Крупномасштабное производство внеклеточных везикул из высокоплотных 3D-клеточных культур в полых волоконных биореакторах с перфузией

Краткое содержание

Приведены инструкции по установке и использованию 3D-перфузионного полого волокнистого биореактора для производства внеклеточных везикул из MSC и других типов клеток. Этот протокол описывает метод непрерывного производства внеклеточных везикул в высоких концентрациях при контроле плотности клеток в биореакторах с полым волокном.

Аннотация

Прогресс в области исследований экзосомов затрудняется малым количеством клеток и низкой продуктивностью секретируемых экзосом в традиционной 2D-клеточной культуре. Клеточные культуры высокой плотности в полых волокнистых биореакторах (HFBR) позволяют непрерывно производить секретируемые биомолекулы и внеклеточные везикулы (EV) из большого количества клеток в течение длительного времени при высоких концентрациях в 3D-культуре. Этот протокол описывает сбор концентрированных секретируемых экзосом при поддержании оптимальной массы клетки и условиях 3D-перфузионной культуры, поддерживающих высокоплотный рост клеток в течение нескольких недель или месяцев непрерывного производства в коммерчески доступном HFBR. Система компактна, закрыта, одноразовая, может соответствовать cGMP, простая в использовании и помещается в стандартный инкубатор^CO2 . Некоторые клетки, такие как мезенхимальные стволовые клетки (MSC) и человеческие амниотические стволовые клетки (HAFSC), могут демонстрировать сниженную пролиферацию при таких условиях, что потенциально влияет на дифференцировку и фенотип со временем. Репрезентативные результаты демонстрируют типичную урожайность EV и жизнеспособность клеток на протяжении недель и более непрерывного производства. Этот метод обеспечивает воспроизводимые, высококачественные сборы электромобилей, подходящие как для исследований, так и для клинических применений.

Введение

Внеклеточные везикулы всё больше признаются за свою роль в межклеточной коммуникации и терапевтических приложениях, включая регенеративную медицину. Традиционные методы 2D-культивирования клеток трудоёмки и имеют ограниченный результат, иногда требуя сотен колб для получения достаточного количества EV для экспериментов или исследований на^{животных 1,2}. Масштабирование клинической трансляции обычно использует традиционные перемешиваемые биореакторы с использованием микроносителей или других поддержек. Эти системы по своей природе нефизиологически, неэффективны и могут иметь разные результаты. Полые волокнистые биореакторы обеспечивают трёхмерную, основанную на перфузии среду, поддерживающую культуры с высокой плотностью клеток в компактных размерах и масштабах, потенциально подходящих для клинических^{применений 3,4}.

HFBR предлагают компактную, высокоплотную систему культивирования клеток, позволяющую непрерывно производить концентрированные электромобили с меньшим трудом, временем и пространством по сравнению с традиционной^{2D-культурой 5}. Они позволяют выращивать клеточные культуры высокой плотности в компактном пространстве, поддерживая крупномасштабное производство электромобилей в любой лаборатории. HFBR культивируют большое количество клеток (1X10⁹ –1×^{10 10}) в небольшом объёме (20–60 мл) в стандартном инкубаторе_CO2 и не требуют специализированного оборудования. Эти системы позволяют непрерывно концентрировать сбор электромобилей в течение недель или месяцев, одновременно облегчая использование восстановленной сыворотки или химически определённых сред. В HFBR клетки удерживаются в малом объёме дополнительного капиллярного пространства (ECS), отделённом от рециркулирующей среды полупроницаемой полой волокнистой мембраной с определённым срезом молекулярной массы (MWCO) (рисунок 1). Мелкие молекулы, такие как глюкоза и лактат, легко пересекают волокна, в то время как крупные элементы, такие как антитела или внеклеточные везикулы, сохраняются и концентрируются в ЭКС, где их можно собирать.

Три фундаментальные характеристики отличают культуру клеток с полым волокном от любого другого метода: 1) высокое соотношение площади поверхности к объёму (200^{см 2}/мл) позволяет при живом виде сохранять плотность клеток — 1–2 × 10⁸клеток на мл. 2) Клетки связаны с пористой опорой, а не к непористой пластиковой чаше. Разделение клеток не^{требуется 3}. Срез молекулярной массы (MWCO) волокна можно контролировать. Секретируемые продукты сохраняются и концентрируются в 10–100 раз по сравнению с 2D-культурой колбы внутри ECS картриджа. Кроме того, определённые матрицы белка, такие как фибронектин или коллаген, можно легко нанести на поверхность волокна, не влияя на поток по волокнам.

