От ткани к морфометрии: пошаговый рабочий процесс Гольджи–Кокса для нейронного и дендритного анализа позвоночника у взрослых мышей

Краткое содержание

В этой статье описан пошаговый метод окрашивания Гольджи–Кокса у взрослых мышей, охватывающий приготовление раствора, пропитывание тканей, криопротекцию, секционирование, проявку и монтаж. Он акцентирует внимание на сохранении тканей и однородном, низкофоновом окрашивании, что позволяет чётко визуализировать морфологию нейронов. Метод маркирует дендритные арборы и поддерживает количественный морфометрический анализ дендритных шипов.

Аннотация

Анализ морфологии нейронов в области здоровья и заболеваний является фундаментальным для понимания функций мозга и оценки эффектов экспериментальных вмешательств. Окрашивание по методу Гольджи–Кокс остаётся классической, но весьма актуальной техникой визуализации полных нейронных беседок и дендритных шипов. Однако опубликованные протоколы часто отличаются в ключевых процедурных этапах и часто не имеют необходимых методологических деталей, что приводит к значительной вариативности качества окрашивания и делает лабораторную стандартизацию трудоёмкой и сложной. Здесь представлен комплексный, пошаговый протокол Гольджи–Кокса для взрослых мышей, охватывающий весь рабочий процесс — от обработки тканей in vivo до визуализации и морфометрического извлечения данных. В нём подробно описаны практические аспекты и распространённые ошибки, влияющие на эффективность пропитывания, целостность сечения и соотношение сигнал/шум, а также предоставляются методологические рекомендации для повышения воспроизводимости. В целом этот протокол обеспечивает надёжную визуализацию и количественный анализ целых нейронов, дендритных сегментов и дендритных шипов. Ожидается, что этот ресурс позволит реализовать окрашивание по методу Гольджи–Кокс с большей последовательностью, прозрачностью и технической строгостью, а также предоставит чёткую основу для адаптации метода к разнообразным лабораторным условиям.

Введение

Общая цель метода окрашивания Гольджи–Кокса — обеспечить высокоразрешающую визуализацию полной морфологии нейронов, включая дендритные арборы и дендритные шипы, в фиксированной ткани^мозга 1,2,3,4. Эта техника позволяет проводить детальный структурный анализ отдельных нейронов в сложных нейронных цепях, что делает её особенно ценной для изучения синаптической пластичности, нейроразвития, нейродегенерации и структурного ремоделирования, зависящего от^{опыта 5,6}.

Обоснование разработки и дальнейшего использования методов на основе Гольджи заключается в их уникальной способности обеспечивать разрежённую и полную нейронную импрегнацию ^1,2. Первоначально описанный Камилло Гольджи в 1873 году и уточнённый в 1891 году Коксом ^7,8, метод основан на осадке хромата серебра в ограниченном подмножестве нейронов, что позволяет провести полную морфологическую реконструкцию без перекрытия^{маркировки 3}. Модификация Гольджи–Кокса заменяет нитрат серебра, использованный в оригинальном методе Гольджи, на хлорид меркуры, улучшая проникновение в ткани и консистенцию^{окрашивания 2}. По сравнению с альтернативными методами маркировки нейронов, такими как экспрессия флуоресцентного белка, отслеживание вирусов или методы заполнения красителями, окрашивание по методу Гольджи–Кокс обладает рядом преимуществ. Он не требует генетических манипуляций, стереотаксических инъекций или специализированного микроскопического оборудования, а также позволяет визуализировать дендритные шипы с высоким контрастом при яркой^{микроскопии 1,2}. Хотя современные методы на основе флуоресценции обеспечивают специфичность клеточного типа, окрашивание по методу Гольджи–Кокс остаётся особенно полезным для непредвзятого морфологического отбора^{примеров 9,10} и для использования в видовых или экспериментальных условиях, где трансгенные инструменты отсутствуют.

