Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Исследовательская статья
В этом исследовании использовались сетевая фармакология, молекулярное докирование и модель пункции хвостового диска у крыс для изучения потенциальных доклинических эффектов отварения И Ци Хуо Сюэ на дегенерацию поясничных дисков, с акцентом на кандидатные мишени, включая AKT1, BCL2 и STAT3, а также на пути, такие как сигнализация PI3K-AKT.
В этом исследовании фармакология сети, молекулярное докирование, симуляция молекулярной динамики и экспериментальная валидация были использованы для изучения фармакологических основ и потенциальных молекулярных механизмов отварения И Ци Хуо Сюэ (YQHXD) при дегенерации поясничных дисков (LDD). Было выявлено всего 678 активных соединений-связанных мишень YQHXD и 296 потенциальных терапевтических мишеней, связанных с LDD. Анализ сетей взаимодействия белков и топологический анализ выявили несколько кандидатов, включая AKT1, IL6, TNF, BCL2 и STAT3. Анализ обогащения с использованием Gene Ontology и Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes показал, что кандидат-мишени связаны с функциями, включая связывание белков и АТФ, а обогащение путей включало сигнализацию PI3K-AKT. Молекулярное соединение предсказывало взаимодействия между выбранными активными соединениями, такими как кверцетин, тетраневрин А и изорхамнетин, и основными мишенями. Молекулярно-динамические симуляции также показали, что комплексы с наименьшими энергозатратами остаются стабильными. Семьдесят самцов крыс Спраг-Доули были случайным образом распределены в контрольные, фиктивно управляемые, модельные, положительные контрольные, а также группы с низкой, средней и высокой дозой YQHXD. После установления модели пункции межпозвоночных дисков в модельной, положительной контрольной и группе YQHXD, крысам вводили YQHXD или целекоксиб перорально гаважным в течение 8 недель, тогда как контрольные группы и группы, оперируемые с имитацией, получали нормальный физиологический раствор. Гистопатологическая оценка показала, что лечение YQHXD было связано с уменьшением дегенерации межпозвоночных дисков в этой модели. Ферментно-связанный иммуносорбентный анализ, полимеразная цепная реакция и western blot показали изменения уровней экспрессии мРНК и белков в выбранных целях, включая AKT1, BCL2 и STAT3. Эти результаты свидетельствуют о том, что YQHXD может оказывать доклинические защитные эффекты при LDD через многокомпонентную и многоцелевую регуляцию, включающую механизмы, связанные с воспалением и апоптозом. Это исследование предоставляет предварительные доклинические доказательства в поддержку дальнейшего изучения YQHXD при ЛПД.
Дегенерация поясничного диска (ЛДП) — это распространённое возрастное ортопедическое заболевание, характеризующееся поздним началом, трудностью лечения, высоким рецидивом и инвалидностью. LDD включает дегенеративные патологические изменения, связанные с дисбалансом между катаболическим и анаболическим метаболизмом внеклеточного матрикса (ECM) в межпозвоночном диске (IVD), и тесно связан с болью в пояснице (LBP)1. Эпидемиологические исследования показывают, что LBP является одной из ведущих причин инвалидности вклинической практике 2.
С 1990 по 2017 год число случаев в мире выросло с 42,5 миллиона до 64,9миллиона 3, что затрагивает повседневную жизнь и создаёт значительную социальную и экономическую нагрузку. Таким образом, эффективное лечение ЛПД остаётся клинически важным. В клинической практике ЛПД часто лечится консервативным или хирургическим симптоматическим методом, которые могут облегчить симптомы, но обычно не обращают обратно дегенерацию межпозвоночных дисков (IVDD). Часто используемые пероральные нестероидные противовоспалительные препараты для консервативного лечения также могут быть связаны с побочными эффектами на почечные, желудочно-кишечно-кишечно-кишечно-желудочно-кишечно-кишечно-желудочно-кишечно-желудочно-кишебные препараты.
Традиционная китайская медицина (ТКМ) давно используется в лечении заболеваний4. Сообщается, что растительные соединения и отдельные компоненты замедляют прогрессирование IVDD и способствуют регенерациитканей 5. В клинической практике формулы ТКМ также используются как часть консервативных стратегий лечения дегенеративных заболеваний костей и суставов. Семейная медицинская школа Ву в районе Сучжоу использует отвар И Ци Хо Сюэ (YQHXD) в качестве основного рецепта при расстройствах поясничного ИВЗ; однако для уточнения его потенциальной роли в LDD необходимы дополнительные механистические данные.
Предыдущие исследования предполагали, что YQHXD может задерживать IVDD, стимулируя клеточную аутофагию и оказывая антивозрастныеэффекты 6,7. Однако фармакологические механизмы, с помощью которых YQHXD может влиять на ЛППД, остаются неясными, и систематический анализ его способа действия по-прежнему отсутствует. В этом исследовании использовалась сетевая фармакология для анализа многокомпонентных и многоцелевых характеристик YQHXD в отношении LDD. Для оценки взаимодействий между соединениями и белками-мишени использовались молекулярные стыковки, за которым последовали молекулярно-динамические симуляции. Эти прогнозы затем оценивались с использованием модели прокола хвостового диска у крысы для изучения возможных механизмов YQHXD приLDD 8. Как показано на рисунке 1, это исследование предоставляет доклинические доказательства того, что YQHXD может влиять на процессы, связанные с LDD, модулируя гены и белки, такие как AKT1, BCL2 и STAT3, при этом обогащение путей связано с PI3K-Akt сигнальными сигналами и другими категориями путей, связанных с заболеваниями.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Все эксперименты были одобрены Институциональным обзорным советом Нанкинского университета китайской медицины (код протокола: 202501A018) и проведены в соответствии с Руководством Национального института здравоохранения (NIH) по уходу и использованию лабораторных животных. Все экспериментальные процедуры соответствовали рекомендациям ARRIVE.
