Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Интегрированные подходы машинного обучения для изучения роли генов, связанных с гликозилированием, в идиопатическом легочном фиброзе

177 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71408

⸱

31 июля 2026 г.

 ,  ,  , 
1Department of Rheumatology and Immunology, The First Affiliated Hospital of Jinan University, 2Department of Rheumatology and Immunology, The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical University

В этой статье

Краткое содержание

В этом исследовании использовались интегрированный транскриптомический анализ, машинное обучение (LASSO, SVM-RFE и XGBoost), анализ иммунной инфильтрации, молекулярное докирование и валидация RT-qPCR для выявления генов, связанных с гликозилированием, связанных с идиопатическим лёгочным фиброзом. Было выявлено десять кандидатных диагностических генов, а также разработана и валидирована диагностическая модель с высокой эффективностью в наборах данных легких тканей.

Аннотация

Идиопатический лёгочный фиброз (ИПФ) — это прогрессирующее хроническое заболевание легких с неясной этиологией, и вклад генов, связанных с гликозилированием (GRG), в его патогенез остаётся слабо изученным. Данное исследование сосредоточено на выяснении потенциальных механизмов GRG в IPF, выявлении ключевых биомаркеров и разработке диагностической модели с использованием биоинформатики и машинного обучения. Транскриптомные данные из базы данных GEO были интегрированы с GRG для изучения их роли в IPF. Были выявлены дифференциально экспрессируемые гены (DEGs) и подвергались анализу функционального обогащения и взаимодействия белков (PPI). Рабочий процесс машинного обучения, сочетающий регрессию LASSO, поддержку векторного машинно-рекурсивного устранения признаков (SVM-RFE) и XGBoost, был применён для выявления ключевых генов и построения диагностической модели с использованием учебного набора GSE150910. Производительность модели была впоследствии оценена в четырёх независимых валидационных наборах данных. Были проведены дополнительные анализы, включая анализ обогащения набора генов (GSEA), анализ иммунной инфильтрации, анализ взаимодействия лекарств и гена, молекулярное соединение и валидацию RT-qPCR с использованием периферических образцов крови от пациентов с ИПФ и здоровых контрольных групп, чтобы выяснить биологическую значимость выявленных генов. Всего было выявлено 126 ДЭГ, связанных с гликозилированием, и отобрано 10 ключевых генов. Диагностическая модель достигла значений площади под кривой (AUC) 0,963 и 0,814 на наборах данных по тканям лёгких, а также 0,681 и 0,706 на наборах крови. Анализ иммунной инфильтрации выявил различия в количестве B-клеток между подгруппами пациентов, а валидация RT-qPCR подтвердила дифференциальную экспрессию выбранных генов в клинических образцах. Эти результаты дают представление о возможном участии GRG в IPF и подтверждают их значимость как кандидатов в диагностические гены.

Введение

Идиопатический лёгочный фиброз (ИПФ) — это прогрессирующее, фиброзирующее интерстициальное заболевание легких, характеризующееся гетерогенным патогенезом, включающим генетическую предрасположенность, триггеры окружающей среды и иммуннуюдисфункцию 1,2. Заболевание представляет значительные клинические сложности, главным образом из-за трудностей с ранней диагностикой, ограниченной терапевтической эффективности и в целом неблагоприятного прогноза. Распространённость ИПФ варьируется от 20 до 80 пациентов на 100 000, и без лечения медианное время выживаемости после постановки диагноза обычно составляет 3–5лет 3,4. Выявление пациентов с повышенным риском быстрого прогрессирования заболевания имеет решающее значение для эффективных стратегий лечения, позволяя применять таргетную терапию для тех, кто с наибольшей вероятностью испытывает ухудшение заболевания.

