводится с использованием бесплатной версии RStudio. Файл шаблона проекта для R находится в репозиторииGitHub 29.

  1. Компиляция всех данных, включая zip-файлы, выводящиеся приложением «Controller», и CSV-файл с массой тела мыши.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Веса необходимы для нормализации приёма по массе тела. В этом рабочем процессе было разумнее собирать данные веса в отдельном файле, чем добавлять их в каждый файл эксперимента. Первый столбец должен совпадать с идентификатором Animal из архивных файлов.
  2. Скачайте шаблон проекта R с репозитория GitHub.
    1. Переименовать проект в соответствии с экспериментом.
    2. Шаблон поставляется с примерами файлов данных, иллюстрирующими, как работает анализ, которые находятся в подпапке data/C1. Замените архивные файлы на персонализированные архивы данных.
  3. Запустите RStudio и откройте проект.
    1. В разделе «Файлы» окна в правом нижнем углу RStudio перейдите к папке qmd и откройте файл IC_template.qmd.
    2. Скопируйте шаблон и переименуйте его в соответствии с экспериментом.
    3. Отрегулируйте метаданные в заголовке YAML дублированного файла и в начальном блоке кода.
    4. Скорректируйте имена групп в файле IC_Commons.R в каталоге R, чтобы они соответствовали экспериментальным группам. (Шаблон использует две группы: Control и LBN.)
  4. Запустите файл из блокнота.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробные инструкции приведены с файлами README.md в репозитории GitHub.

figure-protocol-2
Рисунок 3: Сопоставимый доступ к оперантным углам среди всех мышей во время тренировочных и периодических фаз употребления алкоголя. У одной когортымышей 23 тепловая карта, показывающая общее время, проведённое в каждом углу в день на мышь во время (A) привыкания и привычки к воде, по сравнению с (B) первыми четырьмя днями с периодическим употреблением алкоголя (n = 15 F, 16 M). Более тёмные красные цвета обозначают больше времени в углу в день. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-protocol-3
Рисунок 4: Мыши совершают визиты, тыкают носом и облизывают в соответствии с циркадным ритмом и успешно получают доступ к оперантной бутылке по расписанию FR-3. Среди одной когортымышей 23 года средняя плотность посещений оперантных углов (A), (B) проколов в нос и (C) облизывания в течение сессии в течение первых восьми дней тестирования. (D) Время, пока каждая мышь не облизывает соотношение FR-3 во время тренировки на воде. (E) Процент успешных визитов (= % посещений, приводящих к облизыванию / общее количество визитов) у мышей во время привыкания и привыкания к воде (слева) по сравнению с первыми четырьмя днями периодического употребления алкоголя (справа). Круговые символы обозначают женщин (n = 15); Квадратные символы обозначают мужчин (n = 16). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-protocol-4
Рисунок 5: Мыши испытывают сопоставимые ежедневные частоты облизывания во время тренировки и периодических фаз употребления алкоголя. Среди (A) самок (n = 15) и (B) самцов (n = 16) когорты по одноймыши — 23, общее количество ежедневных облизываний воды (синий) и алкоголя (красный) во время привычки и привыкания к воде (день -4–0) по сравнению с периодическим употреблением алкоголя (день 1–4). C обозначает контрольно-выращивание; L обозначает выращивание LBN. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-protocol-5
Рисунок 6: Мыши, подвергшиеся ранним трудностям в детстве, пьют больше алкоголя, чем контролируемые в оперантной, периодической парадигме употребления алкоголя. (A) Среднее количество алкоголя в день нормируется по массе тела (g; измеряется в неделю) в течение 8 дней прерывистого доступа алкоголя среди контролируемых мышей (серый; слева) и мышей, выращенных на LBN (розовая; правая). (B) Средние потребления алкоголя в день нормализованы по массе тела до, во время и после фальсификации хинина (0,5 мМ, 1 мМ). (C) График плотности, показывающий среднее количество алкоголя в день, нормированное по массе тела в течение одного дня доступа алкоголя FR-0 «Open Bar». Круговые символы обозначают женщин (n = 15); Квадратные символы обозначают мужчин (n = 16). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Результаты