HFBR обеспечивает 3D-перфузионную культурную среду, более похожую на in vivo, чем 2D-культуру⁶, и уникально снижает зависимость клеток от сывороточной поддержки и упрощает их требования к среде. Эта среда высокой плотности культуры может поддерживать различия в обработке белка по сравнению с 2D-культурой, а также сообщается о повышенной биоактивности^{EV 7,8,9}. Биореакторы с полым волокном являются «гистоцентричными»; Они пытаются имитировать тканеподобные свойства физиологии клеток in vivo ¹⁰. Две ключевые характеристики гистоцентричного биореактора: 1) высокая плотность клеток, позволяющая клеткам создавать собственную специфическую микросреду, и 2) не требуется расщепление или пассирование клеток, что позволяет взаимодействиям между клетками и трёхмерным структурам, таким как сфероиды, органически развиваться со временем. Этот метод позволяет достигать плотностей клеток, которую сложно достичь с помощью традиционных 2D-культурных систем, и способствует использованию упрощённых, безбелковых и химически определённых сред.

Любой тип клеток, который можно культивировать в колбах, можно культивировать в биореакторе с полыми волокнами. Трансформированные клеточные линии будут^{пролиферативными 11}. Ключевой параметр для мониторинга — это скорость поглощения глюкозы. Мониторинг глюкозы обеспечивает прямую оценку метаболической активности, позволяя оптимизировать время сбора и контролировать плотность^{клеток 12}. Важно контролировать массу клеток внутри картриджа, чтобы скорость поглощения глюкозы не превышала мощность системы по подаче кислорода и удалению^CO2. Это достигается просто удалением массы клеток во время сбора. MSC и HAFSC не размножаются в полом волокнистом биореакторе, а остаются в состоянии покоя. Эти клетки требуют расширения перед посевом в биореакторе. Однако после установления культуры электромобили можно собирать непрерывно в течение недель или месяцев. Фенотип MSC не меняется в течение 30 дней культуры, за исключением, возможно, экспрессии CD105, которая снижается за это время. Когда MSC из биореактора затем покрывались в колбу с сывороточной средой, экспрессия CD105 возвращалась к исходному^{уровню 13}. Экспрессия CD105 может служить маркером для 2-D vs. 3D культуры. Методы переходной трансфекции также могут использоваться для создания квази-стабильного^{трансфектанта 14}.

Примеры более живых условий культуры клеток и преимущества 3D полой культуры волокнистых клеток включают полные и равномерные посттрансляционные модификации со^{временем 15,16}, образование ворсинок в результате желудочного эпителия для культуры криптоспоридия¹⁷, 3D^{печени 18}, 3D-модель гематоэнцефалического^{барьера 19}, формирование плазмодия спорозоита²⁰ и совместное культивирование костного мозга и стволовых^{клеток 21}.

В HFBR EV имеют высокую концентрацию, с меньшим загрязнением внутриклеточными белками и фрагментами мембраны, поскольку лизис клеток ограничен. Биореакторы с полым волокном совместимы с любой средой, при условии, что в них нет компонентов с высокой молекулярной массой, которые не пересекают волокна. При необходимости эти крупные молекулы могут быть добавлены непосредственно в ECS биореактора. Предпочтительнее использовать среды с высоким содержанием глюкозы, такие как DMEM. Менее сложные, безбелковые культурные среды могут упростить очистку, снижая белковую нагрузку. Мезенхимальные стволовые клетки и стволовые клетки человеческой амниотической жидкости культивировались в стандартных базальных средах и FBS, а также в нескольких коммерчески доступных формулах MSC. HFBR может производить граммовые количества экзосом, используя готовые картриджи. Биореактор из полого волокна — это полезный метод для крупномасштабного производства экзосом в потенциальных условиях cGMP и представляет собой сдвиг парадигмы в развитии как исследований экзосом, так и клинической трансляции.

