Цепная реакция гибридизации с помощью экспансии — smFISH и иммуногистохимия в мозге дрозофил

Краткое содержание

Этот протокол описывает рабочий процесс HCR-smFISH с помощью расширения и иммуногистохимии для количественного, клеточно-специфического анализа экспрессии РНК и белков в мозге дрозофилы , включая визуализацию с помощью световой или конфокальной микроскопии и автоматизированную количественную оценку ядерных и цитоплазматических транскриптов.

Аннотация

Количественный, пространственно разрешённый анализ экспрессии генов необходим для оценки молекулярных профилей, специфичных к типу клеток. В зрительной системе дрозофилы обширные генетические инструменты открывают рамки для прямой оценки уровней РНК и белка в определённых нейронных популяциях. Здесь мы представляем пошаговый протокол, который сочетает экспансионно ассистированную HCR-smFISH (гибридизация, цепная реакция одномолекулярной флуоресценции in situ ) с иммуногистохимией для количественного анализа клеточно-специфических молекулярных профилей в генетически определённых нейронных типах зрительной системы. Рабочий процесс оптимизирован для клеток, помеченных маркерами, локализованными в ядро или мембране, что позволяет измерять уровень транскрипта и белка в одних и тех же нейронах. После расширения тканей образцы снимаются с помощью микроскопии с помощью светового листа для быстрого объемного сбора данных, при этом альтернативный процесс монтажа и визуализации демонстрируется для стандартных инвертированных лазерных сканирующих и вращающихся дисковых конфокальных микроскопов. Мы также предоставляем автоматизированный алгоритм сегментации, который различает ядерные и цитоплазматические транскрипты, позволяя анализировать состояние транскрипции и локализацию субклеточной РНК. Практические рекомендации предоставляются по параметрам экспериментов и распространённым недостаткам, влияющим на качество сигнала, целостность тканей и количественную эффективность. Репрезентативные применения включают валидацию специфических клеточных РНК-интерференций путём количественной оценки соответствующих изменений уровней РНК и белков. Позволяя интегрировать измерения на уровнях РНК и белков с специфичностью к типу клеток, этот подход предоставляет масштабируемую стратегию для молекулярного анализа, основанного на гипотезах, и, в целевых контекстах, практическую альтернативу одноклеточным транскриптомным анализам. Этот протокол предлагает практический подход к валидации молекулярных возмущений, специфичных к клеточному типу, при сохранении анатомического контекста цельного мозга дрозофилы .

Введение

Зрительная система Drosophila melanogaster служила мощной моделью для решения широкого круга вопросов в области нейронауки развития, включая дифференцировку^{нейронов 1,2}, спецификацию типа^{клеток 3,4} и молекулярную логику мозгового^{взаимодействия 5,6,7}. Этот прогресс был обусловлен необычайно богатым набором экспериментальных инструментов, включающим большие коллекции генетических драйверных линий, специфичных для типов^{клеток 8, 9, 10, 10}, недавние комплексные коннектомные^{реконструкции 10, 11, 12} и всё более детализированные одноклеточные транскриптомические^{линии 13, 14} и мультиомные¹⁵ наборы данных. Вместе эти ресурсы определяют типы нейронов в мультимодальной форме и позволяют проводить точные генетические манипуляции. В результате область теперь может формировать всё более предсказательные гипотезы о том, как конкретные гены регулируют нейронную идентичность, связность и^{функцию 16}. Хотя секвенирование одноклеточных РНК даёт глубокие представления о транскрипционных состояниях, количество РНК не всегда предсказывает экспрессию^{белков 17}, и многие эксперименты по возмущениям в конечном итоге требуют прямого количественного измерения как РНК, так и белка в одних и тех же нейронах.

Гибридизация с флуоресценцией в одной молекуле (smFISH^)18,19 позволяет количественно измерять количество транскриптов с клеточным и субклеточным разрешением, сохраняя при этом анатомический контекст. Сочетание smFISH с расширяющейся микроскопией 20,21,22 дополнительно расширило её применение для целостного мозга, физически увеличивая ткани внутри вздуваемого гидрогеля, тем самым снижая скученность молекуляр, улучшая оптический доступ и повышая эффективное пространственное разрешение. В сочетании с усилением сигнала на основе гибридизационных цепных реакций (HCR)^smFISH с помощью экспансии позволяет надёжно обнаруживать дискретные транскрипции в толстой нервной ткани и поддерживает визуализацию всего мозга с помощью световой или конфокальной микроскопии.

В мозге дрозофилы применялись различные подходы к визуализации in situ РНК, отражающие различные экспериментальные приоритеты. Итеративный HCR-FISH с помощью экспансии позволил обнаружить пространственно-разрешённую РНК в^{целом мозге 24}. Параллельно для измерения РНК в генетически маркированных нейронах применялись методы FISH без расширения, включая стратегии картирования активности на основе HCR, основанные на непосредственных ранних^{генах 25}, и процессы подсчета транскриптов на основе сегментации с использованием мембранно связанных генетически закодированных^{маркеров 26}. Коммерческие методы на основе зондов, такие как RNAscope, дополнительно позволили детектировать мультиплексную РНК в целом мозге, часто в сочетании с иммуногистохимией для выявления целевых клеточных^{популяций 27}. Вместе эти подходы доказывают, что пространственно разрешённый анализ РНК в мозге мухи технически осуществим. Однако эксперименты с возмущениями, основанные на гипотезах, предъявляют более специфический набор требований, которые не полностью решаются ни одним существующим рабочим процессом. Многие методы отдают предпочтение либо мультиплексному открытию, либо профилированию состояния активности, либо количественной оценки РНК, при этом иммунокрашивание обычно служит идентификатором клетки, а не согласованным показанием возмущенного белка, или применяется при отсутствии генетического присвоения типов^{клеток 28}. Кроме того, рутинные приложения получат выгоду от совместимости с несколькими платформами визуализации и автоматизированных, масштабируемых аналитических конвейеров.

Здесь мы представляем интегрированный, пошаговый рабочий процесс для зрительной системы Drosophila , который сочетает экспансионно поддерживаемый HCR-smFISH с иммуногистохимией, выполненной до расширения, что позволяет парно измерять уровень РНК и белка в одних и тех же нейронах внутри одного биологического образца. Опираясь на ранее разработанную рамку^{FlySeg 29} , мы предоставляем автоматизированный конвейер количественной оценки для ядерной сегментации и подсчёта транскриптов, который отличает ядерные и цитоплазматические пункты, поддерживая как измерения общей экспрессии, так и анализы, чувствительные к транскрипционному состоянию. Протокол демонстрируется как на световом микроскопе, так и на двух конфокальных системах с альтернативными процессами монтажа и визуализации. Наконец, мы иллюстрируем полезность интегрированного РНК-белкового показания с помощью репрезентативного эксперимента по возмущениям-валидации (то есть РНК-опосредованного сбивания определённой цели), предоставляя практические рекомендации по параметрам и недостаткам, влияющим на качество сигнала, целостность тканей и количественную эффективность.