Авторы использовали автоматизированное тестирование в домашних клетках через IntelliCage, чтобы оценить, как ранние трудности (ELA) изменяют уязвимость к поведениям, похожим наAUD 27. Чтобы вызвать трудности, они использовали парадигму ограниченного постелого и гнездования (LBN) — модель дефицита ресурсов, вызывающую непредсказуемый и фрагментированный материнскийуход 51,52,53,54,55,56. Исследование было новаторским в оценке влияния ELA на алкогольное поведение у мышей, находящихся в социальном жилье, без негативных эффектов стресса, вызванного социальной изоляцией. Это было важно, учитывая, что социальная изоляция во взрослом возрасте по-разному влияет на мышей, подвергшихся воздействиюELA 22,57. Для достижения максимальной пропускной способности авторы одновременно измеряли поведение при употреблении алкоголя в четырёх аппаратах IntelliCage, по два для каждого пола.

Авторы начали процесс анализа, проведя тщательный контроль качества исходных данных. Приведённые здесь графики показывают репрезентативные данные из первой когорты (n = 15 F, 16 M) опубликованногоисследования 23. Скрипт для всего анализа и построения графиков включён в репозиторийGitHub 29. Экспериментальный день 0 был исключён из-за смены клетки, что нарушило сбор данных. Среди аспектов анализа данных и контроля качества авторы обеспечили, чтобы все мыши имели примерно одинаковый доступ ко всем оперантным уголкам как во время тренировки (рисунок 3A), так и в периодических фазах употребления алкоголя (рисунок 3B). Это исключает значительные последствия того, что мыши «захищут» оперантные уголки, мешая другим мышам получить доступ к бутылочкам. Далее авторы подтвердили, что мыши совершали визиты, уколы носом и облизывания в ожидаемом циркадном ритме в течение экспериментальных дней (рисунок 4A–C), и что все мыши успешно совершили первый облизывание по соотношению FR-3 в течение шести часов после начала модуля (рисунок 4D). К концу фазы обучения в воде все мыши достигли относительно высокого уровня успешности облизывания (= % посещений, приводящих к облизыванию/общему числу посещений), что дополнительно подтверждает, что обучение было успешным к концу водного обучения (рисунок 4E).

Во время привыкания, приучения к воде и начала периодического употребления алкоголя мыши поддерживали примерно сопоставимое количество ежедневных облизываний (рисунок 5A–B). Хотя у некоторых мышей наблюдалось снижение общего ежедневного облизывания в начале оперантной водной тренировки на третий экспериментальный день (например, P241260-1), большинство мышей быстро приобрели график FR-1 и FR-3, чтобы поддерживать базовую скорость облизывания. Поэтому маловероятно, что мыши испытывали чрезмерное обезвоживание во время приучения к воде. Все мыши изучали расписание FR-3 с разумной скоростью. Когда в первый экспериментальный день началось периодическое употребление алкоголя, почти все мыши предпочитали употреблять алкоголь, хотя и с разной частотой. В целом, у мышей не было значительного увеличения общего количества ежедневных облизываний при употреблении алкоголя. Вместо этого мыши занимались меньшим количеством водных лизаний, чтобы компенсировать увеличенное потребление алкоголя.

В течение всех дней периодического употребления алкоголя у мышей первой группы значительно варьировалось ежедневное количество алкоголя относительно массы тела (рисунок 6A). Авторы обнаружили, что мыши, прошедшие парадигму LBN, имели значительно меньшую массу тела по сравнению с перекрёстнымиконтролями 23. Таким образом, при изучении групповых различий в употреблении алкоголя они решили нормализовать ежедневные алкогольные облизывания по массе тела, что авторы оценивали еженедельно во время смены клетки. Мыши, выращенные на ЛБН, обычно употребляли больше алкоголя на грамм массы тела, чем контроля, как при периодическом употреблении (см. рисунок 6A), так и при фальсификации хинина (рисунок 6B). Эта тенденция сохранялась в течение одного дня неоперативного открытого доступа (рисунок 6C). Эти результаты первой когорты согласуются с опубликованными результатами, в которых авторы сообщают, что мыши, подвергшиеся воздействию ELA, постоянно употребляли больше алкоголя на грамм массы тела, чем перекрёстные контрольные группы во время прерывистого доступа, что особенно заметно у мужчин23 года.

