Цитометрическая оценка тромбоцитов, положительных по тканевому фактору: гармонизированный многоцентровый рабочий процесс

Краткое содержание

Здесь мы представляем гармонизированный рабочий процесс для количественной оценки тромбоцитов, положительных к тканевому фактору, в многоцентровых исследованиях. Протокол описывает стандартизированные процедуры сбора крови, фиксации цельной клетки, окрашивания и гармонизации приборов, что позволяет проводить анализ как локально, так и центрально, в зависимости от лабораторных возможностей.

Аннотация

Тканевой фактор (TF)pos-тромбоциты представляют собой подмножество популяции тромбоцитов. В последнее время было показано, что эта подгруппа предсказывает смертность сердечно-сосудистых заболеваний у пациентов с ишемической болезнью сердца, что делает его биомаркером, полезным для стратификации тромботического риска. Точная количественная оценка^{ТФ-по-тромбоцитов} с помощью потоковой цитометрии требует строгой стандартизации преданалитической обработки, процедур окрашивания и настроек приборов, особенно в многоцентровых исследованиях, где техническая вариабельность может влиять на их измерения. Этот протокол описывает гармонизированный рабочий процесс для оценки цитометрии циркулирующего^TF pos-тромбоцитов с использованием целостного кровотока, разработанный для обеспечения воспроизводимости в лабораториях с разной технической инфраструктурой. Процедура включает стандартизированный сбор крови и фиксацию цельной части для сохранения фенотипа тромбоцитов in vivo. В зависимости от возможностей местной лаборатории предлагаются два различных метода подготовки образцов: отправка фиксированных образцов в Основную лабораторию для централизованного окрашивания, отбора и анализа для центров без проточной цитометрии, или локальное окрашивание и сбор для центров, оснащённых приборами проточной цитометрии и обученным персоналом. Оценка процента поз-тромбоцитов TF достигается путём прямой маркировки антителами анти-TF Star Fluor 488 и анти-CD41 PerCP-Cy5.5 для идентификации целевых белков и маркера популяции тромбоцитов соответственно. Гармонизация потокового цитометра достигается либо через общий шаблон для идентичных моделей цитометров, либо с помощью выравнивания на основе бусинок для разных платформ. Рабочий процесс дополнительно включает стандартизированный гейтинговый подход и централизованный анализ данных для надежного сравнения измерений^TF pos-тромбоцитов на разных участках. Репрезентативные результаты показали, что этот рабочий процесс поддерживает воспроизводимую количественную оценку^{ТФ-поз-тромбоцитов} в валидированных многоцентровых настройках. Этот протокол может способствовать более широкому применению оценки по-тромбоцитов ТФ в стратификации риска тромбоцитов и способствовать более широкой стандартизации цитометрии потока тромбоцитов в трансляционных и клинических исследованиях.

Введение

Тканевой фактор (ТФ) является основным инициатором каскада свертывания крови и ключевым фактором генерации тромбина. Помимо классической экспрессии субэндотелиальными клетками и лейкоцитами, ТФ также ассоциируется с циркулирующими^{тромбоцитами} 1,2,3,4,5. Во время тромбопоэза мегакариоциты переносят TF на подмножество^{тромбоцитов 6}. В физиологических условиях примерно 20–30% циркулирующих тромбоцитов содержат TF, хранящийся в открытой каналикулярной системе, пространственно отделённый от плазменного фактора VII⁷. В таком разделённом состоянии ТФ функционально защищён от циркулирующих факторов свертывания и остаётся неактивным. Соответственно, только небольшая часть тромбоцитов демонстрирует обнаруживаемый поверхностный ТФ при анализе цельной крови здоровых пациентов с помощью потоковой цитометрии, отражающей физиологический^{гомеостаз 2,8}. Патологические состояния, характеризующиеся активацией тромбоцитов и тромбовоспалительным дисбалансом, могут нарушать это равновесие, приводя к увеличению поверхностного воздействия ТФ. Повышенная доля тромбоцитов с положительными TF-положительными (^{TF pos}) отмечена при нескольких тромботических расстройствах: 9,10,11,12,13,14,15. Примечательно, что при ишемической болезни сердца уровень пос-тромбоцитов ТФ, превышающий 4%, независимо предсказывает смертность от сердечно-сосудистых заболеваний на 5-летнем нагляде, что устанавливает долю^{по-тромбоцитов} ТФ как клинически значимого биомаркера тромботического^{риска 16}.

Точная и воспроизводимая количественная оценка поз-тромбоцитов ТФ поэтому крайне важна как для трансляционных, так и для клинических исследований. Ранее опубликованный рабочий процесс по протоку тромбоцитов для оценки^{по-тромбоцитов} ТФ улучшил изучение этого белка в условиях одного^{центра,} предоставив рекомендации по оптимизации выбранных доаналитических или аналитических шагов. Однако этот подход не был специально разработан для решения дополнительных логистических и аналитических задач многоцентровых исследований, включая процедуры отправки, стандартизированную обработку образцов, а также необходимость гармонизации сбора образцов между различными платформами потоковых цитометров. Кроме того, необходимо учитывать различные инфраструктуры и уровни технической экспертизы участвующих центров.

