Методическая статья

Оптогенетический анализ поведения комара Aedes aegypti

263 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71394

⸱

21 августа 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics, Yale University, 2Kavli Institute for Neuroscience, Yale University, 3Howard Hughes Medical Institute, 4Wu Tsai Institute, Yale University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данном протоколе описывается использование оптогенетики для изучения поведения комаров Aedes aegypti. Представлены методы разведения, подготовки, проведения анализов и анализа данных для оценки функций нейронов в процессе привлечения хозяина и кровососания. Эти базовые методы позволят проводить исследования нейронных цепей и поведения этого важного переносчика заболеваний человека.

Аннотация

Комар Aedes aegypti является важным переносчиком вирусных патогенов и служит моделью для других видов переносчиков. Патогены передаются при укусе комара животного-хозяина, однако нейронные цепи, управляющие поведением по поиску и укусам, остаются неизвестными. В данной работе подробно описаны методы манипулирования нейронной активностью комара с помощью оптогенетики — ключевого метода определения причинно-следственной связи между нейронными цепями и поведением. Эти методы включают разведение комаров для оптогенетики и три теста, предназначенных для измерения различных этапов в последовательности возбуждения, привлечения, зондирования хоботком и насыщения кровью хозяина. Эти формы поведения проявляются на разных пространственных масштабах и в ответ на различные сенсорные стимулы. Каждая установка для поведенческого теста оснащена красными (~625 nm) светодиодами для оптогенетической активации. Для обнаружения возбуждения в ответ на ольфакторные стимулы количественно оцениваются полет и ходьба. Для анализа привлечения или посадки комаров помещают в большую арену с подогретой порцией крови. Зондирование хоботком и насыщение анализируются с помощью видеозаписи с более высоким разрешением, что позволяет измерять положение придатков и размер брюшка. Протокол описывает модели машинного зрения для обеспечения высокого временного разрешения при количественной оценке поведения и конечных измерений кормления. Эти методы могут быть использованы для изучения роли любой генетически доступной популяции нейронов в поведении комара при укусе и могут быть распространены на другие формы поведения.

Введение

Комар является одним из самых опасных животных в мире, причем не из-за своей свирепости или силы, а из-за своей эффективности как переносчика заболеваний. Паразиты, вызывающие малярию и распространяемые комарами Anopheles, становятся причиной сотен тысяч смертей ежегодно, в то время как Aedes aegypti и Aedes albopictus отвечают за распространение желтой лихорадки, денге, чикунгуньи, лихорадки Зика и многих других опасных для жизни заболеваний1. Комары обитают на всех континентах, кроме Антарктиды, и представляют серьезную проблему для общественного здравоохранения2. Поведение, связанное с питанием кровью, напрямую способствует передаче патогенов, но также является необходимым этапом в жизненном цикле комара , поскольку для откладки яиц требуется порция крови позвоночного животного. Таким образом, сдерживание распространения трансмиссивных заболеваний, переносимых комарами, требует понимания механизмов их поиска хозяина.

Хорошо известно, что самки комаров используют сигналы дальнего и ближнего действия для поиска хозяев3,4. Диоксид углерода (CO2) представляет собой очень летучий газ, содержащийся в выдыхаемом человеком воздухе, и зачастую является первым сигналом, который воспринимает комар. В обонятельных сенсорных нейронах Aedes aegypti он детектируется белками Gr1, Gr2 и Gr3, которые образуют рецептор CO2 5. Воздействие CO2 вызывает взлет и полетное поведение, также называемое активацией6,7, которая может сохраняться до 10–15 min даже в отсутствие последующих стимулов8. CO2 синергирует с запахом кожи, усиливая активацию и притяжение5,9. После обнаружения CO2 и запаха кожи комар становится чувствителен к дополнительным, более проксимальным сигналам хозяина, таким как тепло, визуальный контраст и влажность, которые направляют его к посадке на подходящего хозяина для питания кровью5,10,11,12,13. Интеграция множества сенсорных сигналов позволяет комарам эффективно выслеживать и находить своего хозяина.

Когда самка комара садится на потенциального хозяина, она вводит хоботок в поверхность кожи до тех пор, пока не обнаружит подходящий участок, этот процесс известен как зондирование14,15. После зондирования стилет прокалывает кожу, находит кровеносный сосуд и одновременно засасывает кровь, вводя слюну, что позволяет комару удвоить массу своего тела за несколько минут16. Кровь направляется в среднюю кишку, где белки перевариваются для производства яиц. Интересно, что полное насыщение кровью хозяина не является обязательным для распространения патогенов, так как одно лишь зондирование может привести к передаче заболевания16,17. Таким образом, понимание каждого этапа поведения при укусе может позволить разработать стратегии по нарушению процесса поиска хозяина и укуса самками комаров и, в конечном счете, контролировать распространение трансмиссивных заболеваний, переносимых комарами.

Для управления нейронной активностью в модельных организмах было разработано множество инструментов. Ранние инструменты функционировали конститутивно или посредством термической активации18,19,20,21. Несмотря на свою полезность, эти генетические реагенты имеют определенные недостатки. Конститутивные инструменты могут влиять на развитие, что приводит к возникновению фенотипов, обусловленных не только функцией нейронных цепей. Комары используют тепло тела для идентификации позвоночных хозяев, что делает термически активируемые каналы совершенно непригодными для изучения их поведения22,23. В исследованиях поведения под оптогенетикой понимают использование генетических инструментов, которые реагируют на свет с определенной длиной волны для управления активацией интересующих нейронов . Этот метод уже применялся в многочисленных системах: от изучения валентности жажды у мышей и анализа брачного поведения у Drosophila до восстановления зрения при пигментном ретините в клинических испытаниях на людях24,25,26. Оптогенетические каналы работают за счет поглощения фотонов и обеспечения прохождения специфических типов ионов через плазматическую мембрану, что активирует или ингибирует нейрон. Благодаря введению в организм трансгенных генов, кодирующих светочувствительные белки, этот метод позволяет активировать или подавлять специфические нейроны, которыми иначе невозможно было бы манипулировать. Оптогенетика обеспечивает преимущества в темпоральном и пространственном контроле, а также предоставляет ряд контрольных возможностей, позволяющих делать экспериментальные выводы.

Авторы недавно описали первое применение оптогенетических инструментов для изучения поведения комаров8. Эти инструменты основаны на использовании катионного канала CsChrimson, активируемого красным светом, который представляет собой краснo-смещенный ченнелродопсин27. Микробные опсины, включая CsChrimson, требуют химического кофактора, all-trans-ретиналя, для поглощения фотонов28. CsChrimson слит с флуоресцентным репортером tdTomato и находится под контролем бинарной системы экспрессии QF2/QUAS, что позволяет гибко комбинировать его с различными драйверными линиями29. Для воздействия на сенсорные нейроны, реагирующие на CO2 , использовалась драйверная линия, экспрессирующая транскрипционный фактор QF2 в нейронах, которые экспрессируют субъединицу Gr3 рецептора CO2 30. Комары демонстрировали минимальный поведенческий ответ при воздействии только красного света8; кроме того, красный свет наиболее эффективно проникает через биологические ткани, что делает активируемый красным светом опсин идеальным для оптогенетики25.

В данной работе описаны протоколы трех анализов, которые позволяют измерять различные аспекты поведения комаров при поиске хозяина и питании кровью в сочетании с оптогенетической стимуляцией (Рисунок 1A). Сначала приводится протокол разведения оптогенетических линий комаров. Во втором разделе описывается опто-термоциклер — модифицированный ПЦР-термоциклер, который можно использовать для отслеживания возбуждения и зондирования, когда комары подвергаются воздействию температурных и световых стимулов. Анализ с использованием опто-термоциклера предназначен для измерения этого поискового поведения на протяжении длительных временных интервалов с использованием драйверных линий для управления нейронной активностью с помощью оптогенетики. В третьем разделе описывается метод «кровяного одеяла» (blood blanket assay), при котором комары имеют постоянный доступ к тонкому слою искусственной крови на основании модифицированного термоциклера, что позволяет отслеживать полет, зондирование и наполнение при различных условиях освещения и температуры. Метод «кровяного одеяла», созданный на базе опто-термоциклера, предоставляет способ количественной оценки наполнения искусственной кровью, позволяя изучать поведение комаров при питании с использованием точно рассчитанных по времени оптогенетических и тепловых стимулов. В заключительном разделе описывается опто-мембранный фидер, при котором комарам предлагается теплая порция крови в контейнере, что позволяет отслеживать как привлечение к источнику крови, так и наполнение при воздействии световых стимулов. Анализ с использованием опто-мембранного фидера применяется для исследования полной поведенческой последовательности поиска хозяина и питания кровью в системе свободного полета. Помимо ожидаемых результатов для каждого анализа, описаны модели машинного зрения для отслеживания частей тела комаров и идентификации их поведения во время экспериментов. Анализы с использованием опто-термоциклера, «кровяного одеяла» и опто-мембранного фидера позволяют измерять отдельные стадии поведения комаров при питании кровью, одновременно манипулируя нейронной активностью с помощью света. Эти инновационные методы позволяют изучать, как нейронные цепи комаров контролируют поведение, представляющее угрозу для общественного здравоохранения.