Благодаря эффективности автоматизированных систем мониторинга в клетках, опубликованное исследование подтвердило повышенное употребление алкоголя среди грызунов, подвергшихся воздействию ELA, при чрезвычайно надёжных размерах выборки, включая обоих полов (n = 54 контрольных, 43 LBN)23. Эти результаты представляют собой шаг вперёд в моделировании похожих на AUD поведения, наблюдаемых у пациентов с AUD с историей неблагоприятного детскогоопыта 58,59,60,61,62, и открывают дверь для будущих механистических исследований, выявляющих нейробиологию, лежащую в основе повышения уязвимости AUD после ELA.

Обсуждение

Как иллюстрирует использование авторами IntelliCage для надёжной оценки поведения, похожего на AUD, у мышей, подвергшихся воздействиюELA 27 , а также в предыдущих исследованиях трансгенныхлиний 28, автоматизированные системы мониторинга домашних клеток предлагают эффективное и гибкое решение для изучения доклинических моделей AUD. Одновременная оценка до 16 мышей, содержащихся в совместном доме, значительно увеличивает эффективность метода употребления алкоголя, при этом избегая запутанных последствий стресса, вызванного социальной изоляцией. Оперантная, периодическая парадигма употребления алкоголя позволяет экспериментаторам исследовать несколько аспектов поведения, похожего на AUD, в течение одного ~5–6 недель, включая запои, эскалацию со временем и нечувствительность к наказанию алкоголем. Хотя парадигма предлагает один метод оценки поведения, похожего на AUD, его можно легко адаптировать для хронического измерения периодического употребления алкоголя, проверки на нечувствительность к наказанию в ответ на воздушный выдох или добавления переменного соотношения оперантов, среди прочего. В целом автоматизированные системы мониторинга в домашних клетках значительно увеличивают пропускную способность и специфичность, с помощью которых исследователи могут оценивать поведение, похожее на AUD, что способствует выявлению новых базовых схем и методов лечения.

Как и во всех технологиях, авторы иногда сталкиваются с механическими и техническими неисправностями. Несмотря на соблазн позволить системе работать без присмотра, крайне важно, чтобы следователи продолжали регулярно контролировать аппарат для обеспечения надлежащей работы. Периодические механические неисправности магнитных дверей приводили к тому, что бутылочки с сипером становились недоступными для мышей. Это происходило редко при правильной очистке и обслуживании и обычно минимально мешало сбору данных. Для быстрого выявления ошибок важно следить за сопоставимым снижением жидкости в бутылках и регулярно проверять приложение «Контроллер», чтобы убедиться, что облизывание фиксируется во всех углах для всех животных. Для получения более подробной консультации Масуда и коллеги дают отличное описание того, как настроить и выполнить обслуживание IntelliCage48.

Также важно регулярно наблюдать за поведением животных, чтобы следить за наличием драки или других запутанных поведений. Хотя у авторов не было серьёзных проблем с боями при использовании этой парадигмы с мышами C57/BL6, совместное размещение самцов с более агрессивными генотипами привело к значительным проблемам. Регулярно следите за засохшей кровью, хромающими животными или другими признаками драки, особенно после смены клетки. Если вы заметите эти признаки, немедленно удалите нарушительные животные и исключите их из дальнейших экспериментов. Используйте раздел «Индивидуальная мышиная производительность» в предоставленном коде, чтобы оценить, влияла ли агрессия и как долго на питьё у отдельных мышей. Исключите из анализа все затронутые дни. Как уже отмечалось, авторы не могут гарантировать обобщимость протокола на разные генотипы или жилищные структуры.

В связи с этим, у авторов иногда возникали проблемы с мышами, которые «занимали» оперантные уголки, спая или занимая один и тот же угол часами. Такое поведение мешает другим мышам получить доступ к бутылочкам в этом углу. Такие ситуации могут запутать результаты употребления алкоголя, если их не учесть в анализе. Используйте разделы «Заполненность уголков (длительность посещения)» и «Индивидуальная производительность мыши» в предоставленном коде, чтобы определить, достаточно ли «захватывание» влияет на поведение мыши настолько, чтобы исключить определённые экспериментальные дни. В целом, невозможность фиксировать или количественно оценивать социальное поведение во время экспериментов является одним из основных ограничений этой автоматизированной системы мониторинга.

