В данном исследовании изучалось, способствует ли акупотомия восстановлению хряща на модели коленного остеоартрита у кроликов. Пятьдесят кроликов были разделены на пять групп. Акупотомия проводилась еженедельно в течение 4 недель. Для изучения лежащего в основе механизма оценивали отек сустава, гистопатологию, уровни воспалительных цитокинов и маркеры, связанные с осью circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK.
Исследовательская статья
Акупотомия регулирует ось RIC8A/P38 MAPK на основе каркаса circRNA для стимуляции восстановления хряща при остеоартрите коленного сустава
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Остеоартрит коленного сустава (ОАКС) характеризуется прогрессирующей дегенерацией хряща и воспалением. В данном исследовании изучались терапевтические эффекты акупотомии на модели ОАКС у кроликов и их связь с сигнальной осью циркулярной РНК фосфодиэстеразы 4B (circPDE4B)/белка RIC8A (resistance to inhibitors of cholinesterase 8A)/p38 митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK). Пятьдесят новозеландских белых кроликов были случайным образом распределены на пять групп (n = 10 в каждой группе): контрольная группа, группа модели ОАКС, группа целекоксиба, группа акупотомии и группа имитации акупотомии. ОАКС индуцировали с помощью модифицированного метода Видемана. Начиная через 6 недель после моделирования, акупотомию проводили один раз в неделю в течение 4 недель, а целекоксиб вводили ежедневно зондом в дозе 24 mg/kg в течение 4 недель. Оценивали отек коленного сустава и гистопатологию хряща. Уровни интерлейкина-1β (IL-1β), фактора некроза опухоли-α (TNF-α) и интерлейкина-6 (IL-6) в гомогенатах тканей хряща измеряли с помощью иммуноферментного анализа. Экспрессию генов и белков, связанных с метаболизмом хряща и осью circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK, оценивали методом количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией и вестерн-блоттинга. По сравнению с группой модели ОАКС, акупотомия уменьшила отек коленного сустава, улучшила гистопатологические показатели, снизила уровни воспалительных цитокинов, подавила экспрессию матриксной металлопротеиназы-3 (MMP-3), матриксной металлопротеиназы-13 (MMP-13), RIC8A и фосфорилированной p38 MAPK, а также повысила экспрессию транскрипционного фактора SRY-box 9 (SOX9), аггрекана и относительное содержание circPDE4B. Её эффекты были сопоставимы с эффектами целекоксиба, в то время как имитация акупотомии не привела к значимому улучшению. Эти результаты указывают на то, что акупотомия облегчает воспаление и дегенерацию хряща при ОАКС у кроликов и связана с модуляцией оси circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK.
Введение
Остеоартрит коленного сустава (ОАКС) — распространенное дегенеративное заболевание суставов, характеризующееся прогрессирующей деградацией хряща, синовиальным воспалением, склерозом субхондральной кости и образованием остеофитов1,2,3. В связи с глобальным старением населения заболеваемость ОАКС продолжает расти, что делает его основной причиной нарушения функций суставов и хронической боли среди людей среднего и пожилого возраста во всем мире4,5,6. Современные методы клинического лечения сосредоточены преимущественно на симптоматическом облегчении с помощью фармакологических средств, таких как нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) и внутрисуставные инъекции кортикостероидов. Однако количество методов патогенетической терапии, способных остановить прогрессирование заболевания или стимулировать восстановление хряща, остается ограниченным7,8.
Появляющиеся данные указывают на важную регуляторную роль некодирующих РНК (нкРНК) в патогенезе и прогрессировании KOA9,10,11. Среди этих нкРНК растущее внимание привлекают кольцевые РНК (кРНК) благодаря их уникальной ковалентно замкнутой петлеобразной структуре, которая обеспечивает большую стабильность по сравнению с линейными РНК, а также их разнообразным биологическим функциям12,13. Шень и др. сообщили, что circPDE4B функционирует как молекулярный скаффолд, который регулирует устойчивость к ингибиторам сигнального пути RIC8A (резистентности к холинэстеразе 8A)/p38 митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK), влияя тем самым на метаболизм внеклеточного матрикса хондроцитов и воспалительные реакции14. Путь RIC8A/p38 MAPK играет важную роль в регуляции воспаления, катаболизма, апоптоза и старения хондроцитов, что в совокупности способствует развитию остеоартрита15.
Акупотомия представляет собой минимально инвазивный терапевтический метод, который объединяет теорию традиционной китайской медицины с современными анатомическими принципами и демонстрирует многообещающую эффективность при клиническом лечении остеоартрита коленного сустава (ОАКС)16,17. В данной технике используется специализированный инструмент — игла-нож — для устранения адгезий мягких тканей, улучшения местного кровообращения и восстановления биомеханического баланса вокруг пораженных суставов, что позволяет купировать болевой синдром и улучшить функцию сустава у пациентов с ОАКС18. Несмотря на зарегистрированные клинические преимущества, молекулярные механизмы, лежащие в основе терапевтического действия акупотомии, в частности ее потенциальное регулирование сигнальных путей, опосредованных circRNA и участвующих в репарации хряща, остаются в значительной степени неизученными.
С точки зрения механизмов, акупотомия создает локальные механические стимулы посредством релиза мягких тканей вокруг сустава. Хондроциты являются механочувствительными клетками, которые реагируют на биомеханические сигналы, а circRNA, как было показано, участвуют в реакциях механотрансдукции хондроцитов19,20. Хотя прямых доказательств связи акупотомии с регуляцией специфических для суставного хряща circRNA недостаточно, биологически вероятно, что механические сигналы, создаваемые акупотомией, могут модулировать механочувствительные circRNA, такие как circPDE4B. Эта возможность легла в основу данного исследования.
Опираясь на предыдущие данные о регуляторной роли circPDE4B в сигнальном пути RIC8A/p38 MAPK, в настоящем исследовании была использована модель остеоартрита коленного сустава (ОАКС) у кроликов, индуцированного модифицированным методом Видемана, для проверки гипотезы о том, что акупотомия способствует восстановлению хряща путем модуляции сигнального пути circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK. Акупотомия была выбрана для данного исследования вместо других методов лечения ОАКС по нескольким причинам. Во-первых, по сравнению с фармакологическими средствами, такими как нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) и целекоксиб, которые в основном обеспечивают симптоматическое облегчение и связаны с ограниченным модифицирующим болезнь действием и потенциальными долгосрочными нежелательными явлениями7,8, акупотомия предлагает нефармакологический подход, воздействующий как на локальные механические факторы, так и на биологические сигнальные пути. Во-вторых, в отличие от внутрисуставных инъекций кортикостероидов или гиалуроновой кислоты, которые требуют повторного внутрисуставного введения и сопряжены с риском инфекции и повреждения сустава, акупотомия воздействует на периартикулярные мягкие ткани и может оказывать устойчивое биомеханическое и биохимическое воздействие21. В-третьих, клинические данные показали, что акупотомия обеспечивает сопоставимые или более высокие результаты по сравнению с традиционными методами терапии в плане уменьшения боли и улучшения функции сустава у пациентов с ОАКС, а экспериментальные исследования позволили предположить, что акупотомия модулирует воспалительные реакции и метаболизм хондроцитов21,22. Однако конкретные молекулярные пути, посредством которых акупотомия оказывает хондропротективное действие, остаются недостаточно изученными, особенно в отношении сигналинга, опосредованного circRNA. Таким образом, исследование связи между акупотомией и осью circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK может дать новое понимание механизмов и обосновать применение акупотомии в качестве модифицирующего болезнь метода лечения ОАКС16,18. Основными конечными точками были отек коленного сустава, гистопатологическая дегенерация хряща (баллы по шкалам Манкина и Морана), уровни воспалительных цитокинов (интерлейкин-1β, фактор некроза опухоли-α и интерлейкин-6), экспрессия маркеров метаболизма хряща (матриксная металлопротеиназа-3, матриксная металлопротеиназа-13, SRY-box транскрипционный фактор 9 и аггрекан), а также экспрессия circPDE4B и RIC8A и фосфорилирование p38 MAPK. Акупотомия проводилась один раз в неделю в течение 4 недель в выбранных периартикулярных точках с использованием четырехэтапной техники (продольное высвобождение, поперечное разделение и иссечение узлов). Для характеристики эффектов акупотомии и изучения ее потенциальной молекулярной основы при ОАКС использовались гистопатологическая оценка, измерение уровней воспалительных цитокинов, а также анализ экспрессии генов и белков.