Успешное использование полого волокнистого биореактора для производства внеклеточных везикул сильно зависит от протокола. Манипуляции биореактором, плотность посева клеток, частота сбора и используемой среды могут способствовать успешному запуску биореактора. Этот протокол описывает стандартизированный метод использования полого биореактора с полым волокном для получения и сбора внеклеточных везикул из клеточных культур высокой плотности. Цель — предоставить воспроизводимый подход к сбору электромобилей, включая рекомендации по настройке системы, инокуляции клеток, обслуживанию культуры и процедурам сбора урожая. Метод предназначен для поддержки стабильного производства электромобилей для исследовательских приложений и предоставления рамки, которые могут быть адаптированы для различных типов клеток и экспериментальных целей.

Протокол

Все процедуры соответствуют стандартным рекомендациям по хорошей лабораторной практике (GLP) и практике хорошей клеточной и тканевой культуры.

ПРИМЕЧАНИЕ: Картридж предварительно собран и простерилизован гамма. Он упакован в двойной пакет, и на каждом соединении установлены люер-колпаки, поэтому он полностью герметичный и остаётся стерильным снаружи мешков. См. рисунок 2 для идентификации порта картриджа. Все этапы выполнялись при комнатной температуре в ламинарной вытяжке.

1. Подготовка и стерилизация крышки резервуара.

1. Снимите две короткие трубки из двойного пакетного патрона.
2. Прикрепите трубку к зауламкам шланга на нержавеющей стальной трубе крышки резервуара.
3. Обмотайте короткую трубку и открытые концы нержавеющей стальной трубы алюминиевой фольгой, чтобы сохранить стерильность после автоклава. Поместите собранные компоненты в автоклавный мешок.
4. Автоклав с использованием сухого цикла при 121 °C в течение 15–30 минут. Дайте крышке остыть до комнатной температуры перед использованием.

2. Прикрепить картридж из полого волокна к резервуарной бутылке

1. Перенесите 50 мл PBS из бутылки объёмом 1 л в коническую трубку на 50 мл для последующего использования.
2. Снимите крышку резервуара из мешка автоклава и снимите защитную фольгу с длинных стальных труб.
3. Снимите крышку из бутылки PBS и прикрутите крышку резервуара. Выньте картридж из внутреннего стерильного мешка.
4. Снимите алюминиевую фольгу с одной из трубок на верхней части крышки резервуара.
5. Снимите крышку люэра с одной из длинных трубок картриджа и прикрепите её к трубке резервуара на крышке. Используйте немного обратного вращения, чтобы избежать изгиба.
6. Повторяйте это для второго соединения трубок.
7. Аккуратно выжмите коричневую трубку насоса, чтобы PBS провела через систему, пока не будут удалены все воздушные пузырьки.

3. Заполнение дополнительного капиллярного пространства (ECS)

1. Втяните 20 мл PBS в стерильный шприц с помощью крупной иглой длиной не менее 1,5 дюйма; Для безопасности предпочтительно использовать тупую иглу.
2. Продезинфицируйте оба фитинга боковых портов люэра спиртом и дайте им высохнуть.
3. Прикрепите шприц, заполненный PBS, к одному боковому порту, а пустой стерильный шприц — к противоположному. Закройте оба конечных порта и откройте оба боковых порта.
4. Медленно вводите PBS в ECS, удерживая картридж под небольшим углом, чтобы минимизировать пузырьки воздуха. Пустой шприц на противоположном порте наполнится воздухом.
5. Если в ECS есть воздух, откройте правый конечный порт и заберите жидкость в пустой шприц, пока ECS не наполнится жидкостью (это затягивает PBS из резервуара, через волокна и попадает в ECS).
6. Закройте обе боковые затворные зажимы, откройте оба зажима концевого порта и проверьте поток, аккуратно сжимая трубку насоса пальцами.
7. Пустые шприцы оставьте к боковым портам в качестве крышек. Меняйте шприцы на новые каждый раз, когда они выходят из ламинарного вытяжки.