Наконец, как это становится всё чаще с современными нейронаучными методами, автоматизированные системы мониторинга домашних клеток создают большие объёмы данных. Благодаря открытому исходному коду, такому как представленныйздесь 29 и разработанному другими63,64, экспериментаторы располагают множеством инструментов для организации и анализа выводящихся данных. Однако изменения в представленном здесь протоколе потребуют адаптации кода. Кроме того, можно провести множество дополнительных анализов на базе выходных данных, отсутствующих здесь.

Например, исследователей может заинтересовать количественное измерение потребления алкоголя (г алкоголя на килограмм массы мыши в день). Авторы кратко обсуждают это и предоставляют предварительный код для проведения анализа в репозиторииGitHub 29. Там авторы используют коэффициент преобразования лика в объём 1,94 мкл/лик, что соответствует расчётам Касии Радваньской и коллег30,37. Хотя этот коэффициент конверсии лика использовался для оценки потребления алкоголя другими участникамиполя 30,37,38,39, он был рассчитан путём измерения потребления воды. Таким образом, это может быть неточной мерой 20% потребления алкоголя из-за различий в поверхностном натяжении между водой и алкоголем. Другие специалисты в этой области использовали коэффициент преобразования лика 3 мкл/лик 31, 34, 36, 38, что подчёркивает необходимость разрешения этого измерения. Нельзя исключать возможность того, что мыши занимаются лизыванием разных размеров, что ещё больше усложняет этот расчёт. Если исследователи заинтересованы в точной мере потребления алкоголя (г/кг/сутки), авторы рекомендуют рассчитать коэффициент преобразования от лизания к объёму, соответствующий экспериментальной конструкции.

В заключение, развитие и расширение доступности автоматизированных систем мониторинга домашних клеток предоставляют исследователям AUD новые и усовершенствованные инструменты для доклинической оценки употребления алкоголя. Оперантные парадигмы прерывистого употребления алкоголя, подобные этому, позволяют экспериментаторам одновременно оценивать несколько аспектов поведения, похожего на AUD, с гораздо большей пропускной способностью и с большей этологической значимостью, чем традиционная методология. С помощью систем тестирования IntelliCage и открытых альтернатив20,26 исследователи могут более эффективно и гибко исследовать алкогольное поведение, соответствующее AUD, ускоряя выявление эффективных вмешательств.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конкурирующих интересах.

Благодарности

Эта работа была поддержана финансированием Программы внутренних исследований NIH Национальных институтов здравоохранения для V.A.A. (ZIA AA000421; ZIA MH002987). Мы хотели бы поблагодарить Мириам Бокарсли, Ану Маскери и Эрин Мюррей за помощь в разработке этого протокола.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Этанол, доказательство 190Лаборатории Decon2801G
Система тестирования IntelliCageСистемы TSEhttps://www.tse-systems.com/products/intellicage/Включает 1x статическую клетку 2000P (Tecniplast, 2000P001) и nbsp; 4x мышиных домиков (Tecniplast, ACRE011), а также 8x бутылок Sipper (Techniplast, ACBT0252) и крышек (Techniplast, ACCP3521)
IntelliCage Software («Дизайнер», «Контроллер», «Анализатор»)Системы TSEhttps://www.tse-systems.com/products/intellicage/Версия 3.6.9.0
Iso Pads, 6" x 10"Braintree Scientific, Inc.ISO 6105Сжатые хлопковые подушки (15,24 x 25,4 см)
ИзофлуранБакстер10019-360-40
Isoflurane VXP™ Хорошо наполняющий испарительMedVet91305535
Лабораторный рацион грызуновLabDiet5001
Средняя индукционная камера для мышей/крыс с надёжным уплотнением и nbsp;World Precision InstrumentsEZ-178
ГнездаАнкареNES 3600Маленькие хлопковые квадраты (5,08 x 5,08 см)
OHAUS Compass™ CX Scale — 2 200 грамм на 1 граммУлинаH-8110Для измерения массы тела мыши
ПК + ДисплейSupermicrohttps://www.tse-systems.com/products/intellicage/Продаётся как часть системы тестирования IntelliCage
RFID-транспондер (1,25 x 7 мм)Системы TSE290000-IC-60400
Инжектор RFID-транспондераAVIDAVID2028
Считыватель RFID-транспондераСистемы TSE290000-IC-50800
RStudioПоложитьhttps://posit.co/download/rstudio-desktopВерсия 2026.01.1+403; с Tidyverse (2.0.0) и Quarto (1.9.37)
Одноразовый стакан Tri PourКонсолидированные пластики45317Для измерения массы тела мыши