В этом контексте дополнительная ценность данного протокола заключается в предоставлении детального рабочего процесса, который сочетает стандартизированный сбор крови и фиксацию цельной крови, гибкие протоколы обработки образцов, кроссплатформенную гармонизацию сбора, прямое окрашивание и централизованный контроль качества через анализ данных.

Цель этой работы — предоставить операционную основу для гармонизированной многоцентровой реализации анализа по-тромбоцитов ТФ в цельной цитометрии с помощью потока крови. Такая интегрированная конструкция снижает изменчивость преданалитических, аналитических и межинструментальных процессов, создавая условия для согласованной оценки поз-тромбоцитов TF в многоцентровых условиях.

Протокол

Все доноры крови предоставили письменное информированное согласие, утверждённое Этическим комитетом учреждения (No 70/24, CE 18.06.24).

Многоцентровый рабочий процесс для количественной оценки по-тромбоцитов ТФ с помощью цитометрии цельного кровотока изложен на рисунке 1. Протокол, описанный ниже, проведёт пользователя через пять основных шагов.

Рисунок 1: Многоцентровый рабочий процесс для анализа по-тромбоцитов TF. Схематическое представление аналитического конвейера для многоцентровой оценки^{циркулирующих} поз-тромбоцитов TF с помощью цитометрии цельного кровотока. После регистрации и взятия крови образцы фиксируются и обрабатываются в соответствии с техническими ресурсами, доступными в каждом клиническом отделении. Центры без оборудования проточной цитометрии отправляют фиксированные образцы в Core Laboratory для окрашивания, сбора и анализа. Центры, оснащённые потоковыми цитометрами, могут проводить окрашивание и набора на месте с использованием стандартизированных шаблонов сбора данных. Гармонизация приборов достигается либо с помощью общих шаблонов (та же модель прибора), шаблонов, созданных в Core Laboratory (доступна другая модель для выравнивания), либо калибровку с помощью флуоресцентных шариков, когда прямая гармонизация шаблона невозможна. Анализ данных проводится централизованно с использованием стандартизированного рабочего процесса гейтинга. Диаграмма была создана с помощью ChatGPT (OpenAI). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

1. Анализ крови

ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки пост-тромбоцитов ТФ требуется максимум 50 мкл цельной крови.

1. Собирайте периферическую венозную кровь из предкубитальной вены с помощью иголки 19-го калибра. Накладывайте жгут только для венипункции и отпускайте его сразу после установки иглы, чтобы минимизировать активацию тромбоцитов ex vivo.
2. Отбросьте первую ЭДТА-трубку. Затем соберите кровь в вакутайнер с цитратом натрия объемом 0,129 м, заполняя пробирку до маркировки производителя для поддержания правильного соотношения крови к антикоагулянтам.
3. Аккуратно переверните 5 раз, чтобы тщательно смешать кровь и антикоагулянт.
4. Держите трубку вертикально при комнатной температуре, избегая перемешивания, охлаждения или пневматического транспорта.
5. Обработайте образец в течение 3 часов после сбора.

2. Подготовка образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Все антитела должны быть приобретены Основной лабораторией и должны быть из одной партии. Если в ходе текущего исследования потребуется замена пакета, новая партия реагентов должна быть напрямую связана с используемой партией через параллельное тестирование при тех же условиях анализа и принята только при подтверждении сопоставимых результатов. Часто используемые реагенты (например, PBS — физраствор, буферированный фосфатом — и PFA — параформальдегид) могут быть приобретены каждым участвующим центром; однако коды продуктов должны соответствовать используемым Core Laboratory, и пакетная согласованность должна сохраняться на протяжении всего исследования.