Этот протокол в целом основывается на ранее описанной рамке²⁴ EASI-FISH для обнаружения РНК всего мозга у дрозофилы и сохраняет основные принципы закрепления РНК, расширения гидрогеля и усиления сигнала на основе HCR. Настоящий протокол расширяет и совершенствует этот подход, интегрируя иммуногистохимию до расширения для обеспечения согласованных измерений РНК и белков в одних и тех же нейронах, пересматривая несколько этапов обработки и обработки в рабочем процессе для повышения устойчивости и воспроизводимости, предоставляя практические стратегии монтажа и визуализации как для световых листовых, так и для традиционных инвертированных конфокальных микроскопов, а также внедряя автоматизированную сегментацию сома и количественную оценку транскриптов с явным разделением ядерных и цитоплазматических РНК-пулов.

Этот рабочий процесс лучше всего подходит для целевых экспериментов, целью которых является количественное определение данных РНК и белков в генетически идентифицированных нейронах при сохранении анатомического контекста. Он особенно полезен для проверки молекулярных возмущений, когда цель — измерить повышение или снижение регуляции определённого гена или небольшого набора кандидатов, сравнить экспрессию между генотипами или стадиями развития, либо оценить состояние транскрипции с помощью локализации ядерного и цитоплазматического транскрипта. Он менее подходит для беспристрастного открытия транскриптов или высоко-плексного картирования экспрессии всего мозга, где более подходящими подходами могут быть одноклеточное секвенирование, пространственная транскриптомика или итеративные мультиплексированные FISH-подходы.

Протокол

Этическое заявление

В этом протоколе используется Drosophila melanogaster. Позвоночные животные или человеческие объекты не использовались. Поэтому одобрение институционального комитета по уходу и использованию животных не требовалось.

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте технику RNase-clean на всех этапах. Наденьте перчатки, протирайте поверхности и инструменты раствором для дезактивации РНазой и готовьте все растворы с водой без РНаз.

Рисунок 1. Пошаговый рабочий процесс протокола подготовки образцов (A) Схема хронологии протокола, указывающая приблизительный дневный прогресс и этапы инкубации за ночью. (B–J) Схематический обзор основных этапов подготовки образца — от диссекции и фиксации мозга до иммуногистохимии, перекрёстного сшивания РНК/белков, вложения гидрогелей, пищеварения, гибридизации зонда и усиления сигнала HCR. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

1. Диссекция, фиксация и иммуногистохимия мозга (дни 1–3)

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все шаги в многоположенной пластине в стиле Терасаки, если не указано иное. Используйте 10 мкл на одну скважину для инкубаций и промывки. Поддерживайте влажность, положив влажную лабораторную салфетку в один угол тарелки.

ВНИМАНИЕ: Параформальдегид и фиксативные средства глиоксаля токсичны/раздражающие. Держите в капюшоне с дымом и носите соответствующие средства индивидуальной защиты.

1. Вскрытие мозга в ледяной среде S2. Перенесите мозги в колодцы — до 10 мозгов на каждую скважину (рисунок 1B–C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для представленных здесь репрезентативных экспериментов использовались мозги куколки возрастом 72 h.
2. Замените среду S2 на фиксатив 10 мкл на каждую скважину, замените один раз.
3. Зафиксируйте в безкислотном глиоксале Addax с 5% сахарозой на ночь при 4 °C (рисунок 1C).
4. Промыть мозги 3× в 10 мкл PBST (0,5% Triton X-100 в PBS) по 10 минут при комнатной температуре.
   ВНИМАНИЕ: Triton X-100 раздражает; Избегайте контакта кожи и глаз.
5. Инкубировать мозг в растворе первичных антител с концентрацией 10 мкл (в PBST, при разбавлениях, указанных в Таблице материалов) в течение 24 часов при 4 °C (Рисунок 1D).
6. Промывайте мозги 3× в течение 10 минут при 10 мкл PBST при 4 °C. Для каждой промывки заменяйте раствор раз на середине инкубации (два обмена за промывку).
7. Инкубировать мозг в вторичном растворе антител с концентрацией 10 мкл (в PBST, при разбавлениях, указанных в Таблице материалов) в течение 24 часов при 4 °C (рисунок 1D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Защищайте образцы от света.
8. Промывайте мозги 3× в течение 10 минут при 10 мкл PBST при 4 °C. Для каждой промывки заменяйте раствор раз на середине инкубации (два обмена за промывку).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте концентрации первичных и вторичных антител в 2–3 раза выше, чем стандартные концентрации иммуногистохимии целого монтажа
   ТОЧКА ПАУЗЫ: Храните мозги в 10 мкл 1× PBS при 4 °C до 96 часов.

2. Ковалентное закрепление РНК и белков (День 4) (Рисунок 1E)

ВНИМАНИЕ: РНК-якорящие алкилаторы и AcX опасны (токсичные/раздражающие; некоторые подозреваются как канцерогены). Подготовьте и обработайте растворы в вытяжке с химическими дымами с соответствующей индивидуальной защитой. Собирайте все отходы как опасные химические отходы.

1. Инкубировать мозг в 10 мкл буфера MOPS 20 мМ (pH 7,7) в течение 20 минут при 37 °C.
2. Приготовьте анкерный раствор, смешивая 49,5% (v/v) 20 mM MOPS, 49,5% (v/v) Melphalan (2,5 мг·^мл-1 в DMSO) и 1% (v/v) AcX (10 мг·^мл-1 в DMSO). Это даёт конечные концентрации 1,24 мг·^мл-1 мелфалана и 0,10 мг·^мл-1 AcX.
3. Замените MOPS на 7–8 мкл якорного раствора на скважину, замените раствор один раз и инкубируете ночью при 37 °C в темноте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 7–8 мкл для минимизации переполнения и перекрестного смешивания скважин, сохраняя полное покрытие проб.

3. Гелирование (встраивание мозга в гидрогель) и пищеварение протеиназы К (день 5)

ВНИМАНИЕ: Акриловые мономеры, APS и TEMED являются раздражителями/токсичными. Обращайтесь с помощью СИЗ; Подготовьте летучие/экзотермические компоненты в выхлопчике.

