Функциональная характеристика отдельных пре- и постсинаптических партнёров в центральной нервной системе личинок дрозофилы с использованием CaMPARI

Summary

Этот протокол оценивает функциональную синаптическую активность между определёнными нейронными партнёрами in vivo в центральной нервной системе личинок Drosophila melanogaster с помощью генетически закодированных инструментов. CsChrimson-опосредованная оптогенетическая стимуляция пресинаптических сенсорных нейронов cIVda индуцирует кальциезависимую фотоконверсию CaMPARI в постсинаптических интернейронах Basin-4.

Abstract

Исследования коннектома значительно расширили понимание синаптической связности в нервных системах различных видов. Хотя характеристика синаптических партнёров с помощью электронной микроскопии (ЭМ) даёт подробную анатомическую информацию, функциональные аспекты нейронных сетей требуют комплементарных подходов. Недавние исследования на Drosophila выявили не только полный коннектом личинки, а также взрослые мужские и женские центральные нервные системы, но и клеточные компоненты нейронных сетей, регулирующих специфическое поведение, такие как личиночная ноцицептивная сеть. К третьей стадии личинок класса IV дендритных арборизационных нейронов (cIVda) мультидендритных сенсорных нейронов (ноцицепторов) устанавливают большинство синаптических контактов с интернейронами бассейна-4. Для оценки функциональной значимости этих анатомических связей был использован генетически закодированный кальциевый индикатор CaMPARI (кальциевый модулированный фотоактивируемый ратиометрический интегратор) в живых, нерасчлененных личинках третьего возраста в качестве зависимого от активности репортера для оценки синаптической связности между нейронами cIVda и интернейронами Basin-4. CaMPARI — это рациометрический флуоресцентный индикатор, спектр излучения которого меняется в ответ на повышенный внутриклеточный уровень кальция. При базовых условиях CaMPARI флуоресценцирует зелёным; При высокой концентрации кальция и при воздействии фотоконверсионного света (~400 нм) он необратимо переходит в красную флуоресценцию. Поскольку приток кальция в постсинаптические нейроны является отличительной чертой синаптической активации, фотоконверсия CaMPARI обеспечивает отчёт функциональной синаптической сигнализации. Представлен пошаговый метод иммобилизации личинок третьего возраста на микроскопском стекле для оптогенетической активации ноцицепторов cIVda с использованием красносмещённого каналродопсина CsChrimson, в сочетании с одновременной фотоконверсией CaMPARI в нейронах Basin-4. Кальциевая фотоконверсия в нейронах бассейна-4, несмотря на внутренние движения и изменения фокальной плоскости, предоставляет функциональные доказательства синаптической связности между этими клетками. Это служит доказательством принципа использования CaMPARI в сочетании с пресинаптической оптогенетической стимуляцией у целых, нерасчлененных личинок Drosophila .

Introduction

Точное выявление синаптических партнёров в центральной нервной системе (ЦНС) позволяет отслеживать формирование и совершенствование синаптических связей в процессе развития нервной системы. Соответственно, усилия были сосредоточены на использовании объёмной электронной микроскопии (ЭМ) не только для реконструкции полных коннектомов в мощных генетических модельных организмах, таких как Caenorhabditis elegans ^1,2 и Drosophila melanogaster ^3,4,5, но и миллиметровых электромагнитных объёмов сложных мозгов млекопитающих, включая первичную зрительную^{кору 6} и височную кору^{человека 7}. Эти исследования дают уникальное понимание организационных принципов, лежащих в основе синаптической связности на анатомическом уровне. Однако функциональная характеристика синаптических партнёров даёт дополнительное понимание нейронной связности и необходима для подтверждения анатомических результатов.

Drosophila предлагает множество преимуществ для изучения нейронной связности, включая наличие полных коннектомов для^{личинки 3}, а также для женской^4-й и^5-й взрослых женщин, а также хорошо охарактеризованные нейронные цепи, регулирующие предсказуемое поведение ^8,9,10. Личиночная ноцицептивная сеть представляет собой одну из таких хорошо подходящих схем для изучения точной синаптической^{связности 11}. Электромагнитная реконструкция этой сети выявила детальные синаптические партнёрства, необходимые для обработки ноцицептивных стимулов, что привело к характерному поведению ухода, известному как ноцифенсивный^{роллинг 12,13}.