В более широкой литературе методы, основанные на Гольджи, широко применялись для количественной оценки плотности и морфологии дендритного позвоночника в исследованиях обучения и^{памяти 5}, стресса и психиатрических расстройств¹¹,^{возраста 12} лет, а также нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера 12,13,14. Его постоянное использование на протяжении десятилетий подчёркивает его надёжность для структурной^{нейроанатомии 2}. Этот метод особенно подходит для исследователей, анализирующих дендритную архитектуру и морфологию позвоночника в ткани мозга, когда требуется визуализация целых^{клеток 1}. Он хорошо подходит для сравнительных морфологических исследований в экспериментальных группах. Однако исследователям, нуждающимся в специфичности клеточного типа, живой визуализации или молекулярной колокализации, могут больше пользоваться флуоресцентными или генетически закодированными методами маркирования ^9,10.

Протокол

В этом исследовании использовались взрослые самки мышей дикой B6129SF2/J (n = 3). Однако аналогичное окрашивание можно добиться обоими полами на взрослом возрасте. Все экспериментальные процедуры получили предварительное одобрение Комитета по биоэтике. (#117.A, Институт нейробиологии (INb), Национальный автономный университет Мексики)

1. Подготовка растворов

ВНИМАНИЕ: Хлорид меркура очень токсичен и коррозионен. Держитесь внутри капюшона с химическим дымом, надевая перчатки, лабораторный халат и защитную защиту для глаз. Утилизировать отходы в маркированный контейнер для опасных отходов. Дихромат калия и хромат калия являются токсичными и канцерогенными окислителями. Держите их внутри вытяжки с химическим паром и избегайте контакта с кожей или вдыхания.

1. Подготовка растворов для пропитки запаса
   1. Весит 15 г калий-дихромата. Растворите его в 300 мл двойной дистиллированной воды, чтобы получить 5% (w/v) раствор.
   2. Весит 15 г хлорида русала. Растворите его в 300 мл двойной дистиллированной воды, чтобы получить 5% (w/v) раствор.
   3. Весит 15 г хромата калия. Растворите его в 300 мл двойной дистиллированной воды, чтобы получить 5% (w/v) раствор.
   4. Оберните все контейнеры алюминиевой фольгой и храните при комнатной температуре, защищённой от света.
2. Подготовить рабочее решение Гольджи–Кокса
   1. Смешайте раствор дихромата калия объёмом 50 мл, раствор хлорида меркурия объемом 50 мл и раствор хромата калия объемом 40 мл.
   2. Добавьте 100 мл дистиллированной воды и тщательно перемешайте.
   3. Инкубировать смесь 48 часов при комнатной температуре, защищённую от света.
   4. Дайте осадку осеть. Используйте только супернатант для пропитывания тканей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор Гольджи–Кокса может храниться до 1 месяца при защите от света. Чтобы уменьшить отходы реагентов и обеспечить свежесть раствора, подготовьте только необходимый объём как стандартных растворов, так и окончательного раствора Гольджи–Кокса, необходимого для эксперимента. Подготовьте не менее 23 мл на мозг, чтобы получить 20 мл пригодного супернатанда после потери осадка.
3. Приготовьте раствор криопротектора
   1. Растворить сахарозу 300 г в сольном растворе, буферированном фосфатом 0,1 м (PBS), pH 7,4, приготовленном с безводным дибазисным фосфатом натрия, моногидратированным фосфатом натрия и хлоридом натрия.
   2. Отрегулируйте итоговую громкость на 1 л.
   3. Храните при 4 °C до недели.