1. Прикрепите клеящую силиконовую прокладку толщиной 0,5 мм к незаряженному стеклянному стеклу микроскопа (рисунок 1F, внизу слева), плотно прижмите для полного контакта и герметизации.
2. Добавьте 200 мкл раствора поли-L-лизина в камеру и равномерно распределите поверхность, затем инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут и удалить раствор пипеткой.
3. Дайте поли-L-лизину полностью испариться, пока поверхность не станет заметно сухой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Испарение поли-L-лизина происходит медленно. Для надежных результатов заранее подготовьте камеры и дайте им высохнуть ночью в условиях без пыли. В качестве альтернативы — сухие камеры в инкубаторе при температуре 37 °C на ≥ 1 час в день использования.
4. Промывайте мозги 2× в 10 мкл 1× PBS по 10 минут при комнатной температуре.
5. Приготовьте раствор гелевого мономера и добавьте полимеризационные реагенты непосредственно перед использованием, смешивая раствор мономера с 4HT, TEMED и APS (свежий продукт) в соотношении 47:1:1:1. Окончательный раствор для гелирования содержит 1 млн акрилата натрия, 14% акриламида, 0,1% бисакриламида, 1× PBS, 0,01% 4HT, 0,2% TEMED и 0,2% APS.
6. Ненадолго выйти и оставить финальный раствор гелирования на льду. Используйте раствор немедленно.
7. Инкубировать мозг в растворе холодного гелирования объёмом 10 мкл в течение 15 минут на льду.
8. Во время предварительного равновесия, используя новое лезвие бритвы, вырежьте по одному узкому каналу с каждой стороны силиконовой прокладки, чтобы воздух выходил во время наполнения (рисунок 1F, вверху слева)
9. С помощью наконечника пипетки перенесите мозг в подготовленную камеру гелирования, обеспечивая каждый мозг погружённым в раствор гелирования в любое время.
   ВНИМАНИЕ: После закрепления и равновесия мозг становится сильно клеящимся и легко прилипает к пластиковым поверхностям. Чтобы предотвратить потерю образца, используйте наконечники широкого диаметра пипетки или обрежьте конец стандартного наконечника, чтобы расширить отверстие.
10. Снимите защитную вкладку от силиконового клея поверхности и аккуратно нанесите на камеру чистый стеклянный наклад на 1,5H, чтобы избежать застрявших пузырьков воздуха.
11. Медленно пипетить 200 мкл свежеприготовленного раствора гелирования в камеру через один из боковых каналов, пока камера полностью не заполнится.
12. Поместите герметичную камеру в тёмный контейнер и инкубуйте при 37 °C в течение 2 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Положите влажные лабораторные салфетки) внутрь контейнера. Убедитесь, что затвор не контактирует напрямую с жидкой водой.
13. Подготовьте буфер для пищеварения, состоящий из 50 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 500 мМ NaCl, 1 мМ EDTA и 0,5% (v/v) Triton X-100 в воде без РНаз.
14. Непосредственно перед употреблением добавьте протеиназу K с концентрацией 1:100 из запаса 20 мг·^мл-1 до конечной концентрации 0,2 мг·^мл-1.
    ВНИМАНИЕ: Протеиназа К является раздражителем и должна обращаться с ней в перчатках; Избегайте вдыхания и контакта с кожей.
15. Дайте затвору остыть при комнатной температуре 5 минут, прежде чем снимать накладку. Обрежьте гель скальпелем в прямоугольную форму, используя одиночные прямые срезы. Минимизируйте избыточный объём геля вокруг каждого мозга (рисунок 1F, вверху справа).
16. Каждый обрезанный гель поместите в отдельную яму, содержащую раствор для переваривания 1000 мкл. Убедитесь, что гели полностью погружены в воду.
17. Запечатайте пластину парапленкой и инкубуйте ночью при комнатной температуре на орбитальном шейкере при 0,11 г (рисунок 1G).

4. Пищеварение ДНКазы и гибридизация зондов HCR-smFISH (День 6)

1. Аккуратно аспирируйте раствор с помощью пипетки, расположенной на краю колодца, чтобы избежать контакта и деформации геля.
2. Гели для промывания 3× с 500 мкл 1× PBS по 15 минут каждый при комнатной температуре на орбитальном шейкере по 0,11 г.
   ТОЧКА ПАУЗЫ: Храните гели в 500 мкл 1× PBS при 4 °C до 7 дней перед продолжением действия.
3. Подготовьте рабочее раствор ДНКазы по 500 мкл на гель, разбавляя запас DNase I из набора QIAGEN RNase-Free DNase Set 1:10 в буфере RDD. Окончательное рабочее решение содержит примерно 0,27 единиц Куниц·^μL-1.
4. Инкубировать гели в рабочем растворе ДНКазы на 500 мкл в течение 2 часов при 37 °C с мягким покачиванием (рисунок 1H).
5. Промывайте гели 4× с 500 мкл без РНазы 1× PBS по 15 минут при комнатной температуре.
6. Уравновесить гели в предварительно нагретом буфере для гибридизации зонда объемом 500 мкл на 30 минут при 37 °C
7. Разбавленный приклад зонда HCR smFISH (1 мкм; Molecular Instruments) 1:300 в буфере гибридизации зонда до конечной концентрации ~3,3 нм. Смешивание с помощью вихря
8. Замените буфер уравновесия на смесь зонда 500 мкл на гель и инкубируем за ночь при 37 °C на орбитальном шейкере при 0,11г (см. рисунок I).
   ВНИМАНИЕ: Буферы для гибридизации зонда содержат формамид, который токсичен. Используйте перчатки и избегайте вдыхания.

5. Цепная реакция гибридизации (День 7) (Рисунок 1J)

1. Гели для промывания 3× с предварительно подогреным буфером для промывки зондом объёмом 500 мкл на 30 минут при 37 °C на орбитальном шейкере по 0,11 г.
   ВНИМАНИЕ: Буферы для промывки зонда содержат формамид, который токсичен. Используйте перчатки и избегайте вдыхания.
2. Гели для промывания 3× с 500 мкл 1× PBS по 30 минут при комнатной температуре на орбитальном шейкере при 0,11 г.
3. Оставьте гели в 1 мл 1× PBS на ночь при комнатной температуре на орбитальном шейкере при 0,11 г.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительная ночная промывка улучшает соотношение сигнал/шум, снижая связывание зонда вне цели и фоновые пункты. Для обработки в тот же день сразу переходите к усилению HCR.
   ТОЧКА ПАУЗЫ: После постгибридизации храните гели в 1 мл 1× PBS при комнатной температуре или 4 °C до 96 часов до усиления HCR.
4. Заменить PBS на буфер усиления 500 мкл (ранее уравновешенный до комнатной температуры) на каждую скважину и инкубировать 30 минут при комнатной температуре на орбитальном шейкере при 0,11 г.
5. Для каждого набора зонда разбавьте шпильки h1 и h2 (приклад 3 мкм; Молекулярные инструменты) в буфере амплификации 1:100 (конечная концентрация 30 нм). Приготовьте по 350 мкл разбавленной смеси для шпильок на каждую скважину.
6. Растворы шпильки с разбавленной температурой в ПЦР-трубках при 95 °C в течение 90 секунд в термоцикле или тепловом блоке. Используйте 100 мкл общего объёма на трубку для обеспечения равномерного нагрева и уравновесения температуры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендации HCR обычно рекомендуют нагревать шпильки H1 и H2 отдельно и комбинировать их только после охлаждения. В качестве альтернативы смешивать H1 и H2 перед резким нагревом, если требуется упрощённое обращение.
7. Дайте шпилькам остыть до комнатной температуры 10 минут в темноте без беспокойства.
8. Удалите буфер усиления и добавьте 350 мкл смеси для шпильки на каждую яму.
9. Инкубировать гели 2 часа при комнатной температуре в темноте на орбитальном шейкере весом 0,11 г.
10. Промывайте гели 3× с 500 мкл 5× SSCT по 10 минут при комнатной температуре на орбитальном шейкере при 0,11 г.
11. После усиления извлекайте растворы для шпильки, защитите их от света и храните при -20 °C для повторного использования.
12. Перенесите гели на 500 мкл 1× PBS и стирайте 3× в течение 30 минут при комнатной температуре.
13. Храните гели в 500 мкл 1× PBS при 4 °C, защищённых от света.
    ТОЧКА ПАУЗЫ: Усиленные гели можно хранить до 2 недель до 2 недель перед изображением с минимальными потерями сигнала.

