Биоинформатика и количественный анализ полимеразных цепных реакций в реальном времени при SUCNR1 и GPR37L1 при шизофрении

Краткое содержание

В этом исследовании оцениваются SUCNR1 и GPR37L1 как кандидатные молекулярные маркеры, связанные с шизофренией, посредством интегрированного биоинформатического анализа GSE54913 данных, количественной валидации полимеразной цепной реакции в реальном времени (qRT-PCR) и корреляционного анализа с вербальной памятью в независимой когорте.

Аннотация

Шизофрения — это тяжелое, сложное и многофакторное психическое расстройство, включающее множество элементов генетической восприимчивости, приводящее к значительной инвалидности, заболеваемости и смертности. Несмотря на значительный прогресс в понимании её патофизиологии и этиологии, специфические диагностические биомаркеры шизофрении остаются недостижимыми. Целью этого исследования было выявление кандидатов на молекулярные маркеры, связанные с шизофренией. Интегрированный биоинформатический анализ был проведён на публичном наборе данных микрочипов GSE54913. Анализ путей генной онтологии (GO) и Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG) показал, что наиболее значительно обогащённые термины ГО связаны с активностью каналов, включая пассивную трансмембранную активность транспортеров, активность ионных каналов, гейт-каналов и субстрат-специфическую активность каналов. Пять самых обогащённых путей KEGG включали секрецию инсулина, сигнальный путь cAMP, восстановление эксцизии нуклеотидов, сигнальный путь TNF и метаболизм глутатионов. Валидация проводилась с помощью количественной реального времени полимеразной цепной реакции (qRT-PCR) на независимом наборе образцов из больницы Ухань Жунцзюнь Юфу. Результаты qRT-ПЦР в значительной степени соответствовали микроанализу (Pearson r = 0,89, 95% ДИ: 0,66–0,97). Анализ сетей взаимодействия белков и белков (PPI) выявил два центральных гена — SUCNR1 и GPR37L1, которые были значительно связаны с термином GO «активность ионного канала» и обогащены путём KEGG «секреция инсулина». Кроме того, экспрессия SUCNR1 показала отрицательную корреляцию с баллами вербальной памяти (r = -0,54, P = 0,015), тогда как GPR37L1 выражение показало положительную корреляцию (r = 0,59, P = 0,0034). Эти данные свидетельствуют о том, что изменённая экспрессия SUCNR1 и GPR37L1 может быть связана с шизофренией и представлять собой кандидатные молекулярные маркеры для дальнейших исследований.

Введение

Шизофрения — это хроническое и сложное психическое расстройство с неопределённой этиологией, характеризующееся тяжёлой дисфункцией мозга, когнитивными нарушениями и психосоциальными^{дефицитами 1}. Она создаёт серьёзную глобальную нагрузку для здоровья, затрагивая более 21 миллиона человек по^{всему миру 2}. Хотя диагностические и терапевтические подходы значительно эволюционировали за последние пятьдесят лет, основной патогенез остаётся неясным, а долгосрочные результаты, связанные с значительной инвалидностью, заболеваемостью и смертностью, существенно не^{улучшились 3}. Поэтому крайне важно определить потенциальные ключевые гены и регуляторные цели.

Патофизиология шизофрении, хотя и не полностью прояснена, широко объясняется генетическими полиморфизмами и вариациями^{экспрессии 4}. Например, генетическая вариативность эстрогена альфа может влиять на восприимчивость к шизофрении через альтернативную регуляцию генов и обработку^{транскриптов 5}. Аналогично, функциональный промоторный вариант NRG1 был связан с шизофренией и коррелировал с сниженной экспрессией^{изоформы} 6 типа III NRG1. Посмертные исследования показали значительное снижение экспрессии изоформ PDE4B в мозге с шизофренией, что указывает на его^{предсказательный потенциал 7}. Другими кандидатами являются транспортер дофамина (DAT), везикулярный моноаминовый транспортер (VMAT2) и моноаминоксидаза (MAO), которые регулируют синаптический уровень дофамина и могут служить^{биомаркерами 8}. Кроме того, TCP1 может способствовать дефициту цитоскелета через неправильное сворачивание актина при шизофрении⁹. Таким образом, разъяснение профилей экспрессии генов в патогенезе шизофрении может дать представление о прогнозировании рисков, механистическом понимании и терапевтической оценке.