Ссылки

  1. Melendez, R. I. Intermittent (Every-Other-Day) Drinking Induces Rapid Escalation of Ethanol Intake and Preference in Adolescent and Adult C57BL/6J Mice. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 35 (4), 652-658 (2011).
  2. Xiao, T., Chen, Y., Boisvert, A., Cole, M., Kimbrough, A. Chronic Intermittent Ethanol Vapor Exposure Paired with Two-Bottle Choice to Model Alcohol Use Disorder. Journal of Visualized Experiments (JoVE). (196), e65320 (2023).
  3. Rhodes, J. S., Best, K., Belknap, J. K., Finn, D. A., Crabbe, J. C. Evaluation of a simple model of ethanol drinking to intoxication in C57BL/6J mice. Physiology & Behavior. 84 (1), 53-63 (2005).
  4. Thiele, T. E., Crabbe, J. C., Boehm, S. L. “Drinking in the Dark” (DID): A Simple Mouse Model of Binge-Like Alcohol Intake. Curr Protoc Neurosci. 68, 9.49.1-9.49.12 (2014).
  5. Huynh, N., Arabian, N. M., Asatryan, L., Davies, D. L. Murine Drinking Models in the Development of Pharmacotherapies for Alcoholism: Drinking in the Dark and Two-bottle Choice. Journal of Visualized Experiments (JoVE). (143), e57027 (2019).
  6. Longley, M., Willis, E. L., Tay, C. X., Chen, H. An open source device for operant licking in rats. PeerJ. 5, e2981 (2017).
  7. Melo, M. C., Alves, P. E., Nogueira Cecyn, M., Eduardo, P. M. C., Abrahao, K. P. Development of an Eight-Wireless Automated Cage System with Two Lickometers Each for Rodents. eNeuro. 9 (4), ENEURO.0526-21.2022 (2022).
  8. Petersen, N., Adank, D. N., Raghavan, R., Winder, D. G., Doyle, M. A. LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home Cage Device): An Open-Source Tool for Recording Undisturbed Two-Bottle Drinking Behavior in a Home Cage Environment. eNeuro. 10 (4), (2023).
  9. Hou, S., Soto, N. M. A., Glover, E. J., Hou, S., Soto, N. M. A., et al. Modeling Alcohol Consumption in Rodents Using Two-Bottle Choice Home Cage Drinking and Microstructural Analysis. Journal of Visualized Experiments (JoVE). (213), e67486 (2024).
  10. Wilcox, M. V., Cuzon Carlson, V. C., Sherazee, N., Sprow, G. M., Bock, R., et al. Repeated binge-like ethanol drinking alters ethanol drinking patterns and depresses striatal GABAergic transmission. Neuropsychopharmacology. 39 (3), 579-594 (2014).
  11. Godynyuk, E., Bluitt, M. N., Tooley, J. R., Kravitz, A. V., Creed, M. C. An Open-Source, Automated Home-Cage Sipper Device for Monitoring Liquid Ingestive Behavior in Rodents. eNeuro. 6 (5), (2019).
  12. Frie, J. A., Khokar, J. Y. An open source automated two-bottle choice test apparatus for rats. HardwareX. 5, e00061 (2019).
  13. Ieraci, A., Mallei, A., Popoli, M. Social Isolation Stress Induces Anxious-Depressive-Like Behavior and Alterations of Neuroplasticity-Related Genes in Adult Male Mice. Neural Plast. 2016, 6212983 (2016).
  14. Hebda-Bauer, E. K., Dokas, L. A., Watson, S. J., Akil, H. Adaptation to single housing is dynamic: Changes in hormone levels, gene expression, signaling in the brain, and anxiety-like behavior in adult male C57Bl/6J mice. Horm Behav. 114, 104541 (2019).
  15. Johnson, M. C., Zweig, J. A., Zhang, Y., Ryabinin, A. E. Effects of social housing on alcohol intake in mice depend on the non-social environment. Front Behav Neurosci. 18, (2024).
  16. Logue, S., Chein, J., Gould, T., Holliday, E., Steinberg, L. Adolescent mice, unlike adults, consume more alcohol in the presence of peers than alone. Developmental Science. 17 (1), 79-85 (2014).
  17. Holgate, J. Y., Garcia, H., Chatterjee, S., Bartlett, S. E. Social and environmental enrichment has different effects on ethanol and sucrose consumption in mice. Brain Behav. 7 (8), e00767 (2017).