2. Сбор тканей и оплодотворение

1. Проведите внутрисердечную перфузию
   1. Обезболить животное пентобарбиталом натрия (252 мг/кг, i.p.). Подтвердите достаточную глубину анестезии по отсутствию отмены педалей перед продолжением действия.
   2. Проведите внутрисердечную перфузию с примерно 30 мл PBS 0,1 M (pH 7,4) до тех пор, пока сточные каналы не прочистятся, обеспечивая полное удаление крови из ткани мозга. Фиксатив не использовался; само решение Гольджи–Кокс служит фиксатором в этом рабочем процессе.
   3. Аккуратно извлекайте мозг и промывайте его дистиллированной водой. Убедитесь, что мозг правильно перфузирован и не содержит остаточной крови (рисунок 1A).
2. Оплодотворенная ткань
   1. Разделите мозг на полушария или корональные блоки (толщиной ~3 мм) с помощью матрицы мозга для улучшения опрощённости. Меньшие тканевые блоки способствуют более равномерной пропитке и снижают вариативность, тогда как крупные образцы могут требовать более длительного времени инкубации и демонстрировать менее однородное окрашивание.
   2. Поместите мозг в раствор Гольджи–Кокса объёмом 10 мл. Защищайте от света.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 10 мл раствора Гольджи–Кокса достаточно для всего взрослого мозга мыши. При использовании одного полушария или меньших корональных блоков (толщиной ~3 мм) объем раствора может уменьшаться пропорционально, при условии, что ткань остаётся полностью погруженной. Если используется весь мозг, рекомендуется разрезать его с сохранением интересующей области для оптимального проникновения реагентов и однородного опрощещения.
   3. Инкубировать 24 часа при комнатной температуре.
   4. Замените на 10 мл свежего раствора Гольджи–Кокса. Инкубировать 10–14 дней при температуре 22–25 °C в темноте.
      ТОЧКА ПАУЗЫ: Храните ткани в растворе Гольджи–Кокса до 15 дней без значительной потери жизнеспособности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После оплодотворения по методу Гольджи–Кокс мозг приобретает тёмно-золотистый вид и становится очень хрупким; поэтому обращайтесь с ним осторожно (рисунок 1B). Рекомендуется использовать пластиковый пинцет для манипуляций, чтобы избежать химических реакций со стальными материалами.

3. Криозащита

1. Переместить ткань в раствор криопротектора объемом 10 мл (30% сахароза (с в/в) при 0,1 млн PBS, pH 7,4, приготовленный на этапе 1.3).
2. Инкубировать в течение 24 часов (4 °C).
3. При той же температуре (4 °C) замените раствор свежим криопротектором и инкубируют не менее 4–7 дней.
   ТОЧКА ПАУЗЫ: Перед секционированием храните ткани в растворе криопротектора до 3 недель при 4 °C.

4. Вложение и секционирование

1. Встроенная ткань
   1. Приготовьте 8% агарозы в горячей дистиллированной воде. Дайте ей остыть примерно до 40 °C.
   2. Поместите ткань в формы для встраивания и правильно ориентируйтесь.
   3. Залейте агарозу на ткань и дайте ей затвердеть 1 час при комнатной температуре или 30 минут при 4 °C (рисунок 1C).
   4. Обрезать излишки агарозы с блока (рисунок 1D).
2. Ткань сечения
   1. Закрепите агарозный блок на вибратомной стадии с помощью клея. (Рисунок 1E)
   2. Заполните камеру для резки криопротекторным раствором.
   3. Срезная ткань толщиной 100–200 мкм. Для анализа дендритного позвоночника рекомендуются более тонкие срезы (например, 100–120 мкм), чтобы повысить разрешение изображения, тогда как более толстые срезы (например, 150–200 мкм) могут использоваться для реконструкции целого нейрона. В этом исследовании срезы были вырезаны при размере 120 мкм (рисунок 1F).
   4. Собирайте секции мягкой кистью.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Запишите настройки вибратома в таблице материалов. Ни в коем случае не промывайте стекли после установки секций. Сахароза защищает ткань до этапа развития.