1. Исправьте образец.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом обработки крови подготовьте 1% PFA, разбавляя 4% PFA с PBS при комнатной температуре.
   ВНИМАНИЕ: PFA токсичен и должен использоваться в химическом капюшоне с соответствующими средствами индивидуальной защиты (лабораторный халат, перчатки и защита для глаз). Избегайте вдыхания и контакта с кожей или глазами. УТИЛИЗАЦИЯ ОТХОДОВ: Собирайте все растворы, содержащие PFA, фиксированные образцы и загрязнённые расходные материалы в правильно маркированные, закрытые контейнеры для опасных отходов в соответствии с институциональными и местными нормативами.
   1. Аккуратно переверните вакутейнер 5 раз, чтобы смешать кровь и антикоагулянт.
   2. Пересадите 50 мкл крови в трубку объёмом 2 мл с 950 мкл 1% ПФА.
   3. Аккуратно перемешайте образец и инкубуйте 1 час 30 минут при комнатной температуре.
   4. Добавьте 500 мкл PBS.
   5. Центрифугу при 1500 х г в течение 5 минут при комнатной температуре.
   6. Удалите супернатант и снова суспензуйте гранулу в 1 мл PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Технический контрольный пункт: После центрифугирования убедитесь, что гранула видна, прежде чем снимать супернатант. Аккуратно удалите супернатант, не трогая гранулу. После повторной суспензии убедитесь, что образец однородный и свободен от видимых сгустков или заполнителей.
   7. Отправить фиксированный образец в Core Laboratory в упаковке с контролируемой температурой и поддерживать температуру 2-8 °C в течение 24 часов после фиксации. Не замирайте. Время сбора документов, время фиксации и время отправки.
2. Маркировка образца для анализа потоковой цитометрии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Анти-TF Star Fluor 488 (клон HTF1; анти-CD142) направлен против Tissue Factor, тогда как анти-CD41 PerCP-Cy5.5 распознаёт тромбоцитарный интегрин альфаIIb. Перед началом процедуры окрашивания центрифугите антитела при температуре 17000 x g в течение 5 минут при +4 °C, чтобы удалить любой агрегат¹⁸. Разведите антитела против TF Star Fluor 488 (1:100) с помощью PBS. Анти-CD41 PerCP-Cy5.5 не требует промежуточного разбавления и должен использоваться в рекомендованном производителем объёме.
   1. Подготовьте четыре полипропиленовые трубки по 2 мл.
   2. В каждую пробирку вводите 80 мкл фиксированного образца.
   3. В каждую пробирку добавляют правильный объём PBS и антитела Star Fluor 488, указанные в таблице 1  (день 1).
   4. Аккуратно перемешайте образцы.
   5. Инкубировать O/N при 4 °C в темноте.
   6. На следующий день (второй день) добавьте анти-CD41 PerCP-Cy5.5 в трубки 3 и 4, как указано в таблице 1.
   7. Аккуратно перемешайте образцы.
   8. Инкубировать 15 минут при комнатной температуре в темноте.
   9. Разведите каждую трубку 300 мкл PBS.
   10. Окрашиваемые образцы храните в темноте до получения проточной цитометрии.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы можно хранить при 4 °C до трёх дней¹⁷. Длительное хранение приводит к постепенному затуханию сигнала и следует избегать.

		День 1		День 2
Нет.	Идентификация трубки	1X PBS (мкл)	Анти-ТФ Star Fluor 488 (μL)	Anti-CD41 PerCP-Cy5.5 (μL)
1	Без пятен	20	0	0
2	TF	12.5	7.5	0
3	CD41	15	0	5
4	TF/CD41	7.5	7.5	5

Таблица 1: Протокол окрашивания для оценки поз-тромбоцитов ТФ.

3. Стандартизация получения потокового цитометра

1. Установка шаблона приобретения (Core Laboratory).
   1. Шаблон для потокового цитометра A.
      1. Откройте программу A v2.6.
      2. Создайте точечный график FSC-A/SSC-A [Все события] в логарифмичном масштабе для визуализации популяций клеток (рисунок 2A).
      3. Создайте точечный график CD41 PerCP-Cy5.5-A/SSC-A [Все события] в логарифмической шкале для идентификации тромбоцитов внутри врата [Тромбоциты] (Рисунок 2B).
      4. Создайте псевдоцветный график PerCP-Cy5.5-A/Star Fluor 488-A [Все события] для проверки перелива/компенсации (рисунок 2C).
      5. Создайте точечный график FSC-A/FSC-H в затворе [Тромбоциты] и определите область для идентификации синглетов ([Синглетов]; Рисунок 2D).
      6. Создайте точочный график CD41 PerCP-Cy5.5-A/TF звезды Fluor 488-A в затворе [Singlets] для идентификации поз-тромбоцитов TF (рисунок 2E).
      7. Установите порог на 1000 на SSC-H.
      8. Установите расход на «Медленный».
      9. Установить коэффициент усиления B525 на 315, чтобы обеспечить оптимальное различие между положительными и отрицательными событиями; При необходимости корректируйте в зависимости от используемого инструмента.
      10. Установить прирост B690 согласно ежедневному контролю качества. Получение допустимо только в том случае, если популяция^CD41 поз-тромбоцитов полностью выведена из отрицательного фона и остаётся в пределах заранее определённого эталонного элемента, установленного в шаблоне при получении.
      11. Экспортируйте шаблон с помощью шаблона «Export Experiment Template».
      12. Скачать: Шаблон для анализа^TF pos-тромбоцитов на Flow Cytometer A доступен для скачивания в виде дополнительного файла 1 и дополнительного рисунка 1.
          ПРИМЕЧАНИЕ: В приложении прилагается график для проверки на наличие переливания/компенсации (рисунок 2C), хотя он и не обязателен для этого мультипараметрического анализа. Тем не менее, следует рассмотреть возможность использования комбинации флуорохромов, отличающихся от предложенных в этом протоколе.
   2. Создайте шаблон для потокового цитометра B.
      1. Создайте протокольный файл, включающий всю систему приобретения, как описано в 3.1.1.
      2. Экспортируйте шаблон с помощью функции «Export Protocol» в программе B v1.6, генерируя файл протокола.
      3. На принимающем инструменте импортируйте протокольный файл с помощью функции «Import Protocol» внутри программного обеспечения.
   3. Создание шаблона для потокового цитометра C.
      1. Создайте файл workspace, включающий всю конфигурацию приобретения, как описано в 3.1.1. и экспортировать его.
      2. На принимающем инструменте импортируйте файл рабочего пространства с помощью функции «Копировать» программного обеспечения C v3.1.
2. Гармонизация потоковых цитометров с помощью калибровочных шариков.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 6-пиковые калибровочные бусины Rainbow.
   1. Определение целевого значения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте следующую формулу для определения медианной интенсивности флуоресценции (MdFI) первого пика в флуоресцентном канале B525:
      MdFI_CU =
      где CU: клинические приборы, а RI — референсный инструмент.
   2. Подготовка образцов.
      1. Вихрь — флакон с бусинами.
      2. Добавьте 5 капель бусины в пробирку.
      3. Добавьте 1 мл PBS.
      4. Вихрь на 5-10 секунд.
   3. Приобретение бусин.
      1. Создайте точечный график FSC-A/SSC-A в логарифми, отображающий [Все события], и определите область под названием [Бусины] (рисунок 3A).
      2. Создайте точечный график FSC-A/FSC-H в элементе [Beads] и определите область для идентификации синглетов [Singlet] (рисунок 3B).
      3. Создайте гистограмму для флуоресцентного канала Star Fluor 488 (B525).
      4. Отображайте только [Singlet]  на гистограмме.
      5. Нарисуйте ворота по всей ширине первой вершины (область B на рисунке 3C).
      6. В ленте статистики отображайте значения X Медианы (X-Med).
      7. Уберите все существующие компенсации.
      8. Установите расход на «Медленный».
      9. Начинайте сбор в режиме «Run».
      10. Из «Настройки захвата» модифицируйте напряжение/усиление B525, чтобы достичь цели X-Med, рассчитанной в соответствии с значением цели.
      11. Записывайте файл данных с 10 000 событий в шлюзе [Singlet] только после достижения этого критерия принятия. Не собирайте образцы исследований, пока не достигнут целевой диапазон.