6. Подготовка, монтаж и визуализация расширенных образцов (День 8) (Рисунок 2)

1. Инкубировать гели в 1× PBS с DAPI (1:1000) ночью при 4 °C на орбитальном шейкере при 0,11 g.
2. Используйте краткое ультрафиолетовое освещение, чтобы визуализировать мозг внутри геля. Ориентируйте образец и обрежайте лишний гель по мере необходимости.
   ВНИМАНИЕ: При позиционировании и монтаже образца используется ультрафиолетовое освещение. Носите соответствующую защиту для глаз.
3. Монтировать образцы в 1× PBS с дополнением DAPI (1:1000) с использованием соответствующей конфигурации для выбранной платформы изображения (см. таблицу 1).
4. Дайте образцам уравновеситься не менее 1 часа перед получением.
5. Используйте водяные иммерсионные объективы с достаточной рабочей дистанцией для изображения через расширенный гель.
6. Образцы изображений с использованием микроскопии с листами света, лазерно-сканирующей конфокальной микроскопии или вращающейся дисковой конфокальной микроскопии. Репрезентативные параметры монтажа и приобретения, специфичные для платформы, использованные в данном исследовании, обобщены в таблице 1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После визуализации зонды и шпильки HCR можно удалить с помощью ДНКазного расщепления, как описано выше. Затем гели могут подвергаться дополнительным этапам гибридизации зонда и усиления HCR.

Платформа	Визуализация образцов, монтаж и поиск	Цель / детектор	Репрезентативные настройки приобретений
Цейсс Лайтшит 7	Используйте краткое ультрафиолетовое освещение, чтобы визуализировать положение мозга в геле. Уберите лишний гель и ориентируйте каждый мозг на цель обнаружения. Разместите 5–6 гелей на покрытие 1 × 1 см с поли-L-лизиновым покрытием с гелями, обращёнными наружу (рисунок 2A). Прикрепите накладку на держатель для образцов LS7 с помощью небольшой капли клея, отверждаемого УФ; Выключите ультрафиолетовую лампу перед нанесением клея. Установьте в камеру LS7 и определите области мозга с помощью живого просмотра в ZEN Black.	20×/1,0 NA объектив обнаружения водяного погружения; 2,5× оптический зум (50× общего увеличения).	Z-Step, 0,4 мкм при увеличении 2,5× и расширении 2×. Активировано сканирование с поворотом. Экспозиция — 50 мс для всех каналов. Лазеры: 405 нм при 5%, 488 нм при 2%, 561 нм при 8%. Выброс: 420–470 морских миль, 505–545 морских миль, 570–620 морских миль.
			(Рисунок 2C, слева)
Nikon Ti2-E AXR NSPARC лазерно-сканирующий конфокальный аппарат	Используйте краткое ультрафиолетовое освещение, чтобы визуализировать мозг внутри геля. Ориентируйте один гель так, чтобы мозг был обращён вниз к перевёрнутой цели. Перенесите на стеклянную антенну с изображением с 1× PBS + DAPI (рисунок 2B). Определите мозг с объективом 4×, определите ROI с объективом 20× и регистрируйте X-Y позиции в элементах NIS. Добавьте среду погружения, пересмотрите зарегистрированные ROI и выведите их в фокус.	40× дальний рабочий объект с погружением в воду (Nikon CFI APO LWD 40× WI, 1,15 NA Lambda S, рабочий расстояние 0,61 мм); Детектор NSPARC в режиме сверхразрешения.	Гальванометрическое сканирование, 2048 × 2048 пикселей, 1,6 мкс/пиксель, 8,0× зум. Лазеры: 488 нм при 2%, 640 нм при 20%. Выброс: 502–546 морских миль и 666–732 морских миль.
			(Рисунок 2C, середина)
Конфокальный вращающийся диск Evident Scientific IXplore IX85 / Yokogawa CSU-W1	Монтаж образцов для инвертированной конфокальной визуализации: направить гель так, чтобы мозг был обращён к объективу, и поместить в антенну с стеклянным дном с 1× PBS + DAPI (рисунок 2B). Определите области интереса, как описано для лазерно-сканирующей конфокальной микроскопии с помощью программного обеспечения cellSens.	60× дальних рабочих дистанций для погружения в воду (Olympus LUMFLN60XW LWD, 1,10 NA, рабочий дистанции 1,5 мм); Камера Hamamatsu ORCA-Fusion BT GenIII (2304 × 2304 пикселя; 6,5 × размер пикселей 6,5 мкм).	возбуждение 488 нм при 75% мощности, экспозиции 200 мс; Возбуждение 640 нм при 100% мощности, 800 мс экспозиции. Выброс: 500–550 морских миль и 665–705 морских миль.
			(Рисунок 2C, справа)

Таблица 1: Параметры репрезентативного монтажа, локализации образцов и визуализации на микроскопических платформах. Сводка стратегий монтажа образцов, подходов локализации, целей и параметров получения, используемых на платформах световой и конфокальной микроскопии.

7. Количественный анализ экспрессии РНК и белков

ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите рабочий процесс анализа, исходя из экспериментальной цели. Сравнение этих подходов приведено в Дополнительной таблице 1.