5. Монтаж

1. Подготовка слайдов с желатиновым покрытием
   1. Приготовьте раствор покрытия, растворив 0,5 г желатина в 100 мл (0,5% w/v) дистиллированной воды, нагретой до кипения.
   2. Перемешивайте, пока желатин полностью не растворится, и дайте раствору остыть до комнатной температуры.
   3. Добавьте 0,05 г сульфата хрома калия (0,05% w/v) и перемешайте до полного растворения. При необходимости удалите остаточную пену.
   4. Фильтруйте желатиновый раствор через фильтрующую бумагу для удаления нерастворённых частиц и остаточной пены, обеспечивая равномерное покрытие затвора.
   5. Смойте стеклянные стекла нейтральным моющим средством и водой, тщательно прополоскайте, а затем смойте дистиллированной водой.
   6. Погружение в 96% этанола, пока не останется видимых капель.
   7. Сухие слайды в духовке при 50–60 °C в течение 30 минут или до полного высыхания.
   8. Окуньте в желатиновый раствор и дайте избыточному раствору стекать.
   9. Поставьте слайды в духовку при температуре 50–60 °C на 30 минут или до полного высыхания.
   10. Повторите процесс покрытия и сушки не менее пяти раз, чтобы обеспечить правильное прилипание.
   11. После финального этапа сушки дайте стеклам остыть до комнатной температуры в безпыльной среде (например, внутри химического вытяжного контейнера) и храните их в чистом, закрытом контейнере до использования.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте только тот объём желатинового раствора, необходимый для количества затворов, которые нужно покрыть. Количество реагентов можно масштабировать пропорционально при сохранении заданных концентраций (w/v).
2. Разместите секции на стекли микроскопа с желатиновым покрытием с помощью мягкой кисти
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте микроскопические стеклы, покрытые не менее пятью слоями желатина 0,5%. Подготовьте стекли заново, чтобы обеспечить целостность тканей во время проявки. Электрозарядные стекли не тестировались в этом протоколе.
3. Замочите впитывающую бумагу в растворе криопротектора и нанесите её на секции.
4. Аккуратно прижимайте ладонью, чтобы устранить пузырьки воздуха и обеспечить равномерный контакт между тканью и желатиновым покрытием стекла, что способствует стабильной адгезии при последующей обработке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мягкое давление улучшает адгезию, максимизируя контакт между срезом и слоем желатина, снижая риск отслоения во время водного образования.
5. Аккуратно снимите бумагу и дайте слайдам высохнуть в темноте 2–3 дня при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сушка в условиях низкой влажности критически важна для стабильной адгезии. Защита от света минимизирует фотохимические изменения ткани, пропитанной Гольджи–Коксом, которая чувствительна к свету из-за наличия хроматных солей. Кроме того, остаточная агароза не нарушает существенно процесс образования и наблюдается вокруг ткани в развитом срезе (рисунок 2A). Наличие агарозы обеспечивает более безопасное обращение с тканью при монтаже, так как ткань, пропитанная по методу Гольджи–Кокс, очень хрупкая. При желании излишки агарозы можно аккуратно удалить вручную после установки секций на затворы.
   ТОЧКА ПАУЗЫ: Держите слайды защищёнными от света.

6. Развитие

ВНИМАНИЕ: Ксилол горючий и токсичен при вдыхании. Держите его в вытяжной камере с химическим дымом и избегайте открытого пламени. Аммиак коррозионен и производит раздражающие пары. Ручка в вытяжке.

1. Регидратируемые секции
   1. Погрузите слайды в дистиллированную воду на 5 минут.
   2. Переложите в свежую дистиллированную воду на 5 минут.
   3. Погрузитесь в 50% этанола на 5 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этап с 50% этанолом обеспечивает постепенный переход от водных условий к обезвоживанию, облегчая проникновение реагентов и помогая сохранить целостность тканей до этапа проявления.
2. Развивать окрашивание
   1. Инкубировать стекли в водном растворе аммиака, приготовленном путём смешивания двух объёмов 25% аммиака с 1 объёмом дистиллированной воды (2:1, v/v) в течение 8 минут
   2. Стирайте в дистиллированной воде 5 минут.
   3. Снова помойте в дистиллированной воде в течение 5 минут.
   4. Инкубировать в 5% натрия тиосульфате в дистиллированной воде 10 минут в темноте.
   5. Стирайте в дистиллированной воде 1 минуту.
   6. Снова помойте в дистиллированной воде на 1 минуту.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Завершите процесс разработки без перерывов после начала.
3. Обезвоживание и прочистка
   1. Погружение в 70% этанола на 5 минут.
   2. Погружите слайды в 96% этанол на 5 минут.
   3. Погружите слайды в 100% этанол на 5 минут.
   4. Перенесите слайды в ксилол минимум на 6 минут.