Современные вычислительные подходы продвинули идентификацию генов, связанных с заболеваниями, с помощью интегрированного сетевого анализа и методов машинного^{обучения} 10,11,12. Несмотря на многочисленные генетические исследования, ни один надёжный диагностический биомаркер на основе крови не был применён в клиническую практику для шизофрении. Для устранения этого пробела в данном исследовании был использован интегрированный биоинформатический подход для повторного анализа GSE54913 набора данных, содержащих транскриптомические данные из хорошо охарактеризованных пациентов с шизофренией и здоровых контрольных групп. Набор данных был выбран потому, что (1) образцы периферической крови являются минимально инвазивными и клинически практичны, (2) включает относительно большой размер выборки среди общедоступных наборов микрочипов по шизофрении, и (3) были доступны исходные данные для повторного анализа. Цели данного исследования были: (1) выявление дифференциально экспрессированных генов у пациентов с шизофренией по сравнению со здоровыми контролями с использованием GSE54913 набора данных; (2) проведение функционального обогащения и анализов сетей ИПП для выявления генов-центров; (3) валидировать экспрессию кандидатных генов с помощью qRT-PCR в независимой когорте; и (4) исследовать корреляцию экспрессии генов хаба с производительностью вербальной памяти. Насколько известно авторам, это первое исследование, которое идентифицировало SUCNR1 и GPR37L1 как кандидатные молекулярные маркеры на основе крови для шизофрении.

Протокол

Это исследование было одобрено Этическим комитетом больницы Ухань Жунцзюнь Юфу (идентификационный код проекта, YF-IRB202310215) и проведено в соответствии с принципами Хельсинкской декларации. Все участники были жителями китайской общины и предоставили письменное информированное согласие.

Испытуемые и отбор пробы крови
Десять взрослых с диагнозом шизофрения и десять здоровых добровольцев из контрольной группы без семейной истории психических заболеваний в течение трёх поколений были зачислены. Критерии включения пациентов с шизофренией: (1) диагноз шизофрении по критериям DSM-5, подтверждённый двумя независимыми старшими психиатрами; (2) возраст от 18 до 65 лет; (3) отсутствие изменений в принятии антипсихотических препаратов не менее 4 недель до взятия пробы крови; (4) готовность предоставить письменное информированное согласие. Критерии исключения: (1) сопутствующие крупные медицинские заболевания (например, диабет, сердечно-сосудистые заболевания, рак); (2) злоупотребление или зависимость от психоактивных веществ в течение последних 6 месяцев; (3) умственная отсталость; (4) беременность или лактация. Критерии включения здоровых контролей: (1) отсутствие личной или семейной истории (в течение трёх поколений) психических заболеваний; (2) отсутствие текущего или прошлого использования антипсихотических препаратов; (3) совпадение по возрасту и полу с группой с шизофренией; (4) серьёзных медицинских заболеваний нет. Средняя продолжительность заболевания у пациентов с шизофренией составляла 12,5 ± 6,8 года; Все пациенты принимали стабильные антипсихотические препараты (6 — рисперидон, 4 — оланзапин); средний балл PANSS составил 76,4 ± 12,3. Контрольные группы были сопоставлены по возрасту (±5 лет) и полу (5 мужчин, 5 женщин в группе). Вербальная память оценивалась с использованием общего результата воспоминания по тесту вербального обучения Хопкинса — пересмотренный (HVLT-R). Все участники были набраны из больницы Ухань Жунцзюнь Юфу с 1 января по 31 июля 2025 года. Базовая демография приведена в таблице 1.

Размер выборки был определен с помощью программного обеспечения для расчёта размера выборки для двухстороннего независимого t-теста с размером эффекта 1,2, α = 0,05 и степенью (1-β) = 0,80, что дало минимум девять участников на группу.

Венозная кровь была забрана в антикоагулянтные трубки с ЭДТА и обработана без задержек. Периферические мононуклеарные клетки крови (PBMC) затем отделялись от образцов с помощью центрифугирования градиента плотности с использованием среды градиента плотности. Кратко время кровь разбавялась в соотношении 1:1 с фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS, pH 7,4), нанесена слоями на среду градиента плотности и центрифугирована при 400 × г в течение 30 минут при 20 °C с выключенным тормозом. После центрифугирования интерфейс, содержащий PBMC, аккуратно переносился на новую лампу. Клетки промывались дважды с помощью PBS, при каждом промывке следовала центрифугирование при 300 × г в течение 10 минут при 4 °C, а последняя гранула была подвешена в PBS. Жизнеспособность оценивалась с использованием метода исключения красителя трипана, и использовались только препараты с ≥95% жизнеспособными клетками. Изолированные PBMC алицитировали и хранили при −80 °C максимум 3 месяца перед извлечением РНК.