1. Количественная оценка расшифровок на уровне популяции с помощью FlySeg.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ основан на обновлённой версии конвейера FlySeg²⁹ . Схематический обзор рабочего процесса анализа показан на рисунке 3A–B
   1. Установите FlySeg, пакет на основе Python, создав среду Conda с помощью следующих методов:
      conda env create -f environment.yml
   2. Активируйте окружающую среду перед анализом, используя следующее:
      Conda активирует flyseg
   3. Начните анализ с применением:
      python main.py --file >
      Используйте поддерживаемые форматы ввода, включая файлы CZI или NPY.
   4. Настраивайте анализ с помощью необязательных аргументов по мере необходимости, включая:
      Количество каналов (--каналов)
      Канал ядер (--nuclei_ch или --nuclei_wavelength)
      Канал цитоплазмы (--cytoplasm_ch или --cytoplasm_wavelength)
      Параметры обнаружения ядер (--nuclei_sigma_range, --nuclei_threshold)
      Коэффициент ядерной дилатации (--nuclei_dilation)
      Пороги обнаружения РЫБ (--fish_threshold_range)
      Каталог вывода (--output_dir)
      Visualization via Napari (--visualize)
   5. Отобразите все доступные опции с помощью следующих опций:
      python main.py –справка
   6. Проверьте метаданные изображения с помощью следующих методов:
      Python main.py --metadata_only.
      Подтвердите размер вокселя, количество каналов и идентичность канала.
   7. Проводите анализ с параметрами, соответствующими для набора данных. Обычно указывают общее количество каналов, канал ядер, канал цитоплазмы (если он есть) и коэффициент ядерной дилатации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Установите значение --nuclei_dilation, соответствующее желаемой границе между ядерной и цитоплазменной системой. См. рисунок 3C–D для примера.
   8. Следите за журналом обработки. Все выходные данные сохраняются в папке, названной в честь входного файла.
   9. Определите основные выходы для дальнейшего анализа, включая:
      1. <файл>-Nuclei-df.csv
         который содержит измерения признаков на ядра и соответствующие пунктальные подсчёты для каждого канала FISH, а также предоставляет количественные данные для статистического анализа.
      2. <файл>-Nuclei-equivalent-diameter-area-scatter.png
         Это диаграмма рассеяния, используемая для определения сегментационных выбросов по размеру и интенсивности ядра; исключить ядра, отмеченные как выбросы, из дальнейшего анализа.
   10. При необходимости используйте дополнительные промежуточные выходы (например, маски сегментации, таблицы обнаружения пунктов и объединённые файлы сводки FISH) для продвинутой постобработки.
2. Подсчёт транскриптов в индивидуально идентифицируемых клетках с помощью Imaris
   1. Используя инструмент Surfaces, сегментируйте интересующий нейрон на основе цитоплазматического или мембранного маркерного канала.
   2. Отрегулировать параметры сглаживания поверхности и порог интенсивности, чтобы получившаяся поверхность точно охватывала сому, исключая соседние структуры.
   3. С помощью инструмента обнаружения пятен определите пункт транскрипта в канале FISH. Установите предполагаемый диаметр пятна и порог интенсивности на основе размера пункты и интенсивности сигнала (например, 0,25 мкм для двухкратного расширения ткани).
   4. Ограничьте обнаружение пятен ранее сгенерированной поверхностью, чтобы считать только пункты внутри нейрона.
   5. Извлеките общее количество обнаруженных пятен на поверхности нейрона с помощью панели статистики.
   6. Экспортные спотовые подсчёты и связанные с ними измерения для дальнейшего анализа.
3. Квантовая оценка флуоресценции на основе ROI с использованием FIJI/ImageJ
   1. Открывайте стеки изображений в FIJI и генерируйте проекции максимальной интенсивности с помощью стеков > изображения > проекта Z > проекции максимальной интенсивности . Используйте одинаковые параметры проекции для всех образцов в эксперименте.
   2. Определите интересующую нейронную структуру с помощью анатомического маркерного канала (например, мембранного или цитоплазматического GFP). Используя инструмент Freehand или Polygon Select, вручную обведите ROI, соответствующую структуре (например, дендрит Giant Fiber).
   3. Переключитесь на белковый канал и измерите интенсивность флуоресценции в пределах определённого ROI с помощью Analyze > Measure. Запишите следующие параметры: средняя интенсивность флуоресценции; Интегрированная плотность; Район ROI.
   4. Измерьте интенсивность флуоресценции в близлежащем фоне ROI схожего размера, который не имеет специфического сигнала и находится вне помеченной нейронной структуры. Используйте одинаковую стратегию возврата инвестиций для всех образцов эксперимента и вычтите фоновое значение из измерения ROI.
   5. Используйте интегрированные значения плотности или средней интенсивности, корректированные с фоном, для количественного сравнения между генотипами или экспериментальными условиями. Убедитесь, что для всех сравниваемых образцов используются одинаковые настройки изображения.

Результаты

Чтобы подтвердить рабочий процесс HCR-smFISH с помощью расширения и иммуногистохимии в биологически значимых условиях, мы сосредоточились на надвигающейся схеме спасения зрительной системы дрозофилы. Эта цепь состоит из генетически определённых нейронов визуальной проекции^{LC4 30,31}, которые обнаруживают надвигающиеся стимулы, и хорошо охарактеризованных нейронов гигантского волокна (GF), которые обеспечивают быстрые взлёты^32,33, обеспечивая анатомически стереотипную систему для клеточно-специфических молекулярных измерений в целом мозге.

Белок перехода между разрывами Drosophila Shaking-B (ShakB⁾³⁴ участвует в передаче электричества в нескольких компонентах GF-цепи, включая аксонаальные выходные^{синапсы 35} и слуховые^{входы 35}. Хотя прямых доказательств электрической связи в дендритах GF при надвигающейся детектии ограничено, недавние исследования показывают, что нейроны LC4 экспрессируют высокие уровни shakB³⁶. Эти наблюдения побудили использовать стратегии сбивания и маркировки shakB в качестве тестового случая для оценки того, может ли протокол количественно оценивать целевые молекулярные возмущения как на уровнях РНК, так и белка в генетически определённых типах нейронов.

Сначала мы оценили эффективность knockdown shakB в GF и LC4 с помощью HCR-smFISH в сочетании с окрашиванием антител ShakB. GF, один нейрон на каждый полумозг, был помечен мембранным маркером (рисунок 4A). LC4, популяция примерно из 60 нейронов на полумозг, была маркирована ядерным маркером для количественной оценки на уровне популяции (рисунок 4B). В контрольном мозге транскрипты shakB были явно обнаружены как в нейронах GF, так и в LC4. Экспрессия РНК shakB привела к значительному снижению мРНК пункта shakB в таргетных нейронах обоих типов клеток (рисунок 4C–D). В соответствии с цитоплазматическим сайтом интерференции РНК, истощение транскрипта наиболее выражено в цитоплазматическом компартменте. Разделение ядерных и цитоплазматических пунктов с помощью количественной оценки на основе FlySeg показало селективное сокращение цитоплазматических транскриптов shakB в популяции LC4, тогда как ядерные пункты были значительно менее затронуты (рисунок 4D, соответственно снижение 69% против 22%).

Мы обнаружили, что окрашивание антител ShakB локализуется в областях, где дендриты GF перекрываются с аксонами гигантских комиссуральных интернейронов (GCI), которые соединяют два гигантских волокна и обеспечивают контралатеральные визуальные^{реакции 37} (рисунок 4E). Эти наблюдения согласуются с предыдущими^{исследованиями 35} , демонстрирующими электрическую связь между GF и GCI, зависящую от ShakB. Окрашивание антител ShakB также наблюдалось в областях, где LC4-аксоны контактируют с GF-дендритами, хотя локализация в этой области была менее чётко разрешена. Независимо от точной субклеточной локализации, сигнал антител ShakB, связанный с дендритной областью GF, был заметно снижен после экспрессии РНКи (рисунок 4F).

Однако обнаружение на основе антител не позволяет однозначно назначить белок ShakB к пресинаптическим терминалам LC4 по сравнению с постсинаптическими дендритами GF в местах контакта. Кроме того, широкая экспрессия shakB по всей зрительной^{системе 34,36} ограничивает количественное определение типа клеток в нейронах LC4 с помощью анти-ShakB-иммунного окрашивания. Чтобы преодолеть эти ограничения и напрямую оценить локализацию ShakB, специфичную к типу клеток, мы применили эндогенно маркированный аллель shakB, который ранее^{сгенерировали 36,38}. Это позволило селективно визуализировать белок ShakB, особенно внутри нейронов LC4. ShakB с меткой SmGdP-10×V5 был обогащён как дендритами (соответствующими входным областям от верхних зрительных нейронов), так и аксонными концами, контактирующими с дендритами GF (рисунок 4G). Экспрессия РНКи shakB привела к почти полному исчезновению сигнала V5 как в дендритном, так и в аксональных компартментах (см. рисунок 4H). Эти результаты показывают, что протокол позволяет разрешать локализацию эндогенного белка в плотно иннервированном нейропиле, специфическом для типа клеток, и субклеток.