Протокол

Комары, используемые в данном протоколе, содержат трансгены и, согласно правилам Министерства сельского хозяйства США, должны выращиваться в помещениях с II уровнем защиты от распространения членистоногих (Arthropod Containment Level II)32. Для предотвращения побега насекомых используется система содержания, а утилизация осуществляется как биоопасных отходов. Протоколы биобезопасности и содержания членистоногих были рассмотрены и утверждены отделом охраны окружающей среды, здоровья и безопасности Йельского университета (Yale Environmental Health & Safety). В данной работе не использовались люди или животные в качестве объектов исследования. Генотип комаров может быть подтвержден с помощью флуоресцентных маркеров (3xP3-dsRed для Gr3-QF2 и 3xP3-CFP для QUAS-CsChrimson) или с помощью ПЦР на вставленную конструкцию8. Все материалы, использованные в данном исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Оптогенетическое выращивание

  1. Выращивайте комаров в соответствии со стандартным протоколом31 со следующими исключениями для максимизации отклика оптогенетических линий во время экспериментов.
  2. Проведите скрещивание гомозиготных линий Gr3-QF2, QUAS-CsChrimson и дикого типа штамма Liverpool для получения гетерозиготных экспериментальных линий Gr3-QF2/+, QUAS-CsChrimson/+ и Gr3>CsChrimson.
  3. Содержите комаров в светонепроницаемом инкубаторе при температуре 28 °C и влажности 80% с циклом 14 ч синего света (450 nm) и 10 ч темноты (Рисунок 1B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование синего света сводит к минимуму активацию каналов, активируемых красным светом, таких как CsChrimson. Все этапы выращивания вне инкубатора должны проводиться в условиях низкой освещенности.
  4. Начинайте эксперименты с взрослых комаров не ранее чем через 1 неделю после вылета из куколки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя идеальный возраст для поведенческих экспериментов составляет 2–3 недели, можно использовать комаров в возрасте до 4 недель после вылета. Контрольные и экспериментальные генотипы должны быть одного возраста, который фиксируется как количество дней после вылета. Для стандартизации возраста животных все яйца должны быть выведены в один и тот же день.
  5. За два дня до начала экспериментов осторожно соберите спарившихся самок, не питавшихся кровью, из клеток с помощью аспиратора и анестезируйте их при 4 °C. Используя перышко или аспиратор, аккуратно перенесите их в экспериментальные контейнеры в соответствии с используемым методом анализа.
  6. Подготовьте аликвот 0,2 M all-trans-ретиналя (ATR) в диметилсульфоксиде (DMSO), хранящийся при -20 °C. Обеспечьте подачу 10% сахарозы и 400 µM ATR через пропитанные хлопковые фитили на сетке контейнера. Животные могут питаться этой смесью в темноте в течение 1–3 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кормление в темноте, в отличие от кормления под синим светом, предотвращает выцветание ATR (Рисунок 1B). Кроме того, на всех этапах протокола комаров анестезировали путем выдерживания при 4 °C в течение 5–10 мин до прекращения движений. По окончании каждого эксперимента комаров усыпляли путем выдерживания при -20 °C в течение 24 ч.
    ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: All-trans-ретиналь может вызвать сильное раздражение при попадании на кожу и в глаза. При работе используйте соответствующие СИЗ, такие как лабораторный халат, перчатки и средства защиты глаз. Диметилсульфоксид является горючей жидкостью, которая может впитываться через кожу при контакте; с ним следует работать в сухой среде с использованием надлежащих СИЗ и защиты глаз. DMSO также следует хранить в огнестойких химических контейнерах.
  7. За один день (20–24 ч) до начала экспериментов замените кормушки с сахарозой на новые кормушки с дистиллированной водой и 400 µM ATR. Животные остаются в темноте до начала экспериментов (Рисунок 1B). Перейдите к разделу 2, 3 или 4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты следует проводить в дневной фотопериод комаров для максимальной частоты отклика.

2. Опто-термоциклер

  1. Сборка компонентов анализа
    1. Изготовьте акриловые пластины для содержания комаров (Рисунок 2). См. Рисунок 2A для диаграммы, Рисунок 2B для электронных компонентов, и Рисунок 2C для изображения акриловая пластина Для получения шаблонов см. файлы по адресу (https://github.com/sorrellslab/opto-thermocycler/releases/tag/v1.0.0).
      1. Для создания стенок с помощью лазерной резки вырежьте из акрилового листа толщиной 3 мм четыре прямоугольника размером 10 см на 1 см и шесть прямоугольников размером 7 см на 1 см. Склейте прямоугольники акриловым клеем в матрицу размером 5 на 3, где каждый элемент представляет собой камеру размером 17 мм на 17 мм на 10 мм. Шаблон для этих деталей находится в файле «14_животное_толстый_v3.ai”.
        ​ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Акриловый клей является горючим веществом и может вызвать раздражение дыхательных путей, а также раздражение слизистой оболочки глаз. При работе с акриловым клеем следует использовать соответствующие средства индивидуальной защиты, такие как перчатки, лабораторный халат и защитные очки; данный растворитель следует использовать в хорошо проветриваемом помещении, вдали от открытого огня.
      2. Для изготовления дна камеры вырежьте из акрилового листа толщиной 1,5 мм прямоугольник размером 6,985 см на 10,16 см, удалив нижний правый колодец. Для крышки вырежьте из акрилового листа толщиной 1,5 мм прямоугольник размером 6,985 см на 10,16 см. Шаблон для этих деталей — «14_животные_тонкий_v3.ai”.
    2. Отрежьте лист черной сетки, устойчивой к УФ-излучению, по размеру нижней акриловой детали (Рисунок 2C). Поместите сетку между стенками пластины и нижней частью, затем зафиксируйте их акриловым клеем. Удалите сетку из нижнего правого лунки, чтобы отверстие оставалось незагроможденным.
  2. Сконструируйте раму для крепления камеры и светодиодов (Рисунок 2A).
    1. Соберите раму, установив по четыре стойки в каждом углу амплификатора, используя оптические конструкционные профили квадратного сечения 25 мм длиной 60,96 см. Используйте два конструкционных профиля 25 мм длиной 22,86 см, чтобы соединить переднюю правую стойку с задней правой и переднюю левую стойку с задней левой на расстоянии 30 см от лабораторного стола.
    2. Соедините передние правый и левый стойки направляющей из конструктора длиной 30,48 см и диаметром 25 мм, расположенной на высоте 24 см от поверхности стола, а задние стойки — направляющей из конструктора длиной 30,48 см и диаметром 25 мм, расположенной на высоте 42 см от поверхности стола.
    3. Прикрепите оптические стойки длиной 1 фут к монтажной рейке по левой и правой сторонам рамы. К каждой стойке привяжите шесть последовательно соединенных светодиодов с длиной волны 627 нм (красного цвета) на высоте 24 см над блоком ПЦР амплификатора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что пиковая активность CsChrimson наблюдается при длине волны света около 590 нм, использование длин волн в районе 625 нм позволяет сбалансировать необходимость активации CsChrimson и исключить поведенческие реакции на свет в генетических контрольных группах27Закрепите с помощью ленты радиатор и линзу на каждом светодиоде, чтобы сфокусировать свет в сторону блока термоциклера.
    4. Закрепите оптическую стойку длиной 30,48 см на верхней части двух передних направляющих опор конструкции. Используя угольный зажим в центре первой оптической стойки, установите вторую оптическую стойку длиной 15,24 см, направив ее внутрь над блоком амплификатора. На конце стойки закрепите камеру с инфракрасным длинноволновым фильтром, направив ее вниз на расстоянии 40 см над блоком.
    5. С помощью оптических стержней создайте раму в форме прямоугольника, которая отходит от монтажной направляющей и охватывает блок ПЦР, располагаясь чуть выше его поверхности. Закрепите ленту инфракрасных светодиодов, направленную к блоку ПЦР, чтобы освещать комаров под прямым углом к камере.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инфракрасное освещение, используемое для видеосъемки, не вызывает заметного нагрева арены, так как поверхность термоциклера поддерживается при температуре 24°C. °C на протяжении всего эксперимента.
    6. Накройте конструкцию светонепроницаемой шторой, чтобы предотвратить воздействие окружающего света.
    7. Закройте поверхность и боковые стороны блока ПЦР одним слоем светонепроницаемой ленты, чтобы создать ровную плоскую поверхность с темным фоном.
    8. Поместите датчик термопары на блок ПЦР в правый нижний угол и закрепите его светонепроницаемой лентой. С помощью измерителя мощности подтвердите равномерное распределение света по всему блоку ПЦР. Отрегулируйте напряжение или ток источника питания, чтобы обеспечить подачу света на уровне 12 µВт/мм2.
    9. На краю блока ПЦР разместите инфракрасный светодиод для синхронизации видео с выходом подачи стимула (Рисунок 2C). Заклейте поверхность черной изолентой, чтобы свет мог регистрироваться без создания бликов на камере.
    10. Подключите термопару, синхронизирующий светодиод и красные светодиоды согласно схеме в Рисунок 2BЗагрузите необходимое программное обеспечение (SpinView (версия 1.27.0.48), CoolTerm (версия 2.0.1), Arduino IDE (версия 1.8.12)). Загрузите код Arduino и программу термоциклера из репозитория GitHub.
      ​ПРИМЕЧАНИЕ: Код Arduino запрограммирован на подачу красного света, тепла температуры тела, а также комбинации этих двух стимулов. В качестве ресурсов предоставлены семь программ стимуляции, в которых порядок подачи стимулов рандомизирован. Данные программы могут быть изменены для подачи других стимулов. В каждом эксперименте предусмотрено девять стимулов: три только тепловых, три только световых и три одновременных тепловых и световых. Подача стимулов осуществляется следующим образом: Arduino регистрирует изменения температуры поверхности блока ПЦР с помощью термопары, после чего подает световые стимулы в указанное время. Дополнительные сведения содержатся в комментариях к программам стимуляции.
  3. Подготовка к испытанию
    1. Вырастите комаров в соответствии с протоколом оптогенетического разведения; см. раздел 1 и Рисунок 1B.
    2. За два дня до начала эксперимента перенесите 14 самок комаров в отдельный контейнер с помощью аспиратора. Обеспечьте комаров ATR согласно шагу 1.6. Если сравниваются несколько генотипов, проведите их ослепление для экспериментатора.
      ​ПРИМЕЧАНИЕ: после введения ATR комаров следует содержать при приглушенном свете.
    3. За один день до начала эксперимента (за 20–24 ч) перенесите по 14 самок комаров в каждую акриловую пластину и анестезируйте их при 4 °в. Осторожно поместите по одному комару в каждую лунку, используя перо или аспиратор.
    4. Закрепите боковую сторону акриловой пластины скотчем, чтобы зафиксировать крышку. Не заводите скотч на верхнюю или нижнюю части акриловой пластины, так как это перекроет обзор камере.
    5. Поместите акриловую пластину поверх трех хлопковых фитилей, пропитанных 400 µМ ATR в дистиллированной воде (см. шаг 1.6), расположенные параллельно. Выровняйте каждый из трех ряды к фитилю, чтобы все комары имели доступ к раствору воды-ATR. Поместите акриловую пластину в темный инкубатор на ночь.
  4. Проведение испытания
    1. Подключите камеру, светодиоды и Arduino к компьютеру. Включите источник питания. Протрите поверхность опто-термоциклера 70% этанолом и дайте ей высохнуть.
      ​ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Этанол легко воспламеняем и может вызвать серьезное раздражение глаз. При работе с этанолом необходимо использовать соответствующие средства индивидуальной защиты. Кроме того, избегайте использования открытого огня.
    2. Используя светонепроницаемый контейнер, перенесите акрильную пластину с комарами в центр ПЦР-блока. Накройте опто-термоциклер светозащитной шторой.
    3. Откройте программу SpinView на компьютере. Нажмите на название камеры, чтобы открыть окно просмотра. Подключите инфракрасные лампы и убедитесь, что ПЦР-блок и акриловая пластина видны в окне камеры.
    4. При необходимости отрегулируйте положение акриловой пластины так, чтобы она была выровнена, центрирована, а термопара была видна в правом нижнем углу пластины. Убедитесь, что индикатор синхронизации находится в кадре (Рисунок 2C).
    5. Настройте параметры камеры и программы SpinView, чтобы получить четкое кадрированное видео с изображением акриловой пластины. В Формат изображения вкладка, отрегулируйте Ширина, Высота, Смещение Xи Смещение Y варианты обеспечения видимости акриловой пластины и синхронизирующего света. В Настройки вкладка, набор Частота кадров при сборе данных Активировать к истина и Частота кадров при сборе данных к 30 кадры в секунду
    6. Поворот Автоэкспозиция и Автоматическая регулировка усиления выключите. Отрегулируйте Время экспозиции и Усиление значения, чтобы создать четкий контраст между черным фоном и комарами. Нажмите красную кнопку записи в верхнем правом углу, чтобы открыть отдельное окно для сохранения видеофайла.
    7. В появившемся окне укажите путь к файлу в верхней части: нажмите Просмотрперейдите в папку с экспериментом, нажмите Новая папкаи пометьте его названием пробы. Установите количество кадров для записи, соответствующее параметрам эксперимента (например, 43 500), или установите значение 0, чтобы остановить запись вручную.
    8. На вкладке «Видео» заполните следующие поляТип записи видео: MJPG, Размер разделения видеофайла: 1000 МБ, качество сжатия JPEG: 65. Откройте «оптотермо_светнагрев_случайный1программу в термоциклере и запустите её. Термоциклер должен начать работу с этапа выдерживания при 25°C °С.
    9. Откройте соответствующую программу «TC_optothermo_lightheat_random1.ino», в среде Arduino IDE и загрузите его на плату. Откройте монитор последовательного порта и убедитесь, что температура составляет примерно 25 °С.
    10. Закройте монитор последовательного порта в Arduino IDE. Откройте CoolTerm, чтобы начать сбор данных с монитора последовательного порта Arduino. Убедитесь, что выбранный последовательный порт и канал совпадают с параметрами в Arduino IDE. В окне CoolTerm начнут отображаться выходные данные.
    11. Начните запись выходных данных Arduino в текстовый/бинарный файл. Запустите видеозапись в программе Spinview. Нажмите Резюме чтобы завершить режим удержания температуры в термоциклере. Следите за данными с Arduino в CoolTerm, чтобы проверить, опускается ли температура до 18 °C, и счетчик стимулов увеличивается до 1, инициируя серию испытаний. Дождитесь завершения анализа до конца серии.
  5. Очистка
    1. Остановите запись видео и сбор данных в программе CoolTerm. Закройте обе программы. Завершите работу программы термоциклера. Извлеките акрильную пластину с комарами из термоциклера и поместите ее в морозильник при температуре -20 °C. °Поместите в морозильную камеру на ночь для эвтаназии комаров.
      ​ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: При эвтаназии трансгенных комаров следите за тем, чтобы они оставались при температуре -20 °в среде C не менее 24 часов, после чего их следует утилизировать в контейнер для биоопасных отходов для обеспечения полной гибели микроорганизмов.
    2. При начале следующего испытания повторите процедуру, описанную в разделе 2.3. Отсоедините кабели камеры и Arduino. Выключите источник питания. Отсоедините инфракрасные светодиоды. Очистите акриловые пластины, удалив клейкую ленту Scotch и утилизировав погибших комаров.
    3. Обработайте крышку и акриловую пластину 70%-м этанолом, затем аккуратно протрите пальцем в перчатке все стенки лунок и сетку. Тщательно промойте деионизированной водой, после чего сложите акриловые пластины для хранения, прокладывая крышки бумажным полотенцем во избежание появления царапин.