Данные микрочипов
Рабочий процесс исследования показан на рисунке 1. Набор данных микрочипов GSE54913 был скачан из базы данных GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Этот набор данных был выбран потому, что (1) содержит транскриптомные данные из образцов периферической крови, которые являются минимально инвазивными и клинически практичными для обнаружения биомаркеров; (2) включает относительно большую выборку среди общедоступных наборов микрочипов по шизофрении (18 пациентов, 12 контрольных); (3) исходные данные были доступны для повторного анализа. Согласно записи GEO, образцы были получены из периферических мононуклеарных клеток крови (PBMC), а не из плазмы. Первоначальное описание «образцы плазмы» в предыдущей версии было ошибкой и было исправлено.

Предварительная обработка данных и скрининг дифференциально экспрессированных генов (DEG)
Исходные данные (. CEL-файлы) предварительно обрабатывались с помощью программного обеспечения микрочипной предварительной обработки. Коррекция фона проводилась с использованием метода Robust Multichip Average (RMA), затем нормализации квантилей и преобразования log2. Пробники без аннотации генов были отфильтрованы. Зонды с отсутствующими значениями >20% по выборкам были исключены; Недостающие значения для оставшихся зондов были введены с помощью алгоритма k-ближайших соседей (k = 10), реализованного в программном обеспечении для вычисления пропущенных значений. Пакетные эффекты не проявились, так как все образцы были обработаны одной партией согласно записи GEO. После предварительной обработки были получены значения экспрессии для 17 200 генов для дальнейшего анализа. DEG между пациентами с шизофренией и здоровыми контролями были выявлены с помощью программного обеспечения для дифференциального анализа экспрессии. Гены с частотой ложного обнаружения (FDR) < 0,05, абсолютным изменением свержения (FC) > 1,2 и P < 0,05 считались дифференцированно экспрессированными. Был выбран относительно низкий порог ФК (абсолютный ФК > 1,2), поскольку шизофрения — это сложное психиатрическое расстройство, при котором различия в экспрессии отдельных генов часто бывают незаметными, а не заметными.

GO и анализ обогащения путей
Функциональные анализы обогащения терминов генной онтологии (GO) и путей Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG) проводились с использованием программного обеспечения для функционального анализа обогащения. Фоновый набор генов состоял из всех генов, прошедших предобработку (17 200 генов). Были представлены термины обогащения и пути с необработавшими P-значениями < 0,05. Поскольку для выходов обогащения GO и KEGG использовались сырые P-значения, эти результаты следует интерпретировать как исследовательские.

Анализ сетей PPI и идентификация генов хаба
Для построения сети ИПП использовалась база данных взаимодействия белков и белков, где пороговым показателем был установлен комбинированный балл взаимодействия > 0,9. Сеть визуализовалась с помощью программного обеспечения для визуализации сети. Гены хаба идентифицировались с помощью плагина для идентификации генов хаба с алгоритмом Degree. Топ-10 узлов с наивысшими баллами были выбраны в качестве хабовых генов. Подсеть ключевых генов хаба была извлечена с помощью плагина для извлечения подсети с параметрами по умолчанию (срез степени = 2, срез балла узла = 0,2, K-ядро = 2, максимальная глубина = 100).

Полная изоляция РНК и qRT-PCR
β-актин использовался как внутренний референсный (хозяйственный) ген. Стабильность экспрессии β-актина в образцах была подтверждена отсутствием значимой разницы в значениях КТ между группами шизофрении и контрольной группы (P > 0,05). Относительная количественная оценка проводилась с использованием метода 2^−ΔΔCt . Все реакции проводились в тройном экземпляре, и для расчёта использовалось среднее значение Ct (см. последовательности праймеров в таблице 2). Десять ведущих DEG (пять наиболее значительно повышенных и пять наиболее значительно пониженных за счёт изменения складок) были выбраны для первичной валидации qRT-PCR с целью подтверждения общей надёжности данных микрочипов. Впоследствии SUCNR1 и GPR37L1 были отобраны для сфокусированной валидации на основе трёх критериев: (1) они были идентифицированы как хабовые гены в анализе сети PPI (степень ≥ 7); (2) они были существенно связаны с топ-обогащённым термином ГО «активность ионных каналов» и путём KEGG «секреция инсулина»; (3) оба кодируют GPCR, известные мишени для лекарств при шизофрении.