В качестве дополнительного качественного контроля мы протестировали нерасширенный FISH в сочетании с иммуногистохимией в идентифицированных нейронных популяциях (дополнительный рисунок 1). Сигнал FISH от grd перекрылся с соматами LC22, что соответствует прогнозируемой экспрессии данных scRNA-seq оптической доли (дополнительный рисунок 1A–C)¹³. В нейронах Tm3, экспрессирующих tdTomato, мРНК tdTomato перекрывалась с белком tdTomato, тогда как мРНК VGlut1 не перекрывалась с соматами Tm3, что соответствует холинергической идентичности нейронов Tm3 (Дополнительный рисунок 1)¹³. Эти примеры показывают, что нерасширенный FISH + IHC достаточно для качественной оценки наличия/отсутствия, тогда как расширение необходимо для надёжной количественной оценки по однопунктуальному измерению.

Успешная реализация этого протокола подтверждается чёткой маркировкой, специфичной для типа клеток, дискретной пункта smFISH с низким фоном, надёжной сегментацией отдельных ядер или вручную определённых объёмов клеток, а также постоянным снижением целевого сигнала РНК или белка после возмущения. Негативные или слабые сигнальные результаты также должны быть интерпретируемы: например, shakB РНК производила сниженный shakB мРНК и сигнал белка ShakB, тогда как нерасширенные FISH показали отсутствие VGlut1 в соматах Tm3, несмотря на чёткое обнаружение tdTomato mRNA. К субоптимальным результатам относятся слабый сигнал антител или smFISH, высокий фоновый пункт, неполная сегментация, неправильное распределение пунктов или дрейф образца во время визуализации, что может влиять на дальнейшую количественную оценку.

Рисунок 2. Монтаж и визуализация расширенных образцов с помощью платформ световой и конфокальной микроскопии. (A) Визуализация и обрезка расширенных гидрогелей (1–2), общие для всех платформ для визуализации, затем монтаж для микроскопии с лёгким листовым покрытием (3–4; Zeiss Lightsheet 7). (B) Фотография расширенного образца, установленного на инвертированном лазерно-сканирующем конфокальном микроскопе (Nikon Ti2-E AXR). (C) Репрезентативные одиночные оптические срезы (отдельные Z-плоскости) расширенного образца зрительной системы Drosophila (нейроны LC4, помеченные флуоресцентным ядерным маркером), исследованных на наличие shakB мРНК (см . рисунок 4), полученные на трёх платформах визуализации. Чешуйные планки, 10 мкм (ткань после расширения). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3. Количественный анализ пункта smFISH с использованием FlySeg. (A) Схематический обзор рабочего процесса анализа FlySeg для автоматизированной сегментации и количественного определения пунктов внутри идентифицированных ячеек. (B) Трёхмерная мозаика Вороноя, иллюстрирующея основную логику сегментации FlySeg. Объём изображения делится на пространственные домены (каждый из которых обозначен определённым цветом), при этом каждое разбиение ограничено не более одного ядра, обеспечивая назначение одной ячейки. В каждом домене Вороного ядро сегментируется с помощью процедуры функциональной оптимизации, определяющей оптимальную ядерную поверхность на основе как ядерных, так и окружающих цитоплазматических значений. (C) Демонстрация nuclei_dilation варианта различия ядерных и цитоплазматических транскриптов. Один оптический участок, показывающий ядро, маркированное GFP, окружённое пунктой smFISH, с диффузным сигналом DAPI, очертающим цитоплазматический компартмент после обработки DNase. Линии указывают на коэффициенты дилатации 0 и 0,5, соответствующие соответственно ядерному и цитоплазматическому объёмам. (D) Максимальная проекция интенсивности (C), иллюстрирующая пункт локализует как ядерный, так и цитоплазматический компартменты. Чешуйные планки, 10 мкм (ткань после расширения). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4. Валидация количественного рабочего процесса с использованием молекулярного возмущения, опосредованного РНКи, (A) Проекции светлых листов (толщиной 10 мкм, не покрывающие полный объём клетки) сомы гигантского волокна (GF), маркированных мембранным маркером и исследованных на наличие shakB мРНК в контрольных (верхних) и shakB РНКи (снизу). Пунктирные зелёные контуры обозначают границы сомы, чтобы подчеркнуть истощение цитоплазматичного, но не ядерного пула мРНК. n, мозги (по одной стороне на животное). (B) то же, что и (A) для нейронов LC4, помеченных ядерным маркером. (C) Количественная оценка shakB FISH puncta в GF-нейронах (комбинированных ядерных и цитоплазматических бассейнах) под контролем и в условиях shakB RNAi. Точки представляют отдельные нейроны (один нейрон на мозг, одна сторона на животное). (D) То же самое, что и (C) для нейронов LC4. Точки обозначают отдельные мозги (одна сторона на животное; пункт-счёт на клетку, усреднённый на мозг). (E) конфокальные проекции дендритов GF, помеченные мембранным маркером и окрашенные на ShakB в контролирующих (верхних) и shakB RNAi (нижних) условиях. (F) Количественная оценка уровней белка ShakB в дендритах GF, измеряемая как средняя интенсивность флуоресценции под контролем и условия GF>shakB РНК. n, мозги (по одной стороне на животное). (G) Конфокальные проекции нейронов LC4, помеченных мембранным маркером и экспрессирующих smGdP-10xV5-метированный ShakB в контрольных (верхних) и shakB РНКи (внизу). Пунктирные зелёные контуры указывают на участки дендритов LC4 и аксонов, на которых оценивалась плотность ShakB-V5 , (H) количественная оценка уровней белка ShakB-smGdP-V5 в дендритах LC4 и терминалах аксонов измеряется как средняя интенсивность флуоресценции под контролем и условия LC4 > shakB РНКи. n, мозги (по одной стороне на животное). Индикаторы ошибок показывают среднее ± SEM. Все статистические сравнения проводились с использованием двухсторонних t-тестов Уэлча. Полосы масштаба, 10 мкм на всех изображениях (ткань после расширения). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Этот протокол объединяет экспансионно поддерживаемую HCR-smFISH, иммуногистохимию до расширения и количественную оценку транскриптов на основе сегментации, чтобы позволить сопоставлять измерения РНК и белков в тех же генетически определённых нейронах. Интегрируя эти компоненты в единый рабочий процесс, этот метод должен способствовать количественному молекулярному анализу, специфическому к типу клеток, в целом мозге дрозофилы .