В этой сети нейроны класса IV дендритной арборизации (cIVda^{) 14} выполняют функции основных сенсорных ноцицепторов, отвечающих за обнаружение^боли 11,12,13,15,16. Их клеточные тела и дендриты расположены периферически внутри стенки тела, а аксоны проецируются в вентральный нервный кабель личинки (VNC)¹⁵. Внутри ЦНС нейроны cIVda формируют свои аксональные терминалы в стереотипном порядке и образуют большинство синаптических контактов с интернейронами^{Бассейна-4} 11,12,13,17. Эта определённая синаптическая связь устанавливает нейроны cIVda и интернейроны Basin-4 как идеальную пару для функциональной оценки синаптической связности in vivo. Разработка методов анализа функциональных связей между индивидуально идентифицированными синаптическими партнёрами облегчит изучение механизмов, лежащих в основе синаптического развития и усовершенствования, особенно в генетически управляемых системах со стереотипными нейронными цепями.

CaMPARI (кальций-модулированный фотоактивируемый ратиометрический интегратор)¹⁸ — это генетически закодированный рациометрический флуоресцентный индикатор, спектр излучения которого смещается в ответ на повышенный внутриклеточный уровень кальция. При базовых условиях CaMPARI флуоресценцирует зелёным; При высокой концентрации кальция и при воздействии света фотоконверсии (~400 нанометров (нм)) он необратимо превращается в красную^{флуоресценцию 18}. Поскольку приток кальция в постсинаптические нейроны является отличительной чертой синаптической активации, фотоконверсия CaMPARI обеспечивает показатель функциональной синаптической^{сигнализации 19,20}.

Помимо CaMPARI, нейронную активность можно визуализировать с помощью обратимых датчиков, таких как генетически закодированные кальциевые индикаторы (GECI), включая GCaMP или RCAMP²¹, а также генетически закодированные индикаторы напряжения (GEVIs)²² , такие как^{Arclight 23}, Ace2N-mNeon²⁴ или VARNAM²⁵. Хотя эти быстрые, обратимые датчики хорошо подходят для мониторинга временной активности в реальном времени, они подвержены артефактам движения при in vivo съёмке. В отличие от этого, интегративные и необратимые фотоконверсионные свойства CaMPARI позволяют фиксировать активность в течение определённого временного окна, что позволяет обнаруживать активацию нейронов даже при смещении фокальных плоскостей во время изображения²⁰. Кроме того, фотопреобразование CaMPARI можно настроить путём регулировки интенсивности фиолетового света, что позволяет обнаруживать сниженную синаптическую силу или подпороговые^{входы 26}. Эти свойства позволили картировать активность у свободно движущихся животных без фиксации головы или привязки, включая исследования коры^{мыши 27}, мозга^{данио-рериша 28}, C. elegans²⁹ и взрослой Drosophila²⁰.

Описан протокол визуализации функциональных синаптических партнёров с помощью фотоконверсии CaMPARI в сочетании с пресинаптической оптогенетической стимуляцией с использованием конфокальной микроскопии у целых, нерасчленённых личинок Drosophila. В этом подходе CaMPARI используется для обнаружения постсинаптического притока кальция в интернейронах бассейна-4 после оптогенетической активации нейронов cIVda в живых личинках третьего возраста. Нейроны cIVda экспрессируют активируемый красным светом каналродопсин CsChrimson^30,31, а интернейроны Basin-4 экспрессируют CaMPARI. Воздействие красного света избирательно активирует ноцицепторы, имитируя ноцицептивный стимул временно^{контролируемым образом 16,30}. Эта стратегия позволяет оценить, индуцирует ли пресинаптическая активация кальций-зависимую фотоконверсию CaMPARI в постсинаптических нейронах, тем самым предоставляя функциональные доказательства синаптической связности.