Статистический анализ
Нормальность оценивалась с помощью теста Шапиро–Уилка. Переменные, показывающие примерно нормальное распределение (P > 0,05), анализировались с использованием параметрических методов, включая t-тест Стьюдента для двухгрупповых сравнений и односторонний ANOVA для сравнений с более чем двумя группами. Когда предположение о нормальности не было выполнено, использовались тесты Манна–Уитни U или Крускаля–Уоллиса, по мере необходимости. Все статистические тесты были двусторонними. Для множественных сравнений (например, в пост-хок тестах ANOVA) применялся метод частоты ложного обнаружения (FDR) Бенджамини-Хохберга с порогом FDR 0,05. Для корреляционных анализов коррекция с множественным сравнением не применялась, так как было проведено только две корреляции; сырые P-значения сообщаются с осторожностью.

Результаты

Идентификация DEG и иерархическая кластеризация
Анализ набора данных GSE54913 выявил 473 дифференциально экспрессированных гена (DEGs), включая 357 генов с повышенной регуляцией и 116 пониженных, между пациентами с шизофренией и контролем (рисунок 2A,B). Иерархическая кластеризация этих DEG отличала образцы шизофрении от контрольных (рисунок 2C).

Функциональный анализ обогащения DEG
Анализ обогащения GO выявил термины, связанные с активностью каналов, включая пассивную трансмембранную активность транспортеров, активность ионных каналов, активность закрытых каналов и субстрат-специфическую активность канала (сырой P < 0,05; Таблица 3). Анализ путей KEGG выявил секрецию инсулина, сигнальный путь cAMP, восстановление эксцизии нуклеотидов, сигнальный путь TNF и метаболизм глутатиона как наиболее обогащённые пути (сырой P < 0,05; Рисунок 3C и таблица 4).

Валидация верхних DEG с помощью qRT-PCR
Пять самых высоко пониженных генов (HCN3, OLFML2A, NOX1, MRGPRX1 и BRIP1) и пять самых высоко повышающихся генов (CCL22, PNMA2, TBX20, ERAS и C12orf68) были подтверждены qRT-PCR. Валидированные гены и соответствующие значения микрочипов logFC перечислены в таблице 5, валидация qRT-PCR показана на рисунке 4, а сырые значения CT приведены в дополнительной таблице S1. Изменения сворочков qRT-PCR были направно согласованы с данными микрочипов для всех десяти генов (все P < 0,05 по тесту Манна-Уитни U). Корреляция Пирсона между microarray logFC и qRT-PCR logFC составила r = 0,89 (95% ДИ: 0,66–0,97, P = 0,0004), что указывает на сильное согласие. Также были подтверждены различия в экспрессии SUCNR1 и GPR37L1 (рисунок 5A,B).

Анализ сетей ИПП
Из всех DEGs была построена сеть PPI (балл взаимодействия > 0,9; Рисунок 6A). Десять лучших хабов по степени связности включали RTP5 (степень = 14), CXCL1 (степень = 8), CXCL10, GPR37L1, HCAR1, OPRL1, P2RY4, SSTR4, SUCNR1 (степень = 7) и ATM (степень = 5) (рисунок 6B и таблица 6). Подсеть ключевых генов хаба была извлечена с помощью плагина для извлечения подсети с параметрами по умолчанию. Алгоритм извлечения подсети выявил плотно связанный кластер, содержащий RTP5, CXCL1, CXCL10, GPR37L1, HCAR1, OPRL1, P2RY4, SSTR4 и SUCNR1, с кластерным баллом 6,2. ATM не входил в подсеть, поскольку имел более низкую связь с ядром кластера (рисунок 6C).

Связь между вербальной памятью и SUCNR1/GPR37L1
Экспрессия SUCNR1 была значительно повышена, тогда как GPR37L1 экспрессия снизилась у пациентов с шизофренией по сравнению со здоровыми контролями (рисунок 5A,B). Экспрессия SUCNR1 показала отрицательную корреляцию с баллами вербальной памяти (r = -0,54, 95% ДИ: -0,79 до -0,13, R² = 0,287, P = 0,015; Рисунок 5C), тогда как GPR37L1 выражение показало положительную корреляцию с показателями вербальной памяти (r = 0,59, 95% ДИ: 0,20–0,82, R² = 0,349, P = 0,0034; Рисунок 5D). Корреляционные анализы были проведены на всех 20 участниках, включая 10 пациентов с шизофренией и 10 здоровых контрольных групп. При выборке 20 исследований имело 80% мощности для обнаружения корреляционного коэффициента |r| > 0,6 при α = 0,05. Учитывая скромный размер выборки, эти корреляционные результаты являются предварительными и требуют валидации в более крупных независимых когортах.