7. Постоянное крепление

1. Нанесите монтажную среду Permount® (показатель преломления ~1,52) на каждую секцию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Показатель преломления монтажной среды должен быть совместим с масляными иммерсионными объективами для обеспечения оптимального качества изображения.
2. Аккуратно размещайте накладку, чтобы избежать пузырьков воздуха.
3. Запечатайте края прозрачным лаком для ногтей.
4. Дайте стеклам высохнуть в темноте 48 часов при комнатной температуре.

8. Визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ: Методы визуализации и конфигурации приобретения различаются в зависимости от марки микроскопов; оптимальные настройки должны быть определены для каждой системы.

1. Включи микроскоп.
2. Откройте микроскопическое программное обеспечение
3. Поставьте стекло на стадию микроскопа.
4. Захватите 2D-широкое изображение среза мозга с помощью объектива с низким увеличением, такого как 1X/0.04 N.A. или 4x/0.10 (рисунок 2A, B).

9. Визуализация целых нейронов

1. Захватить высокоразрешающие стеки изображений области, содержащей интересующий нейрон, используя объектив 10x/0,25 N.A. или 20x/0,40 N.A. (рисунок 2C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нейроны, отобранные для анализа, должны демонстрировать полное и однородное пропитывание Гольджи–Кокса с чётко очерченными дендритными арборами и минимальным фоновым окрашиванием. Клетки с усечёнными отростками, неполным пропитыванием, перекрывающимися структурами или высоким фоновым сигналом следует исключать для обеспечения точного морфометрического анализа.
2. Фокусируйте изображение и регулируйте настройки камеры, включая экспозицию и баланс белого.
3. Установите верхнюю и нижнюю границы для стека изображений.
4. Установите шаговое расстояние на 0,5 мкм в окне получения изображения.
5. Захватите стек изображений с помощью программной команды для получения стека.
6. Повторите вышеуказанные шаги, чтобы охватить все интересующие области.
7. Сохраните файл данных и сохраните все файлы изображений. Формат TIFF для внешней обработки.

10. Визуализация дендритных шипов

1. Захватить высокоразрешающие стеки изображений области, содержащей интересующий нейрон, с помощью масляного погружённого объектива 63x/1,4 Na в соответствующем микроскопе с ярким полем (рисунок 2D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящей рукописи высококачественные изображения дендритных шипов, показанных на рисунке 2D, были получены с помощью режима яркого поля конфокального микроскопа модели Zeiss LSM 780. Однако другие микроскопы с ярким полем могут служить для получения 63-кратных высококачественных Z-стековых изображений, параметры которых должны быть стандартизированы каждой лабораторией.
2. Нанесите 1–2 капли погружного масла на затвор и положите объектив поверх затвора, обеспечивая контакт между объективом и маслом.
3. Фокусируйте изображение и регулируйте настройки камеры, включая экспозицию и баланс белого.
4. Установите верхнюю и нижнюю границы для стека изображений.
5. Установите ступенчатое расстояние на 0,3 мкм в окне получения изображения.
6. Захватите стек изображений с помощью программной команды для получения стека.
7. Повторяйте вышеуказанные шаги, чтобы охватить все интересующие вас области
8. Сохраните файл данных и сохраните все файлы изображений в формате TIFF для внешней обработки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для шагов 9 и 10. Если микроскоп не оснащён моторизованной ступенью для получения Z-стека, изображения можно собирать вручную, регулируя микрометрический фокус. Однако расстояние между оптическими секциями может быть менее точным. В этом случае Z-стеки могут быть воссозданы позже в программном обеспечении для обработки изображений (например, ImageJ) из полученной последовательности изображений.