  18. Panksepp, J. B., Rodriguez, E. D., Ryabinin, A. E. Sweetened-ethanol drinking during social isolation: Enhanced intake, resistance to genetic heterogeneity and the emergence of a distinctive drinking pattern in adolescent mice. Genes Brain Behav. 16 (3), 369-383 (2017).
  19. Johnson, M. C., Zweig, J. A., Zhang, Y., Ryabinin, A. E. Effects of social housing on alcohol intake in mice depend on the non-social environment. Front Behav Neurosci. 18, 1380031 (2024).
  20. Petersen, N., Adank, D. N., Quan, Y., Edwards, C. M., Hallal, S. D., et al. A Novel Mouse Home Cage Lickometer System Reveals Sex- and Housing-Based Influences on Alcohol Drinking. eNeuro. 11 (10), (2024).
  21. Lander, S. S., Linder-Shacham, D., Gaisler-Salomon, I. Differential effects of social isolation in adolescent and adult mice on behavior and cortical gene expression. Behavioural Brain Research. 316, 245-254 (2017).
  22. Kuhlman, K. R. Pitfalls and potential: Translating the two-hit model of early life stress from pre-clinical non-human experiments to human samples. Brain Behav Immun Health. 35, 100711 (2023).
  23. Lipp, H. P. High-throughput and Automated Behavioural Screening of Normal and Genetically Modified Mice. Bus Brief Future Drug Discov. , (2005).
  24. Kiryk, A., Janusz, A., Zglinicki, B., Turkes, E., Knapska, E., et al. IntelliCage as a tool for measuring mouse behavior - 20 years perspective. Behav Brain Res. 388, 112620 (2020).
  25. Iman, I. N., Yusof, N. A. M., Talib, U. N., Ahmad, N. A. Z., Norazit, A., et al. The IntelliCage System: A Review of Its Utility as a Novel Behavioral Platform for a Rodent Model of Substance Use Disorder. Front Behav Neurosci. 15, 683780 (2021).
  26. Frie, J. A., Khokhar, J. Y. FARESHARE: An open-source apparatus for assessing drinking microstructure in socially housed rats. NPP—Digit Psychiatry Neurosci. 2 (1), 1 (2024).
  27. Anderson, L. G., Tischer, A. E., Bock, R., Michaelides, M., Alvarez, V. A. Early life adversity increases striatal dopamine D1 receptor density and promotes social alcohol drinking in mice, especially males. Transl Psychiatry. , (2026).
  28. Bocarsly, M. E., Shaw, M. J., Ventriglia, E., Anderson, L. G., Goldbach, H. C., et al. Preexisting risk-avoidance and enhanced alcohol relief are driven by imbalance of the striatal dopamine receptors in mice. Nat Commun. 15 (1), 1-17 (2024).
  29. Bock, R., Anderson, L., Averbeck, T. . IntelliCage Intermittent Drinking Analysis Template [R]. , (2026).
  30. Radwanska, K., Kaczmarek, L. Characterization of an alcohol addiction-prone phenotype in mice. Addiction Biology. 17 (3), 601-612 (2012).
  31. Smutek, M., Turbasa, M., Sikora, M., Piechota, M., Zajdel, J., et al. A Model of Alcohol Drinking under an Intermittent Access Schedule Using Group-Housed Mice. PLOS ONE. 9 (5), e96787 (2014).
  32. Mijakowska, Z., Łukasiewicz, K., Ziółkowska, M., Lipiński, M., Trąbczyńska, A., et al. Autophosphorylation of alpha isoform of calcium/calmodulin-dependent kinase II regulates alcohol addiction-related behaviors. Addiction Biology. 22 (2), 331-341 (2017).
  33. Holgate, J. Y., Garcia, H., Chatterjee, S., Bartlett, S. E. Social and environmental enrichment has different effects on ethanol and sucrose consumption in mice. Brain and Behavior. 7 (8), e00767 (2017).
  34. Koskela, M., Piepponen, T. P., Andressoo, J. O., Võikar, V., Airavaara, M. Towards developing a model to study alcohol drinking and craving in female mice housed in automated cages. Behavioural Brain Research. 352, 116-124 (2018).
