Акупунктура кожи головы в сочетании с физическими упражнениями стимулирует активацию PI3K/AKT и улучшает синаптическую пластичность у спастических крыс после инсульта

Краткое содержание

Цель данного исследования — изучить влияние акупунктуры кожи головы в сочетании с физическими упражнениями на синаптическую пластичность моторной коры в модели спастичности конечностей после инсульта у крыс и изучить связь между деятельностью путей PI3K/Akt и терапевтическими эффектами.

Аннотация

Эффективные методы лечения спастичности после инсульта (ПСС) остаются ограниченными, а механизм, с помощью которого акупунктура кожи головы в сочетании с упражнениями (SAE) облегчает ПСС, до конца не изучен. В этом исследовании изучались эффекты SAE у крыс с PSS и изучалось, регулирует ли SAE синаптическую пластичность через путь PI3K/Act. Была установлена модель крыс с окклюзией средней церебральной артерии (MCAO), и крысы были случайным образом распределены по пяти группам: Бланк, Шам, MCAO, SAE и Баклофен. Все вмешательства проводились в течение 7 дней подряд. Затем были оценены неврологические функции, объём инфаркта мозга, гистопатология, синаптическая ультраструктура и связанная экспрессия белков. По сравнению с группой MCAO, SAE улучшила неврологические дефициты, снизила гипертонию мышц, уменьшила объём инфаркта, облегчила повреждение нейронов, увеличила число синапсов и улучшила морфологию синапсов. SAE также повышает уровень нейротрофического фактора, полученного от глиальных клеток (GDNF), фосфорилированного PI3K (p-PI3K), фосфорилированного Akt (p-AKT) и синаптических белков, включая синаптический (SYN), постсинаптический плотный белок 95 (PSD-95) и белок, ассоциированный с ростом, 43 (GAP-43). Иммунофлуоресцентное окрашивание дополнительно указывало на усиление экспрессии SYN и p-Akt в моторной коре после обработки SAE. Эти данные свидетельствуют о том, что SAE может коррелировать с активацией сигналов PI3K/Akt через повышение уровня GDNF, что улучшает синаптическую пластичность и облегчает симптомы PSS. В этом исследовании изучались эффекты SAE у крыс с PSS и рассматривалась потенциальная связь между вмешательством SAE, активностью путей PI3K/Akt и синаптической пластичностью.

Введение

Церебральный инфаркт остаётся одной из ведущих причин смерти и инвалидности во всем мире. Ишемия и гипоксия повреждают нейроны, нарушают баланс возбуждения и торможения в моторных цепях и приводят к нарушениям^{моторной функции 1}. Спастичность после инсульта проявляется в увеличении мышечного тонуса и снижении подвижности суставов, что нарушает повседневную жизнь и увеличивает нагрузку на^{опекуна 2}. Хотя антиспастические препараты, такие как баклофен, могут временно облегчить симптомы, длительное применение может привести к толерантности к лекарствам и побочным эффектам, и не восстанавливает нарушенную^{нейронную функцию 3}. Традиционная моторная реабилитация также ограничена медленным началом эффекта и длительной продолжительностью лечения. Поэтому крайне необходимы более безопасные и эффективные терапевтические стратегии, а основные механизмы требуют дальнейшего изучения. Нейропластичность является центральным механизмом послеинсультного функционального восстановления и включает синаптическое ремоделирование, аксональную регенерацию и выживаемость^{нейронов 4}. После ишемического инсульта нейроны в инфарктном ядре быстро погибают, в то время как локальные воспалительные реакции усугубляют повреждение тканей в ишемической полумясти; Вместе эти процессы приводят к повреждению^{мозга 5,6}. Синаптическая пластичность, ключевой компонент нейропластичности, может быть оценена белками, связанными с синапсами, включая пресинаптические маркеры, такие как синаптофизин (SYN) и белок, ассоциированный с ростом, 43 (GAP-43), а также постсинаптический белок плотности 95 (PSD-95)^7,8,9.