Экспериментальные препараты
Раствор образца YQHXD содержал 20 г корня Astragalus membranaceus , 20 г корня Angelica sinensis , 15 г корневища Ligusticum chuanxiong , 6 г корня Stephania tetrandra , 15 г плода Chaenomeles speciosa и 10 г зрелых семян Sinapis alba , с общей массой сырого препарата 86 г на рецепт. Все травяные материалы были аутентифицированы согласно Китайской фармакопее (издание 2020 года) кафедрой фармации больницы Жуйкан, аффилированной с Гуансийским университетом китайской медицины. Раствор образца YQHXD был приготовлен методом водного наваривания. Была добавлена стерильная дистиллированная вода в 8 раз больше общего объёма сырого препарата, а травы замачивались 30 минут, пока не полностью погрузились. Затем смесь кипятили и отварили на низком огне в течение 30 минут перед фильтрацией. Остатки снова извлекали с тем же объёмом стерильной дистиллированной воды по той же процедуре. Фильтраты из двух экстракций были объединены и концентрированы до 55,5 мл под пониженным давлением с помощью ротационного испарения для получения раствора YQHXD. Исходя из общего массы сырого препарата, итоговая концентрация сырого препарата составляла 1,55 г/мл с выходом экстракции примерно 64,5%. Дозировка, введённая экспериментальным крысам, была преобразована из клинической взрослой дозы с помощью метода нормализации поверхности тела. Коэффициент преобразования между людьми и крысами составлял примерно 6,3; Поэтому дозировка крыс (мг/кг) была рассчитана как человеческая доза (мг/кг) × 6,3. Группа с высокими дозами получила 15,48 г/кг/сутки в качестве эталонной дозы, а средняя и низкая дозы — 7,74 г/кг/сутки и 3,87 г/кг/день соответственно. Для объёма гаважа 10 мл/кг соответствующие рабочие концентрации составляли 1,548, 0,774 и 0,387 г/мл для групп с высокими, средними и низкими дозами соответственно. Бульонный раствор разбавлялся соответствующим образом для достижения целевой дозы для каждой экспериментальной группы перед введением. После приготовления навари охлаждались, алицитировали в стерильных условиях и хранили при −40 °C до использования.
Сетевой фармакологический анализ
Прогнозирование белков-мишень активного ингредиента
24 ноября 2025 года активные соединения были извлечены из базы данных TCMSP с использованием поисковых запросов «Huangqi, Angelica, Chuanxiong, Stephania, Mugua и Jiezi». Соединения проводились скрининг на основе пероральной биодоступности (OB ≥ 30%) и подобия препарата (DL ≥ 0,18)9. Обоснование этих порогов такова: база данных TCMSP интегрирует соединенные данные из авторитетных источников, таких как PubChem, ChEMBL и ChemSpider, и предоставляет параметры, связанные с ADME, включая пероральную биодоступность. Пероральная биодоступность — это доля перорально введённой дозы, которая достигает системного кровообращения без изменений, и высокий уровень OB необходим для идентификации биоактивных молекул. Похожесть на лекарства — это индикатор, используемый для оценки лекарственности соединений и прогнозирования их растворимости и стабильности. В этом исследовании был применён более строгий порог OB (≥30%), превышающий рекомендуемое по базе данных значение (≥20%), для выявления кандидатов с благоприятным пероральным всасыванием и фармакокинетическими профилями. В то же время DL использовался для оценки потенциала соединений, похожих на лекарственные средства, и был установлен порог DL ≥ 0,18 на основе среднего значения DL, наблюдаемого в соединениях традиционной китайской медицины. Выбранные активные соединения были извлечены в формате SMILES из базы данных PubChem и импортированы в базу данных SwissTargetPrediction для прогнозирования цели, при этом вид был установлен как Homo sapiens. Целевые белки стандартизировались с использованием официальных символов генов, и сохранялись только мишени с вероятностными значениями выше 0 для повышения надёжности предсказания. Соединения без предсказанных целей были исключены из последующего анализа сетей. После объединения всех целей дублирующиеся записи удалялись с помощью программного обеспечения для создания таблиц, чтобы каждая цель была представлена только один раз в итоговом наборе данных.
Сбор ключевых целей
Гены, связанные с заболеваниями, были извлечены из баз данных GeneCards10, OMIM11 и TTD12 с использованием ключевого слова «дегенерация поясничного диска». Собранные генные мишени объединялись, а дублирующиеся записи удалялись для получения окончательного набора мишеней, связанных с болезнью.
Возможные цели YQHXD для лечения LDD
Платформа Venny 2.1.0 использовалась для определения потенциальных целей YQHXD в LDD. Затем была создана сеть, показывающая ассоциации между активными компонентами и их предсказанными целями. Основные активные компоненты выбирались в зависимости от их степеней в сети.
Построение сетей компонентов лекарств и целей пересечения заболеваний
Активные ингредиенты, белки-мишени и гены, связанные с LDD, из формулы ТКМ YQHXD были импортированы в программное обеспечениеCytoscape 13 для построения схемы сети компонент-медикамент-мишень-заболевание.
Создание сети PPI и определение ключевых основных целей
Пересекающиеся мишени были отправлены на платформу STRING14 для анализа, при этом организм был установлен в Homo sapiens. Для построения сети взаимодействия белков и белков (PPI) порог оценки взаимодействия был установлен на уровне >0,4, отключённые узлы были скрыты, а все остальные настройки остались по умолчанию. Полученные данные импортировались в программное обеспечение, где инструмент NetworkAnalyzer использовался для оценки топологических свойств и расчёта степеней узлов. Пять лучших узлов, ранжированных по степени, были определены как ключевые цели хаба.
Анализ обогащения основных целей
Пересекающиеся мишени были загружены в базу данныхDAVID 15 для функциональной аннотации генной онтологии (GO) и анализа обогащения путей Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG). Фон организма был установлен как Homo sapiens, а порог обогащения определялся согласно стандартным параметрам DAVID, включая порог EASE < 0,1 и порог подсчёта ≥ 2. Генная вселенная была основана на стандартном фоне целого генома, предоставленном DAVID. Многократное тестирование корректировалось с помощью метода Бенджамини-Хохберга для контроля частоты ложного обнаружения (FDR), и результаты DAVID корректировались на этой основе. Обогащённые пути были упорядочены по числу Count в убывающем порядке. Графики обогащения GO и KEGG были созданы с помощью онлайн-платформы биоинформатики.