Гликозилирование, котрансляционная и посттрансляционная модификация белков, играет ключевую роль в регулировании активности белков и клеточнойбиологии 5,6. Нарушение гликозилирования белков, вероятно, способствует прогрессииIPF 7,8. Во многих ревматических заболеваниях наблюдаются изменения гликозилирования белков, тесно связанные с воспалительными процессами и прогрессированиемболезни 9. Например, Лю и др. обнаружили, что CRLF1 и GLG1 являются ключевыми участниками патологических процессовостеоартрита 10. Кроме того, гликозилирование связано с активацией иммунных клеток в лёгочных тканях, что дополнительно связывает её с патогенезом заболеванийлёгочных 11. Учитывая это, нарушение гликозилирования белка также может способствовать прогрессированию IPF. Однако роль генов, связанных с гликозилированием (GRG), в IPF остаётся недостаточно изученной, и их потенциал для диагностики IPF требует дальнейших исследований.

В этом исследовании мы провели исследование с интеграцией подходов машинного обучения и данных секвенирования РНК для выявления ключевых GRG, связанных с IPF. Предыдущие исследования в IPF часто опирались на традиционные дифференциальные экспрессионные анализы или на единый алгоритм машинного обучения, что может ограничивать устойчивость и обобщаемость кандидатов набиомаркеры 12,13. Для устранения этих ограничений мы применили многоступенчатый вычислительный рабочий процесс, сочетающий дифференциальный анализ выражений с несколькими алгоритмами машинного обучения, включая LASSO, SVM-RFE и XGBoost, для повышения надёжности выбора признаков. Кроме того, диагностическая модель была оценена на нескольких независимых наборах данных, а ключевые результаты дополнительно подтверждены с использованием клинических образцов. Впоследствии была разработана и подтверждена диагностическая модель, а также проанализированы характеристики иммунной инфильтрации. Кроме того, были изучены иммунная микросреда и возможные молекулярные взаимодействия, связанные с выявленными генами. Хотя данное исследование было сосредоточено на IPF, аналитическая стратегия, применяемая здесь, может быть применима к другим хроническим заболеваниям лёгких и транскриптомным наборам данных, предоставляя воспроизводимую основу для идентификации и валидации ключевых генов. См. рисунок 1 для конкретного процесса.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Это исследование было одобрено Институциональным обзорным советом Первой аффилированной больницы Медицинского университета Бэнбу (номер одобрения: 2023YJS162). Письменное информированное согласие было получено от всех участников до сбора образца.

Сбор данных

Данные транскриптома, использованные в этом исследовании, были получены из базы данных Gene Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/; RRID: SCR_005012). Основной обучающий набор данных, GSE150910, был сгенерирован с использованием платформы Illumina NovaSeq 6000 (GPL24676) и включал 103 образца IPF и 103 нормальных образца легких. Для подтверждения результатов были использованы независимые наборы данных GSE24206, GSE110147, GSE93606 и GSE38958. Подробная информация о каждом наборе данных приведена в Таблице 1. Кроме того, из ранее опубликованного исследования14 было отобрано всего 636 GRG.

Дифференциальный анализ экспрессии и функциональная характеристика ДЭГ, связанных с гликозилированием

Дифференциальный анализ экспрессии между образцами тканей легких IPF и нормальными из набора данных GSE150910 был проведён с использованием пакета R DESeq2 (RRID: SCR_015687). Гены с скорректированным P-значением (padj) < 0,05 и |log2FoldChange| > 0,5 считались дифференциально экспрессированными генами (DEG). Связанные с гликозилированием DEGs (GR-DEGs) были выявлены путём пересечения DEG с заранее определённым набором из 636 GRG. Для дальнейшего изучения биологической роли этих генов были проведены анализ обогащения генной онтологии (GO) и анализ путей Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG), чтобы выяснить их функциональные роли и вовлечённость путей. С использованием базы данных STRING (RRID: SCR_005223)15 была создана сеть взаимодействия между белками и белками (PPI) с порогом доверия > 0,7 для выяснения молекулярных взаимодействий и потенциальных регуляторных механизмов GR-DEGs в IPF.