Нейротрофные факторы служат молекулярной основой для синаптической пластичности. Нейротрофический фактор, полученный от глиальных клеток (GDNF), особенно важен, поскольку он способствует выживанию и восстановлению нейронов, подавляет воспаление и улучшает синаптическую^{микросреду 10}. Связываясь с рет-рецептором, GDNF может активировать сигнал PI3K/^{Akt 11}. Каскад PI3K/Akt является основным способом выживания в нервной системе, и его активация подавляет апоптоз, поддерживая синтез белка, необходимый для синаптической^{ремоделирования 12,13}. Иглоукалывание кожи головы в сочетании с упражнениями (SAE) — это интегративная стратегия реабилитации, сочетающая стимуляцию акупунктуры кожи головы с активной моторной тренировкой. Общая цель этого метода — одновременно модулировать центральную нейронную активность и способствовать восстановлению, связанному с задачами, тем самым снижая гипертонию мышц и улучшая функциональные результаты после инсульта. SAE широко используется в Китае для лечения послеинсультной спастичности (PSS). Обоснование такого комбинированного подхода заключается в том, что иглоукалывание кожи головы может модулировать возбудимость коры и перфузию мозга, тогда как физическая терапия обеспечивает моторную тренировку, зависящую от активности, способствующую функциональному восстановлению и ремоделированию синапса. По сравнению с только физической терапией, предыдущие клинические данные показали, что акупунктура кожи головы в точках кожи головы в сочетании с физической терапией дополнительно снижает спастичность конечностей и улучшает моторную функцию и повседневную деятельность у пациентов с постинсультным^{спазмом конечности 14}.

Недавний систематический обзор и мета-анализ также показали, что акупунктура с движением на коже головы или сопутствующие акупунктурные упражнения с упражнениями на коже головы обеспечивают большее улучшение спастичности, моторной функции, равновесия и повседневной деятельности по сравнению с однокомпонентными или последовательными вмешательствами, что подтверждает потенциальное преимущество параллельной нейромодуляции и моторной^{тренировки 15}. Доклинические исследования показали, что SAE или связанные с ним акупунктурные протоколы с движением кожи головы могут улучшать кровоток в мозге и снижать спастичность за счёт реактивации спинального KCC2, опосредованного рецептором 5-HT₂^{A, 16,17}. Недавнее исследование также показывает, что акупунктура способствует нейропластичности через сигнализацию PI3K/^{Akt 18}. Поэтому SAE может быть особенно удобен для экспериментальных и клинических контекстов, где модуляция послеинсультной нейропластичности, моторное восстановление и снижение спастичности являются ключевыми терапевтическими целями. Однако потенциальная связь между SAE, GDNF/PI3K/Akt и синаптической пластичностью в облегчении PSS остаётся плохо изученной. В настоящем исследовании была установлена модель PSS на крысе для оценки влияния SAE на неврологические дефициты и спастичность мышц, а также для характеристики изменений экспрессии GDNF, активности путей PI3K/Akt и белков, связанных с синаптической пластичностью, после вмешательства. Это исследование может предоставить экспериментальные доказательства для определения, является ли SAE подходящей реабилитационной стратегией для PSS, а также для уточнения её потенциального механизма действия.

Протокол

Все процедуры были утверждены Комитетом по этике животных Университета китайской медицины Чанчунь (Одобрение No 20251038) и проводились в соответствии с руководящими принципами Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE 2.0), а также Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных. Все материалы, использованные в этом исследовании, приведены в Таблице материалов.

Экспериментальные процедуры
Экспериментальные животные и группировка
Восемьдесят взрослых самцов рода Sprague–Dawley весом (220–250 г) были приобретены на ферме Hongda Animal Breeding Farm (район Куаньчэн, Чанчунь, Китай). Животные содержались в Центре экспериментальных животных Университета китайской медицины Чанчунь в контролируемых условиях 22–25 °C, относительной влажности 50–60% и 12-часовом цикле свет/тьма, с свободным доступом к корму и воде. После 1 недели акклиматизации крысы случайным образом распределялись в пустую группу (n = 12), фиктивную группу (n = 12) и модель-резервную группу (n = 56). Пустая группа была включена как нормальная, необработанная контрольная группа для получения базовых показателей поведенческой активности, гистопатологических признаков и экспрессии молекулярных маркеров у здоровых крыс. Группа Шама прошла ту же анестезию и хирургическое воздействие, что и группа MCAO, за исключением того, что артериальная окклюзия не проводилась; Поэтому эта группа служила контролем возможных эффектов анестезии и хирургических манипуляций. Включение как групп Бланка, так и Шама позволило отличить эффекты ишемического повреждения от эффектов, связанных с самой хирургической процедурой.