Протокол
Все процедуры с животными проводились в соответствии с институциональными рекомендациями по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены Комитетом по этике работы с животными Университета китайской медицины провинции Аньхуэй (номер одобрения AHUCM-rabbits-2023195). Реагенты, химикаты, программное обеспечение и инструменты, использованные в данном протоколе, перечислены в Таблице материалов.
1. Экспериментальные животные и формирование групп
Пятьдесят здоровых взрослых самцов кроликов породы новозеландский белый (возраст 6 месяцев, вес 2,0–2,5 kg) были получены из племенного хозяйства Laifu в районе Пукоу города Нанкин (лицензия на разведение животных №: SCXK (Su) 2024-0007). Все животные прошли период акклиматизации и кормления в течение 1 недели перед началом эксперимента. Согласно общепринятому процедурному соглашению, а не на основании конкретной экспериментальной гипотезы, правый коленный сустав был предназначен для оценки отека, а левый — для забора образцов хрящевой ткани. После акклиматизации кролики были случайным образом распределены по пяти группам (n = 10 в каждой группе): контрольная группа, в которой не проводилось моделирование или лечение; группа с моделью KOA, в которой остеоартрит коленного сустава (KOA) индуцировали с помощью модифицированного метода Видемана; группа целекоксиба, в которой лекарственную терапию начинали через 6 недель после моделирования; группа акупотомии, в которой лечение методом акупотомии начинали через 6 недель после моделирования; и группа ложной акупотомии, в которой через 6 недель после моделирования проводили введение иглы без выполнения разрезов или расслабления тканей.
2. Создание модели ОАКО
Все кролики, за исключением контрольной группы, были подвергнуты модифицированной процедуре Видемана для индуцирования ОАКО. За 12 ч до операции животные находились на голодном пайке. Анестезия была проведена путем внутривенного введения 3% пентобарбитала натрия в дозе 30 mg/kg через краевую вену ушной раковины. После стандартной подготовки операционного поля, дезинфекции и стерильного обкладывания был выполнен продольный разрез вдоль медиальной поверхности коленного сустава. Последовательно перерезали медиальную коллатеральную связку и переднюю крестообразную связку, после чего полностью удалили медиальный мениск. Затем разрез зашили послойно.
Для снижения риска послеоперационной инфекции пенициллин вводили внутримышечно в дозе 40,000 U/kg/day в течение 3 дней подряд. После операции кроликов возвращали в клетки, обеспечивая им неограниченную подвижность без иммобилизации суставов.
3. Имитация акупотомии (ложное лечение)
Через 6 недель после моделирования KOA кроликам в группе имитации акупотомии провели те же процедуры пальпации и разметки точек, что и при активном лечении акупотомией. Стерильную одноразовую иглу для акупотомии размером 0.35 mm × 25 mm вводили перпендикулярно через кожу в каждой отмеченной точке до достижения подкожной клетчатки. Разрезы, разделение тканей, поперечные манипуляции или другие приемы механического высвобождения не выполнялись. Иглу извлекали сразу после введения без манипуляций с тканями. Имитацию лечения проводили один раз в неделю в течение 4 последовательных недель.
4. Проведение акупотомии
Через 6 недель после моделирования KOA кроликов из группы акупотомии фиксировали на процедурном столе. Пальпировали периартикулярные ткани вокруг пораженного коленного сустава, особенно в области надколенника, а также медиальной и латеральной щелей сустава, для выявления шнуроподобных структур или твердых узелков. На основании результатов пальпации выбирали от четырех до шести точек воздействия и отмечали их на коже.
Область обработки выбрили и продезинфицировали с использованием стандартных процедур стерилизации. Стерильную одноразовую иглу для акупотомии размером 0.35 mm × 25 mm медленно вводили перпендикулярно в каждой отмеченной точке до достижения поверхности кости. Процедуру проводили в соответствии с четырехэтапной техникой акупотомии. Сначала выполняли продольный релиз, затем поперечное разделение. При обнаружении плотного узла его рассекали до тех пор, пока через иглу-нож не ощущалось отчетливое чувство освобождения ткани. После завершения процедуры иглу извлекали, каждое место введения кратковременно прижимали стерильной марлей и закрывали адгезивной повязкой. Лечение проводили один раз в неделю в течение 4 недель подряд.
5. Лечение препаратом
Через 6 недель после моделирования KOA кроликам в группе целекоксиба ежедневно в течение 4 последовательных недель вводили суспензию целекоксиба перорально (зондовым методом) в дозе 24 mg/kg. Суспензию готовили ежедневно из свежего раствора в физиологическом растворе. Сведения о поставщике и каталожные номера указаны в таблице материалов.
6. Оценка отека коленного сустава
По окончании периода вмешательства, через 10 недель после моделирования KOA, проводили оценку отека коленного сустава. Мягкую шелковую нить оборачивали вокруг наиболее отечной области правого коленного сустава, обычно на уровне плато большеберцовой кости. Нить снимали и измеряли линейкой с точностью до миллиметра; зафиксированная длина определялась как окружность колена.
Относительный коэффициент набухания рассчитывали по следующему уравнению:
7. Сбор образцов
По окончании периода вмешательства кроликов подвергали анестезии путем внутривенного введения 3% пентобарбиталя натрия в дозе 30 mg/kg через краевую вену уха. Левый коленный сустав вскрывали скальпелем с лезвием № 23 для обнажения суставных поверхностей плато большеберцовой кости и мыщелков бедренной кости. Из этих областей собирали ткань суставного хряща.
Каждый образец хряща разделяли на две части. Одну часть фиксировали в 4% параформальдегиде для гистопатологического исследования. Вторую часть помещали в криопробирки, быстро замораживали в жидком азоте и хранили при −80 °C до проведения молекулярного анализа. Сразу после завершения всех процедур по сбору тканей кроликов усыпляли путем воздушной эмболии посредством быстрой внутривенной инъекции воздуха в краевую вену уха.