Ряд технических преимуществ поддерживает использование CaMPARI в сочетании с CsChrimson для анализа связности cIVda–Basin-4. Во-первых, дендриты cIVda образуют полное, неперекрывающееся покрытие стенки тела^{личинки 32}, что позволяет оптогенетической активации целостных сенсорных нейронов без комбьютивных эффектов повреждений, вызванных^{диссекцией 16}. Во-вторых, хотя личинки физически обездвижены на стекле микроскопа, внутренние движения часто изменяют положение ЦНС и фокальную плоскость во время визуализации; Фотоконверсия CaMPARI менее чувствительна к таким артефактам движения и обеспечивает стабильный, интегрированный по времени отчёт нейронной активности. В-третьих, интегративные и регулируемые свойства CaMPARI позволяют обнаруживать синаптическую активность даже при снижении синаптической силы или контактного числа, например, на ранних этапах развития, что способствует будущим исследованиям формирования и их усовершенствования синапсов.

Protocol

Все экспериментальные процедуры с участием Drosophila melanogaster проводились в соответствии с институциональными рекомендациями. Генотип w; Basin4-LexA/CyO-TwGFP; ppk-GAL4/ppk-GAL4 (полученный путём рекомбинирования RRID:BDSC_54899¹² и RRID:BDSC_32079¹⁶) использовался для управления оптогенетической и CaMPARI экспрессией (с использованием строки w^-, UAS-IVS-CsChrimson.mVenus, LexAOp-CaMPARI2; Sp/Cyo получен путём рекомбинирования RRID:BDSC_81085 с маркерами второй хромосомы) у пре- и постсинаптических партнёров соответственно. Исследовательские инструменты, используемые в этом протоколе, перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовка личинок

1. Установили генетические скрещивания между девственными самками UAS-CsChrimson, LexAop-CaMPARI; CyO/sp (RRID:BDSC_81085) и самцы из линии мухи, содержащей две бинарные системы, например, при этом пресинаптический нейрон, представляющий интерес, управляет экспрессией GAL4, а постсинаптический нейрон —^{LexA 33,34}.
2. Генетические скрещивания в пластиковых флаконах со стандартной кукурузной средой^{агар-среды} 35,36,37,38 с дополнением 0,5 мМ алл-транс-ретинал (ATR) для активации CsChrimson^30,33. Подготовьте параллельные флаконы без ATR в качестве контроля без ATR.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Растопите кукурузную муку агар, не варяясь. Дайте остыть, не затвердевая. Приготовьте 40 мМ раствора ATR (порошок ATR разведён 95% этанолом согласно инструкции производителя), затем разведите в среде до 0,5 мМ и тщательно перемешайте.
3. Полностью накройте флаконы алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить воздействие света.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте условия вздымания в постоянной темноте из-за светочувствительности ATR и чтобы предотвратить непреднамеренную активацию нейронов. Хотя CsChrimson наиболее чувствителен к красному свету (590–680 нм), он также может активироваться другими видимыми длинами^{волн 31,39}.
4. Инкубировать флаконы при 25 °C и поднимать личинки до третьей стадии.

2. Иммобилизация личинки

1. Соберите личинку третьего возраста с помощью кисточки. Промой личинок в трёхколочной микро-точечной пластине с 0,1 M PBS, чтобы удалить пищу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не удаляйте избыток PBS; Это помогает поддерживать гидратацию.
2. Положите небольшое количество моделирующей глины в каждый угол чистого покрытия (18 × 18 мм). Поместите личинку в каплю PBS на прикрытие и дайте ей ориентироваться вентральной стороной вниз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации вентрального нервного кора (ВНК) разместите личинку на её дорсальной стороне так, чтобы вентральная поверхность соприкасалась с покрывалом. Эта ориентация позволяет интернейронам Basin-4 в VNC обращаться к объективу через прикрытие слыжения.
3. Поставьте чистый микроскопический стекло поверх укрытия, в котором находится личинка.
4. Закрепите прикрытие, нанеся на углы дополнительную глину для моделирования. Прикладывайте достаточное давление, чтобы обездвижить личинку, при этом избегая разрыва личинки или скольжения.