Модель и резервная группа прошла моделирование MCAO. Первые 3 дня после операции определялись как период индукции модели. За этот период 8 из 56 крыс умерли, что соответствует уровню смертности 14,29%, а 12 крыс были исключены из-за неудачного моделирования. Оставшиеся 36 крыс с успешным созданием модели были случайным образом распределены по группам MCAO, SAE и Baclofen, в каждой из которых было по 12 крыс. Групповые вмешательства были следующими: (I) Пустая группа: только рутинное кормление без вмешательства. (II) Фиктивная группа: хирургическое обнажение общей сонной артерии, внутренних и наружных сонных артерий, а также блуждающего нерва без перевязки или установки филамента. (III) Группа MCAO: MCAO была установлена под внутрибрюшинной анестезией с 3% пентобарбиталом натрия, без последующего лечения. (IV) Группа SAE: после успешного моделирования и валидации MCAO крысы получали акупунктуру на коже головы в сочетании с физическими упражнениями. Изофлурановая ингаляционная анестезия в концентрации 1,5–2,0% применялась только во время краткосрочного введения иглы. Тренировки на беговой дорожке начинались только после полного восстановления сознания и способности к спонтанной ходьбе. Акупунктура проводилась при GV20 и двустороннем EX-HN1. Иглы вводились на глубину 1 мм и сохранялись в течение периода тренировок на беговой дорожке. Стандартизированный 30-минутный период удержания/тренировки на беговой дорожке был определен как тренировочный период на беговой дорожке и включал 6 м/мин в течение 10 минут, затем 12 м/мин в течение 20 минут при наклоне 0°. Вмешательство проводилось один раз в день в течение 7 дней подряд. (V) Группа баклофена: после успешного моделирования и валидации MCAO крысы получали баклофен внутрижелудочным влечением в дозе 0,4 мг/кг один раз в день в течение 7 дней подряд.

Создание модели MCAO
Модель MCAO у крыс была создана с помощью модифицированного метода внутрилюминального^{филамента 19}. После 12 часов голодания и лишения воды крыс анестезировались внутрибрюшной инъекцией 3% пентобарбитала натрия и помещались в положение лежащих на спине. После дезинфекции кожи был сделан разрез шейки в средней линии, чтобы обнажить правую общую сонную артерию (CCA) и прилегающие нервы и мышцы. Была выявлена и перевязана наружная сонная артерия (ЭКА), а внутренняя сонная артерия (ИКК) выделена. Связки были размещены в проксимальных ИКА и ККА, а дистальная ККА временно зажата. Затем была проведена небольшая артериотомия в CCA проксимально от зажима. Была вставлена нейлоновая нить толщиной 0,26 мм, которая продвинулась на 18–20 мм через ИКА, чтобы закрыть начало средней церебральной артерии. Впоследствии ICA и CCA были связаны, а разрез был зашит. После операции крыс поддерживали тепло во время восстановления и получали внутрибрюшинную инъекцию пенициллина (40 000 U) для предотвращения инфекции. В группе Sham проводилась только сосудистая экспозиция без установки филамента; Закрытие ран и послеоперационный уход были идентичны тем, что и в группе MCAO. Успешное создание модели определялось как балл Зеа Лонга ≥ 2 через 3 дня после^{операции 19} и модифицированный балл по шкале Эшворта (MAS) по тонусу мышц ≥ степени 1²⁰.