Дополнительный файл 1: Шаблон для анализа по-тромбоцитов ТФ на потоковом цитометре A доступен для скачивания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 1: Скриншот шаблона для анализа по-тромбоцитов TF на потоковом цитометре A. (A) Точечный график FSC-A против SSC-A даёт визуальное представление общего распределения событий. (B) Тромбоциты идентифицируются на графике CD41 против SSC-A и определяются как [Тромбоциты]. (C) Включен график PerCP-Cy5.5 против Star Fluor 488 для оценки возможного переброса. (D) Дублеты исключаются внутри элемента [Тромбоциты] с помощью графика FSC-A против FSC-H, определяющего популяцию [Синглетов]. (E)^TF pos-тромбоциты идентифицируются внутри [Singlets] на основе флуоресценции PerCP-Cy5.5 и Star Fluor 488. (F-H) Показаны настройки захвата, включая скорость потока пробы (Медленный), первичный порог (SSC) и усиление детекторов (B525 и B690), реализованные в шаблоне. Полная информация о структуре и рабочем процессе приобретения приведена в разделе 3.1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Рисунок 2: Шаблон приобретения и стратегия гейтинга для идентификации поз-тромбоцитов ТФ. (A) FSC-A/SSC-A точечный график (логарифмическая шкала), показывающий все обнаруженные события. (B) Точечный график CD41-A/SSC-A, используемый для идентификации популяции тромбоцитов. (C) Псевдоцветный график PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488, используемый для оценки требований к спектральному переливанию и компенсации. (D) График FSC-A/FSC-H в [Тромбоциты], используемый для исключения дублетов и определения синглетов. (E) Точечный график PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 в [Синглетах], используемый для идентификации по-тромбоцитов TF. Поля статистики, отображаемые в скобках, автоматически заполняются значениями, специфичными для выборки, при применении шаблона во время сбора выборки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Процедура калибровки приборов на основе бусин .(A) График FSC-A/SSC-A, используемый для определения событий с бусинами. (B) График FSC-A/FSC-H внутри событий бусин, используемый для исключения агрегатов и определения синглетов. (C) Гистограмма флуоресценции звезды Fluor 488, показывающая пики бусинок с гейтингом, применённым к первому пику бусинки для определения медианной интенсивности флуоресценции. Визуализированные статистические данные должны считаться репрезентативными. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