11. Морфометрический анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой цели могут использоваться различные подходы и специализированные программные программы. Некоторые бесплатные инструменты для анализа дендритного позвоночника включают ImageJ или, как в данном исследовании,^{PyReconstruct 15}. Для более подробного описания PyReconstruct и его функциональности для нейронной реконструкции и морфометрического анализа см. указанный источник.

1. Процедура морфометрического анализа дендритного позвоночника
   1. После открытия файла в ImageJ измените формат на RGB, выбрав Image > Type > RGB Color.
   2. Преобразуйте Z-стеки в последовательность изображений в ImageJ: нажмите File > Save As > Image Sequence. Сохраняйте каждую последовательность изображений в отдельной папке для последующего анализа. В PyReconstruct загрузите последовательность изображений, нажав File > New > From Images.
   3. Появится диалоговое окно, предлагающее присваивать имя файлу (например, WTVR1N1 — Wild-Type Vehicle Mouse 1 Neuron 1).
   4. Затем появляются три последовательных диалоговых окна. В первом окне введите значение калибровки (мкм/пиксель). Эта информация доступна в метаданных Z-стека и доступна в ImageJ.
   5. Во втором окне введите толщину каждого последовательного оптического сечения (мкм). Наконец, серия изображений начнёт загружаться автоматически (дополнительный рисунок 1A).
   6. После определения интересующего сегмента согласно критериям включения, определённым исследователем, приступайте к отслеживанию для получения количественных данных.
   7. Присвоите отдельное имя и домен для каждого типа трассы. Разместите домены в нижней панели, где они представлены разноцветными геометрическими фигурами (дополнительный рисунок 1B).
   8. Нарисуйте линию, соответствующую нужной длине образца, с помощью инструмента карандаш. Затем генерируйте вторую дорожку через Z-стек вдоль дендритного сегмента с помощью инструмента Z.
   9. Используйте начальную следу, чтобы определить подходящую длину сегмента и проверить её в разделе Списки > Z-trace List (дополнительный рисунок 1B).
   10. Ориентируйтесь по Z-стеку и определяйте дендритные головки позвоночника с оптимальной концентрацией. С помощью инструмента карандаш обведите самую широкую дистальную область каждой головки корешка. Затем используйте инструмент Z, чтобы обвести гриф позвоночника по всему Z-стеку (дополнительный рисунок 1C, D). Повторяйте эту процедуру, пока не будут проследлены все головки и шеи позвоночника в выбранном дендритном сегменте.
2. Экспортные измерения головы позвоночника
   1. Откройте списки с измерениями ширины и длины головки позвоночника. Получите доступ к ним в разделах Lists > Trace List (по ширине) и Lists > Z-trace List (по длине) соответственно.
   2. Экспортируйте данные в нужное место на компьютере. Будут сгенерированы два отдельных файла Excel, каждый из которых содержит соответствующие данные измерений.
3. Классифицировать морфологию позвоночника и рассчитать плотность
   1. Извлечь измерения ширины и длины головок и шеи позвоночника из ранее сгенерированных файлов Excel.
   2. Данные должны быть организованы в соответствующие столбцы с обозначениями Ширина и Длина для морфологической классификации по следующим^{критериям 16}: филоподия (>2 мкм), тонкие (< 2 мкм), короткие (соотношение длины к ширине головы ≤1) и грибоногие (ширина головы >0,6 мкм). (Дополнительный рисунок 1E). Филоподии редко наблюдались в анализируемых дендритных сегментах и поэтому не были включены в анализ.
   3. На этом этапе определяется общее количество шипов на анализируемый дендритный сегмент, а также плотность шипа (шипы на линейный мкм), а также тип и количество каждого подтипа шипа. Шаблон Excel¹⁶ , используемый для этого анализа, доступен в приложенном источнике. С помощью этого метода была количественно измерена плотность базального дендритного позвоночника в области CA1 гиппокампа у 12-месячных самок мышей.
   4. Экспортировать количественные данные и генерировать графики с помощью специализированных научных программ, предназначенных для анализа данных, построения графиков и статистики. Здесь график на рисунке 3 был построен с помощью программного обеспечения GraphPad Prism.