Методы интервнции
Акупунктура кожи головы в сочетании с физическими упражнениями
Предыдущие исследования показывают, что у крыс MCAO неврологические дефициты достигают пика на 3-й день и остаются повышенными в течение 10 дней после операции, тогда как сопротивление периферических мышц постепенно увеличивается с 6-го по^9-21 день. Поэтому лечение началось на 3-й день после операции и продолжалось один раз в день в течение 7 дней подряд, чтобы минимизировать влияние спонтанного восстановления. Перед моделированием крысы, приписанные к группе SAE, проходили трёхдневную адаптивную тренировку на беговой дорожке со скоростью 5 м/мин в течение 10 минут^{в день 22}. Эта адаптивная тренировка использовалась для знакомства крыс с бегом на беговой дорожке и снижения вероятности борьбы, падения, отказа от бега или остановки в период формального вмешательства. Во время адаптивных тренировок и формального вмешательства аномальные события, связанные с беговой дорожкой, определялись как постоянные трудности, падение с полосы, отказ бегать более 1 минуты или остановка более 1 минуты во время тренировки на дорожке. Эти события фиксировались в экспериментальных журналах при наблюдении. Кратковременная пауза или временная остановка не приводила к исключению, если бег на беговой дорожке можно было возобновить после мягких подсказок. Данные исключались только в случае, если животное не могло завершить назначенную ежедневную тренировку на беговой дорожке из-за повторяющихся падений, постоянного отказа от бега или сильного стресса. После успешной валидации модели на 3-й день вмешательство SAE проводилось один раз в день в течение 7 последовательных дней.

На каждой сеансе лечения крыс анестезировали с дозой изофлурана 1,5–2,0%. Анестезия была прекращена сразу после введения иглы. В экспериментальной практике крысы обычно полностью приходили в сознание примерно через 1–2 минуты после отмены изофлурана. Тренировка на беговой дорожке не начиналась во время анестезии крыс. Акупунктурные точки были обнаружены опытными специалистами по акупунктуре в соответствии с Номенклатурой и локализацией общих точек акупунктуры у экспериментальных животных, выпущенной Китайской ассоциацией акупунктуры и моксибустии в 2020 году. GV20 был определен как середина линии, соединяющей передние и задние фонтанелли на центральной линии черепа. Двусторонние точки EX-HN1 располагались в 2 мм латерально от GV20. Одноразовые иглы размером 0,25 мм × 13 мм вводились вертикально на глубину 1 мм и сохранялись на протяжении всего стандартизированного 30-минутного периода тренировки на беговой дорожке. Иглы закреплялись дышащей медицинской лентой для предотвращения смещения, а проникновение в череп исключалось пальпацией для обеспечения процедурной согласованности. Положение иглы и фиксация ленты проверялись перед тренировками на беговой дорожке, во время коротких пауз при нарушении бега и сразу после завершения тренировки. Кроме того, положение иглы визуально проверялось каждые 5 минут во время тренировки на беговой дорожке, независимо от поведения животных. Смещение иглы определялось как видимое ослабление, изменение угла иглы, частичное удаление или полное смещение во время беговой дорожки. Если происходило небольшое ослабление без потери положения иглы, лента аккуратно укреплялась, пока беговая дорожка ненадолго останавливалась. Если игла была частично удалена или полностью сдвинута, игла не вводилась обратно во время сеанса; Крыса завершила оставшуюся тренировку на беговой дорожке без дополнительных манипуляций иглами, и это событие было зафиксировано в экспериментальном журнале. Животные не исключались только из-за одного случая смещения иглы, если только это не сопровождалось неспособностью пройти тренировку на беговой дорожке или признаками сильного стресса.