Гистологическое окрашивание, а также оценка по шкалам Mankin и Moran проводились с использованием образцов хряща всех 10 кроликов в каждой группе (n = 10). Репрезентативные изображения окрашивания гематоксилином и эозином, а также сафранином O и Fast Green были отобраны от трех случайно выбранных кроликов из каждой группы. Иммуногистохимический анализ и вестерн-блоттинг проводились с использованием образцов от трех случайно выбранных кроликов из каждой группы (n = 3). Количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией и иммуноферментный анализ выполнялись с использованием образцов от шести случайно выбранных кроликов из каждой группы (n = 6). Отбор всех подгрупп осуществлялся случайным образом без предварительного знания о распределении по группам.
8. Окрашивание гематоксилином и эозином
Ткань хряща, фиксированную в 4% параформальдегиде, подвергали декальцинации в 10% растворе этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) при pH 7.4 в течение 4–6 недель. Раствор для декальцинации заменяли каждые 3 дня. После подтверждения завершения декальцинации путем прокола иглой ткань дегидратировали в серии спиртов возрастающей концентрации (70%, 80%, 90%, 95% и 100%), просветляли в ксилоле и заливали в парафин. Залитую ткань разрезали на срезы толщиной 5 µm с помощью микротома, после чего срезы переносили на предметные стекла.
Для окрашивания гематоксилином и эозином срезы нагревали при 60 °C в течение 60 мин, депарафинизировали в ксилоле (трижды по 5 мин) и последовательно регидратировали в 100%, 95%, 80% и 70% этаноле, после чего промывали дистиллированной водой. Срезы окрашивали гематоксилином в течение 5 мин, промывали под проточной водопроводной водой в течение 10 мин, дифференцировали в 1% растворе соляной кислоты в 70% этаноле в течение 2–3 с и промывали дистиллированной водой. Затем срезы окрашивали эозином в течение 2 мин, промывали дистиллированной водой, дегидратировали в 70%, 80%, 90%, 95% и 100% этаноле, просветляли в ксилоле и заключали в нейтральный раствор смолы. Проводили исследование морфологии хряща и получали репрезентативные изображения с помощью светового микроскопа.
9. Окрашивание сафранином О и быстрым зеленым (Fast Green)
Срезы хряща, залитые парафином, подвергали депарафинизации и регидратации, как описано в разделе 8. Срезы окрашивали железным гематоксилином по Вайгерту в течение 5 min, после чего промывали дистиллированной водой. Затем срезы окрашивали 0,05% раствором Fast Green в течение 3 min, коротко промывали в 1% уксусной кислоте в течение 10–15 s и окрашивали 0,1% раствором сафранина О в течение 5 min.
После окрашивания срезы подвергали быстрой дегидратации в 95% и 100% этаноле, просветляли в ксилоле и заключали в нейтральную смолу. Окрашенные срезы исследовали с помощью светового микроскопа. Интенсивность окрашивания сафранином O, отражающую содержание протеогликанов, анализировали полуколичественно с использованием программного обеспечения для анализа изображений.
10. Гистологическая оценка
Два патологоанатома, не знавшие о распределении образцов по экспериментальным группам, независимо оценивали окрашенные срезы с использованием систем оценки Мэнкина и Морана для определения степени дегенерации хряща. Перед оценкой всем срезам были присвоены случайные идентификационные коды. Информация о распределении по группам лечения не раскрывалась патологоанатомам до завершения всего процесса оценки23.
11. Иммуноферментный анализ
Замороженную ткань хряща взвешивали, смешивали с фосфатно-солевым буферным раствором при pH 7.4 и тщательно гомогенизировали на льду. Гомогенат центрифугировали при 3,000 × g в течение 20 мин при 4 °C, после чего собирали супернатант для анализа. Концентрации интерлейкина-1β (IL-1β), фактора некроза опухоли-α (TNF-α) и интерлейкина-6 (IL-6) в супернатанте ткани измеряли с помощью наборов для иммуноферментного анализа, специфичных для кролика, в соответствии с инструкциями производителя.
12. Количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией
Общую РНК экстрагировали из ткани хряща с использованием метода на основе фенола и хлороформа. Вкратце, ткань подвергали лизису в реагенте для экстракции РНК, после чего добавляли хлороформ для разделения водной и органической фаз. Водную фазу собирали, РНК осаждали изопропанолом, промывали 75% этанолом, высушивали на воздухе и растворяли в воде, обработанной диэтилпирокарбонатом. Концентрацию и чистоту РНК измеряли с помощью спектрофотометра.
Перед обратной транскрипцией остаточную геномную ДНК удаляли с помощью реагента для элиминации геномной ДНК. Затем синтезировали комплементарную ДНК с использованием набора для обратной транскрипции в соответствии с инструкциями производителя. Количественную полимеразную цепную реакцию проводили методом детекции на основе SYBR Green на системе ПЦР в реальном времени. Условия циклирования были следующими: начальная денатурация при 95 °C в течение 1 min, затем 40 циклов денатурации при 95 °C в течение 20 s, а также отжига и элонгации при 60 °C в течение 1 min. Для оценки специфичности амплификации проводили анализ кривых диссоциации.
Были измерены уровни экспрессии матриксной металлопротеиназы-3 (MMP-3), матриксной металлопротеиназы-13 (MMP-13), транскрипционного фактора SRY-box 9 (SOX9), агрекана, RIC8A и circPDE4B. В качестве внутреннего референсного гена использовали β-actin. Относительная экспрессия была рассчитана с помощью данного метода. Последовательности праймеров приведены в Таблице 1.
13. Вестерн-блот-анализ
Ткань хряща лизировали в буфере для радиоиммунопреципитационного анализа с добавлением фенилметилсульфонилфторида. Лизат центрифугировали при 12,000 × g в течение 15 мин при 4 °C, после чего супернатант собирали в качестве фракции общего белка. Концентрацию белка определяли с помощью бицинхонинового метода.
Равные количества белка (30 µg на дорожку) разделяли с помощью 10% электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и переносили на поливинилиденфторидные мембраны, предварительно активированные в метаноле. Перенос проводили при силе тока 300 mA при температуре 4 °C. Время переноса составляло: для aggrecan (250 kDa) — 90 min; для MMP-3 (60 kDa), RIC8A (59 kDa), SOX9 (56 kDa) и MMP-13 (52 kDa) — 50 min; для p38 MAPK (41 kDa) и GAPDH (36 kDa) — 40 min. Мембраны блокировали 5% раствором обезжиренного сухого молока в трис-солевом буфере с Tween 20 в течение 2 h при комнатной температуре. Затем мембраны инкубировали в течение ночи при 4 °C с первичными антителами к MMP-3 (1:2,000), MMP-13 (1:1,000), SOX9 (1:1,000), aggrecan (1:1,000), RIC8A (1:1,500), фосфорилированному p38 MAPK (1:1,000) и общему p38 MAPK (1:2,000). GAPDH (1:2,000) использовали в качестве контроля загрузки. После трех промывок трис-солевым буфером с Tween 20 (по 10 min каждая) мембраны инкубировали со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (1:20,000), в течение 1.2 h при комнатной температуре. После трех дополнительных промывок полосы белков визуализировали с использованием субстрата для усиленной хемилюминесценции и регистрировали с помощью системы документирования гелей. Интенсивность полос количественно определяли с помощью программного обеспечения ImageJ и нормализовали по GAPDH.