3. Анализ «кровяного одеяла» (blood blanket assay)

  1. Сборка компонентов установки (Рисунок 3)
    1. Соберите установку опто-термоциклера, как описано в разделе 2.1. См. рисунки установки (Рисунок 3A), теплового стимула (Рисунок 3B) и алюминиевой пластины (Рисунок 3C).
    2. Изготовьте алюминиевую пластину для кормления кровью, как показано на Рисунке 3C.
      1. С помощью лазерного или гидроабразивного станка изготовьте верхнюю и нижнюю части пластины. Для нижней части вырежьте из алюминиевого листа толщиной 0.8 mm прямоугольник размером 90 mm на 134 mm. Для верхней части вырежьте из алюминиевого листа толщиной 1.6 mm прямоугольник размером 90 mm на 134 mm. В верхней пластине прорежьте 15 прямоугольных отверстий (17.2 mm на 18.6 mm). Шаблоны файлов можно найти в репозитории GitHub blood blanket (https://github.com/sorrellslab/bloodblanket) в разделе "Aluminum plate templates".
      2. Разместите между алюминиевыми частями тонкую силиконовую прокладку (толщиной 0.5 mm) для предотвращения утечек. Вырежьте ее с помощью лазерного станка в соответствии с формой верхней алюминиевой части.
      3. Соедините слои восемью стандартными шестигранными болтами 4–40 с полусферической головкой длиной 0.47625 cm. Используйте формирующую метчиков для нарезания резьбы под болты в металлических деталях. С нижней стороны пластины закрепите их с помощью круглых и W-образных шайб для более надежной фиксации при установке на блок термоциклера.
    3. Загрузите код Arduino и программу термоциклера для установки blood blanket из репозитория GitHub (https://github.com/sorrellslab/bloodblanket).
    4. Приготовьте аликвоты 20 mM ATP в 25 mM NaHCO3 и храните при -20 ˚C до использования.
      ​ПРИМЕЧАНИЕ: Готовьте свежий раствор ATP каждые шесть месяцев. Избегайте повторных циклов замораживания-оттаивания. Приготовьте 1 M NaHCO3 и 5 M NaCl (храните каждый раствор при комнатной температуре). NaHCO3 стабилен в растворе только в течение 7 дней.
  2. Подготовка к эксперименту
    1. Перенесите комаров в акриловые пластины, как описано в разделах 1 и 2.2. Если планируется сравнение разных генотипов, проведите ослепление для экспериментатора.
    2. В день эксперимента приготовьте 10 mL минимальной искусственной крови (110 mM NaCl, 20 mM NaHCO3 и 1.5 mM ATP), добавив 750 µL стокового раствора 20 mM ATP, 220 µL 5 M NaCl и 200 µL 1 M NaHCO3 к 8.83 mL деионизированной воды. Тщательно перемешайте путем инверсии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Готовьте искусственную кровь непосредственно перед каждым экспериментом.
    3. Настройте запись SpinView согласно шагам с 2.3.4 по 2.3.8.
    4. Откройте файл Arduino «Red-light-Only__BB_.ino» (или файл с нужным стимулом) для проведения эксперимента.
  3. Проведение испытаний
    1. Внесите пипеткой 650 µL минимальной искусственной крови в каждую лунку пластины, убедившись, что кровь полностью заполняет каждую лунку без перелива.
    2. Растяните квадрат парафильма размером 10.2 cm на 10.2 cm над кольцом диаметром 20.3 cm. Поместите парафильм на пластину, прижимая края до прилипания. С помощью скальпеля обрежьте границу шириной 1.3 cm вокруг пластины и заправьте излишки парафильма под низ, чтобы загерметизировать кровь.
    3. Поместите пластину непосредственно на блок ПЦР для обеспечения максимальной теплопередачи (Рисунок 3A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Черная светоизоляционная лента используется на поверхности блока ПЦР для опто-термоциклера, но не для установки blood blanket.
    4. Поместите термопару на поверхность парафильма в правый нижний угол алюминиевой пластины. Подключите камеру, светодиоды и Arduino к компьютеру. Включите блок питания. Запустите программу «BB_thermocycler_program.x50prog» на термоциклере.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость изменения температуры соответствует максимальной скорости нарастания температуры термоциклера, выбранной для наилучшей имитации посадки комара на хозяина для питания.
    5. Используя темный контейнер и приглушенный свет в комнате для минимизации воздействия света, перенесите акриловую пластину с комарами на алюминиевую пластину, обеспечив совмещение каждой лунки с комарами. Убедитесь, что термопара находится в правом нижнем углу пластины и контактирует с парафильмом для измерения температуры искусственной крови.
    6. Запустите программу, повторно загрузив «Red-light-Only__BB_.ino» в среде Arduino IDE. Закройте монитор порта. В CoolTerm нажмите Connect, чтобы увидеть текущую температуру. Исходя из этой начальной температуры, отрегулируйте температуру срабатывания в скрипте Arduino примерно на 0.6 °C ниже нее.
    7. В окне CoolTerm выберите Capture to Text/Binary File и начните сбор данных. Запустите видеозапись в окне записи SpinView. Нажмите Resume, чтобы завершить удержание температуры термоциклером. Следите за выводом Arduino в CoolTerm, чтобы убедиться, что падение температуры было зафиксировано и испытание началось.
    8. По завершении испытания нажмите Stop Recording. В CoolTerm на вкладке Capture to Text/Binary File выберите Stop, чтобы прекратить запись последовательного вывода.
    9. Снимите пластину с комарами с пластины blood blanket и перенесите их в холодную комнату для анестезии. Посчитайте количество комаров с увеличенным брюшком, содержащим искусственную кровь, как сытых, включая тех, кто питался частично.
    10. Между испытаниями очистите поверхность блока ПЦР, протерев ее салфеткой Kimwipe, смоченной 70% этанолом. Снимите парафильм и промойте алюминиевую пластину деионизированной водой. Повторите раздел 3.3 для последующих испытаний. Меняйте порядок испытаний между днями, чтобы минимизировать влияние циркадных циклов активности.
  4. Завершение работы
    1. Остановите все программы записи и выйдете из них. Отсоедините USB-кабели камеры, Arduino и инфракрасных ламп. Выключите компьютер. Остановите программу «thermocycler_program.x50prog», запущенную на термоциклере.
    2. Поместите пластины с комарами в морозильную камеру при -20 °C на ночь, чтобы уничтожить насекомых. Промойте алюминиевую пластину деионизированной водой. Ополосните акриловую пластину 70% этанолом, затем промойте деионизированной водой и оставьте до полного высыхания на ночь перед загрузкой новых комаров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины следует сушить в течение ночи после мытья, чтобы убедиться в отсутствии остаточной влаги. Наличие влаги приведет к конденсации на крышке, что помешает видеосъемке.