Стандартизированный 30-минутный период удержания игл и тренировки начинался, когда крыса начинала бегать на беговой дорожке после полного восстановления после анестезии изофлураном, и заканчивался сразу после завершения тренировки на беговой дорожке, когда иглы были удалены. Короткий период восстановления после прекращения приема изофлурана не включался в стандартизированный 30-минутный тренировочный период. Поскольку иглы вводились до восстановления, фактическое время физического пребывания в состоянии было примерно на 1–2 минуты дольше, чем 30-минутный период тренировки на беговой дорожке. Это определение применялось последовательно ко всем крысам группы SAE. Крыса считалась достаточно восстановившейся для начала тренировки на беговой дорожке, когда были выполнены следующие критерии: полное восстановление сознания, способность стоять самостоятельно, способность равномерно ходить по ровной поверхности и нормальная реакция на мягкую внешнюю стимуляцию. Эти критерии проверялись перед размещением на беговой дорожке.

Во время удержания иглы крысы выполняли упражнения на беговой дорожке при наклоне 0°: 6 м/мин в течение 10 минут, затем 12 м/мин в течение 20 минут. Электрический шок не применялся ни в один момент исследования. Если крыса переставала бегать или отказывалась бегать более чем на минуту во время формального тренировки, для стимулирования движения использовалась нежная, неаверсивная слуховая стимуляция, например, лёгкое постукивание по стенке беговой дорожки. Использование такого подсказки, а также любые сопротивления, падения, остановки, отказ бежать или смещение иглы были зафиксированы в экспериментальном журнале при наблюдении. Эти события описательно отслеживались и фиксировались в экспериментальном журнале при наблюдении. Интенсивность упражнений была полностью скорректирована на основе ранее опубликованных протоколов, сочетающих акупунктуру кожи головы с тренировкой на беговой^{дорожке 16,23}. Вмешательство SAE проводилось один раз в день в течение 7 дней подряд (рисунок 1A).

Интервенция с баклофеном
После успешной валидации модели крысы из группы баклофена получали раствор баклофена через внутрижелудочный гаваж в дозе 0,4 мг/кг. Препарат вводили один раз в день в 9:00 утра в течение 7 дней подряд.

Значение результата
Общие наблюдения
Общее состояние отслеживалось ежедневно во всех группах, включая массу тела, психическое состояние, потребление пищи и воды, а также спонтанную активность.

Неврологическая функция и оценка тонуса мышц
Неврологические дефициты и спастичность конечностей оценивались на 1, 3, 5 и 7 днях после валидации модели с использованием шкалы Зеа Лонги, модифицированной неврологической тяжести (mNSS) и модифицированной шкалы Эшворта. Все поведенческие оценки в любой момент времени проводились независимо двумя исследователями, которые не замечали распределения групп на протяжении всего периода наблюдения. Подробные критерии оценки приведены (таблицы 1–3).

Определение объёма инфаркта мозга
Объём инфаркта мозга оценивался с помощью окрашивания хлорида 2,3,5-трифенилтетразолия (TTC). Через 7 дней вмешательства по три крысы из каждой группы были случайным образом отобраны и усыплены внутрибрюшной передозировкой пентобарбитала натрия, после чего последовала быстрая обезглавливание для сбора всего мозга. Мозг сначала замораживался при −20 °C, а затем разрезали на корональные срезы толщиной 2 мм. Срезы инкубировали в растворе 2% TTC при 37 °C в течение 30 минут в темноте, затем фиксировали на ночь в 4% параформальдегиде при 4 °C. На следующий день все секции были сфотографированы цифровой камерой. Нормальная ткань мозга была окрашена в тёмно-красный цвет, тогда как инфарктированная ткань выглядела бледно-белой. Области инфаркта количественно оценивались с помощью ImageJ, а объём инфаркта выражался в процентах по формуле:

Инфарктный объём (%) = инфарктная область / общая площадь среза мозга X 100%.   (1)

Гистопатологическое исследование мозговой ткани
Окрашивание гематоксилин–эозином (HE)
Для оценки гистопатологических изменений в периинфарктной коре использовалось окрашивание гематоксилина и эозина. После 7 дней вмешательства крыс были эвтаназированы внутрибрюшной передозировкой пентобарбитала натрия. Затем была проведена быстрая транскардиальная перфузия с помощью 0,01 M фосфат-буферного физраствора (PBS) для удаления крови, после чего 250 мл холодного параформальдегида 4% (4 °C) для фиксации. Были собраны целые мозги, а периинфарктная кортикальная ткань выделена и зафиксирована в 4% параформальдегиде при 4 °C в течение 24 часов. Ткани были вложены в парафин и коронально сечени с диаметром 5 мкм. Секции монтировались на затворах, запекали при 60 °C в течение 30 минут и депарафинизировали в ксилоле I–III (по 10 минут каждая). Затем проводилось окрашивание HE, после чего следовало обезвоживание и очистка. В конце концов секции были покрыты нейтральным бальзамом, а изображения получены с помощью светового микроскопа Nikon.