Заявление о доступности данных
Анализируемый в этом исследовании GSE54913 набор данных общедоступен в Gene Expression Omnibus. Исходные значения qRT-PCR CT приведены в дополнительной таблице S1. Скрипты анализа, выходные файлы DEG, результаты обогащения, сетевые файлы PPI и исходные файлы рисунков доступны в https://sandbox.zenodo.org/records/514960 или 10.5072/zenodo.514960.

Рисунок 1: Блок-схема: сбор, предобработка, анализ и валидация данных. Анализ микрочипов мРНК на PBMC, полученный из GSE54913. Были проведены анализы функционала и обогащения путей GO на DEG. Топ-10 генов, ранжированных по изменению складок, были отобраны для валидации данных микрочипов с помощью qRT-PCR. Анализ сетей PPI выявил два хабовых гена. Наконец, был проведён экс-виво анализ двух центральных генов SUCNR1 и GPR37L1 . Сокращения: DEGs = дифференциально экспрессированные гены; мРНК = мессенджерная РНК; PBMCs = периферические мононуклеарные клетки крови; qRT-PCR = количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени; PPI = белок-белоковое взаимодействие. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Выбор DEG и иерархический кластерный анализ. (A) Вулканический участок DEGs. Горизонтальная ось представляет log₂ (изменение сгиба), а вертикальная — –log₁₀(значение P). Зелёные и красные точки представляют гены с дифференциальной экспрессией, а чёрные точки — недифференциально экспрессированные гены. (B) Количество пониженных и повышенных DEG. (C) Тепловая карта дифференциально экспрессированных генов. Красный означает повышение регуляции, а зелёный — снижение. Сокращение: DEGs = дифференциально экспрессированные гены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Анализ обогащения GO и KEGG DEGs. (A,B) обогащение GO и (C) KEGG показаны на основе сырых P-значений. Сокращения: DEGs = дифференциально экспрессированные гены; GO = Генная онтология; KEGG = Киотская энциклопедия генов и геномов; BP = биологический процесс; CC = клеточный компонент; MF = молекулярная функция. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Валидация данных микрочипов по десяти наиболее дисрегулированным генам с помощью qRT-PCR. (A) Понижение пяти топ-DEG. (B) Усилить пять топ-DEG. Данные — это средние ± стандартной ошибке среднего. Значения p отображаются в соответствующих панелях. Сокращения: DEGs = дифференциально экспрессированные гены; qRT-PCR = количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5: Экспрессия SUCNR1 и GPR37L1 у пациентов с шизофренией и здоровых контрольных групп. (A) Экспрессия SUCNR1 и (B) GPR37L1 определяется с помощью qRT-PCR. Корреляция между вербальной памятью и (C) SUCNR1 и (D) GPR37L1 выражения. Данные представлены как среднее ± стандартной ошибке среднего, где это применимо. P значений корреляций показаны в соответствующих панелях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6: Анализ сетей взаимодействия белок-белок. (A) Анализ сети PPI с использованием базы данных взаимодействия белок-белок. (B) Белки, ранжированные по степени ассоциации в сети PPI. (C) Подсеть, визуализированная с помощью программного обеспечения для визуализации сети после анализа извлечения подсети. Аббревиатура: PPI = взаимодействие белка и белка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Переменная	Контрольные субъекты (n = 10)	Пациенты с шизофренией (n = 10)
Возраст (год)	36,5 ± 10,6	44,5 ± 9,5
Женский пол, n (%)	5 (50)	5 (50)
Дневное время сна (h)	5.4 ± 3.1	7.5 ± 1.2
Индекс массы тела (ИМТ; кг/м²)	25.2 ± 4.1	22.9 ± 2.3
Оценка вербальной памяти	61 ± 18	30.2 ± 10.8
Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения или числа (%).

Таблица 1: Исходные характеристики пациентов с шизофренией и контрольных участников.