4. Анализ с использованием оптомембранного фидера

  1. Сборка компонентов анализа (Рисунок 4)
    1. Соберите раму, используя оптомеханические компоненты и черную акриловую платформу толщиной 0,635 cm и размером 30,48 cm на 30,48 cm. С помощью лазерного резака прорежьте в центре акрила отверстие диаметром 11,43 cm. Прорежьте отверстия в 2,54 cm от каждого угла, чтобы акрил мог опираться на опоры рамы на высоте примерно 23,495 cm над основанием.
    2. В центре закрепите черное акриловое кольцо с внутренним диаметром 19,05 cm и внешним диаметром 20,32 cm (Рисунок 4A). Шаблоны для всех акриловых компонентов, а также программы для Arduino находятся в репозитории GitHub opto-membrane feeder (https://github.com/sorrellslab/opto-membranefeeder/releases/tag/v1.0.0). Общая схема установки представлена на рисунке (Рисунок 4A), стимул — на рисунке (Рисунок 4B), схема электрической цепи — на рисунке (Рисунок 4C), и стоп-кадр из видео — на рисунке (Рисунок 4D).
      ​ПРИМЕЧАНИЕ: Конкретные материалы, использованные для сборки этой платформы, не являются критически важными, поэтому возможны более экономичные варианты.
    3. Под центральным отверстием закрепите камеру с инфракрасным длиннопропускающим фильтром, направив ее вверх на контейнер с комарами. Отрегулируйте диафрагму так, чтобы она была полностью открыта, обеспечивая селективную фокусировку на сетчатой верхней части контейнера (Рисунок 4A).
    4. Для изготовления контейнеров разрежьте прозрачную поликарбонатную трубку диаметром 11,43 cm на цилиндрические сегменты длиной 12,7 cm.
      1. Изготовьте дна для контейнеров, вырезая лазером круги диаметром 11,43 cm из акрила толщиной 0,3175 cm. Края кругов гравируются лазером, чтобы они вставлялись внутрь трубки. Приклейте их к трубкам с помощью пластикового эпоксидного клея.
      2. Создайте вставную крышку, используя черный акрил толщиной 0,635 cm и 0,3175 cm и устойчивую к УФ-излучению черную сетку. Внутреннее кольцо имеет диаметр 10,795 cm, а внешнее — 12,065 cm; черная сетка натягивается на меньшее кольцо. Сетку следует пришить через прорезанные лазером отверстия вощеными нитями.
        ​ПРИМЕЧАНИЕ: Контейнеры всегда следует ставить на бумажные полотенца, чтобы избежать появления царапин на акриловом дне, через которое ведется запись видео.
    5. Сконструируйте акриловые емкости для подачи порции крови (Рисунок 4A).
      1. Вырежьте кольцо с внутренним диаметром 5,08 cm и внешним диаметром 6,6 cm из прозрачного акрила толщиной 0,15875 cm. Прикрепите его к другому прозрачному кольцу с внутренним диаметром 5,842 cm и внешним диаметром 6,604 cm с помощью акрилового клея.
      2. Поместите цилиндр из металлической сетки высотой 13,97 cm и диаметром 19,05 cm внутрь черного акрилового кольца в центре платформы.
      3. Внутри металлической сетки закрепите катушку RGB-светодиодов на расстоянии 3,81 cm от внешней стенки контейнера; управление осуществляется платой Arduino Uno, которая расположена на черной акриловой платформе (Рисунок 4C).
      4. С помощью измерителя освещенности измерьте интенсивность света внутри цилиндра и отрегулируйте расположение ламп так, чтобы арена освещалась в диапазоне 3,5–6 µW/mm2. Снаружи металлической сетки закрепите кольцо инфракрасных светодиодов с длиной волны 850 nm на раме с помощью пластиковых стяжек, направив их внутрь.
    6. Подключите USB-кабель к плате Arduino Uno и к компьютеру. Подключите USB-кабель от камеры к компьютеру. Отключите интернет-соединение.
    7. Поместите структуру опто-мембраны в темный инкубатор или в помещение с контролируемыми условиями при температуре 26 °C и относительной влажности 80% на время проведения экспериментов.
  2. Подготовка контейнеров с комарами
    1. Перед экспериментом промойте контейнеры с комарами, распылив 70% этанол и аккуратно протерев мягкой губкой. Прополощите контейнеры деионизированной водой и просушите на воздухе в течение ночи.
    2. За два дня до эксперимента отсортируйте самцов и самок комаров под воздействием холодной анестезии и поместите по 20 самок в каждый контейнер. Обеспечьте доступ к ATR согласно шагу 1.6.
    3. На этом этапе генотипы должны быть скрыты от экспериментатора. Порядок проведения испытаний следует менять ежедневно, чтобы минимизировать различия в поведенческих результатах из-за времени проведения эксперимента.
  3. Проведение испытаний
    1. Для подготовки порции крови поместите бутылки с водой объемом 119 mL в водяную баню при 45 °C, по одной на каждое испытание. Такой объем и температура позволяют поддерживать порцию крови близко к температуре тела на протяжении всего эксперимента.
    2. Подготовьте аликвоты дефибринированной крови овцы по 5 mL. Храните при 4 °C и перемешивайте путем переворачивания перед использованием, чтобы предотвратить расслоение. Готовьте порцию крови непосредственно перед каждым экспериментом.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Работайте с дефибринированной кровью овцы, используя соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), чтобы минимизировать риск воздействия патогенов. Многоразовые материалы, контактировавшие с кровью, следует замочить в 10% растворе отбеливателя и промыть деионизированной водой. Поскольку отбеливатель может вызвать сильное раздражение кожи и глаз, на протяжении всего процесса работы следует использовать подходящие СИЗ.
    3. Поместите первую аликвоту крови в водяную баню при 45 °C как минимум за 20 min до начала испытания. Разморозьте ATP на льду. Натяните квадрат из парафильма размером 5,08 cm на 5,08 cm поверх акриловой крышки со стороны большего плоского круга, создавая лунку для порции крови (Рисунок 4A).
    4. Протрите компьютер 70% этанолом, чтобы удалить запахи человека. Подключите компьютер к внешнему жесткому диску. Подключите камеру и Arduino. Подключите RGB и инфракрасные лампы к источнику питания.
    5. Откройте программное обеспечение SpinView и файл Arduino для соответствующего стимула. Создайте папку на внешнем жестком диске для хранения данных эксперимента. Загрузите файл Arduino «blue_only.io» для обеспечения тусклого синего света с длиной волны 471 nm от RGB-светодиодов в арене (согласно Рисунок 4B).
    6. Без воздействия избыточного CO2 от дыхания осмотрите контейнер для испытания и зафиксируйте любые случаи гибели до начала эксперимента. Поместите контейнер в центр и дайте комарам адаптироваться при тусклом синем свете в течение 10–20 min перед воздействием стимула.
      ​ПРИМЕЧАНИЕ: Этап акклиматизации и эксперимент проводятся при тусклом синем свете, так как полная темнота подавляет полет комаров.
    7. Запустите запись видео
      1. В программе SpinView выберите камеру. На вкладке Settings (Настройки) отрегулируйте выдержку и усиление по мере необходимости, чтобы сохранить высокий контраст между светлыми насекомыми и темным фоном (Рисунок 4D).
      2. Нажмите красную кнопку записи на верхней панели, чтобы настроить параметры захвата видео. Укажите путь к файлу, нажав Browse (Обзор), затем перейдите на внешний жесткий диск. Создайте новую папку с описательным названием для каждого испытания. Не используйте пробелы в названии папки.
      3. На вкладке Save Options (Параметры сохранения) выберите Capture 0 frames (Захват 0 кадров), что позволит записывать видео до ручной остановки. В разделе Recording Mode (Режим записи) выберите Buffered (Буферизованный). На вкладке Videos установите следующие значения: Video Recording Type: MJPG, Video File Split Size: 1000 MB, и JPEG Compression Quality: 65.
    8. Непосредственно перед воздействием стимула добавьте пипеткой 500 µL 20 mM ATP в подготовленную аликвоту крови объемом 5 mL для достижения конечной концентрации 2 mM ATP. Переверните пробирку несколько раз для перемешивания.
    9. Налейте раствор ATP-крови в контейнер для кормления. Сверху на порцию крови поставьте перевернутую бутылку объемом 119 mL, наполненную водой при 45 °C, чтобы поддерживать температуру крови близкой к температуре человеческого тела на протяжении всего эксперимента.
    10. В программном обеспечении SpinView выберите Start Recording (Начать запись). Не стимулируя комаров дыханием, поместите контейнер с кровью на сетчатую крышку контейнера с насекомыми, чтобы комары могли проколоть мембрану из парафильма через сетку.
    11. Загрузите программу Arduino для     «1sON_10sOFF.io» (Рисунок 4B) или другой желаемый стимул. Это обеспечит подачу красного света с длиной волны 624 nm в течение 1 s каждые 10 s, пока файл «blue_only.io» не будет загружен вручную. Длины волны 624 nm достаточно для оптогенетической активации CsChrimson.
    12. Поместите аликвоту крови в водяную баню для следующего испытания. После того как испытание продлится 15 min, выберите Stop Recording (Остановить запись). Загрузите файл «blue_only.io», чтобы прекратить стимуляцию красным светом.
    13. Уберите держатель с кровью и бутылку с водой. Извлеките контейнер и анестезируйте комаров при 4 °C. Для проведения дополнительных испытаний вернитесь к разделу 4.3. Визуально осмотрите анестезированных комаров, чтобы определить и зафиксировать количество особей, напитавшихся кровью, по виду наполненного кровью брюшка.
  4. Очистка
    1. Закройте все программы. Извлеките внешний жесткий диск и отсоедините его от компьютера. Выключите компьютер.
    2. Очистите контейнеры с комарами, как описано ранее в шаге 4.2.1. Очистите акриловые держатели для крови. Наполните поликарбонатный лоток половинного размера водой на 2/3, затем добавьте 100 mL отбеливателя.
    3. Поместите в лоток акриловые держатели и пластиковые бутылки. Закройте крышкой и оставьте замачиваться на 10 min. Смойте отбеливатель и удалите парафильм. Аккуратно потрите и промойте, чтобы удалить остатки крови.