Окрашивание Nissl
Окрашивание Nissl использовалось для оценки выживаемости нейронов и плотности тела Nissl в периинфарктной области. После 7 дней вмешательства крыс усыпляли и транскардиально перфузировали с температурой 0,01 M PBS (37 °C), затем 250 мл 4% параформальдегида (4 °C). Целый мозг был удалён, а периинфарктные и контралатеральные кортикальные ткани были вскрыты и фиксированы на ночь в 4% параформальдегиде при 4 °C. После вложения парафина были подготовлены срезы диаметром 5 мкм. Секции депарафинизировались в ксилоле в течение 10 минут, затем регидратированы серией сортированных растворов этанола (95%, 90%, 80%, 70% и 50%; по 5 минут на каждую концентрацию) и окрашены рабочим раствором Nissl в течение 30 минут при комнатной температуре. После короткой промывки дистиллированной водой секции были обезвожены с помощью сортируемого этанола, очищены в ксилоле в течение 2 минут и, наконец, установлены с помощью накладок. Изображения были сделаны и проанализированы под световым микроскопом.

Вестерн-блот-анализ экспрессии белка
Вестерн блоттинг проводился для оценки белков, участвующих в сигнализации PI3K/Akt и синаптической пластичности. После 7 дней вмешательства крыс были эвтаназии с помощью передозировки пентобарбитала натрия, а также собрана периинфарктная ткань моторной коры. Ткани были полностью гомогенизированы в буфере лизиса с помощью радиоиммунопреципитационного анализа (RIPA) на льду и центрифугированы при 1610 × г при 4 °C в течение 30 минут для извлечения общего белка. Концентрация белка была количественно измерена с помощью коммерческого набора для анализа белков на основе бицинхониновой кислоты (BCA). Равные количества белка (50 мкг на полосу) разделялись электрофорезом гель натрия додецилсульфата и полиакриламида (SDS-PAGE) и электрически передавались на мембраны поливинилиденфторида (PVDF). Мембраны блокировались раствором 5% бычьей сыворотки альбумина (BSA) в течение 1 часа при комнатной температуре для устранения неспецифического связывания, затем инкубировали с первичными антителами в течение ночи при 4 °C. После трёх циклов промывания физиологическим раствором с Tris-буфером и буфером Tween-20 (TBST) мембраны инкубировали с вторичным антителом (коэффициент разбавления 1:1000) в течение 1 часа при комнатной температуре. Белковые полосы визуализировались с помощью усиленной хемилюминесценции (ECL), а интенсивность полос измерялась с помощью ImageJ. Относительная экспрессия белка рассчитывалась как отношение целевого белка к внутреннему контролю. Основные антитела были следующими: GAPDH (1:1000), PI3K (1:1000), фосфо-PI3K (1:1000), Akt (1:1000), фосфо-Акт (1:1000), GAP-43 (1:1000), SYN (1:1000), PSD-95 (1:1000) и GDNF (1:1000).

Синаптическое ультраструктурное наблюдение
Для оценки числа синапсов и структурной целостности использовалась трансмиссионная электронная микроскопия (TEM). После 7 дней вмешательства крыс были анестезиированы и транскардиально перфузированы смесью фиксативного средства, содержащего 4% параформальдегида и 2,5% глутаральдегида. Периинфарктные корковые тканевые блоки (1 мм × 1 мм × 1 мм) были собраны и закреплены в 2,5% глутаральдегиде в течение 2 часа, после чего последовала постфиксация с 1% тетроксидом осмия в течение 1 часа. Образцы затем обрабатывались с помощью градированной дегидрации этанола, вложения эпоксидной смолы, ультратонкого сечения (толщиной 50 нм) и двойного окрашивания уранилацетатом и свинцовым цитратом. Синаптическая ультраструктура изучалась с помощью трансмиссионного электронного микроскопа. Изображения были получены на уровне 8 000× для структурной оценки, а синапсы — 5 000×. Для вычисления среднего числа синапсов анализировались три случайных поля нейропилов в каждой группе, а данные сравнивались с помощью одностороннего ANOVA.