14. Иммуногистохимия
Срезы хряща, залитые парафином, подвергали депарафинизации и регидратации через серию спиртов decreasing concentration (три смены ксилола по 5 мин; затем этанол 100%, 95% и 80% по 3 мин каждый). Восстановление антигенов проводили путем нагревания срезов в ЭДТА-буфере (pH 9.0) в скороварке. Буфер нагревали до кипения, и после создания давления восстановление продолжали в течение 2 мин, после чего образцы охлаждали до комнатной температуры. Эндогенную пероксидазную активность блокировали 3% перекисью водорода в течение 10 мин при комнатной температуре. После промывки неспецифическое связывание блокировали сывороткой козы в течение 20 мин при комнатной температуре в темноте.
Срезы инкубировали с первичными антителами к фосфорилированной p38 MAPK (1:800) и фосфорилированному ядерному фактору kappa B (NF-κB) (1:300) в течение 60 min при 37 °C. После трехкратной промывки фосфатно-солевым буферным раствором с добавлением Tween 20 срезы инкубировали с соответствующими вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, в течение 30 min при 37 °C. После еще трех промывок для проявления цвета использовали диаминобензидин (под контролем микроскопа), затем проводили докрашивание гематоксилином (2 min), дифференцировку в 1% растворе соляной кислоты в 70% этаноле и синение в растворе карбоната лития (30 s). Затем срезы подвергали дегидратации, просветлению, заключали в среду и исследовали с помощью светового микроскопа. Оценку окрашивания проводили с использованием программного обеспечения ImageJ, а для полуколичественного анализа вычисляли интегральную оптическую плотность.
15. Статистический анализ
Данные представлены как среднее значение ± SEM. Сравнение нескольких групп проводилось с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Тьюки. Значение P < 0.05 считалось статистически значимым.
Результаты
Акупотомия уменьшает гистологические изменения в суставном хряще
Как показано на рисунках 1A,B, окружность коленного сустава и относительный коэффициент отека были значительно повышены в группе с моделью KOA по сравнению с контрольной группой. Оба показателя значительно снизились после лечения акупотомией или целекоксибом, в то время как имитация акупотомии не привела к значимому улучшению по сравнению с группой с моделью KOA.
Как показано на Рисунке 1C,D, показатель по шкале Манкина в группе с моделью KOA был значимо выше, чем в контрольной группе, и существенно снизился после лечения методом акупотомии или целекоксибом. В группе с имитацией акупотомии значимого снижения не наблюдалось. Показатель по шкале Морана продемонстрировал противоположную тенденцию.
Окрашивание гематоксилином и эозином, а также сафранином О и быстрым зеленым (Fast Green) выявило истончение и разрывы поверхности суставного хряща с локальной эрозией в группе с моделью KOA по сравнению с контрольной группой (Рисунок 1E,F). Акупотомия и целекоксиб смягчили эти патологические изменения, что проявилось в более четких контурах хряща и уменьшении структурных повреждений. Напротив, в группе с имитацией акупотомии наблюдались патологические признаки, схожие с признаками в группе с моделью KOA. Эти результаты указывают на то, что акупотомия оказала эффект, сопоставимый с действием целекоксиба, в уменьшении отека сустава и дегенерации хряща, а также в улучшении гистологических показателей в модели KOA.
Акупотомия снижает уровни воспалительных цитокинов
Как показано на рисунках 2A–C, концентрации интерлейкина-1β (IL-1β), фактора некроза опухоли-α (TNF-α) и интерлейкина-6 (IL-6) в гомогенатах хрящевой ткани были значительно выше в группе с моделью KOA, чем в контрольной группе. Лечение методом акупотомии или целекоксибом привело к значительному снижению уровней всех трех воспалительных цитокинов. Напротив, в группе с имитацией акупотомии не наблюдалось значимого снижения по сравнению с группой с моделью KOA.
Акупотомия модулирует сигнальный путь RIC8A/p38 MAPK на белковом уровне
Иммуногистохимический анализ показал, что экспрессия фосфорилированной митоген-активируемой протеинкиназы p38 (p-p38 MAPK) и фосфорилированного ядерного фактора kappa B (NF-κB) была значительно ниже в группах акупотомии и целекоксиба, чем в группе модели KOA (Рисунок 3A). Между группами ложной акупотомии и моделью KOA значимых различий не наблюдалось.
Вестерн-блот анализ показал, что уровни белков матриксной металлопротеиназы-3 (MMP-3), матриксной металлопротеиназы-13 (MMP-13), белка RIC8A (resistance to inhibitors of cholinesterase 8A) и p-p38 MAPK были значительно выше в группе модели KOA, чем в контрольной группе, в то время как уровни белков, связанных с синтезом хряща — SRY-box транскрипционного фактора 9 (SOX9) и аггрекана, были значительно ниже. По сравнению с группой модели KOA, в группах акупотомии и целекоксиба наблюдалось снижение экспрессии MMP-3, MMP-13, RIC8A и p-p38 MAPK, а также повышение экспрессии SOX9 и аггрекана. В группе имитации акупотомии паттерны экспрессии белков были схожи с паттернами группы модели KOA, и значимых изменений уровней измеряемых белков выявлено не было (Рисунок 3B–I). Эти результаты указывают на то, что эффекты акупотомии и целекоксиба при KOA были связаны с модуляцией сигнального пути RIC8A/p38 MAPK.
Акупотомия модулирует сигнальный путь RIC8A/p38 MAPK на уровне транскриптов
Как показано на рисунках 4A–G, уровни экспрессии MMP-3, MMP-13 и RIC8A были значительно выше в группе с моделью KOA, чем в контрольной группе, в то время как экспрессия SOX9 и аггрекана была значительно ниже. По сравнению с группой с моделью KOA, акупотомия и целекоксиб снижали экспрессию MMP-3, MMP-13 и RIC8A, а также повышали экспрессию SOX9 и аггрекана. В группе с имитацией акупотомии не было выявлено значимых различий в измеряемых уровнях транскриптов по сравнению с группой с моделью KOA.
Акупотомия также повысила относительную экспрессию circPDE4B, что указывает на то, что ее терапевтические эффекты были связаны с модуляцией сигнальной оси circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK и снижением воспалительной и катаболической сигнализации.
ДОСТУПНОСТЬ ДАННЫХ:
Необработанные данные, подтверждающие результаты данного исследования, включая данные ELISA, окрашивания H&E, иммуногистохимии, RT‑qPCR, окрашивания сафранином O и фаст-грин, а также данные вестерн-блоттинга, находятся в открытом доступе в репозитории Figshare по адресу https://doi.org/10.6084/m9.figshare.33090935.