Скрининг ключевых генов и построение диагностической модели

Для скрининга ключевых генов IPF из GR-DEG мы использовали несколько алгоритмов машинного обучения. Изначально регрессия LASSO (RRID: SCR_003418) была оснащена бинарной логистической регрессией (семейство = «биномиальное»), а оптимальный штрафный параметр λ выбирался путём 10-кратной перекрёстной проверки (n-кратно = 10). Окончательными результатами выбора были признаки с ненулевой коэффициентами, соответствующими λ_(min) (0.01700442). Для SVM-RFE использовалась функция RFE из карета пакета R в пакете. Рекурсивное устранение признаков проводилось с помощью 10-кратной перекрестной валидации (метод = «cv», число = 10), постепенно фильтруя признаки от 1 до 126, с точностью для определения оптимального подмножества признаков. В XGBoost целевая функция была установлена как бинарная логистическая регрессия (objective = «бинарный: логистический»), метрика оценки была установлена как log loss (eval_metric = «logloss»), количество итераций (nrounds) — 100, а скорость обучения (eta) — 0.1. Топ-20 генов были отобраны на основе их показателей важности признаков (Gain). Путём пересечения результатов этих методов был выявлен усовершенствованный набор ключевых генов. На основе этого набора генов была построена диагностическая модель XGBoost с использованием обучающего набора данных (GSE150910), а её предиктивная эффективность оценивалась с помощью анализа рабочих характеристик приёмника (ROC) на внешних валидационных наборах данных (GSE110147, GSE24206, GSE93606 и GSE38958). Кроме того, была разработана номограмма для визуализации вклада каждого выбранного гена в вероятность заболевания, а клиническая полезность модели дополнительно оценивалась с помощью калибровочных кривых и анализа кривой принятия решения (DCA).

Исследование биологических путей ключевых генов

Исследовать биологический контекст ключевых генов, выявленных с помощью машинного обучения. Анализ обогащения наборов генов (GSEA)16 был проведён на основе списков генов из базы данных молекулярных сигнатур (MSigDB) (RRID: SCR_016863)17, а пути были отскринированы на NES > 1. Верхние обогатённые пути визуализировались с помощью функции обогащенного графика.

Изучение биологических функций и различий в иммунном ландшафте в подтипах IPF на основе ключевых оценок генов

На основе профилей экспрессии выявленных ключевых генов были рассчитаны и использованы баллы одиночного анализа обогащения наборов генов (SSGSEA) для стратификации пациентов с IPF на группы с высоким и низким баллом на основе медианного результата. Был проведен дифференциальный анализ экспрессии между двумя группами, затем GSEA (RRID: SCR_003199)18 для проведения анализа биологических процессов GO (GOBP) и обогащения путей KEGG на DEGs.

Анализ инфильтрации иммунных клеток и ключевых различий экспрессии генов

После стратификации подгрупп на основе баллов ssGSEA были оценены различия иммунной инфильтрации между группами с высоким и низким баллом. Сначала мы рассчитали относительную численность 22 типов иммунных клеток в образцах с использованием алгоритма CIBERSORT (RRID: SCR_016955)19 в сочетании с матрицей признаков LM22. В частности, для вычислений использовалась функция deconv_tme в R-пакете IOBR (параметры: method = «cibersort», arrays = FALSE, perm = 200), а также были созданы бокс-графики с использованием пакета ggpubr (RRID: SCR_021139) для оценки различий в инфильтрации иммунных клеток между группами с высоким и низким баллом. Кроме того, функция gsva в R-пакете GSVA (с использованием метода ssGSEA) использовалась для расчёта оценок обогащения для 28 типов иммунных клеток. Эти показатели затем нормализовались с помощью масштабирования Min-Max для сопоставления с интервалом [0, 1], что облегчало сравнение между типами клеток. Наконец, были проведены тесты с суммой ранга Уилкоксона для сравнения экспрессии ключевых генов между нормальными образцами и пациентами с IPF в наборах данных GSE150910 и GSE110147, что позволило провести всесторонний анализ различий в инфильтрации иммунных клеток и экспрессии генов между подгруппами IPF.