Иммунофлуоресцентный двойной маркировочный анализ
Для оценки экспрессии и распределения SYN и p-Akt в периинфарктной коре было проведено двойное маркирование иммунофлюоресценцией. После 7 дней вмешательства крыс были эвтаназированы внутрибрюшной передозировкой пентобарбитала натрия, а периинфарктная кортикальная ткань была быстро расчленена. Образцы фиксировались в 4% параформальдегиде в течение 24 часа, помещались в состав с оптимальной температурой резки (OCT) и разрезались на секции толщиной 10 мкм. Секции сушились на воздухе при комнатной температуре в течение 1 часа и три раза промывались с помощью буфера TBST для удаления остатков ОКТ-соединения. Срезы были проницаемы с 0,3% Triton X-100 в течение 20 минут при комнатной температуре, затем промывались PBS и блокировали раствором BSA 5% в течение 1 часа при комнатной температуре. В тёмных условиях секции инкубировали ночью при 4 °C с первичными антителами кролика анти-SYN (разбавление 1:200) и кролика анти-p-Akt (разбавление 1:200). На следующий день срезы были три раза промыты PBS и инкубированы в темноте с вторичным антителом (разбавление 1:400) в течение 50 минут при комнатной температуре. После шести дополнительных промыв буфером TBST ядра клеток были заменены рабочим раствором 4′,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) в течение 5 минут при комнатной температуре. Изображения получались при одинаковой экспозиции и настройках фона с помощью флуоресцентного микроскопа. Репрезентативные изображения использовались для оценки паттернов экспрессии SYN и p-Akt в моторной коре по группам.

Статистический анализ
Статистический анализ проводился с использованием GraphPad Prism 10.1.2 и IBM SPSS Statistics 25. Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения (SD). Поведенческие данные, собранные в несколько временных моментов, включая балл Зеа Лонги, модифицированную оценку неврологической тяжести и модифицированную шкалу Эшворта, анализировались с использованием двухнаправленной повторяемой оценки ANOVA с группой в качестве фактора между участниками и временем как фактором внутри участников. Когда выявлялись значимые основные эффекты или взаимодействия, для пост-хок анализа использовался тест Сидака с множественными сравнениями. Другие данные анализировались с помощью одностороннего ANOVA, а затем был проведен тест множественных сравнений Сидака для пост-хок сравнений. Двуххвостый p. < 0,05 считался статистически значимым. В столбчатых графиках статистическая значимость обозначается звёздочками, как определено в соответствующих легендах рисунков.

Результаты

SAE улучшает неврологическую функцию и снижает мышечную спастичность у крыс с ПСС
Терапевтические эффекты SAE на поведенческую дисфункцию у крыс с постинсультной спастичностью оценивались с использованием шкалы Зеа Лонги, модифицированной шкалы неврологической тяжести и модифицированной шкалы Эшворта на 1, 3, 5 и 7 дни после валидации модели (n = 12 на группу). Для оценки неврологических дефицитов использовались балл Zea Longa и mNSS, тогда как балл MAS применялся для...

Обсуждение

Предыдущие клинические исследования показали, что акупунктура кожи головы в сочетании с физическими упражнениями может облегчить спастические симптомы у пациентов с постинсультной спастичностью, одновременно улучшая моторную функцию и повседневную деятельность (ADL^)14,24. Эти результаты подтверждают его клиническую ценность. Настоящее исследование дополнительно подтвердило терапевтическую пользу SAE в модели на крысах с помощью т...