Рисунок 1. Акупотомия уменьшает отек коленного сустава и дегенерацию суставного хряща у кроликов с остеоартритом коленного сустава. (A) Окружность коленного сустава. (B) Относительный коэффициент отека коленного сустава. (C) Гистологический балл по шкале Манкина. (D) Гистологический балл по шкале Морана. (E) Репрезентативные срезы суставного хряща, окрашенные гематоксилином и эозином, из контрольной группы, группы модели KOA, группы целекоксиба, группы акупотомии и группы ложной акупотомии. (F) Репрезентативные срезы из пяти экспериментальных групп, окрашенные сафранином O и Fast Green. Гистологическая оценка (по Манкину и Морану) проводилась с использованием образцов всех 10 кроликов в группе (n = 10), в то время как репрезентативные изображения окрашивания H&E и сафранином O–Fast Green были получены от 3 случайно выбранных кроликов в группе. Данные представлены как среднее значение ± SEM. Статистические сравнения проводились с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Тьюки. Горизонтальные линии указывают сравниваемые группы. P < 0.05, P < 0.01 и P < 0.001. Масштабный отрезок, 100 µm. Сокращения: KOA = остеоартрит коленного сустава; SEM = стандартная ошибка среднего. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Акупотомия снижает уровни воспалительных цитокинов у кроликов с остеоартритом коленного сустава. (A) Концентрация интерлейкина-1β. (B) Концентрация интерлейкина-6. (C) Концентрация фактора некроза опухоли-α. Концентрации цитокинов измеряли методом иммуноферментного анализа в образцах от шести кроликов в каждой группе (n = 6). Данные представлены как среднее значение ± SEM. Статистические сравнения проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Тьюки. Горизонтальные линии указывают на сравниваемые группы. P < 0.05, P < 0.01 и P < 0.001. Сокращения: IL-1β = интерлейкин-1β; IL-6 = интерлейкин-6; KOA = остеоартрит коленного сустава; SEM = стандартная ошибка среднего; TNF-α = фактор некроза опухоли-α. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот рисунок в большем размере.
Рисунок 3. Акупотомия модулирует экспрессию белков, связанных с воспалением и метаболизмом хряща, у кроликов с остеоартритом коленного сустава. (A) Репрезентативные иммуногистохимические изображения, демонстрирующие экспрессию фосфорилированного ядерного фактора kappa B и фосфорилированной p38 митоген-активируемой протеинкиназы в суставном хряще в контрольной группе, группе модели KOA, группах применения целекоксиба, акупотомии и имитации акупотомии. Масштабный отрезок, 100 µm. (B) Репрезентативные вестерн-блоттинги, демонстрирующие экспрессию SOX9, RIC8A, MMP-13, фосфорилированной p38 MAPK, общей p38 MAPK, MMP-3, аггрекана и GAPDH. (C) Денситометрический количественный анализ аггрекана, нормализованный по GAPDH. (D) Количественный анализ MMP-13, нормализованный по GAPDH. (E) Количественный анализ MMP-3, нормализованный по GAPDH. (F) Количественный анализ общей p38 MAPK, нормализованный по GAPDH. (G) Количественный анализ фосфорилированной p38 MAPK, нормализованный по GAPDH. (H) Количественный анализ SOX9, нормализованный по GAPDH. (I) Количественный анализ RIC8A, нормализованный по GAPDH. Вестерн-блот анализ проводили с использованием образцов от трех кроликов в каждой группе (n = 3). Данные представлены как среднее значение ± SEM. Статистические сравнения проводились с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Тьюки. Горизонтальные линии указывают сравниваемые группы. P < 0.05, P < 0.01 и P < 0.001. Сокращения: GAPDH = глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа; KOA = остеоартрит коленного сустава; MAPK = митоген-активируемая протеинкиназа; MMP-3 = матриксная металлопротеиназа-3; MMP-13 = матриксная металлопротеиназа-13; NF-κB = ядерный фактор kappa B; p-NF-κB = фосфорилированный ядерный фактор kappa B; p-p38 MAPK = фосфорилированная p38 MAPK; RIC8A = устойчивость к ингибиторам холинэстеразы 8A; SEM = стандартная ошибка среднего; SOX9 = транскрипционный фактор SRY-box 9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4. Акупотомия модулирует экспрессию транскриптов, связанных с метаболизмом хряща, и экспрессию circPDE4B у кроликов с остеоартритом коленного сустава. (A) Относительная экспрессия aggrecan. (B) Относительная экспрессия MMP-3. (C) Относительная экспрессия MMP-13. (D) Относительная экспрессия p38 MAPK. (E) Относительная экспрессия SOX9. (F) Относительная экспрессия circPDE4B. (G) Относительная экспрессия RIC8A. Экспрессия измерялась методом количественной обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) и была нормализована по контрольному гену. Анализ проводился с использованием образцов от шести кроликов в каждой группе (n = 6). Данные представлены как среднее значение ± SEM. Статистическое сравнение проводилось с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Тьюки. Горизонтальные линии указывают на сравниваемые группы. P < 0.05, P < 0.01 и P < 0.001. Сокращения: circPDE4B = кольцевая РНК фосфодиэстеразы 4B; KOA = остеоартрит коленного сустава; MAPK = митоген-активируемая протеинкиназа; MMP-3 = матриксная металлопротеиназа-3; MMP-13 = матриксная металлопротеиназа-13; RIC8A = устойчивость к ингибиторам холинэстеразы 8A; SEM = стандартная ошибка среднего; SOX9 = SRY-box транскрипционный фактор 9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Ген | Размер ампликона | Прямой праймер | Обратный праймер |
| （п.о. (основываясь на контексте, это может означать «базовое давление» или «базовые пары», однако без контекста аббревиатура bp обычно переводится как «п.о.» (основы) или «п.п.» (пары оснований). Если это сокращение от blood pressure — «артериальное давление»).） | （5'→3'） | （5'→3'） | |
| β-актин | 113 | CAGCCCTCCTTCATCGGTAT | GACATGACGTTGTTGGCGTA |
| ММП-3 | 108 | TGTGAGTTGAAGTGGCTCAT | CCTGTTTGAACACCCGTAAC |
| MMP-13 | 119 | GGCTCCTAGGCAAGTACAAT | GTGTACGCCCATCAGGATAA |
| SOX9 | 85 | GGAGGAAGTCGGTGAAGAAT | GCCTTGAAGATGGCGTTG |
| Агрекан | 70 | TTGATGAGTGCCTTTCAAGC | CATGTGAAAGAGTCGATGGC |
| RIC8A | 100 | ATAAACTTTCCAGAGAGGAGTTGC | TCGATGACAGAGTACTGGTTG |
| p38 MAPK | 103 | TGTTCAAGGTCTCCCACAAG | TGCAGCTCCCTTATGATCTG |
| CircPDE4B | 174 | GTCATTTTGCCGAACTCCC | CATTATCATCTGCCGTCACTG |
Таблица 1: Последовательности праймеров, использованных для количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией. В таблице приведены целевые гены, ожидаемые размеры ампликонов, а также последовательности прямого и обратного праймеров в направлении от 5′ к 3′. Сокращения: bp = пары оснований; circPDE4B = кольцевая РНК фосфодиэстеразы 4B; MAPK = митоген-активируемая протеинкиназа; MMP-3 = матриксная металлопротеиназа-3; MMP-13 = матриксная металлопротеиназа-13; RIC8A = белок устойчивости к ингибиторам холинэстеразы 8A; SOX9 = транскрипционный фактор SRY-box 9.
Обсуждение
В данном исследовании оценивалось терапевтическое воздействие акупотомии на модели коленного остеоартрита (KOA) у кроликов, а также была выявлена связь между экспрессией circPDE4B и сигнальным путем RIC8A/p38 митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK). Акупотомия способствовала уменьшению отека сустава и улучшению гистопатологических изменений, а также привела к изменению маркеров воспаления и метаболизма хрящевой ткани как на уровне транскриптов, так и на уровне белков.