Генный символ	Прямая последовательность капсюля (5'→3')	Реверсная последовательность праймеров (5'→3')
HCN3	GTCCGCCGGGGCCTGGAT	CCTCCCACTGGTGTATGTAGC
OLFML2A	CAGGCAGAGCGGGCGAAG	AATATTTGCGGACTGGGTCA
NOX1	CACCCCAAGTCTGTAGTGGGAG	CCAGACTGGAATATCGGTGACA
MRGPRX1	CTAGGGTACCACGGAGGATT	TGGTTCTGGAGGCTCCTTGGC
BRIP1	CAGATGAGGGCG-TAAGTGA	CGTCCTCCGGAGCTCTCTCTAG
CCL22	TCCATCTCTTCTTGACTCTGA	CTGTGGGTCAGTCAGTCAGAAGAGA
PNMA2	GCGGGTCAATTCTCGGGACA	GTCCTGCCCCCAGGTGGTTT
TBX20	GAGGGAAAGTGGAGAGCC	AAGGCTGACCCTCGATTTGG
ERAS	AGTCTATTATTTCGGGCACC	CCTTCGTGGTTCCCCGAGAC
C12orf68	TTCAACCCCTACACCGAGTT	CTTGAACGTGGACTGCAGC
GPR37L1	ATGTTTCTTGCCGAGCAGTG	CCACATGGAATCGGTCTAT
SUCNR1	ACAGAAGCCGACAGCAGAAT	GCACAGGAAAGCAAAGTCAG
β-Актин	CTAAGGCCAACCGTGAAAAG	GCATACAGGGACACACAG
qRT-PCR: количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени.

Таблица 2: ПЦР-праймеры для qRT-PCR.

GO ID	Термин	Сырое P-значение	Граф
ВПЕРЁД:0015267	Деятельность канала	0.000000056	13
ВПЕРЁД:0022803	Активность пассивных трансмембранных транспортеров	5.78E-08	13
ВПЕРЁД: 0005216	Активность ионного канала	0.000000127	12
ВПЕРЁД:0022839	Активность ионного канала	0.000000131	11
ВПЕРЁД:0022836	Активность закрытых каналов	0.000000136	11
ВПЕРЁД:0022838	Субстрат-специфическая активность канала	0.00000017	12
ВПЕРЁД: 0005261	Активность катионного канала	0.00000668	9
ВПЕРЁД:0015276	Активность ионных каналов с лигандом	0.000315	5
ВПЕРЁД:0022834	Активность каналов с лигандным контролем	0.000315	20
ВПЕРЁД:0022890	Активность трансмембранных транспортеров неорганических катионов	0.000487	20
ВПЕРЁД:0008324	Активность катионных трансмембранных транспортеров	0.0009	18
ВПЕРЁД:0099094	Активность лиганд-геймированного катионного канала	0.00128	16
ВПЕРЁД: 0005244	Активность ионных каналов с ограничением напряжения	0.001382	16
ВПЕРЁД:0022832	Активность каналов с ограничением напряжения	0.001382	18
ВПЕРЁД:0046873	Активность трансмембранных транспортеров металлических ионов	0.001836	21
ВПЕРЁД: 0022824	Активность ионного канала, управляемого передатчиком	0.002762	19
ВПЕРЁД:0022835	Активность канала с передатчиком	0.002762	13
Примечание: P-значения являются необработанными и не скорректированными; значимость определялась как сырой P < 0,05.

Таблица 3: Анализ генной онтологии дифференцированно экспрессированных генов (raw P < 0,05).

ID	Описание	Сырое P-значение	Граф
hsa04911	Секреция инсулина	0.007066	6
hsa04024	Путь сигнализации cAMP	0.010661	10
hsa03420	Восстановление эксцизии нуклеотидов	0.013724	4
hsa04668	Путь сигнализации TNF	0.023694	6
hsa00480	Метаболизм глутатионов	0.02466	4
hsa04740	Обонятельная трансдукция	0.032104	15
hsa05222	Мелкоклеточный рак лёгких	0.03572	5
hsa00590	Метаболизм арахидоновой кислоты	0.035991	4
hsa04080	Взаимодействие нейроактивного лиганда и рецепторов	0.037546	12
hsa05031	Зависимость от амфетаминов	0.045653	4
hsa05203	Вирусный канцерогенез	0.046404	8
hsa04933	Сигнальный путь AGE-RAGE при диабетических осложнениях	0.04831	5
Примечание: P-значения являются необработанными и не скорректированными; значимость определялась как сырой P < 0,05.

Таблица 4: Киотская энциклопедия генов и геномов, анализ генов по обогащению (сырой P < 0.05).