Валидация ключевых генов у пациентов с IPF с помощью RT-qPCR анализа

Для подтверждения диагностической значимости выявленных генов были выбраны шесть генов с наивысшими баллами важности алгоритма XGBoost для валидации уровня экспрессии у пациентов с IPF и здоровых контрольных групп с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией (RT-qPCR). Всего было взято 20 образцов крови, включая 9 от пациентов с IPF и 11 от здоровых людей, из Первой аффилированной больницы Медицинского университета Бэнбу. Из образцов крови была извлечена общая РНК, а концентрация РНК измерена с помощью многофункционального считывателя микропластин. Качество РНК оценивалось перед последующим анализом. Геномная ДНК была удалена во время обратной транскрипции, а праймерные последовательности, используемые для RT-qPCR, приведены в таблице 2. Специфичность праймера была подтверждена анализом кривой расплава. GAPDH использовался в качестве внутреннего эталонного гена. Относительные уровни экспрессии генов рассчитывались с помощью метода 2-ΔΔCt . Этот этап валидации обеспечивает предварительное экспериментальное подтверждение дифференциальной экспрессии и потенциальной диагностической значимости выявленных генов в IPF.

Статистический анализ

Данные анализировались в R, и тест Уилкоксона использовался для выявления различий между двумя группами. Анализ обогащения GSEA, GO и KEGG проводился с использованием пакета R clusterProfiler (RRID: SCR_016884). p-значение < 0,05 считалось значимым, если не указано иное.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Функциональный анализ и анализ сетей взаимодействия GR-DEGs

Для изучения вовлечённости генов в IPF был проведён дифференциальный анализ экспрессии GSE150910, выявил 4 216 DEGs (рисунок 2A). Путём пересечения этих DEGs с 636 GRG было выявлено 126 генов гликозилирования, связанных с заболеваниями (рисунок 2B). Кроме того, для оценки потенциальных биологических функций г...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

ИПФ — это хроническое, прогрессирующее заболевание неизвестной этиологии, которое значительно снижает качество жизни пациентов и приводит к более раннейсмертности 4. Несмотря на достижения в терапевтических стратегиях, медианная продолжительность выживаемости после постановки диагноза остаётся низкой, а патогенез IPF до сих пор не полностьюизучен 22. Поэтому разъяснение молекулярных механизмов, лежащих в основе ИПФ, является одновременно и ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.

Благодарности

Мы выражаем благодарность всем коллегам, которые оказывали помощь и поддержку на протяжении всего исследовательского процесса. Их сотрудничество и поддержка были бесценны в нашей работе. Это исследование не получило внешнего финансирования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
CaretR Foundation for Statistical ComputingВерсия 6.0.94SVM-RFE
ClusterProfilerR Foundation for Statistical ComputingВерсия 4.12.6GSEA, GO и KEGG анализ обогащения
DESeq2R Foundation for Statistical ComputingВерсия 1.44.0Анализ дифференциальной экспрессии
Fast First-Strand cDNA Synthesis MixGoonie Biotech Co., Ltd.500-101Синтез cDNA для RT-qPCR
FastTaq qPCR SYBR Green Master MixGooniebio500-102Количественное усиление ПЦР
Fluorescent Quantitative PCR SystemBio-Rad Laboratories, Inc.CFX96Количественное усиление ПЦР
GEO DatabaseNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/Источник данных транскриптома
ggpubr R Foundation for Statistical ComputingВерсия 0.6.0Создание ящиков с графиком
GSVAR Foundation for Statistical ComputingВерсия 1.52.3ssGSEA
MSigDBBroad Institutehttps://www.gsea-msigdb.org/GSEA анализ
PCR SystemBio-Rad Laboratories, Inc.PTC TempoСинтез cDNA для RT-qPCR
PrimersTsingke Biotechnology Co., Ltd.N/AКастомный синтез qPCR праймеров
R softwareR Foundation for Statistical ComputingВерсия 4.4.1Статистический анализ и визуализация
RNA Isolater Total RNA Extraction ReagentVazyme Biotech Co., Ltd.R401-01Извлечение общей РНК из цельной крови
STRING DatabaseSTRING Consortiumhttps://string-db.org/Построение сети PPI
Synergy HTX Multi-Mode ReaderBioTek Instruments, Inc.Synergy HTXИзмерение концентрации РНК