4. Покрытие волокон и инокуляция клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры покрытия волокон специфическим матричным белком и инокуляции клеток по сути одинаковы. Избыточная жидкость будет проходить через волокна и попадать в резервуар, в то время как ячейки или материал покрытия останутся снаружи волокон в ECS. Рекомендуется 1 × 10⁸ клеток для посева. Рекомендуется 100–500 мкг матриксного белка в 20 мл PBS для HFBR диаметром 4 000^{см 2} ГБС. Матричные белки, связанные с поверхностью волокна, не влияют на MWCO

1. Подготовьте раствор покрытия или ячейку в стерильной конической трубке объёмом 50 мл. 1 X 108 клеток в кондиционированной среде из расширения колбы или 100–500 мкг-матриксового белка в PBS. Объем 20 мл.
2. Извлеките 20 мл клеток или раствора покрытия в стерильный шприц с помощью иголки крупного калибра.
3. Подключите шприц с раствором к одному боковому порту, а пустой стерильный шприц — к другому.
4. Закройте оба конечных порта и откройте оба боковых порта.
5. Аккуратно перемешайте раствор, перемешивая жидкость между двумя шприцами. Оставьте половину раствора в каждом шприце. Закройте оба боковых порта.
6. Откройте правый конечный порт и ослабьте крышку резервуара на 1/4 оборота.
7. Введите раствор из одного шприца в ECS. Закройте прикреплённый боковой порт.
8. Введите раствор из другого шприца. Закройте прикреплённый боковой порт. Откройте оба концевых порта.
9. Если вы инокуляете клетки, оставьте патрон в горизонтальном положении на 30 минут при комнатной температуре, затем поверните на 180° вдоль длинной оси и оставьте ещё 30 минут.
   1. Если покрывать волокна матричным белком, оставьте на ночь при комнатной температуре.
10. Вставьте картридж в насосную систему Duet и запустите поток на 25.

5. Подготовка к урожаю (см. рисунок 2)

1. Прикрепите пустой стерильный шприц с трёхпозиционным запорным краном и стерильным фильтром к правому боковому порту.
2. Настройте трёхпозиционный запорный кран, чтобы пропускать вентиляцию через стерильный фильтр. Прикрепите второй пустой стерильный шприц к левому порту.

6. Сбор кондиционированной среды (Harvest)

1. Откройте правый порт и поддерживайте стерильный вентиляционный отток через фильтр.
2. Наклоните правый конец картриджа вверх и выведите кондиционированную среду (продукт) в левый шприц. Полностью сливайте содержимое ECS в левый шприц.
3. Закройте правый порт. Закройте левый боковой порт, вынимите шприц и соберите сбор в коническую трубку объемом 50 мл.
4. Замените шприц на левом боковом порте. Откройте левый боковой порт. Откройте правый конечный порт.
   Открутите крышку резервуара на 1/4 оборота.
5. Наклоните левый конец картриджа вверх и заполните ECS, вытягивая шприц, подключённый к левому порту. Полностью заполните ECS, пока жидкий мениск не окажется в середине боковой трубки.
6. Закройте правый конечный порт. Откройте правый порт и настройте трёхпозиционный запорный кран, чтобы он выходил через фильтр.
7. Откройте левый боковой порт. Наклоните картридж вправо и полностью спустите ECS в левый шприц.
8. Закройте левый боковой порт. Вынимите шприц и соберите собранный ECS в коническую трубку объемом 50 мл.
9. Поставьте шприц в левый боковой порт. Закройте правый порт. Откройте правый порт
10. Наклоните левую сторону картриджа вверх и заполните ECS, вытащив его левым шприцем. Полностью заполните ECS, пока жидкий мениск не окажется в середине боковой трубки.
11. Закройте левый боковой порт. Откройте левый конечный порт. Затяните крышку резервуара.
12. Проверьте системный поток, вручную сжав трубку насоса перед возвращением картриджа на насос Duet.

7. Вставьте биореактор в насосную систему.

1. Установите расход насоса на 25 на пульте управления. Картридж проще устанавливать, когда насос работает.
2. Держитесь за правый край стойки потокового пути. Вставьте трубку насоса в трубку насоса.
3. Сдвиньте основание потока в паз на базе насоса. Убедитесь, что прямоугольный регистр защёлкнулся в вырез на подставке с дорожкой потока.
4. Поместите бутылку с резервуаром в вмятину сбоку от основания насоса.
5. Тонкий шнур для питания поместится между прокладкой инкубатора. В коробке управления есть магнит для крепления её к боковой части инкубатора.

8. Следите за уровнем глюкозы

1. Используя пипетку объемом 1 мл, извлекайте образец среды объёмом 1 мл из резервуара.
2. Измеряйте концентрацию глюкозы с помощью совместимого глюкометра, нанеся небольшую каплю отобранной среды на тест-полоску прибора.