Молекулярная стыковка
Для прогнозирования взаимодействий между ключевыми активными компонентами YQHXD и основными мишенями LDD в этом исследовании был проведён анализ молекулярного стыковки. Пять ключевых активных соединений, ранжированных по топологическим значениям сетевой степени и целевым значениям, были выбраны как лиганды, а соответствующие основные белки-мишени использовались в качестве рецепторов. Файлы Ligand SDF были извлечены из PubChem, а трёхмерные структуры целевых белков были скачаны из Protein Data Bank (PDB). Анализ стыковки проводился на платформе CB-Dock2 с использованием полностью автоматизированного протокола слепой стыковки. После загрузки белковых структур платформа автоматически удаляла гетероатомы, включая мелкие молекулы, ионы и молекулы воды, а затем восстановила отсутствующие атомы и атомы водорода. Использовался режим автоматического слепого стыковки. В этом режиме CB-Dock2 выявляет потенциальные карманы связывания поверхности белков с помощью алгоритма обнаружения полости на основе кривизны, а затем выполняет расчёты стыковки с использованием интегрированного движка AutoDockVina 16. В процессе стыковки белки рассматривались как жёсткие структуры, тогда как лиганды считались гибкими, и все параметры стыковки были установлены на стандартные значения платформы. Результаты стыковки подвергались трёхмерной визуализации и анализу взаимодействий с использованием встроенных инструментов CB-Dock217, а энергии связывания рассчитывались для оценки прогнозируемых сродств связывания между активными соединениями и целевые белки.
Симуляция молекулярной динамики
Были проведены молекулярно-динамические симуляции для целевого комплекса белок-лиганд с использованием GROMACS 2022.2. Белок был смоделирован с помощью силового поля Amber14SB, а система растворителя была представлена с помощью водной модели TIP3P. Атомные заряды лиганда рассчитывались с использованием метода AM1-BCC, реализованного в Antechamber, после чего были назначены типы атомов GAFF2. Полученные топологические файлы конвертировались в совместимый с GROMACS формат с помощью ACPYPE. Параметры ионов, согласованные с водной моделью TIP3P, были назначены на основе набора параметров Джоунга-Читама. Начальный комплекс был помещён в усечённую додекаэдрическую симуляционную коробку с расстоянием не менее 1,2 нм между поверхностью белка и краем коробки. Для растворения системы были добавлены молекулы воды TIP3P, а также введены ионы Na+ и Cl− для нейтрализации заряда системы и установления ионной прочности на уровне 0,15 М. Минимизация энергии выполнялась с помощью самого крутого алгоритма снижения до тех пор, пока максимальная сила не опустилась ниже 1000 кДж·моль−1·нм−1. Система затем была уравновешена на 100 пс под ансамблем NVT при 298 К и 1 баре. После уравновешения под ансамблем NPT была проведена симуляция производства на 100 нс с временным шагом 2 fs. Несвязанные взаимодействия решались по схеме отсечения Верле. Электростатические взаимодействия рассчитывались с использованием метода элементарной сетки Эвальда (PME), при этом для взаимодействий Ван-дер-Ваальса и Кулона использовался срез 1,2 нм. Связи, содержащие водород, были ограничены алгоритмом LINCS. Температура регулировалась термостатом Нозе-Гувер, а давление — баростатом Парринелло-Рахмана, поддерживая систему на уровне 298 К и 1 бар. Траектории сохранялись каждые 10 ps. Структурная динамика и межмолекулярные взаимодействия анализировались с использованием встроенных инструментов GROMACS, VMD и PyMOL. Свободная энергия связывания оценивалась с gmx_MMPBSA, где это было применимо.
Исследования на животных
Разведение животных
Семьдесят самцов крыс Спраг-Доули (SD) в возрасте 3–8 недель были случайным образом распределены в семь экспериментальных групп (n = 10 на группу) с использованием компьютерных случайных чисел, что гарантировало отсутствие статистически значимых различий в исходной массе тела между группами. Все животные содержались в контролируемых условиях (22 ± 1 °C, 55 ± 10% относительной влажности, 12 часов свет/тёмный цикл) с свободным доступом к корму и воде. Положения клеток рандомизировались при каждом изменении клетки, чтобы минимизировать экологическую смещенность. После недели акклиматизации крысам в модельных группах проходили каудальную пункцию IVD для вызова дегенерации. Местная инфильтрационная анестезия с бупивакаином была введена до операции для уменьшения боли. Животные тщательно наблюдались во время операции и на протяжении всего послеоперационного восстановления. Послеоперационные наблюдения включали время восстановления, восстановление спонтанной активности, потребление пищи и воды, а также изменение веса тела. Через неделю после установления модели по две крысы из каждой группы были случайным образом отобраны для послеоперационной цифровой рентгенографии (DR) и окрашивания гематоксилином и эозином (HE). Рентгенологический анализ показал снижение высоты хвостового IVD, тогда как окрашивание HE выявило заметное уменьшение нотохордальных клеток pulposus (NP) и дезорганизацию ламеллярной структуры кольцевойфиброзы 18, что подтверждает успешное создание модели. Через восемь недель после операции крыс усыпляли путём вдыхания передозировки изофлураном, а также были взяты образцы ткани хвоста и крови. После предварительной валидации для итогового анализа гистологии, ELISA, ПЦР и анализа western blot использовались три независимых образца в каждой группе, соответствующие заранее заданным критериям качества. Гистологические срезы оценивались в условиях одного слепого, при этом слайды маркировались только номерами идентификации животных. Для ELISA, ПЦР и western blot анализов при алицитировании и маркировке образцов применялось слепое кодирование, а порядок тестирования всех образцов был рандомизирован перед экспериментами. Исходные данные, включая значения поглощения, Ct и интенсивность полос, были декодированы в групповые идентичности статистиком, не участвовавшим в экспериментальной группировке или обработке выборок, и впоследствии проанализированы статистическим персоналом. Все статистические анализы проводились статистиками, не участвовавшими в экспериментальных группировках или обработке выборки. Любые побочные явления, включая инфекцию раны, расслоение, кровотечение или сильную вялость, немедленно регистрировались и оценивались. Лёгкие состояния тщательно контролировались с усиленной поддерживающей помощью. Гуманные конечные показатели применялись, если у крыс наблюдалась потеря массы тела более 20% от исходного уровня, сильную боль, не облегчаемую обезболивающими, потерю подвижности, невозможность доступа к еде или воде, инфекцию, некроз, другие тяжёлые послеоперационные осложнения, дыхательные недостатки или любые опасные для жизни состояния. В таких случаях животных гуманно усыпляли путём вдыхания передозировки изофлурана.