5. Анализ поведения

  1. Подготовьте видеозаписи для анализа, сжав их в файлы формата .mp4 с помощью ffmpeg (версия 8.0.1). Если видеофайлы разделены, объедините их в одно видео с помощью любого программного обеспечения для редактирования видео. Откройте обучающие видео в SLEAP (версия 1.4.1) в градациях серого.
    ​ПРИМЕЧАНИЕ: При правильных настройках записи видео всё должно оставаться в кадре, а движущиеся комары не должны быть размыты. Можно использовать другое программное обеспечение для трекинга частей тела. В данной работе использовалась версия SLEAP 1.4.1. Актуальные протоколы см. в документации SLEAP.
  2. Создайте скелет, в котором отмечены соответствующие части тела животных в зависимости от оцениваемого поведения (Рисунок 2D, Рисунок 3D и Рисунок 4E).
  3. Используя опцию «Random frame» во вкладке Suggested frame, случайным образом выберите 10 кадров и обозначьте каждого комара как отдельный экземпляр (instance). Если некоторые части комара перекрыты (например, кончик хоботка вставлен в сетку при зондировании), отметьте приблизительное положение части тела. Обучите модель на размеченных кадрах со следующими настройками:
    1. Для модели Top-Down для нескольких животных (использовалась для опто-термоциклера и модели с кровяным одеялом): во вкладке Training Pipeline установите Max Instances на 14. Во вкладке Centroid Model Configuration установите Crop Size на Auto, Plateau Min. Delta на 1e-04, Plateau Patience на 10, Stride на 8, а Anchor Part на thorax.
    2. Для модели Bottom-Up для нескольких животных (использовалась для опто-мембранной кормушки): во вкладке Training Pipeline установите Max Instances на no max. Во вкладке Bottom-Up Model Configuration установите Crop Size на Auto, Plateau Min. Delta на 1e-04, Plateau Patience на 10 и Stride на 16.
  4. Выполните предсказание на определенном количестве кадров со следующими настройками: во вкладке Inference Pipeline для опто-термоциклера и кровяного одеяла установите Max Instances на 14, Tracker на Simple, Max number of tracks на 14 и Connect Single Track Breaks на True.
  5. Для опто-мембранной кормушки установите No Max для Max Instances и Max number of tracks, Tracker на Simple и Connect Single Track Breaks на True. Скорректируйте предсказанные кадры и проведите повторное обучение. Повторяйте циклы предсказания, разметки и обучения на обучающем наборе данных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Валидация проводилась путем случайной выборочной проверки размеченных кадров и выявления систематических ошибок (например, ложных обнаружений комаров, дублирующихся предсказаний, неправильной ориентации или неверного присвоения частей тела) с акцентом на кадрах, содержащих такие граничные случаи. В зависимости от частоты ошибок может потребоваться до 150 размеченных кадров. SLEAP также предоставляет метрики оценки на базе GUI для дополнительной валидации модели. После того как визуальный осмотр подтвердит достаточную точность и прецизионность, примените модель к экспериментальным видео и экспортируйте результаты в форматах .csv или .h5 для анализа поведения. Затем можно обучить классификаторы поведения, используя результаты оценки поз, как описано ранее8. Поведение определяется следующим образом: ходьба — трансляционное движение тела с движением ног; полет — быстрое трансляционное движение с расправленными крыльями; груминг — повторяющиеся движения ног по частям тела (усикам, хоботку, крыльям или ногам); и зондирование — введение хоботка через сетку в нижней части контейнера. Классификаторы поведения должны достигать точности >90% по сравнению с аннотациями, сделанными человеком.
  6. Проведите статистический анализ, выбрав непараметрические тесты, так как данные обычно не имеют нормального распределения. Выполните соответствующие апостериорные (post-hoc) тесты с поправкой на множественные сравнения. Для данных о насыщении экспериментальными повторами являются группы комаров, тогда как для данных о поведении повторами являются отдельные особи комаров.

Результаты

Для наблюдения за поведением комаров при поиске хозяина и питании кровью использовались три поведенческих теста, как показано на Рисунке 1A. Комаров выращивали при цикле синего света и темноты (14:10 LD; Рисунок 1B) для синхронизации циркадных ритмов, чтобы эксперименты можно было проводить в периоды бодрствования. За два дня до экспериментов комаров переводили в полную темноту и обеспечивали кофактором опсина ATR. Если комары не синхронизированы или не получали ATR, они проявляют низкую активность в поведенческих тестах. Генотипами, использованными в каждом тесте, были Gr3>CsChrimson и два генетических контроля: линия-драйвер Gr3-QF2 и линия-эффектор QUAS-CsChrimson.

Анализ с использованием опто-термоциклера (Раздел 2) позволяет оценивать пробуждение и зондирующее поведение комаров в течение длительных периодов времени в ответ на тепловые и световые стимулы. Подача тепла имитирует приближение комара к теплокровному хозяину, а 5-секундная подача света имитирует длительный выдох3. Использование термоциклера обеспечивает быстрый нагрев и охлаждение поверхности, синхронизированные с оптогенетической активацией с помощью термопары и микроконтроллера (Рисунок 2A, B). Три генотипа комаров помещали в акриловые пластины с изолированными лунками, имеющими сетчатое дно, в которых они демонстрируют ходьбу, полет и зондирующее поведение (Рисунок 2C). Положение частей тела комара определялось с помощью алгоритмов отслеживания поз, таких как SLEAP34 и DeepLabCUT35 (Рисунок 2D, E). Для классификации поведения можно использовать данные отслеживания поз (например, SimBA36, A-SOiD37) или видеоданные (например, FERAL38). На Рисунке 2E показаны метки SLEAP во время полета, ходьбы и зондирования — основных форм поведения при поиске хозяина и кормлении. Эти виды поведения можно классифицировать по скорости перемещения груди и расстоянию между основанием и кончиком хоботка. Здесь представлены результаты отслеживания поведения с помощью APT и JAABA39. Комаров подвергали воздействию либо повышения температуры, либо светового стимула, либо одновременно теплового и светового стимулов, после чего следовал перерыв в 20 min перед следующим стимулом8 (Рисунок 2F). При воздействии тепла все три генотипа демонстрируют короткий период зондирования (Рисунок 2G). Важно отметить, что при воздействии 5-секундного светового стимула комары Gr3>CsChrimson пробуждаются или «активируются», проявляя усиленную ходьбу и полет, которые длятся до 10–15 min. Комары также демонстрируют зондирование, определяемое как повторяющееся введение хоботка в сетчатое дно пластин. Данные были представлены в виде поведения отдельных особей (Рисунок 2G) и доли всех комаров, проявляющих каждое поведение с течением времени (Рисунок 2H). Опто-термоциклер позволяет проводить многократную точную оптогенетическую и тепловую стимуляцию нескольких особей, что делает его полезным инструментом для изучения пробуждения и зондирующего поведения.

Метод «кровяного одеяла» (раздел 3) основан на методе с использованием опто-термоциклера, но предполагает использование приемлемой искусственной минимальной порции крови, что позволяет количественно оценить степень насыщения комаров (Рисунок 3A). Для оптогенетической активации сенсорных нейронов CO2 подавался 5-секундный импульс красного света (~627 nm), при этом тонкий слой искусственной крови нагревался от 25 °C до ~35 °C (измерение температуры на поверхности проводилось с помощью термопары; Рисунок 3B). Комарам трех генотипов предлагали искусственную порцию крови в алюминиевой кормушке (Рисунок 3C). Комарам линий Gr3-QF2, QUAS-CsChrimson и Gr3>CsChrimson (n = 10 опытов для каждой генетической группы, по 14 комаров в каждом) предлагали искусственную порцию крови в алюминиевой кормушке (Рисунок 3C). Для измерения степени насыщения комаров в течение всего эксперимента использовалась программа SLEAP для отслеживания точек на теле комара. Это было реализовано путем создания скелета, включающего 5 узлов на брюшке комара (Рисунок 3D). В конце каждого опыта количество насытившихся комаров подсчитывали вручную. Контрольные линии комаров Gr3-QF2 и QUAS-CsChrimson продемонстрировали схожую среднюю степень насыщения (Рисунок 3E, p = 0.401). Напротив, линия Gr3>CsChrimson показала значительно более высокую интенсивность питания со средней степенью насыщения 53% (Рисунок 3E, p = 0.078 по сравнению с Gr3-QF2 и p = 0.097 по сравнению с QUAS-CsChrimson). Данные были представлены в виде скрипичных и диаграмм размаха (медиана, межквартильный размах и общий диапазон) и проанализированы с использованием критерия Краскела-Уоллиса и критерия Данна с поправкой Холма при пороге значимости p < 0.05. Степень насыщения каждой особи во времени определяли по изменению площади брюшка, ограниченной 5 узлами (Рисунок 3F). Эти результаты показывают, что метод «кровяного одеяла» может быть использован для оценки влияния оптогенетической активации популяций нейронов, реагирующих на CO2, на поведение комаров при питании искусственной кровью.

Метод анализа с использованием опто-мембранной системы кормления (Раздел 4), при котором комарам предоставляется доступ к теплой порции крови в цилиндрической арене, позволяет изучать привлечение комаров к источнику крови и их насыщение. Чтобы определить, приводит ли оптогенетическая активация CO2 сенсорных нейронов достаточно для того, чтобы вызвать притяжение к источнику крови и начало питания из него, Гр3>CsChrimson и контрольным комарам (n = 10 для каждого генотипа, где n обозначает количество проведенных испытаний, по 20 комаров в контейнере на одно испытание) предоставляли доступ к теплой порции крови в опто-мембранном фидере при воздействии повторяющихся 1-секундных импульсов ярко-красного света каждые 10 с в течение 15 мин (Рисунок 4B). Для измерения степени притяжения к мембранному кормулятору использовали модель SLEAP с тремя точками для отслеживания головы, груди и брюшка приземлившихся комаров, подсчитывая особей, находящихся в пределах интересующей области (Рисунок 4D, Рисунок 4E). Gr3>CsChrimson со временем комары проявляли повышенную привлекательность к области с кровяной порцией по сравнению с Gr3-QF2 контроль (Рисунок 4F, p = 0,027). При этом Группа 3>CsChrimson комары не проявили статистически более сильного притяжения, чем... QUAS-CsChrimson (Рисунок 4F, p = 0,310). Группы значимости были определены с помощью критерия Краскела — Уоллиса с последующим применением критерия Данна с поправкой Холма. Порог значимости был установлен на уровне p < 0,05. Данные представлены в виде среднего процента комаров, привлеченных источником крови; заштрихованная область соответствует стандартной ошибке. Контрольные генотипы Gr3-QF2 и QUAS-CsChrimson проявили схожую степень полнокровия — 26% и 29% соответственно, согласно результатам ручной оценки, проведенной по описанному методу (Рисунок 4G, p = 0,351). Напротив, Группа 3>CsChrimson показатель насыщения у комаров был значимо выше, чем в обеих контрольных группах, и составил в среднем 61% (Рисунок 4G, p < 0,01 в сравнении с Gr3-QF2 и p = 0,02 в сравнении с QUAS-CsChrimson). Данные были представлены в виде скрипичных диаграмм и диаграмм «ящик с усами» (медиана, межквартильный размах и общий размах) и проанализированы с помощью критерия Краскела — Уоллиса и критерия Данна с поправкой Холма при пороге значимости p < 0,05. Эти результаты указывают на то, что анализ с использованием оптомембранного фидера является жизнеспособным способом оценки эффектов оптогенетической активации CO2 нейроны, отвечающие за привлечение комаров и их насыщение при питании кровью.