Несколько практических модификаций, введённых здесь, представляют собой критические шаги для объединения иммуногистохимии с экспансионной HCR-smFISH в мозге дрозофилы ²⁴. Во-первых, иммуногистохимия должна проводиться до расширения тканей и smFISH. Поскольку протокол включает стадию пищеварения протеиназы K, проведение иммуногистохимии после расширения может снижать целостность эпитопа. Важно, что инкубация антител до расширения (24 часа первичная + 24 часа вторичная) не снижает интенсивность сигнала РНК при использовании метода очистки РНКазой и ковалентного закрепления РНК. Во-вторых, концентрации первичных и вторичных антител следует увеличить, обычно на 2–3× относительно стандартного цельного ИГК, чтобы компенсировать потерю сигнала, связанную с расщеплением и расширением тканей протеиназы K. В-третьих, условия фиксации важны для сохранения как белка, так и сигнала РНК. Безкислотная фиксация глиоксала улучшает сохранение локализации пунктат-синаптических белков, поддерживает структурную целостность нейронных процессов и не снижает количественное обнаружение пункта мРНК. Мы также наблюдали, что одновременное закрепление РНК и белка совместимо как с дальнейшим обнаружением HCR-smFISH, так и с обнаружением иммунофлуоресценции. В совокупности эти корректировки улучшают совместимость между иммуногистохимией и обнаружением транскрипта с помощью экспансии.

Расширение добавляет один мгновенный шаг и технически не является сложным, но его использование зависит от цели эксперимента. Как показано на дополнительном рисунке 1, нерасширенный FISH в сочетании с иммуногистохимией достаточно для оценки экспрессии гена в данном типе клеток, тогда как расширение необходимо, когда отдельные пункты smFISH необходимо надёжно разрешить, присвоить к отдельным соматам и проанализировать количественно, благодаря значительному увеличению эффективного пространственного разрешения. Аналогично, многояковинные пластины в стиле Терасаки не являются строго обязательными, но они снижают использование реагентов, позволяют параллельно обрабатывать несколько условий и помогают сохранять идентичность образцов в небольших партиях; Стандартные микроцентрифугальные трубки также могут использоваться, когда объём реагента менее ограничен. Хотя микроскопия с лёгким листом позволяет быстро объёмную визуализацию расширенной ткани, мы демонстрируем, что стандартные инвертированные лазерно-сканирующие и вращающиеся дисковые конфокальные системы достаточно для полной визуализации отдельных нейронных популяций в расширенном мозге дрозофилы . Распространённым ограничением конфокальной микроскопии является короткое рабочее расстояние. Однако, поскольку мозг мухи небольшой, а образцы расширены примерно на 2× в PBS, дальние рабочие объекты с погружением в воду обеспечивают достаточную глубину проникновения. Для количественных сравнений настройки получения должны оставаться одинаковыми для всех выборок, избегать насыщенных пикселей, а размер вокселей должен быть достаточным для определения отдельных пунктов smFISH. Это расширяет доступность протокола для лабораторий без выделенных приборов для световых листов.

Обновлённая реализация FlySeg основана на ранее опубликованном фреймворке FlySeg и вводит два основных дополнения для этого протокола. Во-первых, настраиваемый параметр ядерной дилатации позволяет классифицировать пункты smFISH как ядерные или цитоплазматические на основе их пространственной связи с сегментированными ядрами. Цитоплазматическое окрашивание DAPI после обработки DNase важно на этом этапе, так как оно обеспечивает диффузный сигнал, очертающий тело клетки, и поддерживает надёжную сегментацию ядер, поддерживая разделение ядерного и цитоплазматического транскриптных пулов. Во-вторых, автоматическое обнаружение выбросов выявляет плохо сегментированные ядра, которые можно исключить из дальнейшей количественной оценки. Помимо оценки молекулярных эффектов блокировки генов, специфичных к клеточному типу, разделение ядерных и цитоплазматических транскриптов может быть полезно, когда локализация транскрипта отражает текущую транскрипционную активность. В мозге млекопитающих немедленные ранние транскрипты генов, вызванные активностью, сначала появляются в ядре, а затем накапливаются в цитоплазме по мере переработки и экспорта мРНК³⁹ — принцип, используемый в анализе времени активации нейронов в^{catFISH 40} . Существует ли сопоставимая транскрипционная динамика в мозге дрозофилы , пока неизвестно, но в принципе это можно исследовать с помощью текущего рабочего процесса. В любых других экспериментах с погоней за импульсами различие ядерных и цитоплазматических пунктов может предоставлять временную информацию, выходящую за пределы общего количества транскриптов. В то же время рабочий процесс не ограничивается ядерной сегментацией и может быть адаптирован к сегментации клеток целой сомы (то есть мембранно-определённой). Текущий количественный рабочий процесс оптимизирован для нейронных сомат; Хотя области нейропила можно визуализировать, количественное назначение пункта мРНК отдельным аксонам или дендритам потребует дополнительных специфических стратегий сегментации. FlySeg наиболее полезен для автоматизированной, высокопроизводительной количественной оценки в плотных нейронных популяциях, где требуется статистика на уровне популяции. Для индивидуально идентифицируемых нейронов или вручную определённых компартментов более подходящими могут быть другие инструменты, такие как Imaris или FIJI/ImageJ. Краткое изложение этих стратегий количественной оценки, включая их основные применения, преимущества и ограничения, приведено в Дополнительной таблице 1.

Распространённые точки устранения неполадок включают слабый сигнал антител, высокий уровень smFISH, повреждение геля или потерю образца, дрейф образца во время визуализации и плохую сегментацию. Слабый сигнал антител часто можно улучшить дальним увеличением концентрации антител или продлением инкубаций первичных и/или вторичных антител с 24 до 48 часов. Высокий уровень smFISH часто можно уменьшить, продлевая постгибридизационные промывки и избегая насыщенных условий насыщения. Повреждение геля и потеря образца минимизируются с помощью широкоотворных наконечников, обрезки гелей прямыми разрезами и вырезания вентиляционных каналов, чтобы предотвратить появление пузырьков при заполнении камеры. Дрейф образца во время визуализации уменьшается за счёт уравновешения закреплённых гелей не менее 1 часа до получения; Если дрейф сохраняется, уравновесление можно продлить до 2 часов и дольше. Плохая сегментация может быть связана со слабым цитоплазматическим окрашиванием DAPI или неполным уравновесением образца, что может уменьшить сигнал на границе клеток или вызвать сдвиги X-Y-Z во время своя; Их следует проверить перед корректировкой параметров FlySeg. В этом протоколе гели поддерживаются в 1× PBS, что приводит к примерно 2× изотропному расширению. Если требуется более высокое пространственное разрешение, можно добиться большего расширения в разбавленной PBS или деионизированной воде. Наоборот, если цель заключается только в оценке наличия или отсутствия экспрессии в определённом типе клетки, нерасширенная FISH в сочетании с иммуногистохимией может быть достаточной, как показано на дополнительном рисунке 1. Протокол остаётся совместим с итеративными рабочими процессами FISH. Зонды и шпильки HCR можно удалить с помощью обработки ДНКазой, что позволяет проводить дополнительные раунды гибридизации и амплификации в одном и том же образце. Будущие технические расширения могут включать итеративные HCR-smFISH с более высоким плексом, автоматизированную регистрацию по раундам визуализации, улучшенную сегментацию цельных клеток или нейритов, а также более стандартизированные аналитические конвейеры для сравнения сигналов РНК и белков между экспериментами. Дальнейшее развитие стратегий сегментации, специфичных для компартментов, может расширить количественный анализ за пределы нейронных сомат, на аксоны и дендриты. В совокупности комбинированное считывание РНК и белков, количественная оценка транскриптов с разделением компартментов и совместимость со стандартными платформами визуализации делают этот рабочий процесс подходящим для целенаправленных молекулярных валидационных экспериментов в генетически определённых нейронах целостного мозга дрозофилы .