Экспериментальное моделирование
Крыс анестезировались вдыхаемым изофлураном и лежали на земле. Хвостовые IVD Co6/7, Co7/8 и Co8/9 находились под рентгеновским флюороскопическим управлением. Игла весом 21 G продвигалась вертикально в IVD до противоположной стороны кожи, после чего кончик иглы убирался к центру хвоста. Вторая игла служила позиционным ориентиром. Для индуцирования устойчивой дегенерации IVD иглу поворачивали на 360°, держали на месте 30 секунд, а затем удаляли. В группе Шама глубина прокола через кожу и мышцу составляла примерно 2 мм, без повреждения ИВД. В других группах игла вводилась на 5 мм к центру ИВД, избегая кровеносных сосудов. После введения иглу поворачивали на 360° и оставляли на месте на 30 секунд. Место прокола было дезинфицировано, отмечено и защищено стерильной марлей. Через неделю после моделирования рентгеновская визуализация хвостового отдела показала уменьшение высоты IVD. HE окрашивание выявило значительное снижение числа нотохордальных клеток NP и дезорганизацию структуры кольцевой ламели, что подтвердило успешное создание модели. После успешного моделирования группам, получавшим лечение ТКМ, и группе положительной контрольной (PC) группы были введены соответствующие дозы, рассчитанные на основе соотношения площади поверхности тела между людьми и крысами.
Группировка и вмешательство
В этом эксперименте было использовано 70 самцов SD крыс в возрасте от 3 до 8 недель, которые были разделены на семь групп:
(1) Контрольная группа (Ctrl): Крысы в этой группе были случайным образом распределены одновременно и при тех же условиях, что и экспериментальные группы. Их содержали в отдельных клетках в ведении для животных с уровнем SPF, с бесплатным доступом к стандартной еде и питьевой воде.
(2) Фиктивная группа: крыс были анестезиированы вдыханием изофлурана. После установления анестезии кожу хвоста дезинфицировали повидон-йодом, и крысы лежали на земле. IVD CO6/7 и Co7/8 были размещены под рентгеновским флюороскопическим управлением. Игла была продвинута примерно на 2 мм через кожу и мышцу, не повредив ИВД. Дистиллированная вода (10 мл/кг) вводилась один раз в день по гаважу в течение 8 недель.
(3) Модельная группа: крысы были анестезиированы вдыхаемым изофлураном. После установления анестезии кожу хвоста дезинфицировали повидон-йодом, и крысы лежали на земле. Под рентгеновским флюороскопическим управлением были обнаружены IVD CO6/7, Co7/8 и Co8/9. Игла 21 G продвигалась вертикально в IVD до противоположной стороны кожи, после чего кончик иглы убирался к центру хвоста.
Вторая игла использовалась в качестве позиционного ориентира. Игла поворачивалась на 360° и удерживалась на месте 30 секунд, чтобы вызвать непрерывную дегенерацию IVD перед удалением. Дистиллированная вода (10 мл/кг) ежедневно вводилась в гаваж в течение 8 недель, а восстановление крыс тщательно отслеживалось после операции.
(4) Группа ПК: Положительная контрольная группа подвергалась той же процедуре моделирования, что и модельная группа, а затем получила пероральную гаваж целекоксиба (20 мг/кг/день), приготовленный в виде суспензии в 0,5% карбоксиметилцеллюлозе натрия (CMC-Na) в течение 8 последовательных недель с объёмом гавального объёма 10 мл/кг массы тела.
(5) YQHXD низкодозовая группа [YQHXD(L)]: Моделирование проводилось как в группе Модель. Крысы получали YQHXD с концентрацией 3,87 г/кг/день в течение 8 недель, с объёмом гаваджи 10 мл/кг и рабочей концентрацией 0,387 г/мл.
(6) YQHXD среднедозированная группа [YQHXD(M)]: Моделирование проводилось как в группе Модель. Крысы получали YQHXD при 7,74 г/кг/день по гаважу в течение 8 недель, с объёмом 10 мл/кг и рабочей концентрацией 0,774 г/мл.
(7) YQHXD высокодозированная группа [YQHXD(H)]: Моделирование проводилось как в группе модели. Крысы получали YQHXD с концентрацией 15,48 г/кг/день в течение 8 недель, с объёмом гавада 10 мл/кг и рабочей концентрацией 1,548 г/мл.