Снижение уровней интерлейкина-1β, фактора некроза опухоли-α и интерлейкина-6 после проведения акупотомии согласуется с ранее описанными иммуномодулирующими эффектами этого метода21. Данные цитокины способствуют дегенерации хряща, стимулируя выработку ферментов, разрушающих матрикс, и подавляя синтез внеклеточного матрикса22,24,25. Сопутствующее снижение уровней матриксной металлопротеиназы-3 (MMP-3) и матриксной металлопротеиназы-13 (MMP-13) на уровнях транскриптов и белков дополнительно указывает на то, что акупотомия подавляет катаболическую активность, связанную с KOA.
Примечание было сделано относительно связи между вызванными акупотомией изменениями экспрессии circPDE4B и модуляцией пути RIC8A/p38 MAPK. Аномальная активация этого пути связана с воспалением, окислительным стрессом и деградацией внеклеточного матрикса. Снижение экспрессии RIC8A и фосфорилирования p38 MAPK после акупотомии позволяет предположить, что лечение может помочь восстановить сигнальный баланс в этом пути. Скоординированные изменения относительных уровней circPDE4B и маркеров, связанных с RIC8A/p38 MAPK, согласуются с гипотезой о том, что circPDE4B может функционировать как молекулярный каркас, как было предложено ранее26,27. Однако полученные данные носят корреляционный характер и не доказывают, что circPDE4B опосредует терапевтический эффект акупотомии. Для установления причинно-следственной связи необходимы исследования с потерей и усилением функции (loss- and gain-of-function studies).
Потенциальная связь между акупотомией и регуляцией circRNA является важным аспектом данного исследования. Было показано, что механическая стимуляция влияет на экспрессию circRNA в нескольких типах тканей28,29,30,31. Однако прямых доказательств связи между вызванной акупотомией механической стимуляцией и регуляцией специфических для суставного хряща circRNA остается недостаточно. Наблюдаемое изменение относительной экспрессии circPDE4B после лечения может отражать либо прямой ответ на механическую стимуляцию, либо косвенный ответ на снижение воспаления. Будущие исследования, сочетающие контролируемую механическую стимуляцию со специфическим для хондроцитов манипулированием circPDE4B, помогут разграничить эти возможности.
Акупотомия и целекоксиб продемонстрировали схожие тенденции по многим измеренным показателям, несмотря на их различные механизмы действия. Это сходство можно объяснить несколькими причинами. Во-первых, оба метода лечения могут воздействовать на общие нижележащие пути, включая ось RIC8A/p38 MAPK и сигнальный путь ядерного фактора kappa B. Во-вторых, наблюдаемые сходства могут отражать общие характеристики защиты хряща, а не эффекты, специфичные для конкретного пути. В-третьих, выбранные маркеры могут представлять собой общие конечные точки воспаления и метаболизма хряща и, следовательно, могут быть недостаточны для разграничения различных вышестоящих механизмов. Схожая эффективность не означает идентичности механизмов, но предполагает, что оба вмешательства могут влиять на общие компоненты патологической сети остеоартрита26,32,33. Непредвзятые подходы, такие как транскриптомное или протеомное профилирование, могут помочь определить специфические для конкретного лечения молекулярные сигнатуры.
Сравнимые эффекты акупотомии и целекоксиба также могут иметь клиническое значение. Акупотомия может предложить вариант нефармакологического лечения, воздействующий на периартикулярные механические факторы и позволяющий избежать некоторых побочных эффектов, связанных с длительным приемом препаратов. Однако к такой интерпретации следует подходить с осторожностью, поскольку модель на кроликах не полностью отражает всю сложность гонартроза у людей. Прежде чем данные доклинические результаты смогут стать основанием для более широкого клинического применения, необходимы дальнейшие трансляционные и клинические исследования.
Следует признать ряд ограничений. Во-первых, связь между circPDE4B и осью RIC8A/p38 MAPK не была проверена с помощью экспериментов по потере или усилению функции. Во-вторых, использование модели кролика и 4-недельный период лечения ограничивают возможность делать выводы относительно заболеваний человека и долгосрочных результатов. В-третьих, в молекулярных анализах использовались относительно небольшие подгруппы животных, что могло ограничить выявление незначительных различий между группами. В-четвертых, выбранная панель маркеров может не позволить дифференцировать специфические для конкретного метода лечения вышестоящие механизмы. Наконец, сходные ответы на акупотомию и целекоксиб требуют дальнейшего изучения, чтобы определить, действуют ли эти два вмешательства через конвергентные или независимые пути.
Заключение
Акупотомия привела к уменьшению отека суставов, снижению уровней воспалительных цитокинов, замедлению дегенерации хряща и снижению экспрессии катаболических маркеров на модели коленного остеоартрита у кроликов. Эти эффекты были связаны с изменением относительной экспрессии circPDE4B и модуляцией сигнального пути RIC8A/p38 MAPK. Поскольку полученные данные носят корреляционный характер, необходимы дальнейшие исследования механизмов для определения того, опосредует ли circPDE4B терапевтические эффекты акупотомии напрямую.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, описанную в данной статье.
Благодарности
Данная работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (грант № 81774436), Проектом по трансформации клинических медицинских исследований провинции Аньхой (грант № 202427b10020136), Научно-исследовательским проектом департамента образования провинции Аньхой (грант № 2023AH050824), Программой исследований в области здравоохранения Аньхоя (грант № AHWJ2023A30123) и Исследовательским проектом по наследованию и инновациям Ассоциации традиционной китайской медицины Аньхоя (грант № 2024ZYYXH153).