Ссылки

  1. Koudstaal T, Wijsenbeek MS. Idiopathic pulmonary fibrosis. Presse Med. 2023;52(3):104166.
  2. Moss BJ, Ryter SW, Rosas IO. Pathogenic Mechanisms Underlying Idiopathic Pulmonary Fibrosis. Annu Rev Pathol. 2022;17:515-46.
  3. Bonella F, Spagnolo P, Ryerson C. Current and Future Treatment Landscape for Idiopathic Pulmonary Fibrosis. Drugs. 2023;83(17):1581-93.
  4. Spagnolo P, et al. Idiopathic pulmonary fibrosis: Disease mechanisms and drug development. Pharmacol Ther. 2021;222:107798.
  5. Schjoldager KT, Narimatsu Y, Joshi HJ, Clausen H. Global view of human protein glycosylation pathways and functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 2020;21(12):729-49.
  6. He M, Zhou X, Wang X. Glycosylation: mechanisms, biological functions and clinical implications. Signal Transduct Target Ther. 2024;9(1):194.
  7. Xie X, Kong S, Cao W. Targeting protein glycosylation to regulate inflammation in the respiratory tract: novel diagnostic and therapeutic candidates for chronic respiratory diseases. Front Immunol. 2023;14:1168023.
  8. Shi X, et al. Secreted RCN3 acts as an early epithelial-fibroblast mediator via TGFβR1-Smad signaling in post-ALI pulmonary fibrosis. Cell Commun Signal. 2026;24(1).
  9. Kissel T, Toes REM, Huizinga TWJ, Wuhrer M. Glycobiology of rheumatic diseases. Nat Rev Rheumatol. 2023;19(1):28-43.
  10. Lyu Y, et al. Identification of proteins and N-glycosylation sites of knee cartilage in Kashin-Beck disease compared with osteoarthritis. Int J Biol Macromol. 2022;210:128-38.
  11. Komaromy A, Reider B, Jarvas G, Guttman A. Glycoprotein biomarkers and analysis in chronic obstructive pulmonary disease and lung cancer with special focus on serum immunoglobulin G. Clin Chim Acta. 2020;506:204-13.
  12. Ruan H, Ren C. Integrating machine learning with bioinformatics for predicting idiopathic pulmonary fibrosis prognosis: developing an individualized clinical prediction tool. Exp Biol Med (Maywood). 2024;249:10215.
  13. Wang L, et al. Serum Proteomics Identifies Biomarkers Associated With the Pathogenesis of Idiopathic Pulmonary Fibrosis. Mol Cell Proteomics. 2023;22(4):100524.
  14. Shi Y, et al. Glycosylation-related molecular subtypes and risk score of hepatocellular carcinoma: Novel insights to clinical decision-making. Front Endocrinol (Lausanne). 2022;13:1090324.
  15. Szklarczyk D, et al. The STRING database in 2023: protein-protein association networks and functional enrichment analyses for any sequenced genome of interest. Nucleic Acids Res. 2023;51(D1):D638-d46.
  16. Yan S, et al. Identification of ITGAX and CCR1 as potential biomarkers of atherosclerosis via Gene Set Enrichment Analysis. J Int Med Res. 2022;50(3):3000605211039480.
  17. Wang T, He Q, Chan KHK. A Multi-omics approach to identify and validate shared genetic architecture in rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, and type 1 diabetes: integrating GWAS, GEO, MSigDB, and scRNA-seq data. Funct Integr Genomics. 2025;25(1):91.
  18. Lu Y, Lu D, Li C, Chen L. Exploring Immune Cell Infiltration and Small Molecule Compounds for Ulcerative Colitis Treatment. Genes (Basel). 2024;15(12).
  19. Guan M, Jiao Y, Zhou L. Immune Infiltration Analysis with the CIBERSORT Method in Lung Cancer. Dis Markers. 2022;2022:3186427.
