Стандартизированная процедура in vitro для оценки изменений микротвёрдости поверхности в композитах из наногибридной смолы после воздействия напитков сывороточного белка

Краткое содержание

Этот протокол описывает стандартизированный метод in vitro для оценки влияния напитков из сывороточного белка на микротвердость композита смолы. Этот подход позволяет контролировать оценку диетического воздействия с помощью циклического погружения и тестирования по методу Vickers, предоставляя воспроизводимую модель для изучения взаимодействия между пищевыми напитками и восстановительные биоматериалы.

Аннотация

Целью этого in vitro исследования было оценить влияние различных сывороточных протеиновых напитков на микрожёсткость поверхности трёх композитов из наногибридной смолы. Всего было получено 90 дискообразных образцов из трёх композитов из наногибридной смолы (n = 30 на материал) и разделены на три группы (n = 10) в зависимости от среды погружения: сывороточный концентрат, сывороточный изолят и дистиллированная вода. Образцы погружались по 10 минут дважды в день в течение 30 дней. Микротвёрдость поверхности измерялась на исходном уровне и после погружения с помощью тестера микротвёрдости Vickers, а изменение твёрдости рассчитывалось как ΔVHN. Данные анализировались с использованием двусторонних повторяющихся измерений ANOVA и пост-хок тестов. Анализ показал, что составный тип, раствор погружения и их взаимодействие оказывают статистически значимое влияние на значения ΔVHN (p < 0,0001). Наибольшие потери твёрдости наблюдались в инъекционном композите, подвергшемся воздействию концентрата сыворотки (ΔVHN: 10,4 ± 2,1), тогда как наименьшее изменение наблюдалось в сильно заполненном композите, хранящемся в дистиллированной воде (ΔVHN: 0,9 ± 0,4). Погружение в концентрат сыворотки приводило к значительно большей потере твёрдости во всех композитах по сравнению с дистиллированной водой (p < 0,05). Изолят сыворотки также вызывал значительно большую потерю твёрдости во всех композитах, кроме сильно заполненного, в котором статистически значимой разницы не наблюдалось (p = 0,076). Эти результаты показывают, что напитки из сывороточного белка могут снижать поверхностную микротвёрдость смольных композитов, при этом степень разрушения зависит как от состава материала, так и от состава напитка.

Введение

Долгосрочный успех реставрации композитов из смолы зависит от их устойчивости к сложным проблемам полости рта, включая механическую нагрузку, воздействие пищи и химическое^{разложение 1,2}. Композиты из наногибридной смолы широко используются благодаря своим благоприятным эстетическим и механическим свойствам, особенно поверхностной микротвёрдости, что служит важным индикатором устойчивости к износу и разрушению^{конструкции 3,4}.

Предыдущие исследования показали, что воздействие кислых напитков, таких как фруктовые соки, газированные напитки и энергетические напитки, может негативно влиять на восстановление композитов, снижая микротвёрдость поверхности и изменяя целостность^{поверхности} 5,6,7,8. Эти деградативные эффекты зависят от множества факторов, включая pH, время воздействия и состав филлер-матрица. Однако большинство существующих экспериментальных моделей используют высококислотные растворы, которые могут не точно отражать химические проблемы, с которыми сталкиваются современные пищевые привычки.

В отличие от этого, напитки из сывороточного протеина приобрели широкую популярность благодаря своей питательной ценности и увеличению потребления среди людей, ориентированных на фитнес ^9,10. Несмотря на почти нейтральный pH, эти напитки содержат лактозу, белки и другие органические компоненты, которые могут взаимодействовать с матрицей смолы и влиять на стабильность материала. Поэтому для оценки их воздействия необходим протокол, учитывающий не только кислотность, но и органический состав и повторные паттерны воздействия.

Общая цель этого протокола — предоставить стандартизированный и воспроизводимый метод in vitro для оценки влияния напитков из сывороточного белка, в частности концентратных и изолированных составов, на поверхностную микротвёрдость композитов из наногибридной смолы. Этот метод позволяет контролировать ежедневное воздействие пищи с помощью циклического погружения, тем самым повышая экспериментальную значимость условий тестирования in vitro .

По сравнению с традиционными моделями воздействия кислотных напитков, этот протокол обладает рядом преимуществ. Во-первых, она позволяет исследовать деградацию материала при условиях почти нейтрального pH, что позволяет оценить реакции материалов за пределами кислотных эффектов. Во-вторых, циклический дизайн погружения лучше отражает реальные модели потребления. В-третьих, метод способствует сравнительной оценке различных составов составов на основе структурных характеристик, таких как содержание наполнителя и состав матрицы смолы.

Этот протокол особенно подходит для исследователей, стремящихся оценить химическую стабильность восстановительных материалов в условиях питательной ценности, а также для исследований, изучающих взаимодействие между пищевыми компонентами и стоматологическими биоматериалами. Он также может быть адаптирован для тестирования альтернативных формул напитков, обработки поверхностей или недавно разработанных композитных материалов.