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 3% перекись водорода | Fuzhou Maixin Biotech | SP kit-A3 | Блокирует эндогенную пероксидазную активность при иммуногистохимическом анализе. |
| 4% параформальдегид | Biosharp | BL539A | Фиксирует хрящевую ткань перед декальцинацией и гистологической обработкой. |
| Уксусная кислота | Merck | A6283 | Используется для приготовления 1% раствора соляной кислоты в 70% спирте |
| Адгезивные пластыри | Zhejiang Renkang | RK-8802 | Используются после акупотомии. |
| Антитела к аггрекану | Proteintech | 13880-1-AP | Первичные антитела, используемые для детектирования аггрекана в белковых экстрактах хряща. |
| Безводный этанол | Sinopharm Chemical Reagent | 10009228 | Используется для дегидратации тканей и регидратации срезов при гистологической обработке. |
| Набор для определения концентрации белка методом BCA | Thermo Fisher Scientific | A55860 | Используется для определения концентрации белка. |
| Целекоксиб | Biochempartner | BCP02156 | Контрольный фармакологический препарат, вводимый путем перорального зондирования. |
| Центрифуга | Anhui Jiawen Instruments | JW-3021HR | Используется для очистки лизатов и гомогенатов тканей путем центрифугирования. |
| Хлороформ | Nanjing Reagent | 67-66-3 | Используется для разделения фаз при экстракции общей РНК. |
| Цитратный буфер, pH 6.0 | ZSGB-BIO | ZLI-9065 | Используется для тепловой демаскировки антигенов перед иммуногистохимическим анализом. |
| Криопробирки | NEST Biotechnology | 607001 | Используются для хранения замороженных образцов |
| Субстрат DAB | Fuzhou Maixin Biotech | Kit-5230 | Хромогенный субстрат, используемый для визуализации иммуногистохимических сигналов, меченных HRP. |
| Вода, обработанная DEPC | Generay Biotech | D1007 | Вода, свободная от РНказы, используемая для растворения РНК и процедур молекулярной биологии. |
| Одноразовая игла для акупотомии, 0.35 мм × 25 мм | Ma'anshan Bond Medical Equipment | GB3525R | Стерильная игла-нож, используемая для процедур акупотомии и ложной акупотомии. |
| EDTA | biosharp | BL617A | Используется для приготовления раствора для декальцинации тканей, содержащих хрящ. |
| Субстрат для усиленной хемолюминесценции | Thermo 340958 | 340958 | Используется для визуализации полос вестерн-блоттинга. |
| Раствор эозина | Zhuhai Beso | BA4022 | Контрастный краситель, используемый при окрашивании гематоксилином и эозином. |
| Раствор Fast Green | Solarbio | G1371 | Контрастный краситель, используемый при окрашивании Сафранином O – Fast Green. |
| Антитела к GAPDH | Zsbio | TA-08 | Используются в качестве контроля загрузки при вестерн-блоттинге, но на данный момент не указаны. |
| Система визуализации гелей | Shanghai Peiqing Technology | JS-1070P | Используется для получения хемолюминесцентных изображений вестерн-блоттинга. |
| Стеклянные предметные стекла | CITOTEST | 188105 | Используются для закрепления срезов |
| Козьи антитела против мышиного IgG, конъюгированные с HRP | ZSGB-BIO | ZB-2305 | Вторичные антитела, конъюгированные с HRP, для первичных антител мыши. |
| Козьи антитела против кроличьего IgG, конъюгированные с HRP | ZSGB-BIO | ZB-2301 | Вторичные антитела, конъюгированные с HRP, для первичных антител кролика. |
| Сыворотка козы | ZSGB-BIO | ZLI-9056 | Блокирует неспецифическое связывание антител при иммуногистохимическом анализе. |
| GraphPad Prism, версия 10 | GraphPad Software | Не применимо | Используется для статистического анализа и построения графиков. |
| Раствор гематоксилина | Zhuhai Beso | BA4041 | Ядерный краситель, используемый при окрашивании гематоксилином и эозином, а также для контрастного окрашивания при иммуногистохимическом анализе. |
| Гомогенизатор | Witeg | SGCR-5-553-722 | Гомогенизирует хрящевую ткань для ИФА и молекулярных анализов. |
| Соляная кислота | Merck | 7607 | Используется для приготовления 1% раствора соляной кислоты в 70% спирте |
| Программное обеспечение Image Lab | Bio-Rad | Не применимо | Используется для денситометрического анализа полос вестерн-блоттинга. |
| Image-Pro Plus, версия 6.0 | Media Cybernetics | Не применимо | Используется для полуколичественного анализа интенсивности окрашивания Сафранином O. |
| Изопропанол | Sinopharm Chemical Reagent | SCR40007960 | Используется для осаждения РНК при экстракции общей РНК. |
| Световой микроскоп | Olympus | CX41 | Используется для изучения и получения изображений окрашенных срезов хряща. |
| Медицинский маркер | edding | 497985 | Используется для разметки точек воздействия |
| Метанол | Shanghai Suyi | 20180427 | Используется для активации ПВДФ-мембраны |
| Микротом | Leica | RM2016 | Используется для нарезки парафинированных тканей на срезы толщиной 5 µм. |
| Антитела к MMP-13 | Bioss | bs-0575R | Первичные антитела, используемые для детектирования матриксной металлопротеиназы-13. |
| Антитела к MMP-3 | Bioss | bs-43017R | Первичные антитела, используемые для детектирования матриксной металлопротеиназы-3. |
| Нейтральная смола | Wuxi Jiangyuan | ZLI-9516 | Заключительная среда, используемая для постоянного закрепления окрашенных срезов ткани. |
| Белоновозеландские кролики (самцы, 6 месяцев, вес 2.0–2.5 кг) | Nanjing Pukou District Laifu Breeding Farm | SCXK (Su) 2024-0007 | Экспериментальные животные, используемые для моделирования остеоартрита коленного сустава и оценки лечения. |
| Лезвие скальпеля № 23 | Caisson | SCX08-100PC | Используется при сборе образцов. |
| Обезжиренное сухое молоко | Gene | 9999S | Используется в качестве блокирующего реагента. |
| Антитела к p38 MAPK | Bioss | bs-0637R | Первичные антитела, используемые для детектирования общего p38 MAPK. |
| Парафин | Thermo | 8330 | Используется для заливки тканей |
| PBS | ZSGB-BIO | ZLI-9062 | Используется для гомогенизации тканей, промывки и приготовления реагентов. |
| Пенициллин | Jilin Huamu Animal Health Products | Не применимо | Используется после операции в дозе 40 000 Ед/кг/день |
| Пентобарбитал натрия | Beijing Chemical Reagents | 61222 | Используется для анестезии (3%, 30 мг/кг). |
| Фосфатно-солевой буфер | beyotime | ST448 | Используется для гомогенизации тканей и промывки при иммуногистохимическом анализе. |
| Физиологический раствор | servicevio | G4702 | Используется для приготовления суспензии целекоксиба |
| PMSF | Beyotime | ST506 | Ингибитор протеаз, добавляемый в буфер для лизиса при экстракции белка. |
| Антитела к p-NF-κB | Santa | sc-136548 | Первичные антитела, используемые для детектирования p- NF-κB при иммуногистохимическом анализе. |
| Антитела к p-p38 MAPK | Bioss | bs-5476R | Первичные антитела, используемые для детектирования фосфорилированного p38 MAPK. |
| Набор PrimeScript RT Reagent с gDNA Eraser | TaKaRa | RR047A | Используется для удаления геномной ДНК и обратной транскрипции РНК в кДНК. |
| ПВДФ-мембрана | Millipore | IPVH00010 | Мембрана, используемая для переноса белка при вестерн-блоттинге. |
| Набор ИФА для определения IL-1β кролика | Jiyinmei | JYM0011Rb | Количественно определяет интерлейкин-1β кролика в анализируемом образце. |
| Набор ИФА для определения IL-6 кролика | Jiyinmei | JYM0006Rb | Количественно определяет интерлейкин-6 кролика в анализируемом образце. |
| Набор ИФА для определения TNF-α кролика | Jiyinmei | JYM0003Rb | Количественно определяет фактор некроза опухоли-α кролика в анализируемом образце. |
| Система ПЦР в реальном времени | Thermo Fisher Scientific | PIKOREAL 96 | Осуществляет количественную ПЦР-амплификацию на основе флуоресценции. |
| Антитела к RIC8A | Bioss | bs-11355R | Первичные антитела, используемые для детектирования RIC8A. |
| Буфер для лизиса RIPA | Beyotime | P0013B | Экстрагирует общий белок из хрящевой ткани. |
| Раствор сафранина O | Solarbio | G1371 | Окрашивает протеогликаны хряща при гистологическом окрашивании Сафранином O – Fast Green. |
| Реагенты для SDS-PAGE или готовые гели | Solarbio | S8010 | Включают процентное содержание геля или продукт. |
| Антитела к SOX9 | Bioss | bs-4177R | Первичные антитела, используемые для детектирования SOX9. |
| Спектрофотометр | Nanjing Wuyi Technology | OD1000+ | Измеряет концентрацию и чистоту РНК. |
| Стерильная марля | Zhende | V505463 | Используется для компрессии после извлечения иглы. |
| SYBR Green Master Mix | Novoprotein | E096-01B | Флуоресцентный реагент, используемый для количественной ПЦР. |
| Трис-солевой буфер | Solarbio | T8060 | Используется для приготовления промывочного и блокирующего буферов для вестерн-блоттинга. |
| Реагент TRIzol | Life Technologies | 15596018 | Фенол–гуанидиновый реагент, используемый для экстракции общей РНК. |
| Tween 20 | Solarbio | T8220 | Неионогенный детергент, добавляемый в промывочные растворы на основе Трис-солевого и фосфатно-солевого буферов. |
| Раствор железного гематоксилина по Вайгерту | Merck | 1.15973 | Используется при окрашивании Сафранином O – Fast Green. |
| Ксилол | Sinopharm Chemical Reagent | 10023428 | Используется для депарафинизации и просветления тканей. |
Ссылки
- Mobasheri A, Batt M. An update on the pathophysiology of osteoarthritis. Ann Phys Rehabil Med. 2016;59(5):333-339.