Схема анализа поведения комаров; методы: опто-термоциклер, «кровяное одеяло»; стимулы: тепло, CO2.
Рисунок 1Методы анализа и разведение комаров для оптогенетики. (AСхема поведения комаров при поиске хозяина с характеристиками представленных поведенческих тестов. Этапы поиска хозяина, измеряемые каждым поведенческим тестом, отмечены серыми полосами.BГрафик разведения комаров для оптогенетических экспериментов. Рисунок 1 был создан авторами для данной публикации с помощью Adobe Illustrator; лицензия на его использование не требуется. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Поведение комаров, инфракрасный термоциклер, установка с красным светодиодным освещением, анализ графиков, ответ на стимул.
Рисунок 2Опто-термоциклизатор позволяет количественно оценить поведение, связанное с пробуждением и поиском, в процессе оптогенетической активации. (AСхема анализа с использованием опто-термоциклера, состоящего из планшета с комарами, установленного на блоке ПЦР-термоциклера с расположенными сверху светодиодами и камерой.B) Схема микроконтроллера, который определяет температуру термоциклера и управляет светодиодами. Схема создана в программе Fritzing по лицензии CC-BY-SA 3.0 (https://github.com/fritzing/fritzing-app/blob/develop/README.md). Данная лицензия также позволяет полное повторное использование изображения при условии надлежащего указания авторства. (C) Стоп-кадр анализа, на котором показана акриловая пластина, вмещающая до 14 комаров. Термопара находится в лунке в правом нижнем углу. (DСкелет комара, использованный в модели SLEAP для оценки поз. Точки, отмеченные на теле, включают: кончик и основание хоботка, используемые для обнаружения зондирующего поведения (показаны красным); передние ноги в местах их прикрепления к груди, соединения бедра с голенью и голени с лапкой (показаны синим), а также кончик брюшка (показан желтым). Была использована многоживотная модель с видом сверху. Для количественной оценки возбуждения и зондирующего поведения комаров применялись оценщики поз и поведенческие классификаторы.ЕПримеры ходьбы, полета и зондирования комаров с наложением предсказаний SLEAP. Ходьба и полет используются в качестве поведенческих показателей возбуждения.F) Вывод подачи стимулов. Желтые волнистые линии обозначают тепловые стимулы температуры тела, а красные светодиоды — стимулы красным светом. (G) Этограммы поведения при ходьбе, полете и зондировании, составленные... Gr3-QF2, QUAS-CsChrimsonи Гр3>CsChrimson комары (n = 2–23 особи на генотип) после воздействия стимула. (HДолговременное поведение после оптогенетической активации в Группа 3>CsChrimson комары (n = 68–70 отдельных особей). Панели A–E на рисунке были созданы авторами для данной публикации с помощью Adobe Illustrator; лицензия на использование авторских прав не требуется. Данные на панелях (F–H) воспроизведены из работы Sorrells et al, 202 по лицензии CC BY 4.08. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Схема установки эксперимента по кормлению комаров, графики анализа данных, диаграмма искусственного кровозаменителя, график температуры.
Рисунок 3Метод анализа «кровяного одеяла» (blood blanket assay) позволяет количественно оценить степень наполнения кровью в ответ на оптогенетическую активацию. (AСхема анализа с использованием «кровяного одеяла». Комары помещены в акриловую клетку, где доступная искусственная кровь представлена под сетчатым экраном.B) Считывание показателей температуры и стимуляции красным светом в ходе анализа. (C) Схема узла алюминиевой пластины для подачи «кровяного одеяла». (DСкелет SLEAP, использованный для оценки поз, включал точки, описанные на рисунке 2D, а также четыре точки по бокам брюшка в местах его примыкания к грудному отделу и края самой широкой части брюшка. Степень наполнения измеряли как площадь внутри пяти точек по периметру брюшка, используя прогнозы многоживотной модели с видом сверху.Е) Скрипичный график, отображающий средний процент насыщения искусственным кровяным питанием по генотипам (n = 10 повторов по 14 комаров в каждом повторе для каждого генотипа). Статистическая значимость определялась с помощью критерия Краскела-Уоллиса с последующим применением теста Данна с поправкой Холма. Разные буквы указывают на значимость p < 0,05 между группами, при этом группы, обозначенные одной и той же буквой, существенно не различаются между собой. (F) Нарастание отека с течением времени в Группа 3>CsChrimson животного, измеренное по площади брюшной полости. Красная линия тренда отображает 30-секундное скользящее окно в течение восьми минут испытания, где x = 0 отмечает время начала наполнения. Все схемы на рисунке 3 были созданы авторами специально для данной публикации с использованием Adobe Illustrator; лицензия на авторские права для их использования не потребовалась. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Установка для оптогенетики комаров; управление RGB-освещением; Arduino; порция крови; график процента привлечения; результаты.
Рисунок 4Метод анализа с использованием оптомембранного фидера позволяет измерить степень притяжения и интенсивность питания кровью. (A) Схема оптомембранного дозатора с указанием отдельных компонентов. (B) Хронология экспериментальных серий. Синяя линия обозначает тусклый синий свет на протяжении всего периода акклиматизации и эксперимента. Показан сегмент экспериментального стимула, представляющий собой 1-секундные импульсы красного света с интервалом в 10 с. (CСхема соединений для оптомембранного устройства подачи корма. Схема цепи создана авторами в программе Fritzing по лицензии CC-BY.D) Пример кадра из видео с оптомембранным фидером. Комары в красном круге подсчитываются для определения процента привлечения. (ЕПримеры голодного и сытого комара, в которых голова, грудной отдел и брюшко отмечены моделью трекинга SLEAP для оптомембранного фидера. Для измерения притяжения к области интереса, где размещен корм (кровь), использовалась восходящая многоживотная модель SLEAP.F) Линейный график, отображающий средний процент пребывания в зоне кормления кровью (используемый в качестве поведенческого показателя приземления) в зависимости от времени для каждого генотипа (n = 10 попыток по 20 комаров на генотип). Среднее значение откладывается каждые 30 с. Затененные области обозначают стандартную ошибку. Значимость определяли с помощью критерия Краскела-Уоллиса с последующим тестом Данна с поправкой Холма. Разные буквы обозначают значимо различающиеся группы; порог был определен как p < 0.05. (G) Скрипичная диаграмма, отображающая средний процент насыщения кровью по генотипам. В (F, G), значимость определяли с помощью критерия Краскела-Уоллиса с последующим применением теста Данна с поправкой Холма. Генотипы, обозначенные одной и той же буквой, не имеют статистически значимых различий между собой. Порог значимости определен как p < 0.05. Рисунок 4 был создан с помощью Adobe Illustrator, данные для него были собраны авторами специально для данной публикации, лицензия на авторские права для его использования не потребовалась. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

В данной работе представлены подробные протоколы для оценки достаточности определенных типов нейронов для запуска этапов привлечения хозяина и укуса. Поведение при укусе состоит из ряда поведенческих этапов: от обнаружения объекта на большом расстоянии и привлечения на короткое расстояние до прокола кожи и последующего насыщения. В принципе, типы нейронов могут контролировать конкретные действия или этапы, смещать поведение в сторону определенных последовательностей, увеличивать общую продолжительность поведенческого акта или выполнять множество других функций. Таким образом, представленные многочисленные анализы необходимы для детального изучения нейронных функций в этом процессе.

Несколько распространенных ошибок могут привести к слабым реакциям комаров в этих анализах. Низкой активности и плохого питания можно избежать, проводя эксперименты в периоды пиковой активности комаров, рядом с временем перехода между светлым и темным циклами в их инкубационных камерах. Низкая интенсивность питания в «кровяном одеяле» (blood blanket) и опто-мембранном фидере может быть вызвана низким качеством искусственной крови или неправильной температурой. Убедитесь, что все реагенты (NaHCO3, ATP, дефибринированная овечья кровь) не просрочены и хранятся надлежащим образом. Рекомендуется готовить все растворы в день проведения эксперимента для обеспечения максимальной свежести. Убедитесь, что планшет с «кровяным одеялом» напрямую контактирует с поверхностью блока ПЦР-термоциклера. На планшетах опто-термоциклера и «кровяного одеяла» может скапливаться конденсат при наличии остаточной влаги. Перед началом экспериментов поместите планшеты на бумажные полотенца, чтобы впитать любую влагу. При слабом оптогенетическом ответе убедитесь, что возраст комаров составляет не менее одной недели и что им предоставляется достаточное время для питания ATR, так как он является необходимым химическим кофактором для каналов CsChrimson.

Были созданы оптогенетические инструменты, чувствительные к длинам волн от синего (~450 nm) до красного (~650 nm) цветов, охватывающие видимый спектр. Красный свет особенно полезен при работе с насекомыми, так как они обычно обладают низкой чувствительностью и/или отсутствием поведенческих реакций на эти длины волн40. Интересно, что комары в полете проявляют влечение к участкам визуальных стимулов с длинными волнами, присутствующими в оттенках человеческой кожи41. Таким образом, использование красного света может стать ограничивающим фактором, затрудняющим интерпретацию оптогенетической активации в тестах на привлечение комаров к хозяину. Однако генетические контрольные комары демонстрировали минимальные реакции на широко применимый красный свет даже при высокой интенсивности (Рисунки 2–4). Для обеспечения точной интерпретации поведенческих эффектов рекомендуется использовать генетический контроль (особи, лишенные либо драйверных, либо эффекторных конструкций) и контроль без облучения. В оптогенетических экспериментах на других видах часто используется контроль с отсутствием кофактора родопсина ATR; однако корм для рыб, используемый для кормления личинок комаров, содержит витамин A, который является предшественником ATR, поэтому в данной системе такой контроль менее эффективен.

Представленные здесь оптогенетические стимулы ограничены непрерывным воздействием с регулируемой интенсивностью света. Оптогенетические стимулы, которые максимально точно воспроизводят естественные паттерны нейронной активности, с наибольшей вероятностью вызовут интересующее поведение. Таким образом, при наличии данных нейронных записей стимул можно спроектировать так, чтобы он соответствовал наблюдаемой интенсивности и временной динамике. В случаях, когда эти данные неизвестны, функцию нейронов можно исследовать с помощью различных стимулов и поведенческих контекстов, с учетом того, что результаты могут не отражать функцию нейронов при естественном поведении. Тем не менее, стимуляция активности нейронов за пределами естественного диапазона может быть использована для изучения цепей или поведенческих свойств уникальными способами, подобно тому как электрофизиология используется для изучения свойств клеток. В настоящее время оптогенетические инструменты применялись только для сенсорных нейронов комаров, что дает определенные преимущества по сравнению с подачей естественных стимулов. Традиционные стратегии измерения поиска хозяина комарами опираются на подачу реального газа CO2. Использование реального CO2 требует очищенного и увлажненного воздушного потока, что предполагает использование сложных экспериментальных установок для точной подачи и удаления газа за короткие промежутки времени9,10,42,43. Поскольку и воздушный поток, и влажность являются сигналами для привлечения и навигации комаров, оптогенетическая стимуляция является привлекательным методом изучения эффектов обонятельных стимулов отдельно от этих факторов. Оптогенетические инструменты также использовались ранее для изучения влияния пола и физиологического состояния на поведение8, что позволило пролить свет на эти важные вопросы биологии комаров.