4. Взятие образцов с проточной цитометрией для анализа^TF pos-тромбоцитов

1. Приобретайте с помощью шаблона FCM.
   1. Импортируйте шаблон приобретения с помощью функции «Импорт шаблона » внутри программного обеспечения A.
   2. Возьмите образцы, подготовленные на шаге 2.
   3. Проверьте, совпадают ли тромбоциты и синглетные элементы геометрии опорного графика перед записью данных. При необходимости регулируйте ворота.
   4. Начинайте запись через 5–10 секунд стабильного течения. Запишите файл данных из 20 000 событий внутри [Singlets] gate  (см. рисунок 2D). Сохраняйте некомпенсированные .fcs-файлы и пересылайте их в Core Laboratory.
2. Приобретение без шаблона FCM.
   1. Воссоздайте рабочий лист по получению, как указано в разделе 3.1, включая пять описанных графиков и иерархию врат: Все события > тромбоцитов > синглеты > квадранты TF/CD41.
   2. Установите порог на 1000 на SSC-H.
   3. Установите расход на «Медленный».
   4. Установите напряжение/усиление B525, как определено в 3.2.3.
   5. Возьмите образец, подготовленный на шаге 2. Начинайте запись через 5–10 секунд стабильного течения; Получите 20 000 событий внутри [Singlets] gate. Сохраняйте некомпенсированные .fcs-файлы и пересылайте их в Core Laboratory.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приобретение допускается только при условии принятия ежедневного инструмента контроля качества. Если целевой показатель в 20 000^CD41 pos-тромбоцитов не удаётся достичь, набирайте минимум 10 000^CD41 pos-тромбоцитов.

5. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Описанный ниже рабочий процесс анализа предназначен для поддержки деятельности Core Laboratory, отвечающей за централизованную обработку данных и контроль качества.

1. Откройте новый аналитический лист и загрузите .fcs-файлы.
2. Для каждого образца создайте шаблон анализа, как показано на рисунке 2. Для неидентичных платформ используйте эквивалентный шаблон, специфичный для платформы, с той же структурой элементов и статистическими результатами.
3. Проверьте, правильно ли гейтинг идентифицирует популяцию тромбоцитов согласно заранее определённым характеристикам рассеяния и стратегии различения синглетов (рисунок 4A, B, D).
4. Проверьте наличие перебросов/компенсации с помощью псевдоцветного графика [Все события] (рисунок 4C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фторохромный Star Fluor 488 имеет спектральное излучение на 520 нм, в то время как PerCP-Cy5.5 имеет спектральное излучение на 676 нм, что объясняет отсутствие перекрытия и отсутствие компенсации.
5. Примените следующую последовательность гейтинга на точечном графике Star Fluor 488 (рисунок 5):
   1. Неокрашенные: определите квадранты с помощью неокрашенного контроля так, чтобы фоновые^{по-события} TF оставались на уровне или ниже 0,01% событий тромбоцитов, исключая автофлуоресценцию тромбоцитов (рисунок 5A).
   2. TF: применить координаты квадранта, определённые в неокрашенном образце, чтобы определить^{TF pos-сигнал} в одноокрашенных образцах (рисунок 5B).
   3. CD41: определить квадранты с использованием образца CD41, окрашенного с одной окрашенностью, чтобы исключить фоновую флуоресценцию тромбоцитов (рисунок 5C).
   4. TF/CD41: применить одни и те же координаты квадрантов для идентификации^{TF-pos-сигнала} в образцах, окрашенных TF/CD41 (рисунок 5D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Итоговый процент поз-тромбоцитов ТФ получается из статистики, генерируемой программным обеспечением для анализа, и отражается как процент^{понентарных} событий CD41, попадающих в^{покантный} квадрант ТФ в популяции тромбоцитов.
6. Осуществлять централизованный контроль качества идентификации имён файлов, партий реагентов, интервала фиксации и получения, температуры отправки, количества событий и распределения флуоресценции выбросов. Файлы, показывающие задокументированные отклонения в локальной обработке, отправке, времени фиксации или настройках приобретений, должны быть отмечены, централизованно рассмотрены и либо исключены, либо повторены в соответствии с конкретным планом управления отклонениями.

Рисунок 4: Стратегия последовательного гейтинга для анализа по-тромбоцитов ТФ. Рабочий процесс репрезентативного анализа иллюстрирует идентификацию популяций тромбоцитов после загрузки .fcs-файлов. (A-B) Точечные диаграммы, подтверждающие правильное гейтинг популяций тромбоцитов. (C) Псевдоцветный график PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488, используемый для оценки спектрального перелива. (D) График FSC-A/FSC-H внутри элемента тромбоцитов, используемый для исключения дублетов и определения синглетов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5: Шаблон для анализа данных. Репрезентативные точечные диаграммы (A) неокрашённого контроля, используемые для определения базовой автофлуоресценции и позиционирования квадрантов. (B) образец TF с однократным окрашиванием; (C) CD41 образец с одним окрашением, используемый для определения позиционирования квадранта. (D) Двойной окрашиваемый образец TF/CD41, используемый для анализа^TF pos-тромбоцитов. Цифры показывают процент по-тромбоцитов TF в репрезентативной выборке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Результаты