  35. Beroun, A., Nalberczak-Skóra, M., Harda, Z., Piechota, M., Ziółkowska, M., et al. Generation of silent synapses in dentate gyrus correlates with development of alcohol addiction. Neuropsychopharmacology. 43 (10), 1989-1999 (2018).
  36. Simmons, K. E., Healey, K. L., Li, Q., Moore, S. D., Klein, R. C. Effects of sex and genotype in human APOE-targeted replacement mice on alcohol self-administration measured with the automated IntelliCage system before and after repeated mild traumatic brain injury. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 45 (11), 2231-2245 (2021).
  37. Pagano, R., Salamian, A., Skonieczna, E., Wojtas, B., Gielniewski, B., et al. Molecular fingerprints in the hippocampus of alcohol seeking during withdrawal. Res Sq. , rs.3.rs-3337670 (2023).
  38. Stefaniuk, M., Pawłowska, M., Barański, M., Nowicka, K., Zieliński, Z., et al. Global brain c-Fos profiling reveals major functional brain networks rearrangements after alcohol reexposure. Neurobiol Dis. 178, 106006 (2023).
  39. Frycz, B. A., Nowicka, K., Konopka, A., Hoener, M. C., Bulska, E., et al. Activation of trace amine-associated receptor 1 (TAAR1) transiently reduces alcohol drinking in socially housed mice. Addiction Biology. 28 (7), e13285 (2023).
  40. Skupio, U., Sikora, M., Korostynski, M., Wawrzczak-Bargiela, A., Piechota, M., et al. Behavioral and transcriptional patterns of protracted opioid self-administration in mice. Addiction Biology. 22 (6), 1802-1816 (2017).
  41. Ismail, N. I. W., Jayabalan, N., Mansor, S. M., Müller, C. P., Muzaimi, M. Chronic mitragynine (kratom) enhances punishment resistance in natural reward seeking and impairs place learning in mice. Addiction Biology. 22 (4), 967-976 (2017).
  42. Ajonijebu, D. C., Abboussi, O., Mabandla, M. V., Daniels, W. M. U. Differential epigenetic changes in the hippocampus and prefrontal cortex of female mice that had free access to cocaine. Metab Brain Dis. 33 (2), 411-420 (2018).
  43. Kimbrough, A., Kim, S., Cole, M., Brennan, M., George, O. Intermittent Access to Ethanol Drinking Facilitates the Transition to Excessive Drinking After Chronic Intermittent Ethanol Vapor Exposure. Alcohol Clin Exp Res. 41 (8), 1502-1509 (2017).
  44. Gage, G. A., Muench, M. A., Jee, C., Kearns, D. N., Chen, H., et al. Intermittent-Access Operant Alcohol Self-Administration Promotes Binge-like Drinking and Drinking Despite Negative Consequences in Male and Female Heterogeneous Stock Rats. Neuropharmacology. 235, 109564 (2023).
  45. Hwa, L. S., Chu, A., Levinson, S. A., Kayyali, T. M., DeBold, J. F., et al. Persistent escalation of alcohol drinking in C57BL/6J mice with intermittent access to 20% ethanol. Alcohol Clin Exp Res. 35 (11), 1938-1947 (2011).
  46. Miczek, K. A., Akdilek, N., Ferreira, V. M. M., Kenneally, E., Leonard, M. Z., et al. Excessive alcohol consumption after exposure to two types of chronic social stress: intermittent episodes vs. continuous exposure in C57BL/6J mice with a history of drinking. Psychopharmacology (Berl). 239 (10), 3287-3296 (2022).
  47. Ko, Y. E., Hwa, L. S. Serotonin regulation of intermittent and continuous alcohol drinking in male and female C57BL/6J mice with systemic SB242084 and buspirone. Alcohol Alcohol. 58 (3), 280-288 (2023).
  48. Masuda, A., Kobayashi, Y., Itohara, S. Automated, Long-term Behavioral Assay for Cognitive Functions in Multiple Genetic Models of Alzheimer’s Disease, Using IntelliCage. Journal of Visualized Experiments (JoVE). (138), e58009 (2018).