Протокол

Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовка образца

1. Подготовьте в общей сложности 90 дискообразных образцов из трёх композитов наногибридной смолы (n = 30 на материал).
2. Изготовление образцов с использованием цилиндрических прозрачных силиконовых форм (диаметром 6 мм × толщиной 2 мм) для обеспечения стандартизированных размеров.
3. Поместите композитный материал в формы одним шагом (толщиной 2 мм) и закройте поверхность прозрачным микроскопическим стеклом, чтобы получить ровную поверхность.
4. Полимеризуйте образец с помощью синего светодиодного светового отверждения (≈спектр излучения 440–480 нм), расположенного примерно на расстоянии 1 мм от поверхности с выходной интенсивностью 1000 мВт/^см² в течение 20 секунд.
5. Проверяйте интенсивность света с помощью радиометра перед каждым циклом полимеризации, чтобы обеспечить стабильное освещение.
6. Храните подготовленные образцы в дистиллированной воде при 37 °C в течение 24 часов, чтобы обеспечить постполимеризацию и имитировать начальные пероральные условия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут храниться в дистиллированной воде при 37 °C до 24 часов перед дальнейшей обработкой.

2. Процедура отделки и полировки

1. Отделка и полировка верхних поверхностей всех образцов с помощью полировочных дисков, пропитанных оксидом алюминия. Все процедуры полировки должны выполняться одним оператором для обеспечения стандартизации поверхности.
2. Наносите полировку последовательно, используя средние, мелкие и сверхтонкие диски по 10 секунд каждый под водяным охлаждением примерно при 10 000 об/мин при лёгком давлении и одностороннем вращательном движении.
3. Заменяйте полировочные диски после каждые пять образцов, чтобы поддерживать стабильную абразивную эффективность и стандартизировать поверхность.
4. После каждого этапа полировки промывайте образцы дистиллированной водой в течение 10 секунд, чтобы удалить мусор, и аккуратно сушите на воздухе 5 секунд, прежде чем перейти к следующему диску.
5. Отметьте неотполированную поверхность каждого образца уникальным идентификационным кодом, чтобы обеспечить согласованную ориентацию при последующих испытаниях.
6. Храните образцы в дистиллированной воде при 37 °C в течение 24 часов до базового тестирования на микротвёрдость.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут храниться в дистиллированной воде при 37 °C до 24 часов до базового тестирования.

3. Базовое измерение микротвёрдости

1. Проведите базовое тестирование микрожесткости Vickers (VHN) по ранее опубликованным протоколам с использованием тестера микрожесткости^{Vickers 11}.
2. Примените нагрузку 200 г на время пребывания 15 с.
3. Сделайте три вмятины на каждый экземпляр с расстоянием не менее 1 мм. Сделайте вмятины на центральной поверхности каждого образца, чтобы избежать эффектов по краям.
4. Вычислите средний базовый уровень VHN.
5. Проводите измерения одним откалиброванным оператором для минимизации вариативности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут храниться в дистиллированной воде при 37 °C до 24 часов до погружения.

4. Подготовка погружных материалов

1. Приготовьте две формулы сывороточного белка: концентрат сывороточного белка (WC) и изолят сывороточного белка (WI), используя коммерчески доступные порошки.
2. Растворите 25 г порошка сывороточного белка в 200 мл дистиллированной воды (0,125 г/мл) для подготовки растворов погружения.
3. Растворы смешивают с помощью лабораторного шейкера в течение 60 секунд до полного растворения.
4. Дайте растворам уравновеситься при комнатной температуре в течение 5 минут, чтобы минимизировать образование пены и обеспечить единородность.
5. Измеряйте и фиксируйте pH каждого раствора с помощью калиброванного цифрового pH-ометра перед погружением.
6. Готовьте свежие растворы сыворотки перед каждым циклом погружения, чтобы обеспечить стабильный химический состав и предотвратить разрушение белка.
7. Используйте 10 мл раствора для погружения на образец для полного погружения в каждом цикле.

5. Процедура погружения

1. Разделите каждую составную группу на три подгруппы (n = 10).
2. Погружайте образцы в назначенные растворы на 10 минут два раза в день. Выберите длительность и частоту погружения на основе ранее установленных моделей воздействия напитков in vitro , предназначенных для моделирования повторяющихся ежедневных моделей^{потребления 7}.
3. После каждого цикла погружения промывайте образцы дистиллированной водой и помещайте их в искусственную слюну на 10 минут, чтобы имитировать кратковременное воздействие слюны.
4. Храните образцы в дистиллированной воде между циклами погружения при 37 °C до следующего цикла воздействия.
5. Применяйте эту процедуру только к группам, подверженным воздействию сыворотки. Поддерживать контрольную группу непрерывно в дистиллированной воде (DW) при 37 °C на протяжении всего экспериментального периода.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол погружения может быть приостановлен между циклами и возобновлён на следующий день без нарушения экспериментальной согласованности.
6. Продолжайте погружение в течение 30 дней.