Этот рабочий процесс был специально разработан для того, чтобы центры с гетерогенной технической инфраструктурой могли участвовать в многоцентровых исследованиях, требующих количественной оценки пост-тромбоцитов TF. Рисунок 1 иллюстрирует диаграмму организационного рабочего процесса, предназначенную для поддержки многоцентровых исследований, направленных на измерение^{циркулирующих ТФ-поз-тромбоцитов} с помощью цитометрии цельного кровотока. Различные процедуры подготовки образцов реализуются в зависимости от технических ресурсов, доступных в участвующих центрах. В частности, (i) когда в клиническом подразделении нет центра проточной цитометрии или обученного персонала, образцы цельной крови проходят фиксацию сразу после сбора, а затем отправляются в Основную лабораторию для централизованного окрашивания, отбора и анализа. (ii) Альтернативно, центры с оборудованием проточной цитометрии могут проводить окрашивание и набирание на месте. В таких случаях сбор данных осуществляется по гармонизированному рабочему процессу, определённому Основной лабораторией. Если модель прибора совпадает с моделью, используемой в Core Laboratory, получение осуществляется по стандартизированному шаблону, предоставленному Core Laboratory. При использовании различных моделей приборов гармонизация может быть достигнута либо через перенос шаблонов — когда инструменты доступны для выравнивания в Core Laboratory, — либо с помощью процедур калибровки на основе бусинок перед сбором образцов. Затем образцы могут быть собраны и проанализированы в соответствии со стандартизированным рабочим процессом.

Следующие репрезентативные результаты предназначены для иллюстрации осуществимости рабочего процесса и шагов гармонизации ключей, а не для предоставления формальной многоцентровой валидации анализов. Для обеспечения надёжного обнаружения TF стратегия окрашивания была сначала оценена на спектральную совместимость и стабильность сигнала. Тромбоциты идентифицировались с помощью анти-CD41 PerCP-Cy5.5, тогда как обнаружение ТФ основано на моноклональном антителе против ТФ, конъюгированном со звездой Fluor 488. Для проверки отсутствия флуоресцентного перехода между каналами обнаружения использовались одиночные контрольные системы. Как показано на рисунке 6A, CD41 PerCP-Cy5.5 с однократным окрашением не выявили обнаруживаемого сигнала в канале Star Fluor 488. Последовательно, процент по-тромбоцитов TF, измеренных в образцах с двойным окрашиванием, был сопоставим с тем, что получен в образцах с одинарным окрашиванием TF (рисунок 6B).

Рисунок 6: Проверка специфичности окрашивания. (A) Однократный образец анти-CD41 PerCP-Cy5.5, проанализированный на точечном графике PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 для проверки специфичности сигнала. (B) Проценты поз-тромбоцитов TF, измеренных в образцах TF с однократным окрашиванием и TF/CD41, показаны как отдельные парные измерения (точки) и среднее ± SD (n = 18 независимых испытуемых). Данные анализировались с помощью теста Уилкоксона с парами со знакомым рангом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.Аналитическая чувствительность предлагаемого анализа оценивалась на образцах n=200 здоровых испытуемых. Используя биологически пустые образцы, рассчитанный предел пустоты (LoB) составлял 0,39%, предел обнаружения (LoD) — 0,77%, а предел количественной оценки (LoQ) — 1,12%, определяемый как минимальный уровень, связанный с CV ≤ 20%. Межоператорная воспроизводимость стратегии гейтинга была оценена на 40 независимых образцах, проанализированных 6 операторами с использованием заранее заданного шаблона анализа, что дало ICC 0,985 (95% ДИ: 0,978-0,990).

Стабильность обнаружения ТФ после фиксации цельной кровью затем оценивалась путём продольного окрашивания фиксированных образцов. По сравнению с исходными образцами, окрашенными в день фиксации (D0), уровень пос-тромбоцитов TF оставался стабильным до четырёх дней после фиксации (D3-D4), показывая лишь незначительное снижение примерно на 22% при D3-D4 (77,8 ± 7,2% — относительный процент в^{TF pos-тромбоцитах}) по сравнению с уровнем D0. При окрашивании при D5-D6 обнаружение по-тромбоцитов TF значительно снизилось до 53,8% ± 20,7 % (относительный процент в^{TF pos-тромбоцитах}; стр< 0.0001; Рисунок 7). Эти результаты показывают, что фиксированные образцы можно надёжно анализировать в течение четырёх дней после фиксации с лишь небольшой потерей сигнала.

Рисунок 7: Анализ временного курса после фиксации образца. Количественная оценка^{ТФ-поз-тромбоцитов}, измеряемых в разные временные моменты после фиксации, указывается по оси x следующим образом: D0 = день сбора крови; D1 = день 1; D2 = день 2; D3-4 = день 3 или 4; D5-6 = день 5 или 6. Данные представлены в среднем проценте относительного ± SD по сравнению с D0 (n = 7-10 здоровых испытуемых, оцениваемых по указанным временным точкам после фиксации). Данные анализировались с помощью Anova, а затем был проведен тест множественных сравнений Даннетта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Эффективность гармонизированного процесса приобретения впоследствии оценивалась на различных платформах потоковой цитометрии. Гармонизация на основе шаблонов впервые была оценена с использованием инструментов FACSLyric и MACSQuant в качестве эталонных цитометров. Дополнительные приборы тех же моделей, расположенные на внешних объектах, использовались в качестве испытательных платформ. Образцы цельной крови с покоящимися тромбоцитами были получены как на эталонных, так и на тестовых приборах с использованием стандартизированного шаблона накопления. Как показано на рисунке 8A,B, сопоставимые проценты поз-тромбоцитов TF были получены по референсным и тестовым цитометрам, что подтверждает воспроизводимость подхода с общим шаблоном.