Помимо оптогенетики, в данных протоколах используются стандартные методы анализа, которые применялись для оценки поведения комаров и имеют определенные ограничения. Для упрощения очистки в «кровавом покрывале» (blood blanket) используется искусственная порция пищи, содержащая только те вкусовые стимулы, которые необходимы комарам для насыщения. Это ограничение можно преодолеть, используя кровь (как в случае с опто-мембранным фидером) или биомиметические материалы, воспроизводящие характеристики тканей хозяина. Тепло в опто-термоциклере и «кровавом покрывале» подается на идущих или стоящих комаров, а не на летающих, и ограничено скоростью изменения температуры ПЦР-термоциклера. Следовательно, эти тесты позволяют обнаружить поведение, связанное с зондированием и насыщением, но не привлекаемостью. Еще одним ограничением лабораторных анализов является то, что для понимания поведенческого эффекта конкретных стимулов исключаются другие сигналы, которые используют комары. Для изучения дополнительных аспектов естественной среды, в которой комары питаются своими хозяевами, могут быть созданы более сложные лабораторные и полуполевые методы анализа.

Еще одним ограничением оптогенетики у комаров является то, что было создано лишь несколько линий-драйверов, помимо тех, что предназначены для сенсорных нейронов. Таким образом, ее полный потенциал будет реализован при сочетании с драйверами, экспрессируемыми в интернейронах, которые не могут быть напрямую стимулированы с помощью других подходов. Появляющиеся новые ресурсы, такие как атлас клеток комара Aedes aegypti, открывают путь к достижениям в нейрогенетике комаров44. В будущем потребуется разработка таких драйверов для исследования нейронных цепей комаров. Аналогичным образом, необходимы дополнительные оптогенетические инструменты ингибирования, чтобы определить, является ли определенный тип нейронов необходимым для конкретного поведения. Хотя методы, представленные в данной работе, предназначены для измерения привлечения хозяина и кровососания, эти подходы могут быть расширены для изучения дополнительных этапов поиска хозяина и таких форм поведения, как спаривание, откладка яиц и питание нектаром. Оптогенетические исследования позволят по-новому взглянуть на то, как поведение комаров контролируется на уровне нейронных цепей, и могут привести к новым подходам по предотвращению распространения трансмиссивных заболеваний, передаваемых комарами.

Раскрытие информации

Авторы не имеют конфликтов интересов, подлежащих раскрытию.

Благодарности

Мы благодарим Ким Лезон-Гейду, Фернанду Медейрос Контини и Яою Цзяо за замечания к рукописи. Данное исследование было профинансировано грантом NIH DP2AI177891. Мы благодарим Центр нейротехнологий (Neurotechnology Core), финансируемый Институтом нейробиологии Кавли при Йельском университете, за технические консультации. T.S. является стипендиатом HHMI Freeman Hrabowski Scholar.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1⁄Черный акрил, 8 дюймовMcMaster-Carr8650K32Структура оптомембранного устройства подачи вещества
1⁄Прозрачный акрил 8 дюймовMcMaster-Carr8536K134Канистра оптомембранного фидера
¼ Черный акрил (1 дюйм)McMaster-Carr8560K259Структура оптомембранного фидера
Адаптер питания переменного токаJameco ReliaPro2197581Структура оптомембранного устройства подачи
Акриловый клейUnited States Plastic Corp 97562Канистра-фидер с оптомембраной, клетка с кровавым одеялом
Аденозин 5-фосфат′гидратированная натриевая соль трифосфатаSigma AldrichA6419-1GИскусственный кровозаменитель
Все-транс-ретинальSpectrum ChemicalR3041-1GMОптогенетическое выращивание
Алюминиевая оптическая плитаThorlabsMB12Структура оптомембранного устройства подачи
Алюминиевый лист 0,03125 дюймаMcMaster-Carr89015K11Плата для кормления с кровавым слоем
Алюминиевый лист 0,0625 дюймаMcMaster-Carr89015K37Питательная пластина с кровяным покрытием
Система отслеживания частей тела животных (APT)Лаборатория Брансона в HHMI Janelia FarmПоскольку исходный текст не был предоставлен, пожалуйста, введите текст, который необходимо перевести.Версия 3.0, воспроизведенные данные опто-термоциклера (Рисунок 2), скачано 9 июля 2020 г.
Arduino IDEArduinoПоскольку исходный текст не был предоставлен, пожалуйста, введите текст для перевода. Я готов приступить к профессиональному переводу вашего научно-образовательного контента JoVE на русский язык, соблюдая все указанные инструкции по терминологии, стилистике и точности.Версия 1.8.12, используемая для управления стимулами опто-термоциклера, подогревающего мата для крови, &оптомембранный податчик
Микроконтроллерная плата Arduino Uno Rev3ArduinoA000066 Программирование оптомембранного фидера
Черная стекловолоконная москитная сеткаИнновационные премиум-продукты IHLRS3684BLКлетка с кровавым одеялом
Черная изолентаThorlabsT137-2.0Опто-термоциклер
Черные кабельные стяжки Стяжки для кабелей и прочие принадлежностиПоскольку вы предоставили только код «ct242», который, вероятно, является идентификатором контента JoVE, я не могу выполнить перевод без исходного текста. Пожалуйста, предоставьте текст статьи, протокола или описание видео, которые необходимо перевести на русский язык.Структура оптомембранного устройства подачи питания
Светонепроницаемая штораМастерская по подготовке оборудования6520SFОпто-термоциклер и согревающее одеяло для крови
Светодиоды синего света21LEDUSARB5730BLWPВыращивание комаров
ФлаконФлакон SKS &и упаковка0604-07Оптомембранный подогреватель крови с системой подачи
Гранулы для придонных видов рыбAPI (интерфейс прикладного программирования)5352983Кормление личинок
КамераМошкаU3-13S2M-CS, FLIЗапись видео для анализов
Счетчик кликовULineH-7350Прореживание личинок
КомпьютерAsus X1407QПроведение анализов
Концентрированный отбеливатель (8,25% гипохлорита натрия)VWR89501-620Очистка оптомембранного дозатора
CoolTermБесплатное программное обеспечение Роджера МайераПоскольку исходный текст не был предоставлен, пожалуйста, введите текст, который необходимо перевести.Версия 2.0.1, используемая для записи данных с последовательного порта для опто-термоциклера, системы подогрева крови (blood blanket), &оптомембранный дозатор
Дефибринированная кровь овцы Hemostat Laboratories DSB100Кровяной корм для оптомембранного скармливателя
Болт 4-40 с полусферической головкой и шестигранным шлицемMcMaster-Carr92949A105Чашка для кормления с кровавкой (blood blanket feeding plate)
Эпоксидная смолаLoctite1363118Акриловая пластина опто-термоциклера, структура подачи опто-мембраны
ЭтанолDecon Labs2716Санитарная обработка
Внешний жесткий дискLaCieLAC9000298Хранение видео
ffmpegFFmpegПоскольку исходный текст не был предоставлен, пожалуйста, введите текст, который необходимо перевести.Версия 8.0.1, предварительная обработка видео
Хлопковый фитиль длиной четыре дюймаRichmond Dental201226Кормление взрослых комаров
GitHubGitHub, Inc.Нет данныхРепозитории с кодом, файлами деталей и моделями SLEAP для опто-термоциклера (v1.0.0, https://github.com/sorrellslab/opto-thermocycler/releases/tag/v1.0.0), «кровяного одеяла» (blood blanket, v1.0.0, https://github.com/sorrellslab/bloodblanket/releases/tag/v1.0.0) и опто-мембранного фидера (v1.0.0, https://github.com/sorrellslab/opto-membranefeeder/releases/tag/v1.0.0)
Гр3>CsChrimsonДанные отсутствуютНет данныхСоздан для данного исследования, описание приведено в шаге 1.2
Комары Gr3-QF2Нет данныхПожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода.Генетический реагент, DOI: 10.1016/j.cell.2013.12.044
Инкубатор с непрозрачной дверцейCaron7340-25Разведение комаров
Инфракрасный светодиодный светAdafruit387Опто-термоциклер и согревающая подстилка для крови
Инфракрасная светодиодная лентаWaveform Lighting7031.85Опто-термоциклер, согревающее одеяло для крови и опто-мембранная структура
Инфракрасный пропускающий фильтрEdmund Optics65-796Запись видео для проведения анализов 
Инсектарий (клетка для насекомых)BugdormDP1000Инсектарий для взрослых комаров
Автоматический аннотатор поведения животных Janelia (JAABA)Лаборатория Брэнсона в HHMI Janelia FarmПожалуйста, предоставьте текст для перевода.Воспроизведенные данные опто-термоциклера (Рисунок 2); Версия 0.5.0
Большая чаша для супаWebstaurantStore50016SOUPPLAВыращивание комаров
Радиатор для светодиодаLuxeon StarN25-15BОпто-термоциклер и согревающее одеяло для крови
Линза для светодиодаLuxeon Star10209Опто-термоциклер и согревающее одеяло для крови
Держатель линзы светодиодаLuxeon Star10235Опто-термоциклер и согревающее одеяло для крови
Лента для линз светодиодовLuxeon StarLT-01Опто-термоциклер и согревающее одеяло для крови
Светодиодный светLuxeon StarSP-01-D9Стимуляция красным светом для опто-термоциклера и «кровавого одеяла» (blood blanket)
Теплопроводящая лента для светодиодовLuxeon StarLXT-S-12Опто-термоциклер и согревающее одеяло для крови
Оптические монтажные направляющиеThorlabsXE25L12, XE25L24, XE25L09, XE25T4, RA90, TRA6, TR12Структура опто-термоциклера и «кровяного одеяла»
Оптический штифт ThorlabsTR12Структура оптомембранного фидера
Бумажные полотенцаPacific Blue27385Очистка канистры
ПарафильмAmcorPM-996Мембрана «кровяного одеяла», оптомембранный контейнер для питания
ПЦР-амплификаторEppendorf2231001196Опто-термоциклер и согревающее одеяло для крови
Пластиковый порционный стаканчикВыбор999P2CКормление взрослых комаров
Крышка пластикового стаканчика для порцийВыбор999PL2Кормление взрослых комаров
Поликарбонатный лотокCambro21410CWCHCLВыращивание личинок 
Поликарбонатный гастроемкость, размер 1/2Cambro24CW135 Очистка оптомембранного устройства от остатков пищи
Крышка для поликарбонатной гастроемкости размера 1/2Cambro20CWCH135 Очистка оптомембранного устройства от остатков пищи
Крышка для поликарбонатной формыCambro10CWCH135Выращивание личинок
Поликарбонатная пробиркаMcMaster-Carr8585K56Канистра с оптомембранным питателем 
Измеритель мощностиКогерентный1299161Все анализы
Комары QUAS-CsChrimsonПоскольку исходный текст не был предоставлен, пожалуйста, введите текст, который необходимо перевести.Поскольку исходный текст не был предоставлен, пожалуйста, отправьте текст, который необходимо перевести.Генетический реагент, DOI: 10.7554/eLife.76663
RGB-подсветкаDigikey 289-1189-NDПодача стимула с помощью оптомембранного фидера
Угольный зажимThorlabsRA90Структура оптомембранного устройства подачи вещества
липкая лента Scotch Magic Tape3M104Опто-термоциклер и акриловая крышка для прогревающего одеяла
Силиконовая прокладка, 0,5 ммMcMaster-Carr1460N22Питательная пластина с кровавым слоем
SLEAPЛаборатория ТальмоДанные отсутствуютВерсия 1.4.1a2, трекинг поз комаров в каждом из анализов
Бикарбонат натрия, 1М буферный раствор, pH 8,0Thermo ScientificJ62495.APИскусственная кровяная смесь
Раствор хлорида натрияSigma-AldrichS5150-1L 100 3532552Искусственный кровозаменитель для кормления
SpinViewTeledyne Vision SolutionsДанные отсутствуютВерсия 1.27.0.48, программное обеспечение для видеозаписи всех трех анализов
ПульверизаторUlineS-11686Санитарная обработка
СахарозаSigma AldrichS0389-500GКормление взрослых комаров
Термопара (тип T)Harold G Schaevitz Industries LLCCPTC-120-X-NОпто-термоциклер и согревающее одеяло для крови
Усилитель термопарыAdafruitMAX31856Опто-термоциклер и согревающее одеяло для крови
ТаймерEnduraLightRAC-MTКонтроль светового цикла при разведении комаров
Переносная пипетка Thermo ScientificSAM-225Прореживание личинок
Пакет для мусораUlineS-23040Транспортировка насекомых
УФ-стойкая сеткаMcMaster-Carr 87655K13Канистра-питатель с оптомембраной
ВодаSigma AldrichW4502-1LИскусственный кровозаменитель для метода «кровяного одеяла»
Вощеная нитьMcMaster-Carr6356K91Крышка канистры с оптомембраной
Металлическая сеткаMcMaster-Carr9322T65Структура оптомембранного фидера