Материалы

```html

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
2,3,5-трифенилтетразолиевый хлорид раствор для окрашивания	Beyotime	C0651	TTC окрашивание
3MM Фильтровальная бумага	Whatman, UK	3030861	Перенос Western blot
Антитело к AKT	Affinity	AF0836	Первичное антитело
Ацетон	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10000418	Инфильтрация образцов для электронной микроскопии
Adobe Illustrator	Adobe Inc.	Версия 29.5 (64-bit), https://www.adobe.com/products/illustrator.html	64-битная версия, используемая для графической редакции и подготовки научных рисунков
Безводный этанол	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	100092683	Депарфинизация парафиновых срезов
Анти-фейдерное монтажное средство	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C1020	Накрытие слайда
Комплект для определения концентрации белка BCA	MDL	MD913053	Определение концентрации белка
Голубильный раствор	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2104	Окрашивание гематоксилином
Система люминесцентного изображения	CLINX, China	ChemiScope6100	Система для обнаружения целевого белка
Концентрированная нормальная сыворотка козла	Boster Biological Technology	AR1009	Блокирование сывороткой
DAPI	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C1030	Окрашивание ядер
Алмазный нож	Daitome	Ultra 45°	Резка ультратонких образцов
Дифференцирующий раствор	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2104	HE окрашивание
Сушильный шкаф	Tianjin Labory Instruments Equipment Co., Ltd.	GFL-230	Прожарка фиксированных тканевых срезов
Реагент для восстановления антигена EDTA (pH 9,0)	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C1052	Восстановление антигена
Фиксирующий раствор для электронной микроскопии	ASPEN	AS1063	Фиксация образцов для электронной микроскопии
Электрофорезное питание	Longfang	LF-2000	Обеспечение напряжения электрофореза
Среда для включения Embed 812	SPI	90529-77-4	Инфильтрация образцов для электронной микроскопии
EndNote X9	Clarivate Analytics (US) LLC	Версия X9, https://endnote.com/	Используется для управления ссылками и форматирования академических цитат
Морозильная камера	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd.	JB-L5	Заморозка тканевых блоков
Антитело к GAP-43	Affinity	Df7766	Первичное антитело
Антитело к GAPDH	Affinity	AF7021	Первичное антитело
Антитело к GDNF	Biosynthesis	Bs-1024r	Первичное антитело
Ледяная уксусная кислота	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2138	Окрашивание по Нисслю
Стеклянные предметные стёкла и покровные стёкла	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10212432C	Нанесение тканевых срезов
GraphPad Prism	GraphPad Software, LLC	Версия 10.1.2 (324) для Windows 64-bit, https://www.graphpad.com/	64-битная версия, используемая для статистического анализа и научного построения графиков
Мельница	Beijing Herde	N.9548	Измельчение образцов тканей
Растворы для окрашивания HE	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2103	HE окрашивание
Горчичный антиген связанный с горчичным белком, конъюгат HRP	Servicebio	C030205	Вторичное антитело
Горчичный антиген связанный с горчичным белком, конъюгат HRP, антитело к кролику	SeraCare	5220-0336	Вторичное антитело
Перекись водорода (H2O2)	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C5101	Подготовка реагентов TSA
IBM SPSS Statistics	IBM Corp.	Версия 25, 64-bit, https://www.ibm.com/products/spss-statistics	64-битная версия, используемая для статистического анализа и обработки данных
Система изображений	Nikon, Japan	Nikon DS-U3	Захват микроскопических изображений
Металлическая ванна	COYOTE	H203-H	Инкубация при постоянной температуре
Микроволновая печь	Galanz Microwave Electrical Appliance Co., Ltd.	P70D20TL-P4	Восстановление антигена
Мембрана NC (0,22 мкм)	GVS, USA	ISEQ00010	Перенос блотов белков
Нейтральный бальзам	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10004160	Дегидратация и накрытие слайда
Буфер PBS	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C0003	Деколоризация и промывка
Антитело к PI3K	Affinity	AF6241	Первичное антитело
Антитело к PSD-95	Affinity	Af5283	Первичное антитело