3. Рабочий процесс стимуляции, фотоконверсии и изображения

1. Получите базовый z-стек постсинаптических нейронов, экспрессирующих CaMPARI, используя одновременные зелёные (488 нм, 0,8% мощности лазера) и красный (~561 нм, 0,8% мощности лазера) каналы. Используйте Z-шаг 1 мкм, разрешение 256 × 256 пикселей, линейное среднее 2, двунаправленное сканирование и скорость сканирования 9 на конфокальном микроскопе с объективом 40×/1.2. Выполняйте все изображения в тёмной среде. Сохраняйте одинаковые параметры z-стека на протяжении всего эксперимента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидайте ярко-зелёных клеточных тел на стереотипных позициях личиночного ВНК и отсутствия обнаружения красной флуоресценции на исходном уровне.
2. Стимулируйте личинку непрерывно в течение 30 секунд с помощью одновременного фотоконверсионного света (405 нм, 0,5% мощности лазера) и оптогенетического стимулирующего света (594 нм, 0,8% мощности лазера).
3. Получите постстимуляционный z-стек с использованием тех же параметров, что и на шаге 3.1 , при красном (~561 нм) и зелёном (488 нм) каналах. Ожидайте, что тела клеток VNC находятся в похожих позициях, как и в базовом состоянии. Обнаружить красную флуоресценцию CaMPARI в нейронах, активируемых во время стимуляции у личинок с ATR, с минимальным фотоконверсией в контролях без ATR.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий процесс и параметры изложены на рисунке 1.

Рисунок 1: Рабочий процесс стимуляции, фотоконверсии (ПК) и визуализации. Для оценки активности кальция в нейронах Basin-4 использовались три последовательных фазы визуализации. Во время базовой фазы были получены z-стеки с помощью лазеров 488 нм и 561 нм для захвата зелёной и красной флуоресценции CaMPARI перед стимуляцией. Во время фазы стимуляции нейроны cIVda оптогенетически активировались с помощью CsChrimson (594 нм), в то время как одновременное освещение 405 нм фотоконвертировало активный CaMPARI из зелёного в красный флуоресцент; В этот 30-й период не проводилось никаких визуализаций. В постстимуляционной фазе z-стеки восстанавливались с использованием тех же лазерных настроек, что и на исходном уровне, для обнаружения фотопреобразованного красного сигнала в телах клеток Basin-4. Все z-стеки были получены с разрешением 256 × 256 пикселей с 1 мкм Z-шагами, линейным усреднением 2 и двусторонним сканированием в тёмных условиях с помощью конфокального микроскопа с объективом 40×/1,2 NA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

4. Анализ визуализации

1. Открыть z-стековые изображения на Фиджи (RRID:SCR_002285) с включёнными биоформатами. Установите просмотр стека на Hyperstack, цветовой режим на композитный и включите автомасштабирование. Прокрутите Z-плоскости и выберите плоскость с оптимальным фокусом. Дублировать выбранную плоскость (изображение → дубликат; Каналы: 1–2; выбран Z-плоскость).
2. Разделить красный и зелёный каналы (изображение → цвет → разделённые каналы).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Регулируйте яркость и контраст с помощью Image → Adjust → Brightness/Contrast → Auto для обоих каналов.
3. Вычитайте фон из обоих каналов (Процесс → Вычитание фона), используя радиус вращающегося шара 50 пикселей.
4. Настройте измерения (Анализ → Набор измерений) с включением площади, среднего значения серого, интегрированной плотности (IntDen), стандартного отклонения и значения серого минимума и максимума.
5. Рисуйте интересующие области (ROI) вокруг каждой ячейки зелёного канала с помощью инструмента Freehand. Добавьте ROI в ROI Manager и измеряйте. Примените те же ROI к красному каналу и измеряйте.
6. Записывайте все измерения в таблицу, включая идентификаторы личинок и клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите измерения для изображений до и после стимуляции.
7. Рассчитайте соотношения флуоресценции красного и зелёного с использованием интегрированных значений плотности для получения (R/G)_post и (R/G)_pre для каждой ячейки. Средние значения на уровне клеток на личинку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Интегрированная плотность (площадь × среднее) позволяет сравнивать ячейки разных размеров.
8. Вычислите Δ(R/G) как (R/G_)post − (R/G_)pre , используя средние значения личинок. Интерпретировать положительные значения Δ(R/G) как повышение постсинаптической активности кальция во время фотоконверсии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Отрицательные значения Δ(R/G) могут возникать из-за шума или асимметрии фона. Установите отрицательные значения на 0. В этом наборе данных одна личинка показала отрицательное значение (−0,008), которое было установлено в 0.