Патологические изменения
Ткань хвостового IVD крысы была хирургически изолирована, и были зафиксированы изменения в IVD и окружающих мышечных тканях. Собранная ткань затем обрабатывалась в патологические срезы, а образцы готовились продольными срезами для морфологического наблюдения. Каудальный позвоночный IVD, закреплённый в формальдегиде в течение 96 часов, был быстро декальцифицирован с помощью декальцифицирующего раствора, обезвожен с помощью серии градуированных спиртов и очищен ксилолом. После вложения в парафин были подготовлены срезы по 5 мкм парафина. После депарафинизации ксилолом и обезвоживания с помощью серии спиртовых градиентов срезы окрашивались гематоксилином и эозином. Затем их обезвоживали, очистили и посадили на верх. Образцы наблюдались под оптическим микроскопом для изучения морфологических изменений структуры хвостового IVD в разных группах. Впоследствии была проведена трихромная окрашивание Массона. Срезы последовательно окрашивались раствором дихромата калия и гематоксилином по 3 минуты каждая, затем дифференцировались кислым этанолом, а затем окрашивались Picrosirius Red в течение 10 минут. После обработки фосфоронгстической кислотой в течение 10 минут секции окрашивались толуидиновым синим цветом в течение 5 минут. После обезвоживания срезы очищались ксилолом, устанавливались и обследовались под микроскопом для изучения изменений в каудальном IVD.
Обнаружение ELISA белков-мишей сыворотки
Через восемь недель после операции крыс были анестезиированы ингаляционным изофлураном, а также взята кровь из брюшной аорты. Периферические образцы крови хранились при комнатной температуре в течение 1 часа и центрифугированы при 1400 × г в течение 10 минут. Сыворотка отделялась и хранилась при −80 °C до использования. Уровни AKT1, STAT3 и Bcl-2 в сыворотке были количественно измерены с помощью ферментно-связанного иммуносорбентного анализа (ELISA). Анализы проводились в соответствии с протоколами производителей. Поглощение было измерено на 450 нм, а концентрации определялись по стандартным кривым. Диапазоны обнаружения AKT1, STAT3 и BCL-2 составляли соответственно 0,625–40 нг/мл, 31,25–1000 пг/мл и 0,16–10 нг/мл с чувствительностью 0,1 нг/мл, 10 пг/мл и 0,1 нг/мл. Все образцы сыворотки анализировались без разбавления, и все результаты попадали в соответствующие стандартные диапазоны кривых. Все образцы и стандарты анализировались в дублировании, а нормализация проводилась на основе равных объёмов сыворотки.
Обнаружение уровней экспрессии генов с помощью ПЦР
Ткани межпозвоночных дисков были рассечени из хвостовых позвонков крыс, и из каждого образца было взято примерно 20 мг. Ткани измельчались в жидком азоте и лизировали в 500 мкл неферментативного лизисного буфера в течение 15 минут. Затем была извлечена общая РНК, а её концентрация и чистота измерялись с помощью спектрофотометра. Образцы с A260/A 280 1,8–2,0 были приняты для анализа, а концентрации РНК были скорректированы до 500 нг/мкл. Обратная транскрипция проводилась согласно протоколу производителя. Количественная ПЦР (qPCR) проводилась на системе реального времени ПЦР для измерения экспрессии мРНК Akt1, Bcl-2 и Stat3 . Последовательности праймеров приведены в Таблице 1. Программа ПЦР состояла из начальной денатурации при 95 °C в течение 30 секунд, затем 40 циклов при температуре 95 °C в течение 5 с и при 60 °C в течение 30 секунд. Анализ кривой плавления проводился после усиления для подтверждения специфичности продукта. Gapdh использовался в качестве эталонного гена, и все образцы анализировались в три экземпляжа. Эффективность усиления праймеров составляла 90%–110%. Относительная экспрессия генов рассчитывалась с помощью метода 2−ΔΔCt .
Вестерн-блоттинг для уровня экспрессии белка
Общий белок был выделен из тканей хвостовых межпозвоночных дисков крыс каждой группы. Ткани лизировались в буфере RIPA с дополнением ингибиторами протеазы. Концентрация белка измерялась с помощью набора для анализа белков BCA и корректировалась до 2 мкг/мкл. Равные количества белка (15 мкг на образец) разделялись на 10% SDS-PAGE и передавались на мембраны поливинилидифторида (PVDF) при постоянном токе 300 мА в течение 90 минут с использованием системы влажного переноса. Мембраны затем блокировались 5% обезжиренным молоком в течение 1 часа при комнатной температуре и инкубировали ночью при 4 °C с первичными антителами против AKT1 (1:5 000), STAT3 (1:6 000), Bcl-2 (1:1 500) и β-актина (1:4 000). После промывания ТБСТ мембраны инкубировали вторичными антителами, конъюгированными пероксидазой хрена (HRP), при разбавлении 1:5 000 в течение 1 часа при комнатной температуре. Белковые полосы были обнаружены с помощью реагента усиленной хемилюминесценции (ECL), а изображения получены с помощью гелевой системы визуализации при идентичных условиях экспозиции. Интенсивность полос измерялась с помощью ImageJ и нормализована до β-актина для определения относительной экспрессии белков. Каждый эксперимент проводился независимо в тройном экземпляре, при этом каждый образец был взят с разных животных.
Статистика
Результаты выражаются в среднем ± стандартном отклонении (SD). Различия между группами оценивались с помощью одностороннего анализа дисперсии (ANOVA), за которым следовал пост-хок тест с наименее значимой разницей (LSD). Статистическая значимость была определена как P < 0,05.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Выводы, полученные по результатам исследования
В этом исследовании были интегрированы сетевая фармакология, молекулярное стыкингование, симуляции молекулярной динамики и эксперименты in vivo для изучения потенциальных защитных эффектов YQHXD против LDD. Результаты свидетельствуют о том, что YQHXD может действовать, по крайней мере частично, через регуляцию оси сигнализации AKT1/STAT3/BCL-2, что характеризуется снижением экспрессии STAT3 и повышением экспресси...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Сообщается, что традиционные китайские травяные препараты оказывают фармакологические эффекты, включая противовоспалительные и обезболивающиеи кровообращение. Предыдущие исследования предполагали, что отвар Сяосуй Хуахэ, предшественник YQHXD, может способствовать резорбции массивной грыжи IVD, влияя на резорбцию пульпозного ядра (NP) и всасываниеIVD 20; однако лежащие в основе молекулярные механизмы остаются неясными. В настоящем исследован...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.