  20. Roy D, Ramasamy R, Schmidt AM. Journey to a Receptor for Advanced Glycation End Products Connection in Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 Infection: With Stops Along the Way in the Lung, Heart, Blood Vessels, and Adipose Tissue. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2021;41(2):614-27.
  21. Li Z, Yang P, Feng B. Effect of atorvastatin on AGEs-induced injury of cerebral cortex via inhibiting NADPH oxidase -NF-κB pathway in ApoE(-/-) mice. Mol Biol Rep. 2020;47(12):9479-88.
  22. Liu GY, Budinger GRS, Dematte JE. Advances in the management of idiopathic pulmonary fibrosis and progressive pulmonary fibrosis. Bmj. 2022;377:e066354.
  23. Liao Y, et al. Integrating cellular experiments, single-cell sequencing, and machine learning to identify endoplasmic reticulum stress biomarkers in idiopathic pulmonary fibrosis. Ann Med. 2024;56(1):2409352.
  24. Liu B, et al. A novel model for predicting prognosis in patients with idiopathic pulmonary fibrosis based on endoplasmic reticulum stress-related genes. Cell Biol Int. 2024;48(4):483-95.
  25. Zhu H, et al. Comprehensive analysis of an endoplasmic reticulum stress-related gene prediction model and immune infiltration in idiopathic pulmonary fibrosis. Front Immunol. 2023;14:1305025.
  26. Yeo HJ, et al. Development of a Novel Biomarker for the Progression of Idiopathic Pulmonary Fibrosis. Int J Mol Sci. 2024;25(1).
  27. Perkins TN, Oury TD. The perplexing role of RAGE in pulmonary fibrosis: causality or casualty? Ther Adv Respir Dis. 2021;15:17534666211016071.
  28. Dai J, et al. Construction of a lipid metabolism-related and immune-associated prognostic score for gastric cancer. BMC Medical Genomics. 2023;16(1):93.
  29. Li W, et al. An 11-gene glycosyltransferases-related model for the prognosis of patients with bladder urothelial carcinoma: development and validation based on TCGA and GEO datasets. Translational Andrology and Urology. 2024;13(12).
  30. Li SJ, et al. Identifying causal genes for migraine by integrating the proteome and transcriptome. J Headache Pain. 2023;24(1):111.
  31. Zhang W, et al. ANK2 as a novel predictive biomarker for immune checkpoint inhibitors and its correlation with antitumor immunity in lung adenocarcinoma. BMC Pulm Med. 2022;22(1):483.
  32. Burkhard T, et al. BS10 Characterising the degradome of the metalloprotease ADAMTS8: implications for pulmonary arterial hypertension. BMJ Publishing Group Ltd and British Cardiovascular Society; 2025.
  33. Lee HC, et al. The Therapeutic Potential of ADAMTS8 in Lung Adenocarcinoma without Targetable Therapy. J Pers Med. 2022;12(6).
  34. Bera T, Ghosh M, Ghosh SK. Elucidating the mycochemistry and anticancer efficacy of F5 fraction of ethanolic extract of Daldinia eschscholtzii. Scientific Reports. 2025;15(1):34953.
  35. Li F, et al. Construction and validation of a prognostic model for lung adenocarcinoma based on endoplasmic reticulum stress-related genes. Sci Rep. 2022;12(1):19857.
  36. Lin L, et al. Integrated profiling of endoplasmic reticulum stress-related DERL3 in the prognostic and immune features of lung adenocarcinoma. Front Immunol. 2022;13:906420.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Биохимиявыпуск 233выпуск 233пустое значениевыпускиммунная инфильтрация
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.