Results

Согласно этому протоколу, функциональная связность между нейронами cIVda и интернейронами бассейна-4 была оценена у живых, нерасчленённых личинок третьего возраста D. melanogaster с помощью CaMPARI (см. рисунок 2). До любой стимуляции фотоконверсионным светом (PC) или оптогенетической активацией интернейроны бассейна-4 демонстрировали зелёную флуоресценцию из-за цитозольной экспрессии CaMPARI (рисунок 2A). Красная флуоресценция не была обнаружена при ис...

Discussion

Описанный здесь протокол позволяет качественно и количественно оценивать синаптическую связь между определёнными синаптическими партнёрами в целых личинках D. melanogaster . Этот подход использует сочетание оптогенетической стимуляции сенсорных нейронов cIVda с визуализацией активированных постсинаптических интернейронов Basin-4 на основе CaMPARI для мониторинга синаптической активности в центральной нервной системе (ЦНС) нерасчленённых личинок. Предыдущие применения CaMPARI у <...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 М фосфатный буферный раствор (PBS)	Sigma Aldrich	P5368-10PAK	Химикат, используемый в растворе для гидратации и монтажа личинок
Алл-транс-ретиналь (ATR)	Sigma Aldrich	R2500-500mg	Химикат, добавляемый в пищу для активации оптогенетических инструментов
Конфокальный микроскоп	ZEISS	LSM900 Конфокальный	Конфокальный микроскоп, Объектив (40×/1.2 NA), Источник света/лазера (405, 488, 561 нм)
Предметные стёкла (18х18мм)	VWR	48366-205	Используется для монтажа животных для изображения
Этанол (95%)	Sigma Aldrich	E7023	Используется в качестве растворителя для порошка ATR
Fiji (ImageJ)	Открытый исходный код	RRID:SCR_002285	Используется для анализа изображений
Prism версия 10.4.1	GraphPad Software Inc.	RRID:SCR_002798	Используется для статистического анализа
Предметные стёкла	VWR	48300-041	Используется для монтажа животных для изображения
Моделирующая глина	Flinn scientific	FB0600	Используется для удержания предметного стекла на предметном стекле с личинками между ними
Кисти для рисования	Genesee scientific	59-204	Используется для переноса личинок между местами
Стандартная кукурузная агара-среда	Genesee scientific	66-123	Пища также может быть приготовлена с использованием аналогичных стандартных рецептов и ингредиентов
Стандартные пластиковые пробирки для Drosophila (25мм x 95мм узкие пробирки Drosophila)	Genesee scientific	32-109	Также могут использоваться большие пробирки или бутылки
Трёхколодезная микро-точечная пластинка	Electron Microscopy Sciences	71561-01	Пластинка, используемая для разделения и очистки отдельной личинки
Штамм Drosophila (генотип: w; Basin4-LexA/CyO-TwGFP; ppk-GAL4/ppk-GAL4)	Bloomington Drosophila Stock Center	RRID:BDSC_54899 & RRID:BDSC_32079	Получен путём рекомбинации RRID:BDSC_54899 и RRID:BDSC_32079
Штамм Drosophila (генотип: w, UAS-IVS-CsChrimson.mVenus, LexAOp-CaMPARI2; Sp/CyO)	Bloomington Drosophila Stock Center	RRID:BDSC_81085	Получен путём рекомбинации RRID:BDSC_81085 с маркерами второй хромосомы