Ссылки

  1. UNICEF, UNDP, World Bank, WHO Special Program for Research and Training in Tropical Diseases. Global vector control response 2017-2030. Geneva: World Health Organization; 2017.
  2. Knight KL, Stone A. A catalog of the mosquitoes of the world (Diptera: Culicidae). Lanham (MD): Entomological Society of America; 1959.
  3. Raji JI, DeGennaro M. Genetic analysis of mosquito detection of humans. Curr Opin Insect Sci. 2017;20:34-38.
  4. Coutinho-Abreu IV, Riffell JA, Akbari OS. Human attractive cues and mosquito host-seeking behavior. Trends Parasitol. 2022;38(3):246-264.
  5. McMeniman CJ, Corfas RA, Matthews BJ, Ritchie SA, Vosshall LB. Multimodal integration of carbon dioxide and other sensory cues drives mosquito attraction to humans. Cell. 2014;156(5):1060-1071.
  6. Gillies MT. The role of carbon dioxide in host-finding by mosquitoes (Diptera: Culicidae): a review. Bull Entomol Res. 1980;70(4):525-532.
  7. Geier M, Bosch O, Boeckh J. Influence of odor plume structure on upwind flight of mosquitoes towards hosts. J Exp Biol. 1999;202(Pt 12):1639-1648.
  8. Sorrells TR, Pandey A, Rosas-Villegas A, Vosshall LB. A persistent behavioral state enables sustained predation of humans by mosquitoes. eLife. 2022;11:e76663.
  9. Dekker T, Geier M, Cardé RT. Carbon dioxide instantly sensitizes female yellow fever mosquitoes to human skin odors. J Exp Biol. 2005;208(15):2963-2972.
  10. van Breugel F, Riffell J, Fairhall A, Dickinson MH. Mosquitoes use vision to associate odor plumes with thermal targets. Curr Biol. 2015;25(16):2123-2129.
  11. Liu MZ, Vosshall LB. General visual and contingent thermal cues interact to elicit attraction in female Aedes aegypti. mosquitoes. Curr Biol. 2019;29(13):2250-2257.e4.
  12. Chandel A, DeBeaubien NA, Ganguly A, et al. Thermal infrared directs host-seeking behavior in Aedes aegypti. mosquitoes. Nature. 2024;633(8030):615-623.
  13. Tang R, Busby R, Laursen WJ, Keane GT, Garrity PA. Functional dissection of mosquito humidity sensing reveals distinct Dry and Moist Cell contributions to blood feeding and oviposition. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024;121(35):e2407394121.
  14. Burgess L. Probing behavior of Aedes aegypti. (L.) in response to heat and moisture. Nature. 1959;184(4703):1968-1969.
  15. Hol FJ, Lambrechts L, Prakash M. BiteOscope, an open platform to study mosquito biting behavior. eLife. 2020;9:e56829.
  16. Martin-Martin I, Williams AE, Calvo E. Determination of mosquito probing and feeding time to evaluate mosquito blood feeding. Cold Spring Harb Protoc. 2023;2023(6):pdb.top107659.
  17. Boyd MF, Stratman-Thomas WK. Studies on benign tertian malaria. VII. Some observations on inoculation and onset. Am J Epidemiol. 1934;20(2):488-495.
  18. Swanson MM, Poodry CA. The shibire(ts) mutant of Drosophila: a probe for the study of embryonic development. Dev Biol. 1981;84(2):465-470.
  19. Sweeney ST, Broadie K, Keane J, Niemann H, O'Kane CJ. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 1995;14(2):341-351.
  20. Baines RA, Uhler JP, Thompson A, Sweeney ST, Bate M. Altered electrical properties in Drosophila neurons developing without synaptic transmission. J Neurosci. 2001;21(5):1523-1531.
  21. Hamada FN, Rosenzweig M, Kang K, et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 2008;454(7201):217-220.
  22. Corfas RA, Vosshall LB. The cation channel TRPA1 tunes mosquito thermotaxis to host temperatures. eLife. 2015;4:e11750.
  23. Greppi C, Laursen WJ, Budelli G, et al. Mosquito heat-seeking is driven by an ancestral cooling receptor. Science. 2020;367(6478):681-684.
  24. Allen WE, DeNardo LA, Chen MZ, et al. Thirst-associated preoptic neurons encode an aversive motivational drive. Science. 2017;357(6356):1149-1155.
  25. Inagaki HK, Jung Y, Hoopfer ED, et al. Optogenetic control of Drosophila courtship using a red-shifted channelrhodopsin reveals experience-dependent influences. Nat Methods. 2014;11(3):325-332.
  26. Sahel JA, Boulanger-Scemama E, Pagot C, et al. Partial recovery of visual function in a blind patient after optogenetic therapy. Nat Med. 2021;27(7):1223-1229.
  27. Klapoetke NC, Murata Y, Kim SS, et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 2014;11(3):338-346.
  28. Deisseroth K. Optogenetics. Nat Methods. 2011;8(1):26-29.
  29. Potter CJ, Tasic B, Russler EV, Liang L, Luo L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 2010;141(3):536-548.
  30. Herre M, Goldman OV, Lu TC, et al. Non-canonical odor coding in the mosquito. Cell. 2022;185(17):3104-3123.e28.
  31. Wohl MP, McMeniman CJ. Batch rearing Aedes aegypti. Cold Spring Harb Protoc. 2023;2023(3):pdb.prot108017.
  32. American Committee of Medical Entomology, American Society of Tropical Medicine and Hygiene. Arthropod containment guidelines, version 3.2. Vector Borne Zoonotic Dis. 2019;19(3):152-173.
  33. Pleil JD, Wallace MAG, Davis MD, Matty CM. The physics of human breathing: flow, timing, volume, and pressure parameters for normal, on-demand, and ventilator respiration. J Breath Res. 2021;15(4):042002.
  34. Pereira TD, Tabris N, Matsliah A, et al. SLEAP: a deep learning system for multi-animal pose tracking. Nat Methods. 2022;19(4):486-495.
  35. Mathis A, Mamidanna P, Cury KM, et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nat Neurosci. 2018;21(9):1281-1289.
  36. Goodwin NL, Choong JJ, Hwang S, et al. Simple Behavioral Analysis (SimBA) as a platform for explainable machine learning in behavioral neuroscience. Nat Neurosci. 2024;27(7):1411-1424.
  37. Tillmann JF, Hsu AI, Schwarz MK, Yttri EA. A-SOiD, an active-learning platform for expert-guided, data-efficient discovery of behavior. Nat Methods. 2024;21(4):703-711.
  38. Skovorodnikov P, Zhao J, Buck F, et al. FERAL: a video-understanding system for direct video-to-behavior mapping. bioRxiv. 2025. doi:10.1101/2025.11.16.688666.
  39. Kabra M, Robie AA, Rivera-Alba M, Branson S, Branson K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nat Methods. 2013;10(1):64-67.
  40. Autrum H, Bennett MF, Diehn B, et al. Comparative physiology and evolution of vision in invertebrates. A: Invertebrate photoreceptors. Berlin: Springer; 1979.
  41. Alberto DAS, Rusch C, Zhan Y, Straw AD, Montell C, Riffell JA. The olfactory gating of visual preferences to human skin and visible spectra in mosquitoes. Nat Commun. 2022;13(1):555.
  42. Dekker T, Cardé RT. Moment-to-moment flight maneuvers of the female yellow fever mosquito (Aedes aegypti. L.) in response to plumes of carbon dioxide and human skin odor. J Exp Biol. 2011;214(Pt 20):3480-3494.
  43. Demir M, Kadakia N, Anderson HD, Clark DA, Emonet T. Walking Drosophila navigate complex plumes using stochastic decisions biased by the timing of odor encounters. eLife. 2020;9:e57524.
  44. Goldman OV, DeFoe AE, Qi Y, et al. A single-nucleus transcriptomic atlas of the adult Aedes aegypti. mosquito. Cell. 2025;188(25):7267-7290.e26.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Поведение комаровнейронные цепиоптогенетическая активацияповеденческие тестыпоиск хозяинакровососаниемашинное зрениесенсорные стимулы

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.