Рисунок 8: Воспроизводимость между инструментами с использованием шаблонов совместного приобретения. Проценты поз-тромбоцитов ТФ, измеренных в цельной крови от n=6 здоровых участников, полученных на референтных и тестовых FACSLyric (A) или MACSQuant (B) приборах с помощью общего шаблона набора на разных приборах. Данные выражаются в виде индивидуальных определений (точек) и среднего ± SD. Данные анализировались с помощью парного t-теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Наконец, была оценена гармонизация на основе бусинок для выравнивания приборов различных конфигураций. Цитометр A использовался в качестве эталонного прибора, а FACSymphony — в качестве тестового прибора. Выравнивание проводилось с помощью 6-пиковых калибровочных шариков Rainbow путём регулировки напряжения детектора FACSymphony 488 нм до тех пор, пока флуоресцентная интенсивность шариков не достигла заранее определённого целевого диапазона. Профили гистограмм, иллюстрирующие распределение пиков шариков до и после выравнивания, показаны на рисунке 9A. Затем на тестовом приборе до и после калибровки собирались образцы цельной крови. До гармонизации проценты^{по-тромбоцитов} TF различались между двумя платформами. После выравнивания на основе шариков значения близко совпали с теми, что получены на эталонном цитометре (рисунок 9B), что демонстрирует успешную кроссплатформенную гармонизацию и воспроизводимую квантовую оценку TF.

Рисунок 9: Гармонизация инструментов на основе бусин. (A) Репрезентативная флуоресцентная гистограмма 6-пиковых калибровочных шариков Rainbow, полученных до (красных пиков) и после (зелёных пиков) выравнивания прибора. (B) Проценты по-тромбоцитов TF, измеренные в покоящих образцах, полученных из n=6 здоровых испытуемых, полученных на тестовом приборе до (до) и после (пост) гармонизации. Для сравнения показаны измерения, полученные на эталонном приборе. Данные анализировались с помощью парного t-теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Этот протокол обеспечивает пошаговый рабочий процесс для количественной оценки по-тромбоцитов TF с помощью цитометрии цельного кровотока, специально разработанный для многоцентровой реализации. Его основное методологическое преимущество перед традиционными рабочими процессами, основанными на анализе цитометрии потока тромбоцитов, заключается в стандартизации всего аналитического процесса — от сбора крови и фиксации цельной крови до маркировки образцов, гармонизации приборов перед отбором образцов, а также централизованного анализа и контроля качества данных. Это позволяет центрам, не имеющим возможности обработки образцов, участвовать в многоцентровых исследованиях, если они могут предоставить образцы крови. Текущий рабочий процесс охватывает практические источники изменчивости между центрами, которые наиболее актуальны, учитывая, что лишь небольшая часть тромбоцитов проявляет обнаруживаемый поверхностно-ассоциированный ТФ при физиологических^{условиях 7,8}. К таким источникам относятся различия в локальной обработке образцов, доступ к центрам проточной цитометрии, конфигурацию приборов и анализ данных, зависящий от оператора.

Чтобы преодолеть эти проблемы, цельная кровь фиксируется вскоре после забора, стабилизируя in vivo тромбоцитарный фенотип и избегая необходимости немедленного маркирования и взятия образцов. Репрезентативные результаты показывают, что такой подход с фиксированной выборкой позволяет задержку централизованной обработки в рамках валидированного интервала после фиксации. Это расширяет возможности участия в исследованиях в центрах без локальных установок проточной цитометрии, при этом сохраняя единый преданалитический рабочий процесс. Второе преимущество протокола — использование упрощённой стратегии прямого окрашивания с простой двухцветной панелью, что снижает сложность процедуры.

В панели мы использовали хорошо охарактеризованный клон моноклонального антитела против TF HTF1, который распознаёт каталитический участок TF и конкурирует с связыванием фактора VII, что делает его одним из самых надёжных реагентов для обнаружения TF, также в^{тромбоцитах} 14,16,17. Антитело было конъюгировано со Star Fluor 488 — ярким, фотостабильным фторхромом, спектрально похожим на FITC, но с улучшенной стабильностью сигнала. Важно, что возбуждение при 488 нм позволяет обнаруживать образцы с помощью конфигурации синего лазера, доступной практически на всех традиционных потоковых цитометрах, включая приборы начального уровня. Это сочетание специфичности эпитопов и простого обнаружения фторохрома повышает аналитическую чувствительность и масштабируемость на нескольких участках. В этом анализе пороги положительности были определены с использованием неокрашенных и FMO контролей как лучший вариант по сравнению с контролем изотипа для установки порога в популяциях с^{низкой частотой 18}.

Использование различных потоковых цитометров может быть источником вариативности в многоцентровых исследованиях потоковой^{цитометрии} 19,20,21. Ранее мы давали советы по предварительной обработке, настройке окрашивания и локальной оптимизации^{инструментов 17}. Однако эти меры не обеспечивают единообразные флуоресцентные сигналы на разных платформах. Текущий рабочий процесс решает эту проблему, сочетая централизованный анализ с гармонизацией перспективных приобретений. Шаблоны совместного сбора можно использовать, когда доступны идентичные цитометры, тогда как выравнивание на основе бисеров — при необходимости включения разных платформ. Эта двойная стратегия даёт практическое преимущество по сравнению с многоцентровыми аналитическими моделями, которые полностью опираются на централизованный анализ после гетерогенного локального приобретения, снижая вариабельность анализа данных с самого начала и поддерживая более воспроизводимое применение элементов на разных площадках.