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
10N раствор гидроксида натрия	Fisher Scientific	Cat# SS255-1
1N раствор гидроксида натрия	Fisher Scientific	Cat# SS266-1
20X физиологическо-натриевый цитратный буфер и bbsp;	Invitrogen	Cat# AM9763
4-гидрокси-TEMPO	Sigma-Aldrich	Кот# 176141
5M раствор хлорида натрия	Sigma-Aldrich	Cat# S5150
Акриламид	Sigma-Aldrich	Cat# A9099
Акриловая кислота	Sigma-Aldrich	Cat# 147230
Акрилоил-X, SE	Инвитроген	Cat# A20770
Adobe Illustrator	Adobe	Н/Д
Alexa Fluor 488 Козья Анти-Курица (1:200)	Лаборатории Jackson ImmunoResearch	Cat# 103-545-155, RRID:AB_2337390
Alexa Fluor 568 Козла против мышей IgG1 (1:200)	Инвитроген	Cat# A-21124, RRID:AB_2535766
Alexa Fluor 568 Козла против кроликов IgG1 (1:200)	Инвитроген	Cat# A-11011, RRID:AB_143157
Персульфат аммония	Sigma-Aldrich	Cat# A3678
Безводный DMSO	Sigma-Aldrich	Cat# 900645-4X2ML
Bondic UV-отверждающий клей	Бондик	Стартовый набор Bondic
Программное обеспечение cellSens для визуализации версии 4.4.1	Очевидный Научный	Н/Д
Куриный поликлональный анти-GFP (1:400)	Abcam	Cat# ab13970, RRID:AB_300798
Conda (менеджер окружающей среды)	Anaconda, Inc	Н/Д
Corning&Trade; Матовые микроскопические слайды	Корнинг	Cat# 2948-75X25
Индивидуально разработанный держатель для образцов LS7	Janelia Tech	ID 2021-021
DAPI	Сигма-Олдрич	Cat# D9542
Одноразовый стерильный скальпель из нержавеющей стали	MedPride	MPR-47101
Этилендиаминтетрауксусная кислота	Сигма-Олдрич	Cat# EDS-100G
Fiji (ImageJ) программное обеспечение для анализа изображений версии 2.14.0	Консорциум ImageJ	Н/Д
FlySeg (пользовательский конвейер)	https://github.com/avaccari/DrosophilaFISH	Н/Д
Фиксирующее решение GAF	Addax Biosciences	Cat# VI25
GenClone® 24 скважинные клеточные культивные пластины, необработанные	Genesee Scientific	Кат# 25-102
GMR-86D05-Gal4 (LC4)	Блумингтонский фондовый центр	#41315
Донорское стадо козьих сывороток	Sigma-Aldrich	Cat# G6767
HCR™ Буфер усилителя RNA-FISH(v3.0)	Молекулярные инструменты	Н/Д
HCR™ Усилители RNA-FISH(v3.0): AF546, JF669	Молекулярные инструменты	Н/Д
HCR™ Буфер гибридизации зонда RNA-FISH(v3.0)	Молекулярные инструменты	Н/Д
HCR™ RNA-FISH(v3.0) Буфер промывания зонда	Молекулярные инструменты	Н/Д
HCR™ RNA-FISH(v3.0) ShakB зонд	Молекулярные инструменты	Н/Д
Imaris 10.1	Oxford Instruments	Н/Д
IXPlore IX85 SpinSR вращающийся дисковый конфокальный микроскоп	Очевидный Научный	Н/Д
Микроскоп LS7 Light Sheet	Карл Цейсс	Н/Д
Melphalan	Cayman Chemical	Cat# 16665
MOPS Buffer	Fisher Scientific	Cat# BP308-100
Мышиный моноклональный анти-V5 (SV5-Pk1) (1:100)	Abcam	Cat# ab27671, RRID:AB_471093
N,N,N',N' - Тетраметилэтилендиамин	Sigma-Aldrich	Cat# T7024
N,N'-метиленбисакриламид	Sigma-Aldrich	Cat# M7279
Напари	Сообщество с открытым исходным кодом	Н/Д
Программное обеспечение для визуализации передовых исследований NIS-Elements	Корпорация Nikon	Н/Д
Вода без нуклеазы	Цягэн	Кот# 129114
Nunc™ MiniTrays с Nunclon™ Поверхность дельты	Инвитроген	Кот# 163118
PBS (10X), pH 7.4	Gibco	Кот# 70011044
Моющее средство Photo-Flo	Науки об электронной микроскопии	Cat# 74257
Раствор поли-L-лизина	Тед Пелла	Cat# 18026
Precision Cover Glasses, толщина #1.5H	Торлабы	Кот# CG15CH2
Press-to-Seal™ Силиконовый изолятор с клеем, одна скважина, диаметром 20 мм, глубиной 0,5 мм	Инвитроген	Cat# P24740
Протеиназа K	Новая Англия   Биолаборатории	Cat# P8107S
Rabbit Anti-ShakB (1:400)	Подарок от Георда Аммера	Н/Д
RNase AWAY & Trade; Поверхностный деконтаминант	Инвитроген	Cat# 7002
РНаз-свободный набор ДНКазы	Qiagen	Cat# 79256
Шнайдер s Drosophila Medium	Gibco	Кот# 21720001
shakB-KDRT-стоп-KDRT-smGdP-V5;;	Фригетто и др., 2025	ПМИД: 41278920
натрий азид	Sigma-Aldrich	Cat# S8032
Стереомикроскоп Stemi 508	Карл Цейсс	Н/Д
SYTO и trade; 41 Синяя флуоресцентная нуклеиновая окраска	Инвитроген	Cat# S11352
Лазерно-сканирующий конфокальный микроскоп Ti2E AXR NSPARC	Корпорация Nikon	Н/Д
Tris Base	Fisher Scientific	Cat# BP152-500
Triton ™ X-100	Sigma-Aldrich	Cat# T8787
UAS-GFP-2A-KDR;	Санфилиппо и др. 2024	ПМИД: 38262414
UAS-his2A-GFP;	Домбровски и др., 2025	ПМИД: 40468081
UAS-mCherry RNAi	Блумингтонский фондовый центр	#35785
UAS-myr::GFP;	Блумингтонский фондовый центр	#32198
UAS-shakB RNAI	Аммер и др., 2022	ПМИД: 35385694
UltraPure™ 1M Tris-HCI, pH 8,0	Инвитроген	Кот# 15568025
VT042336-Gal4 (Гигантское волокно)	Домбровски и др., 2025	ПМИД: 40468081
Zen Black 3.1	Карл Цейсс	Н/Д