Результаты

Импрегнация и сечение тканей
Протокол Гольджи–Кокса, описанный здесь, обеспечил надёжное и однородное нейронное окрашивание в ткани мозга взрослых мышей. После пропитания раствором Гольджи–Кокса мозг приобретает характерный тёмно-золотистый оттенок, что свидетельствует об успешной диффузии раствора для окрашивания по всей ткани. Секционирование вибратомы сохраняло структурную целостность нейронных сомат и дендритных отростков.

Визуа...

Обсуждение

Метод окрашивания Гольджи–Кокса остаётся одним из самых широко используемых методов визуализации морфологии нейронов и дендритных шипов в фиксированной ткани^{мозга 3,4}. Путём импрегнации небольшого случайного подмножества нейронов позволяет визуализировать целые дендритные деревья с минимальным фоновым окрашиванием. В настоящем протоколе эта методика позволила чётко визуализировать пирамидальные нейроны гиппокампа и их дендритные ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Агарозе	Жизненные технологии	15510-027	CAS 9012-56-6
Раствор аммиака 25%	Merck	208380	CAS 1336-21-6. Опасно.
Безводный фосфат натрия дибазовый	Сигма-Олдрич	S3264	CAS 7558-79-4
Микроскоп с ярким полем	Nikon	Eclipse Ci
Сульфат хрома калия	Сигма-Олдрич	243361
Конфокальный микроскоп	Zeiss	LSM 780
Цифровой баланс	Accuris Instruments	W3200-1200
Встраивающие формы	Merck	E6032	Размеры: 22x22 мм
Этанол	Мейер	394
Экспериментальные животные	Лаборатория Джексона	2124-01	B6129SF2/J штамм мыши
Желатиновый порошок	Сигма-Олдрич	G2500
Программное обеспечение GraphPad Prism	GraphPad Software Inc.		Версия 8.0.2
ImageJ Fiji Software	Национальный институт здравоохранения США		Версия 1.54p, https://imagej.net/software/fiji/downloads
Хлорид меркура	Дж.Т. Бейкер	2594-01	CAS 7487-94-7. Опасно.
Микроскопическая камера	Nikon	DS-Vi1
Объектив микроскопа (10x)	Nikon	93183	План 10x/0.25 N.A.
Микроскопический объектив (1 раз)	Nikon	93180	План UW 1x/0.04 N.A.
Микроскопический объектив (20x)	Nikon	93184	План 20x/0.40 N.A.
Микроскопический объектив (4 раза)	Nikon	93182	План 4x/0.10 N.A.
Объектив микроскопа (63 раза)	Zeiss	420782-9900-799	План APO 63x/1.4 N.A. oil DIC
Микроскопические стекли	Сигма-Олдрич	S8902
Моногидратированный фосфат натрия монобазичен	Дж.Т. Бейкер	3818-05	CAS 10049-21-5
Лак для ногтей	ГРЕХОВНЫЕ ЦВЕТА	ЯРКИЙ ЦВЕТ	Прозрачность
Монтажные материалы Permount	Fisher Scientific	SP15-500
Хромат калия	Productos Quí micos Monterrey	2784	CAS 7789-00-6. Опасно.
Калиев дихромат	Сигма-Олдрич	207802	CAS 7778-50-9. Опасно.
Программное обеспечение PyReconstruct	Техасский университет, Остин		версия 1.19.0, https://github.com/SynapseWeb/PyReconstruct
Хлорид натрия	Фермон	24912	CAS 7647-14-5
Тиосульфат натрия	Productos Quí micos Monterrey	7291	CAS 7772-98-7. Опасно.
Сахароза	Дж.Т. Бейкер (Авантор)	4072-05	66,55°; Специфическая ротация, реагент ACS
Вибратом	Leica Biosystems	VT1200S	СКОРОСТЬ 20 мм/с, AMPL и DASH; 0,60 мм
Ксилол	CTR Scientific	CTR05128	CAS 1330-20-7. Опасно.