Обобщённость рабочего процесса не стоит переоценивать. Протокол был проверен с использованием определённых условий фиксации цельной крови, комбинации реагентов против TF-Star Fluor 488 и анти-CD41 PerCP-Cy5.5, процедур гармонизации и ограниченного набора конфигураций потокового цитометра. Если используются другие анти-TF-клоны, комбинации фторхромов, тайминги фиксации, фиксационные концентрации или потоковые цитометры с существенно иной оптикой, следует проверить аналитическую эффективность рабочего процесса. В целом, любые сбои протокола должны управляться с помощью рекомендованных заранее заданных правил отклонения. В зависимости от тяжести отклонения данные могут быть отмечены, повторены или исключены в соответствии с конкретным планом отклонения. В этих границах нынешний протокол следует рассматривать как операционную основу для многоцентровой реализации анализа по-тромбоцитов TF. Формальная аналитическая валидация, включая более широкую межлабораторную оценку эффективности, валидацию поставок и повторяемость анализов, в настоящее время рассматривается в специальном международном исследовании стандартизации Международного общества тромбоза и гемостаза. Клиническая значимость точной количественной оценки поз-тромбоцитов ТФ подчёркивает доказательства её прогностической ценности при ишемической болезни сердца, где уровни^{пост-тромбоцитов} ТФ, превышающие 4%, независимо предсказывают долгосрочную сердечно-сосудистую смертность при пятилетнем наблюдении ¹⁶. Поэтому надёжное многоцентровое измерение необходимо для валидации поз-тромбоцитов TF как биомаркера и для расширения его применения в проспективных клинических испытаниях и реальных реестрах. Будущая реализация автоматизированных алгоритмов нормализации и стратегий автогатинга может дополнительно снизить смещение операторов и поддержать децентрализованный анализ при сохранении сравнимости между^{сайтами 22,23}.

В заключение, этот гармонизированный рабочий процесс предоставляет практичный и воспроизводимый подход к количественной оценке поз-тромбоцитов ТФ с помощью цитометрии цельного кровотока в многоцентровых условиях. Объединяя стандартизированные преданалитические процедуры, упрощённую обработку образцов и стратегии гармонизации приборов, протокол позволяет надёжно сравнивать измерения по-тромбоцитов TF на разных участках. Помимо поддержки оценки по-тромбоцитов ТФ как биомаркера тромботического риска, описанные здесь принципы могут способствовать более широким усилиям по стандартизации цитометрии потока тромбоцитов для трансляционных и клинических исследований.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1X PBS w/o Calcium and Magnesium	Gibco	10010-015	Для разбавления антител и образцов
Anti-CD41 PerCP-Cy5.5  (clone HIP8)	BD	333148	Моноклональное античеловеческое антитело к CD41a, используемое в качестве маркера тромбоцитарной популяции; должно быть предоставлено лабораторией Core
Anti-TF Star Fluor 488  (clone HTF1)	Cyanagen	CR304	Моноклональное античеловеческое антитело к тканевому фактору (CD142); должно быть предоставлено лабораторией Core
BD FACSLyric Flow Cytometer	BD	non catalog item	В тексте, Flow Cytometer B
BD FACSuite software v1.6	BD	non catalog item	В тексте, software B
Butterfly Needle G19	PIKDARE	02044019030010	Для забора крови
CytExpert Software	Beckman Coulter	non catalog item	В тексте, software A
CytoFLEX S flow cytometer	Beckman Coulter	non catalog item	В тексте, Flow Cytometer A
MACSQuant Flow Cytometer	Miltenyi Biotec	non catalog item	В тексте, Flow Cytometer C
MACSQuantify software v3.1	Miltenyi Biotec	non catalog item	В тексте, software C
Eppendorf tubes 2 mL	Eppendorf	120094	Для фиксации цельной крови
Paraformaldehyde	Antibioticos – Divisione Carlo Erba Reagenti	387507	Для фиксации образцов
Pipet tips 10 µL	Gilson	F161630	Для передачи образцов крови
Pipet tips 1000 µL	Gilson	F161670	Для передачи образцов крови
Pipet tips 200 µL	Gilson	F161930	Для передачи образцов крови
Polystyrene Round-Bottom Tube 5 mL	Corning	352052	Необходим для захвата флоу-цитометром
Rainbow calibration beads (6 peaks)	Spherotech (BD)	556286	Для гармонизации флоу-цитометра
Vacutainer EDTA	BD	368857	Для забора первых 3 мл крови
Vacutainer multiple sample luer adapter	BD	367300	Для забора крови
Vacutainer one use holder	BD	364815	Для забора крови
Vacutainer with 0,129 M sodium citrate	BD	363079	Для забора крови