Генный символ	Официальное полное имя	logFC	Сырое P-значение
Снижение регуляции
HCN3	Гиперполяризационно-активированный циклический канал 3 с нуклеотидным контролем	-1.489	0.0001
OLFML2A	Белок 2А, подобный олфактомедину	-1.521	0.0042
NOX1	NADPH оксидаза 1	-1.522	0.0022
MRGPRX1	Связанный с Mas-связанным G-белковым рецептором X1	-1.526	0.0003
BRIP1	Белок группы J анемии Фанкони	-1.699	0.0018
Повышенная регуляция
CCL22	C-C мотив хемокин 22	2.517	0.0041
PNMA2	Паранеопластические антигены Ma	2.159	0.0062
TBX20	Транскрипционный фактор T-box TBX20	1.866	0.0001
ERAS	Эпохи GTPase	1.846	0.0008
C12orf68	Домен с спиральной катушкой, содержащий 184	1.839	0.0002
Примечание: logFC и сырые P-значения взяты из анализа дифференциального выражения микрочипов.

Таблица 5: Топ-10 DEG, ранжированных по изменению свержения в повышенной и пониженной регуляции генов.

Генный символ	Описание	Ко-гены (n)	P-значение
RTP5	Белок транспортера рецепторов 5	14	0.000276
CXCL1	Регулируемый ростом альфа-белок 1	8	0.011423
CXCL10	Мотив C-X-C хемокин 10	7	0.046144
GPR37L1	Рецепторы прозапозинов GPR37L1	7	0.003792
HCAR1	Рецептор гидроксикарбоновой кислоты 1	7	0.046572
OPRL1	Ноцицептиновый рецептор 1	7	0.039753
P2RY4	P2Y пуриноцептор 4	7	0.001279
SSTR4	Соматостатиновый рецептор типа 4	7	0.006742
SUCNR1	Сукцинатный рецептор 1	7	0.000105
Банкомат	Серин-протеинкиназа АТМ	5	0.004961
ИПП: белок-белковое взаимодействие; DEGs: гены с дифференциальной экспрессией.

Таблица 6: Топ-10 генов хаба, выявленных в сети PPI для DEG.

Дополнительная таблица 1: Исходные значения qRT-PCR CT, полный рабочий процесс биоинформатического анализа и обработанные результаты (DEG, GO/KEGG и PPI) для исследования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Шизофрения — это тяжёкое многофакторное заболевание, включающее множество факторов генетической^{восприимчивости 13,14}. Хотя достигнут прогресс в понимании его патофизиологии, надёжные диагностические биомаркеры всё ещё отсутствуют. В этом исследовании интегрированный биоинформатический подход выявил 473 DEGs в образцах крови пациентов с шизофренией. Анализы GO и KEGG выявили обогащение терминами и путями, связанными с активностью каналов, включая секрецию инсулина, сигнализацию cAMP, восстановление эксцизии нуклеотидов, сигнализацию TNF и метаболизм глутатионов. Анализ сетей PPI также выявил SUCNR1 и GPR37L1 как хабовые гены, а их экспрессия была связана с вербальной памятью, что указывает на их потенциальную релевантность как молекулярных маркеров, связанных с шизофренией.

Обогащение терминов «активности каналов» в ГО соответствует предыдущим исследованиям шизофрении. Кальциевые каналы, зависящие от напряжения (например, CACNA1C, CACNB2) и калиевые каналы (например, Kv3, Kv2.1), были связаны с предрасположенностью к шизофрении и возбудимости нейронов 15,16. Аналогично, выявленные основные пути KEGG соответствуют существующей литературе. Гиперинсулинемия и нарушения секреции инсулина отмечаются при ранней^{шизофрении 17}. Сигнальный путь cAMP всё больше связан с патофизиологией заболеваний¹⁸. Механизмы восстановления нуклеотидной эксцизии, включая модификацию варианта H2AX гистона, также могут играть^роль 19,20,21,22. Кроме того, сигнализация ФНО и метаболизм глутатионов связаны с патогенезом^{шизофрении 23,24}.

Нарушение вербальной памяти — это основной когнитивный дефицит при шизофрении, присутствующий с самого начала болезни и связанный с функциональными исходами. Вербальный тест Хопкинса — пересмотренный (HVLT-R) — это хорошо проверенная мера вербального обучения и памяти. Оценка корреляции между экспрессией кандидатских маркеров и вербальной памятью помогает установить клиническую значимость, поскольку когнитивные нарушения являются основным фактором инвалидности при шизофрении.