9. Расчёт скорости поглощения глюкозы

ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость поглощения глюкозы рассчитывается путём вычитания измерения глюкозы через 24 часа из первоначального измерения. Поскольку скорость зависит от объёма резервуара, умножьте падение концентрации глюкозы на объём резервуара в литрах. Например, если в резервуарной бутылке 250 мл, умножьте на 0,25 (25%). (Глюкоза1-Глюкоза2) X (резервуарная бутылка в литрах). 250 мл — это 0,25 л. Если прошло больше одного дня, разделите это на количество дней. Например: начальная глюкоза 4,5 г/л; измерять глюкозу через 24 часа: 2,7 г/л; резервуарная бутылка: 250 мл. 4,5-2,7=1,8 г 1,8X,25 (резервуарная бутылка — 0,25 л), 0,45 г потребленной глюкозы. Скорость поглощения глюкозы составляет 450 мг в день.

10. Проверка жизнеспособности

1. Соберите небольшой образец клеток с использованием протокола сбора.
2. Пластинчатые клетки помещают в термофлягу T 25 с свежей сывороткой с 10% сывороткой. Визуально оценивайте привязанность и жизнеспособность.

11. Ежедневное обслуживание картриджа и первая неделя культуры.

ПРИМЕЧАНИЕ: В течение первой недели культуры пролиферативные клетки будут расширяться до целевого показателя потребления глюкозы в 1–2 грамма глюкозы в день.

1. День 0: Инокуляция клеток, определение начальной концентрации глюкозы по формуле среды. Начальный объём резервуара: 125 мл.
2. День 1-2: Измеряйте уровень глюкозы каждый день. Когда начальный уровень глюкозы истощён на 50%, замените резервуар объёмом 125 мл свежими материалами 250 мл и уменьшите количество сыворотки до 7,5%.
3. День 3-4: Измерьте глюкозу. Когда начальная глюкоза истощена на 50%, замените резервуар объёмом 250 мл свежими материалами 500 мл и уменьшите количество сыворотки до 5%.
4. День 4-5: Измерьте глюкозу. Когда стартовый уровень глюкозы истощён на 50%, замените 500 мл на 1 л свежей среды. Уменьшите дозу сыворотки до 2,5% и при желании переходите на химически определённые среды.
5. День 6+: Измерять глюкозу, собирать ECS. Контролировать плотность клеток за счёт сбора глюкозы, чтобы усвоение глюкозы в диапазоне от 1 до 2 граммов в день.
6. Для непролиферативных клеток начинайте с 125 мл в резервуарной бутылке и меняйте среду каждые 3 дня.
7. Если потребление глюкозы значительное, увеличите резервуар до 250 мл. Удалите сыворотку из ECS на 3-4 день и замените её на базальную среду.

Результаты

Согласно этому протоколу, картридж размером 4 000^{см 2} , засеянный пролиферирующими клеточными линиями, обычно потребляет 1–2 г глюкозы в день. Это означает 1 л среды каждые 2–3 дня при использовании среды с высоким содержанием глюкозы, такой как DMEM. Клетки достигают максимальной плотности в течение недели после посева. Сбор должен начинаться через 5–7 дней или когда скорость поглощения глюкозы достигает 1 г в день, а затем проводить его ежедневно, если возможно. В течение первой недели культуры среда с сывороткой в ECS может быть заменена базальной средой без сыворотки, сохраняя сыворотку в циркулирующей среде, если необходима сыворотка. Когда скорость усвоения глюкозы достигает 1 г в день, вы легко можете перейти на редуцированную сывороточную среду или другие химически определённые среды. MSC и HAFSC потребляют глюкозу гораздо реже, чем трансформированные клеточные линии, такие как CHO, 293 или гибридомы. Формирование сфероидов типично для MSC и HAFSC, а также для других типов клеток (см. рисунок 3). Ежедневный мониторинг глюкозы обеспечивает достоверную оценку состояния культуры и метаболической активности. Стандартные, коммерчески доступные ксено-свободные носители успешно использовались вместе с MSC и HAFSC. Объёмы урожая составляют около 20 мл. Оптимальны интервалы в 24 часа между урожаями, так как концентрация электроэнергии достигает максимума после 24 часов (рисунок 4). Типичные концентрации экзосом в собранной средней средней температуре варьируются от 1 до 5 × 10¹² частиц/мл, в зависимости от типа клетки, количества посевов клеток и других факторов, и могут приводить к появлению видимых гранул после центрифугирования (см. рисунок 5). Большое количество клеток может быть засеяно и должно основываться на номере клеток, а не по площади культуры (рисунок 6).