Мы благодарны доктору Цзиньтао Лю из Аффилированной больницы Сучжоу ТКМ при Нанкинском университете китайской медицины в Сучжоу за помощь на всех этапах этого исследования. Эта работа была поддержана грантом Национального фонда естественных наук Китая (82474529); Лю 2024, проект Национального фонда естественных наук Китая (82374220); Цзян 2023, Фонд естественных наук провинции Цзянсу (NO). BK20250396); Проект развития традиционной китайской медицины провинции Цзянсу (NO. QN202419); Проект инноваций в области прикладных фундаментальных исследований (медицина и здравоохранение) в области науки и технологий в Сучжоу (NO). SYWD2024154); Проект развития технологий традиционной китайской медицины провинции Цзянсу (MS2022080); Третий набор ведущих специалистов в области традиционной китайской медицины в провинции Цзянсу (Su TCM Science and Education [2023] No 17); Проект повышения научных и образовательных возможностей провинции Цзянсу: проект по строительству ключевых медицинских дисциплин и медицинских лабораторий провинции Цзянсу (Suwei Science and Education [2022] No 17); Проект Фонда естественных наук провинции Цзянсу (No BK20241802); 29-й выпуск Плана развития науки и технологий Сучжоу на 2022 год (строительство новых ключевых лабораторий) (SZS2022019); Проект по повышению базовых исследовательских способностей молодых и средних учителей университетов Гуанси до Юань Чая (2024KY0300); Самофинансируемый научно-исследовательский проект Администрации традиционной китайской медицины Гуанси-Чжуанского автономного района (GXZYA20240113); Грант от университетского исследовательского проекта Гуансийского университета традиционной китайской медицины для Юань Чая (2023QN010); Грант от проекта Innovation Training Project для студентов колледжей в автономном районе Гуанси-Чжуан для Yongyuan Li (202410600022); Грант от проекта Innovation Training Project для студентов Гуансийского университета китайской медицины для Суцзе Лю (X202410600062); Грант от Инновационного учебного проекта для студентов Гуансийского университета китайской медицины для Мэнфэй Линь (S202410600084)
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,5% карбоксиметилцеллюлозы натрия (CMC-Na) | Не указано | Транспортное средство, используемое для подготовки подвески celecoxib к гавери. | |
| Игла 21 G | Не указано | Используется для проколов каудального межпозвоночного диска. | |
| 2 раза; Универсальный синий SYBR зелёный qPCR мастер-микс | Servicebio Technology Co., Ltd., Ухань | G3326 | Реагент для усиления qPCR. |
| 30% раствор геля акриламида/бис-акриламида (29:1) | Solarbio Co., Ltd. | Раствор для подготовки геля для SDS-PAGE; В оригинальной таблице материалов указано как раствор геля 30%/29:1. | |
| 3D-замороженный шлифовальный станок | Servicebio Technology Co., Ltd., Ухань | Используется для гомогенизации/измельчения тканей. | |
| 4 раза; Концентрирующий гель-буфер SDS-PAGE (pH 6.8) | Solarbio Co., Ltd. | Реагент для приготовления геля Western Blot. | |
| Кислый этанол | Не указано | Используется для дифференцировки гистологического окрашивания. | |
| ACPYPE | Проект ACPYPE | Используется для преобразования топологических файлов лиганда в формат, совместимый с GROMACS. | |
| Комплект AKT1 ELISA | Ханчжоу UpingBio Technology Co., Ltd. | SYP-R1928 | Используется для измерения уровней AKT1 в сыворотке; дальность обнаружения 0,625– 40 нг/мл. |
| Метод заряда AM1-BCC | Инструменты для переддверной камеры/АМБЕР | Используется для вычисления атомарного заряда лиганда. | |
| Силовое поле Amber14SB | Силовое поле AMBER | Силовое поле белка, используемое в моделировании молекулярной динамики. | |
| Корень Angelica sinensis | Аптека Цзяньшоу, Наньнин, Гуанси, Китай | Партия No 20250503 | Ботанический компонент YQHXD; 20 г на рецепт. |
| Безводный этанол | Tianjin Aopusheng Chemical Co., Ltd. | Используется для обработки тканей и обезвоживания. | |
| Преддверие | AMBER Tools | Используется для расчёта заряда лиганда и типирования атомов. | |
| Антитела к анти-AKT1 | Wuhan Sanying Co., Ltd. | Первичное антитело к западному блотингу; разбавление 1:5 000. | |
| Анти-Bcl-2 антитела | Wuhan Sanying Co., Ltd. | Первичное антитело к западному блотингу; разбавление 1:1 500. | |
| Анти-STAT3 антитела | Wuhan Sanying Co., Ltd. | 10253-2-AP | Первичное антитело к западному блотингу; разбавление 1:6 000. |
| Реагент APS | Beyotime/Biyuntian Co. | Реагент для полимеризации геля Western Blot. | |
| Корень мебранацеус астрагал | Аптека Цзяньшоу, Наньнин, Гуанси, Китай | Партия No 20250405 | Ботанический компонент YQHXD; 20 г на рецепт. |
| Автоклав | SANYO, Япония | Оборудование для стерилизации. | |
| Двигатель AutoDock Vina | Проект AutoDock/Vina | Стыковочный двигатель, используемый в CB-Dock2. | |
| Белковый тест BCA | Solarbio Co., Ltd. | Используется для определения концентрации белка перед западным блотингом. | |
| Комплект BCL-2 ELISA | Wuhan Fine Biotech Co., Ltd. | PMK1545 | Используется для измерения уровня Bcl-2 в сыворотке; дальность обнаружения 0.16– 10 нг/мл. |
| Бупивакаин | Не указано | Местный инфильтрационный анестетик, используемый перед операцией. | |
| CB-Dock2 | Веб-сервер CB-Dock2 | Автоматизированная слепая молекулярная стыковка. | |
| Целекоксиб | Sichuan New Ston Pharmaceutical Co., Ltd. | H20233911 | Препарат положительного контроля; 20 мг/кг в день по гаважу. |
| Плод Chaenomeles speciosa | Аптека Цзяньшоу, Наньнин, Гуанси, Китай | Партия No 231001 | Ботанический компонент YQHXD; 15 г на рецепт. |