  49. Kahnau, P. General Instructions for Using the IntelliCage with Mice. Curr Protoc. 6 (2), e70314 (2026).
  50. Thiele, T. E., Navarro, M. “Drinking in the dark” (DID) procedures: a model of binge-like ethanol drinking in non-dependent mice. Alcohol. 48 (3), 235-241 (2014).
  51. Rice, C. J., Sandman, C. A., Lenjavi, M. R., Baram, T. Z. A novel mouse model for acute and long-lasting consequences of early life stress. Endocrinology. 149 (10), 4892-4900 (2008).
  52. Ivy, A. S., Brunson, K. L., Sandman, C., Baram, T. Z. Dysfunctional nurturing behavior in rat dams with limited access to nesting material: a clinically relevant model for early-life stress. Neuroscience. 154 (3), 1132-1142 (2008).
  53. Baram, T. Z., Davis, E. P., Obenaus, A., Sandman, C. A., Small, S. L., et al. Fragmentation and unpredictability of early-life experience in mental disorders. Am J Psychiatry. 169 (9), 907-915 (2012).
  54. Molet, J., Maras, P. M., Avishai-Eliner, S., Baram, T. Z. Naturalistic rodent models of chronic early-life stress. Dev Psychobiol. 56 (8), 1675-1688 (2014).
  55. Walker, C. D., Bath, K. G., Joels, M., Korosi, A., Larauche, M., et al. Chronic early life stress induced by limited bedding and nesting (LBN) material in rodents: critical considerations of methodology, outcomes and translational potential. Stress. 20 (5), 421-448 (2017).
  56. Demaestri, C., Gallo, M., Mazenod, E., Hong, A. T., Arora, H., et al. Resource scarcity but not maternal separation provokes unpredictable maternal care sequences in mice and both upregulate Crh-associated gene expression in the amygdala. Neurobiology of Stress. 20, 100484 (2022).
  57. Peña, C. J. Early-life stress sensitizes response to future stress: Evidence and mechanisms. Neurobiology of Stress. 35, 100716 (2025).
  58. Dube, S. R., Felitti, V. J., Dong, M., Chapman, D. P., Giles, W. H., et al. Childhood abuse, neglect, and household dysfunction and the risk of illicit drug use: the adverse childhood experiences study. Pediatrics. 111 (3), 564-572 (2003).
  59. Anda, R. F., Felitti, V. J., Bremner, J. D., Walker, J. D., Whitfield, C., et al. The enduring effects of abuse and related adverse experiences in childhood. Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci. 256 (3), 174-186 (2006).
  60. Pilowsky, D. J., Keyes, K. M., Hasin, D. S. Adverse Childhood Events and Lifetime Alcohol Dependence. Am J Public Health. 99 (2), 258-263 (2009).
  61. Kirsch, D., Nemeroff, C. M., Lippard, E. T. C. Early Life Stress and Substance Use Disorders: Underlying Neurobiology and Pathways to Adverse Outcomes. ADV RES SCI. 1 (1), 29-47 (2020).
  62. Leza, L., Siria, S., López-Goñi, J. J., Fernández-Montalvo, J. Adverse childhood experiences (ACEs) and substance use disorder (SUD): A scoping review. Drug Alcohol Depend. 221, 108563 (2021).
  63. Ruffini, N., Müller, M. B., Schmitt, U., Gerber, S. IntelliPy: a GUI for analyzing IntelliCage data. Bioinformatics. 37 (21), 3972-3973 (2021).
  64. Daguano Gastaldi, V., Hindermann, M., Wilke, J. B. H., Ronnenberg, A., Arinrad, S., et al. A comprehensive and standardized pipeline for automated profiling of higher cognition in mice. Cell Reports Methods. 5 (3), 101011 (2025).

Перепечатки и разрешения

Теги

Оперантное поведениесистема IntelliCageрасстройствосвязанное с употреблением алкоголяавтоматизированная оценкапрерывистый доступ к алкоголюRFID-транспондердобровольное употреблениевысокопроизводительное тестирование

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.