Результаты показывают, что производство электромобилей коррелирует с метаболической активностью, измеряемой по потреблению глюкозы, что обеспечивает практический параметр для мониторинга и оптимизации эффективности культуры. Ежедневный сбор урожая с интервалом в 24 часа максимизирует концентрацию электромобилей при сохранении стабильности культуры. Эти результаты подтверждают использование мониторинга глюкозы и контролируемой частоты добычи в качестве ключевых параметров для воспроизводимого производства электромобилей в биореакторах с полым волокном.

Рисунок 1: Поперечное сечение полого волокнистого биореактора. Среда проходит через внутреннюю часть волокон, и клетки прикрепляются к их внешним слоям. Компоненты с малым молекулярным весом, такие как глюкоза и лактат, легко пересекают волокна. Секретируемые продукты, такие как электромобили, не могут пересекать волокна и становятся сильно концентрированными в области за пределами волокон, называемой экстракапиллярным пространством (ECS). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Фото патрона с идентифицированными портами и зажимами. Односторонние обратные клапаны на пути потока создают рециркуляционный поток среды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Мезенхимальные стволовые клетки, стволовые клетки человеческой амниотической жидкости, сердечные предшественники и некоторые другие типы клеток образуют сфероиды при достаточном засеянии в картридж. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Измерение концентраций электромобилей после сбора урожая с разным временным интервалом. Через 24 часа концентрация EV достигает максимальной концентрации. Оптимальный сбор происходит после 24 часов. (Данные предоставлены Паоло Невиани, EV core, Детская больница Лос-Анджелеса). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5: Недельный сбор электромобильных веществ из клеток DIFI, культивируемых в биореакторе полого волокна C2011. EV изолированы дифференциальной центрифугой. (данные предоставлены Джеффом Франклином, Университет Вандербильта)^18,19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6: Удивительно большое количество клеток может быть засеяно в полый волокнистый биореактор. MSC занимают большую роль в 2D-культуре; когда их выращивают в виде сфероидов в 3D-культуре, они занимают меньше места. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Биореакторы с полым волокном не способны разумно производить белки или антитела в действительно коммерческих количествах. Однако они обладают уникальной способностью культивировать относительно большое количество клеток при высокой плотности и выделять концентрированный продукт EV в клинически значимых масштабах. Только в последние несколько лет были признаны истинные преимущества гистоцентричного биореактора. Условия высокой плотности перфузионной культуры приводят к получению концентрированных электромобилей с использованием среды, совместимой с cGMP, в количествах, которые могут быть пригодны для исследований и потенциальных клинических применений. Один урожай с 4 000^{см 2} может содержать 5 ×^{10 12} –1 × 10¹⁴ электромобилей в объёме 10–20 мл. Эти показатели находятся в пределах диапазона, указанного в исследованиях, оценивающих дозировку^{электромобилей 22}.

Ежедневный мониторинг скорости усвоения глюкозы является важным параметром для оценки эффективности культуры и является прямым индикатором метаболизма клеток, числа клеток и здоровья. В целом предпочтительнее использовать среды с высоким содержанием глюкозы, такие как DMEM, где начальная концентрация глюкозы составляет 4,5 г/л. Среду следует заменить на свежую среду, когда глюкоза потреблена на 50%. Некоторые клетки, такие как МСК, по-видимому, потребляют глюкозу и вырабатывают лактат при концентрации глюкозы выше 3 г/л, затем переходят на потребление глутамин и вырабатывают аммиак при концентрациях ниже 3 г/л. Полное метаболическое профилирование МСК в 3D-культуре пока не проведено.