6. Измерение микротвёрдости после погружения

1. Прополосните образцы дистиллированной водой и аккуратно высушите.
2. Проведите микрожёсткость Vickers с использованием тех же параметров (200 г, 15 с).
3. Запишите три отступа и вычислите среднее значение VHN после погружения.
4. Определите ΔVHN для каждого образца.

7. Статистический анализ

1. Проанализировать значения микротвёрдости Виккерса с использованием модели повторных измерений ANOVA, при этом временная точка (базовая и пост-иммерсионная) является фактором внутри субъекта и составным типом и раствором погружения между факторами.
2. При необходимости рассчитывайте значения ΔVHN как описательные показатели исхода для выражения величины изменения микротвёрдости для каждого образца.
3. Проведите пост-хок парные сравнения с помощью теста Тьюки на действительно значимую разницу (HSD).
4. Вычислите 95% доверительные интервалы для всех средних групп.
5. Отчёт о размерах эффектов с использованием частичного квадрата (η²p) для результатов ANOVA.
6. Сравните значения pH между растворами сывороточного белка с помощью t-теста Уэлча.
7. Установим уровень статистической значимости на p < 0,05.
8. В дополнение к абсолютным значениям ΔVHN вычисляйте изменение микротвёрдости в процентах по следующей формуле: [(базовый VHN − пост-иммерсионный VHN) / базовый VHN] × 100.

Результаты

Описательная статистика

Средние значения ΔVHN (±SD) комбинаций композитных решений представлены в Таблице 1.

...

Композит из смолы	Решение	ΔVHN (Среднее ± SD)	95% ДИ	n
EA

Обсуждение

Настоящий протокол предусматривает стандартизированный подход к оценке химического влияния сывороточных протеиновых напитков на микротвёрдость композита смолы. Критически важные этапы включают единообразное изготовление образцов, контролируемые условия светового отверждения и стандартизированные параметры тестирования Vickers. Поддержание одинаковых размеров образца и интенсивности отверждения крайне важно, поскольку вариации могут влиять на степень преобразования и механическую устойчив...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Алюминиевые шлифовальные диски	RubyPlaton, Inci Dental Tibbi Malz. San. ve Tic. Ltd. Sti., Стамбул, Турция	5714	Средняя, мелкая, сверхмелкая, используется для отделки и полировки
Аналитическая весы			Используется для взвешивания материалов
Раствор искусственной слюны	DIN 53160-1, Testonic Laboratory, Стамбул, Турция		Используется для хранения между циклами иммерсии
Цифровой pH-метр	Hanna Instruments, Woonsocket, RI, США	HI2211	Измерение pH напитков
Дистиллированная вода	Не указано	Не применимо	Используется в качестве контрольного раствора и для хранения образцов
Стеклянный предметный столик	Ningbo Trueline Imp. & Exp. Co., Ltd, Чжэцзян, Китай	7102	Используется для получения плоской поверхности образца при нанесении композита
Цилиндр с градуировкой	Не указано	Не применимо	Используется для измерения объемов жидкостей
Высоконаполненный наногибридный резинный композит (EA)	Estelite Asteria (Tokuyama Dental, Токио, Япония)	10942	Используется в качестве реставрационного материала; отличается содержанием наполнителя и составом резинной матрицы
Инкубатор	Memmert Universal, Memmert GmbH + Co. KG, Швабах, Германия	UN55	Используется для хранения при 37 °C
Инъекционный наногибридный резинный композит (GUI)	G-ænial Universal Injectable (GC Corporation, Токио, Япония)	12365	Используется в качестве реставрационного материала; отличается содержанием наполнителя и составом резинной матрицы
Лабораторная колба	Не указано	Не применимо	Используется для приготовления растворов сывороточного белка
Лабораторный шейкер	Не указано	Не применимо	Используется для смешения и гомогенизации растворов
LED световой отверждающий аппарат и радиометр	Woodpecker LED аппарат для отверждения (Guilin Woodpecker Medical Instrument Co., Ltd., Гуанси, Китай)	FD-300	Полимеризация и  проверка интенсивности света
Микромоторная насадка	FX205, NSK Ltd., Канума, Япония	C1056002	Используется в процедуре полировки
Умеренно наполненный наногибридный резинный композит (FU)	Filtek Universal (3M ESPE, Сент-Пол, Миннесота, США)	6570A2	Используется в качестве реставрационного материала; отличается содержанием наполнителя и составом резинной матрицы
Силиконовая форма	Не указано	Не применимо	Диск в форме, диаметр 6 мм × толщина 2 мм, используется для изготовления образцов
Твердомер Викерс	HMV, Shimadzu Corporation, Киото, Япония	HMV-G31	Испытание по твердости по Викерс (VHN)
Концентрат сухого сывороточного белка	Сывороточный белок со вкусом клубники, Proteinocean Gida AS., Анкара, Турция		Содержание лактозы: ~1–2%, содержание белка: ~85–90%
Изолят сухого сывороточного белка	Изолят сывороточного белка со вкусом шоколада, Proteinocean Gida AS., Анкара, Турция		Содержание лактозы: ~4–6%, содержание белка: ~70–80%