| Цитоскейп | Консорциум Cytoscape | Версия 3.9.0 | Используется для построения и анализа сетевых диаграмм. |
| Набор хромогенных реагентов DAB (20 и более раз;) | Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | Указано в таблице существующих материалов. | |
| ДЭВИД | Национальный институт рака | Версия 6.8 | База данных для аннотации, визуализации и интегрированного обнаружения; используется для анализа обогащения GO и KEGG. |
| Решение для декальцификации | Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | Используется для декальцификации ткани хвостового позвоночника IVD. | |
| Шейкер для обесцветления | Liu Yi Biotechnology Co., Ltd., Пекин | Лабораторный шейкер. | |
| Вода DEPC | Wuhan Sanying Co., Ltd. | Работа с РНК/подготовка реагентов. | |
| Цифровая система рентгенографии | Не указано | Используется для послеоперационной радиографической валидации моделей. | |
| Дистиллированная вода | Не указано | Гаваж для транспортных средств/управления и подготовка отварного раствора YQHXD. | |
| Хемилюминесцентная подложка ECL | Компания Biosharp | Реагент для обнаружения сигнала Western Blot. | |
| Раствор для извлечения антигена ЭДТА (pH 8.0) | Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | Указано в таблице существующих материалов. | |
| Аппарат электрофореза | Не указано | Используется для электрофореза SDS-PAGE. | |
| Буфер электрофореза | Servicebio Co. | Раствор электрофореза вестерн-блот. | |
| Ледогенератор FM40 | Changliu Scientific Instruments Co., Ltd., Пекин | Ледогенератор. | |
| Формальдегид | Не указано | Фиксатив, используемый для ткани хвостового позвоночника ИВД. | |
| Типы атомов GAFF2 | AMBER Tools | Типы атомов лиганда, используемые для моделирования молекулярной динамики. | |
| Гелевая система визуализации | Tianen Scientific, Шанхай | Используется для съёмки западных блот-изображений. | |
| GeneCards | Институт науки Вейцмана | Версия 5.26 | База данных человеческих генов, используемая для извлечения мишеней, связанных с заболеваниями. |
| gmx_MMPBSA | gmx_MMPBSA проект | Используется для оценки свободной энергии связывания MM-PBSA, где это применимо. | |
| GraphPad Prism | Программное обеспечение GraphPad | Версия 8.0 | Статистическое/графическое программное обеспечение, указанное в более ранней рукописи авторов. |
| Шлифование бусин | Servicebio Technology Co., Ltd., Ухань | Используется для измельчения/гомогенизации тканей. | |
| ГРОМАКИ | Команда разработчиков GROMACS | Версия 2022.2 | Используется для моделирования молекулярной динамики. |
| Реагенты для окрашивания гематоксилина и эозина | Не указано | Используется для окрашивания ВВ хвостовых срезов IVD. | |
| Высокоскоростная центрифуга | Эппендорф, Германия | Лабораторная центрифуга. | |
| Высокоскоростная мололка для салфеток на низких температурах | Servicebio, Китай | Используется для измельчения тканей при низких температурах. | |
| Горизонтальный встряхивающий | Компания Чиринбелл | Лабораторный шейкер. | |
| Антитела, маркированные по HRP козлиные антитела | Servicebio Co. | Вторичные антитела против западного блоттинга; разбавление 1:5 000. | |
| HyperScript III RT SuperMix для qPCR с gDNA Remover | Servicebio Technology Co., Ltd., Ухань | Реагент обратной транскрипции, указанный в таблице существующих материалов. | |
| Ледогенератор | СИМАГ, Китай | Ледогенератор. | |
| ImageJ | Национальные институты здравоохранения | Используется для количественной оценки интенсивности полос западного блота. | |
| Инвертированный биологический микроскоп | Олимп, Япония | Используется для микроскопии окрашенных срезов. | |
| Изофлуран | Не указано | Ингаляционный анестетик/средство для эвтаназии. | |
| Изопропаноловый реагент | Китайская национальная фармацевтическая группа Chemical Reagent Co., Ltd. | Реагент для экстракции РНК. | |
| Параметры ионов Джонга-Читама | Не применимо | Набор параметров ионов, используемый для моделирования молекулярной динамики. | |
| Лигустикум чуаньсюн корневище | Аптека Цзяньшоу, Наньнин, Гуанси, Китай | Партия No 20250301 | Ботанический компонент YQHXD; 15 г на рецепт. |
| Жидкий азот | Не указано | Используется для измельчения тканей перед экстракцией РНК. | |
| Низкоскоростная центрифуга | Эппендорф, Германия | Используется для сепарации сыворотки и других низкоскоростных этапов центрифуга. | |
| Трихромное окрашивающее решение Массона | Не указано | Используется для массоновской окрашивания хвостовых срезов IVD. | |
| Считыватель микропластин (TECAN) | ТЕКАН, Швейцария | Используется для измерения поглощения при 450 нм; Перечислен в таблице существующих материалов. | |
| Считыватель микропластин (Thermo Fisher Scientific) | Thermo Fisher Scientific, США | Многофункциональный считыватель микропластин, указанный в таблице существующих материалов. | |
| Microsoft Excel/программное обеспечение для электронных таблиц | Microsoft | Используется для удаления дублирующихся целевых записей и управления табличными данными. | |
| Спектрофотометр NanoDrop 2000 | Thermo Fisher Scientific, США | Используется для измерения концентрации и чистоты РНК. | |
| Неферментативный лизисный буфер | Не указано | Используется для лизиса тканей перед экстракцией РНК. | |
| OMIM | Медицинская школа Университета Джонса Хопкинса | Онлайн-менделевское наследие в человеке; используется для извлечения целей, связанных с болезнью. | |