Хотя десять лучших DEG, валидированных с помощью qRT-PCR, совпали с микрочипами, они не совпали с первичными результатами GO/KEGG. В отличие от этого, SUCNR1 (усиленный) и GPR37L1 (пониженный) были существенно связаны с «активностью ионных каналов» и обогащены «секрецией инсулина». Оба гена кодируют G-белок-связанные рецепторы (GPCR), которые являются критическими мишенями антипсихотиков и регулируют активность ионных^{каналов 25}.

SUCNR1 (GPR91) связывает метаболический стресс с секрецией инсулина^и резистентностью ^26,27, а инсулинорезистентность является известным фактором риска шизофрении²⁸. GPR37L1, орфанный рецептор, сильно экспрессируемый в мозге, участвует в развитии мозжечка и моторной^{функции,} а также связан с болезнью^{Паркинсона 30} и почечным транспортом^{натрия 31}. Её роль при шизофрении может включать модуляцию активности ионных каналов.

Нарушение вербальной памяти является основной чертой шизофрении, отражающим генетическую ответственность и тяжесть заболевания ^32,33. Обратная корреляция экспрессии SUCNR1 и положительная корреляция экспрессии GPR37L1 с показателями вербальной памяти дополнительно подтверждают их потенциальную значимость при шизофрении.

Следует учитывать несколько ограничений. Во-первых, размер выборки для когорты валидации (n = 10 на группу) был мал, что ограничивало статистическую мощность и обобщаемость. Во-вторых, все пациенты с шизофренией получали антипсихотические препараты, поэтому наблюдаемые изменения экспрессии могут отражать влияние медикаментов, а не патологии заболевания. Будущие исследования должны включать пациентов с первым эпизодом, не относящихся к лекарствам. В-третьих, в когорте валидации не было подтверждения РНК-секвенции; Требуется транскриптомное секвенирование в более крупных независимых когортах. В-четвёртых, поперечная конструкция исключает оценку причинно-следственных связей между уровнем биомаркеров и прогрессированием заболевания. В-пятых, корреляционный анализ с вербальной памятью был исследовательским и требовал репликации. В-шестых, GSE54913 набор данных был сгенерирован на микрочипной платформе с более низкой чувствительностью, чем RNA-seq. Будущие направления включают лонгитюдные исследования для отслеживания уровней SUCNR1 и GPR37L1 в ходе болезни и лечения, функциональные исследования для выяснения механистической роли этих GPCR в патофизиологии шизофрении, а также разработку клинически валидированного анализа этих биомаркеров.

В итоге этот интегрированный анализ показывает, что изменённая экспрессия SUCNR1 и GPR37L1 связана с шизофренией и вербальной запоминанием. Эти гены могут представлять собой кандидатные молекулярные маркеры, связанные с шизофренией. Однако ограничения включают относительно небольшой размер выборки и частичную оценку тяжести шизофрении с помощью вербальной памяти. Необходимо провести дальнейшие исследования для подтверждения этих результатов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
affy	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/affy/	microarray preprocessing software. Description: R package for microarray preprocessing
clusterProfiler	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/	functional enrichment analysis software. Description: R package for functional enrichment analysis
CytoHubba	National Institute of Bioinformatics	https://apps.cytoscape.org/apps/cytohubba	hub gene identification plugin. Description: Cytoscape plugin for hub gene identification
Cytoscape	Cytoscape Consortium	https://cytoscape.org/	network visualization software. Description: Software for network visualization and analysis
G*Power	Heinrich Heine University Düsseldorf	https://www.psychologie.hhu.de/arbeitsgruppen/allgemeine-psychologie-und-arbeitspsychologie/gpower	sample size calculation software. Description: Sample size calculation software
GraphPad Prism	GraphPad Software	https://www.graphpad.com/	statistical analysis and graphing software. Description: Statistical analysis and graphing software
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	density gradient medium. Description: Density gradient medium for PBMC isolation
impute	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/impute/	missing-value imputation software. Description: R package for missing-value imputation
Limma	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/limma/	differential expression analysis software. Description: R package for differential expression analysis
MCODE	Cytoscape app	https://apps.cytoscape.org/apps/mcode	subnetwork extraction plugin. Description: Cytoscape plugin for subnetwork extraction
R/Bioconductor	R Foundation	https://www.r-project.org/	statistical computing environment. Description: Statistical computing environment
STRING	EMBL	https://string-db.org/	protein-protein interaction database. Description: Protein-protein interaction database
SYBR Green	Takara	RR820A	fluorescent dye for qRT-PCR. Description: Fluorescent dye for qRT-PCR
TRIzol	Takara	9109	RNA extraction reagent. Description: Reagent for RNA extraction