- Forestier R, et al. Prevalence of generalized osteoarthritis in a population with knee osteoarthritis. Joint Bone Spine. 2011;78(3):275-278.
- Motta F, Barone E, Sica A, Selmi C. Inflammaging and osteoarthritis. Clin Rev Allergy Immunol. 2023;64(2):222-238.
- Ghouri A, Conaghan PG. Prospects for therapies in osteoarthritis. Calcif Tissue Int. 2021;109(3):339-350.
- Roseti L, et al. Articular cartilage regeneration in osteoarthritis. Cells. 2019;8(11):1305. https://doi.org/10.3390/cells8111305
- Fujii Y, et al. Cartilage homeostasis and osteoarthritis. Int J Mol Sci. 2022;23(12):6330. https://doi.org/10.3390/ijms23126330
- Kreutzinger V, et al. Limited effects of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) on imaging outcomes in osteoarthritis: observational data from the osteoarthritis initiative (OAI). BMC Musculoskelet Disord. 2025;26. https://doi.org/10.1186/s12891-025-08245-0
- Migliore A, et al. Low dose NSAIDs and sysadoas in the management of knee osteoarthritis. Aging Clin Exp Res. 2025;37(1):121. https://doi.org/10.1007/s40520-025-03015-6
- Fu M, et al. Expression profile of long noncoding RNAs in cartilage from knee osteoarthritis patients. Osteoarthritis Cartilage. 2015;23(3):423-432.
- Jiang SD, et al. Long noncoding RNAs in osteoarthritis. Joint Bone Spine. 2017;84(5):553-556.
- Xing D, et al. Identification of long noncoding RNA associated with osteoarthritis in humans. Orthop Surg. 2014;6(4):288-293.
- Wu W, Zou J, Yang Y. Studies on the role of circRNAs in osteoarthritis. BioMed Res Int. 2021;2021:6672322. https://doi.org/10.1155/2021/6672322
- Liu X, et al. Identification and comprehensive analysis of circRNA–miRNA–mRNA regulatory networks in osteoarthritis. Front Immunol. 2022;13:1018820. https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.1018820
- Shen S, et al. circPDE4B prevents articular cartilage degeneration and promotes repair by acting as a scaffold for RIC8A and MID1. Ann Rheum Dis. 2021;80(9):1209-1219.
- Cao M, et al. A peroxiredoxin-P38 MAPK scaffold increases MAPK activity by MAP3K-independent mechanisms. Mol Cell. 2023;83(17):3140-3154.
- Lu M, et al. Promotion and mechanism of acupotomy on chondrocyte autophagy in knee osteoarthritis rabbits. Chin J Integr Med. 2024;30(9):809-817.
- Chen C, et al. Clinical effects of ultrasound-guided acupotomy in knee osteoarthritis treatment. J Vis Exp. 2024;(208):e66587. https://doi.org/10.3791/66587
- Wang Y, et al. Effect of acupotomy modulation of NLRP3/Caspase-1/GSDMD pathway on chondrocyte pyroptosis in knee osteoarthritis. J Pain Res. 2025;18:4935-4945.
- Zhang J, et al. Whole transcriptome mapping identifies an immune- and metabolism-related non-coding RNA landscape remodeled by mechanical stress in IL-1β-induced rat OA-like chondrocytes. Front Genet. 2022;13:843187. https://doi.org/10.3389/fgene.2022.843187
- Liu Q, et al. Emerging roles of circRNA related to the mechanical stress in human cartilage degradation of osteoarthritis. Mol Ther Nucleic Acids. 2017;7:223-230.
- Guo Y, et al. Acupotomy improves synovial hypoxia, synovitis and angiogenesis in KOA rabbits. J Pain Res. 2023;16:749-760.
- Ma Y, et al. Acupotomy ameliorates KOA related chondrocyte premature senescence through YAP/FOXD1 pathway. J Pain Res. 2025;18:2011-2023.
- Wang Z,et al. Electroacupuncture ameliorates cartilage damage in a rat model of knee osteoarthritis and regulates expression of miRNAs and the TLR4/NF-κB pathway, Acupuncture in Medicine. 2025, 43(2025), 164-173.
- Feng S, Cong H, Ji L. Salvianolic acid A exhibits anti-inflammatory and antiarthritic effects via inhibiting NF-κB and p38/MAPK pathways. Drug Des Devel Ther. 2020;14:1771-1778.
- Abdallah AM, et al. Pyrazole derivatives ameliorate synovial inflammation in collagen-induced arthritis mice model via targeting p38 MAPK and COX-2. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2025;398(1):819-832.
- Alaaeldin E, et al. Topical nano-vesicular spanlastics of celecoxib: enhanced anti-inflammatory effect and down-regulation of TNF-α, NF-кB and COX-2 in complete Freund's adjuvant-induced arthritis model in rats. Int J Nanomedicine. 2021;16:133-145.
- Pamudurti NR, et al. Translation of CircRNAs. Mol Cell. 2017;66(1):9-21.
- Wang Z, et al. Electroacupuncture ameliorates cartilage damage in a rat model of knee osteoarthritis and regulates expression of miRNAs and the TLR4/NF-κB pathway. Acupunct Med. 2025;43(3):164-173.
- Shen J, et al. Circular RNA sequencing reveals the molecular mechanism of the effects of acupuncture and moxibustion on endometrial receptivity in patients undergoing infertility treatment. Mol Med Rep. 2019;20(2):1623-1633. https://doi.org/10.3892/mmr.2019.10386
- Wang Y, et al. Electroacupuncture alleviates perioperative hypothalamus-pituitary-adrenal axis dysfunction via circRNA-miRNA-mRNA networks. Front Mol Neurosci. 2023;16:1152861. https://doi.org/10.3389/fnmol.2023.1152861
- Xiao X, et al. Transcription profiling of a revealed the potential molecular mechanism of Governor Vessel electroacupuncture for spinal cord injury in rats. Neurospine. 2022;19(3):757-769.
- Xu C, Gu K, Yasen Y, Hou Y. Efficacy and safety of celecoxib therapy in osteoarthritis: a meta-analysis. Medicine (Baltimore). 2016;95(20):e3585. https://doi.org/10.1097/MD.0000000000003585
- 33. Jiang D, et al. Efficacy of intra-articular injection of celecoxib in a rabbit model of osteoarthritis. Int J Mol Sci. 2010;11(10):4106-4113.