| Онлайн-платформа для биоинформатики для построения графиков | Не указано | Используется для генерации графиков GO и KEGG. | |
| Гель-полимеризационный агент PAGE | Solarbio Co., Ltd. | Реагент для приготовления геля Western Blot. | |
| Парафин | Не указано | Среда вложения для гистологических срезов. | |
| ПЦР-праймеры для Akt1, Bcl-2, Stat3 и Gapdh | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | Последовательности праймеров приведены в таблице 1. | |
| PDB | RCSB PDB | Белковый информационный банк; используется для получения трёхмерных структур целевых белков. | |
| Фосфорилированные/протеазные ингибиторы | Servicebio Co. | Добавлен в буфер RIPA для извлечения белка. | |
| Фосфотунгстическая кислота | Не указано | Используется при окрашивании Массона. | |
| Пикросирий Красный | Не указано | Используется при окрашивании Массона. | |
| Мембрана поливинилидендифторида (0,45 & mu; m) | Servicebio Co. | PVDF-мембрана, используемая для переноса западных блотов. | |
| Транспорт с положительным контролем наркотиков | Не указано | 0,5% подвеска CMC-Na для целекоксиба. | |
| Повидон-йод | Не указано | Используется для дезинфекции операционного места. | |
| Белковый маркер | Thermo Fisher Scientific, США | Маркер молекулярной массы для западного блотинга. | |
| Аппарат для переноса белков | Bio-Rad, США | Оборудование для влажного переноса для западного блотинга. | |
| Модуль переноса белков (влажный перенос) | Bio-Rad, США | Western Blot влажный трансферный модуль. | |
| PubChem | Национальный центр биотехнологической информации (NCBI) | Используется для получения файлов SMILES/SDF составных структур. | |
| Система подготовки чистой воды | Le Feng Biotechnology Co., Ltd., Шанхай | Используется для приготовления чистой воды. | |
| PyMOL | Schrö Dinger, LLC | Используется для визуализации и анализа выходов молекулярной динамики/стыковки. | |
| Система ПЦР в реальном времени qPCR | Applied Biosystems QuantStudio, США | Используется для количественного усиления ПЦР. | |
| Буфер лизиса ткани/клеток RIPA | Solarbio Co., Ltd. | Используется для полного извлечения белка. | |
| Раствор растворения РНК | Servicebio Technology Co., Ltd., Ухань | Реагент с РНК. | |
| Роторный испаритель | Не указано | Используется для концентрации комбинированных фильтратов YQHXD под пониженным давлением. | |
| Зрелые семена Sinapis alba | Аптека Цзяньшоу, Наньнин, Гуанси, Китай | Партия No 20240801 | Ботанический компонент YQHXD; 10 г на рецепт. |
| Крысы Спраг-Доули | Shanghai Slack Experimental Animal Co., Ltd. | SCXK (Шанхай) 2022-0004 | Семьдесят самцов крыс, возрастом 3 дюйма; 8 недель, используется для модели прокола хвостового диска. |
| SPSS | IBM, США | Версия 21.0 | Статистическое программное обеспечение, указанное в предыдущей рукописи авторов. |
| Набор STAT3 ELISA | Ханчжоу UpingBio Technology Co., Ltd. | SYP-R1555 | Используется для измерения уровней STAT3 в сыворотке; дальность обнаружения 31.25&nDASH; 1000 пг/мл. |
| Корень Stephania tetrandra | Аптека Цзяньшоу, Наньнин, Гуанси, Китай | Партия No 230301 | Ботанический компонент YQHXD; 6 г на рецепт. |
| Стерильная марля | Не указано | Используется для защиты места прокола после моделирования. | |
| СТРУНА | STRING Consortium | Версия 12.0 | Платформа сетей взаимодействия белка и белка. |
| SweScript All-in-One RT SuperMix для qPCR | Servicebio Technology Co., Ltd., Ухань | G3337 | Реагент обратной транскрипции, указанный в таблице существующих материалов. |
| SwissTargetPrediction | Швейцарский институт биоинформатики SIB | Используется для прогнозирования потенциальных целей соединений. | |
| Буфер TBST | Не указано | Используется для мембранной промывки во время западного протирания. | |
| TCMSP | Центр биоинформатики, Колледж наук о жизни, Northwest A& Университет F | Версия 2.3 | База данных фармакологии систем традиционной китайской медицины; используется для получения активных компонентов китайских травяных соединений. |
| Водная модель TIP3P | Не применимо | Водная модель, используемая в моделировании молекулярной динамики. | |
| Толуидин синий | Не указано | Используется при окрашивании Массона. | |
| Буфер передачи | Servicebio Co. | Буфер переноса западных блотов. | |
| Реагент TriQuick | Servicebio Technology Co., Ltd., Ухань | Реагент для экстракции РНК. | |
| Реагент Тризол | Не указано | Общий реагент для экстракции РНК, упомянутый в рукописи. | |
| TTD | Китайский университет Гонконга (IDRBLab) | База данных терапевтических целей; используется для извлечения целей, связанных с болезнью. | |
| Венни | BioinfoGP, CNB-CSIC | Версия 2.1.0 | Используется для выявления перекрывающихся целей между YQHXD и LDD. |
| Схема среза Верле | ГРОМАКИ | Схема несвязного взаимодействия, используемая в моделировании молекулярной динамики. | |
| Аппарат вертикального электрофореза | Bio-Rad, США | Используется для SDS-PAGE. | |
| VMD | Университет Иллинойса в Урбана-Шампейн | Используется для визуализации и анализа выходов молекулярной динамики. | |
| Система влажного переноса | Bio-Rad, США | Используется для переноса белка при западном блотинге. | |
| Система рентгеновской флюороскопии | Не указано | Используется для определения каудальных уровней IVD при моделировании проколов. | |
| Ксилол | Не указано | Используется для депарафинизации/очистки во время гистологии. | |
| &бета;-актин первичный антител | Wuhan Sanying Co., Ltd. | Первичные антитела для контроля нагрузки к западному блотингу; разбавление 1:4 000. |