Самым важным параметром для успешной культуры биореактора является число инокуляции клеток. Минимальный номер инокуляционной ячейки для биореактора C2011 размером 4 000 см²составляет 1 ×^{10 8} ячеек. Для непролиферирующихся клеток, таких как MSC или HAFSC, предпочтительнее большее количество — до 1 × 10⁹ всего клеток. Объём резервуара должен быть пропорционален числу ячеек в картридже. 1 × 10⁸ ячеек должны использовать резервуар не больше 125 мл. 1 × 10⁹ элементов должны иметь резервуар не больше 1 л. Слишком большой резервуар может отправить клетки в фазу лага. Это характеризуется отсутствием потребления глюкозы клетками, хотя они жизнеспособны, как определяется окрашиванием Trypan Blue. В этом случае уменьшите объём резервуара или засейте больше ячеек. Для получения достаточного количества клеток для эффективной культуры биореактора могут потребоваться инокуляции нескольких клеток. Просто засейте больше ячеек поверх уже существующих в картридже. При оценке эффективности биореактора обратите внимание на размер клетки инокуля. Увеличение посева клеток в 10 раз может привести к увеличению производства электромобилей в 10 раз.

Изменения в протоколе могут включать изменения составов среды, поверхностных покрытий, номера ячеек, объёма сбора, частоты сбора или размера шприца в зависимости от типа ячейки и желаемого выхода. Непрерывная культура обеспечивает простую оптимизацию условий в реальном времени, поскольку изменения могут вноситься во время культуры, а результаты получаются в реальном^{времени 21}. Устранение неисправности должно быть сосредоточено на поддержании стерильности и контроле метаболической активности. Убедитесь, что в трубке нет засоров или изгибов, особенно вокруг затворных зажимов. Бактериальное загрязнение приведёт к быстрому потреблению глюкозы и мутности в резервуарной бутылке. Грибковое загрязнение указывается на пушистое белое скопление на левом конце картриджа, блокирующее поток. Использование системы биореактора с полым волокном требует умелого обращения и строгого соблюдения протоколов. Ключевые шаги включают посадку правильного количества клеток, поддержание стерильности во время сбора и тщательный контроль потребления глюкозы для предотвращения избыточного роста или истощения питательных веществ. Большинство клеток прикрепляются к волокнам, иногда в зависимости от белкового матрикса, покрытого фибронектином, что способствует быстрому прикреплению клеток. Некоторые клетки, такие как MSC, HAFSC и сердечные предшественники, остаются прикреплёнными к волокнам и образуют трёхмерные сфероиды.

Система HFBR поддерживает высокоплотные, химически определённые и ксеносвободные культуры большинства типов клеток, что способствует крупномасштабному производству^{электромобилей 23}. Ежедневный мониторинг глюкозы обеспечивает надёжную метрику эффективности биореактора. Закрытая система на основе перфузии совместима со стандартами cGMP, и масштабирование возможно с использованием более крупных картриджей или даже нескольких картриджей. Производство электромобилей в масштабе грам может быть возможно при оптимальных условиях. Биореактор с полым волокном обеспечивает воспроизводимую платформу для устойчивого производства и сбора электромобилей в контролируемых условиях. Изложенный здесь протокол акцентирует внимание на практических аспектах, включая установку системы, асептическое обращение и метаболический мониторинг, чтобы поддерживать стабильную работу и надёжные результаты. Могут потребоваться дальнейшие исследования для оценки характеристик и функциональных свойств электромобилей при различных условиях культуры, а также для сравнения производительности с альтернативными производственными системами.

Этот метод широко применим в исследованиях и клиническом производстве электромобилей, включая регенеративную медицину и терапевтические приложения.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Игла 16 калибров 1,5"	Stellar Scientific	SOLM-111615
Трёхходовой кран, стерильный	Cole-Parmer	UX-48523-28
Шприц с замком Люэр 20мл	Becton Dickenson	302830
Стерильная серологическая пипетка 25мл	Stellar Scientific	TC50-TAU-25
Стерильный фильтр для шприца 25 мм	Thomas Scientific	1162B74
Капсула для резервуара 38 мм	FiberCell Systems	A1006
Конические центрифужные пробирки 50 мл	Stellar Scientific	T50-101-PK
Дульбекко фосфатно-буферный раствор 500 мл	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
Стерильные салфетки для дезинфекции спиртом CVS, 480 шт	CVS Pharmacy	Item # 376560
Биореактор с полым волокном	FiberCell Systems	C2011
Гибронектин человека, 1 мг	Corning	354008