Модель энтероколита, ускоренного пироксикамом, у мышей с интерлейкином-10 для изучения метаболических изменений, вызванных воспалением

Краткое содержание

Этот протокол использует пироксикам для ускорения развития колита в модели мышей с интерлейкином (IL-10)-нокаут. Протокол обеспечивает синхронизацию колита, что приводит к строгим, воспроизводимым результатам независимо от пола, фонового напряжения или условий вивария. Он служит полезной моделью для изучения метаболических изменений во время воспаления кишечника.

Аннотация

Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) — это хроническое воспалительное заболевание пищеварительного тракта, поражающее более 10 миллионов человек по всему миру. Хотя значительные исследования сосредоточены на иммунологических механизмах и последствиях ВЗК, меньше известно, как слизистое воспаление способствует метаболической дисрегуляции, включая потерю веса и снижение аппетита. Здесь авторы описывают мышиную модель энтероколита, ускоренного пироксикамом, у мышей интерлейкина-10-нокаут (IL-10-KO) для изучения метаболической дисрегуляции, вызванной воспалением. Известно, что мыши IL-10-KO развивают спонтанный энтероколит и повышенную восприимчивость к энтероколиту, вызванному инфекциями или лекарствами. Однако условия вивариума и фон деформации были отмечены как факторы смешивания при развитии колита в этой модели. Пироксикам, нестероидный противовоспалительный препарат (НПВС), доказано способен вызывать или ускорять энтероколит на животных моделях, увеличивая воздействие люминальных бактерий на слизистое слизистое. В этом протоколе самцов и самок мышей с IL-10-KO кормили рационом, обогащённым пироксикамом, вместо обычной пищи. Ежедневно измерялись потребление пищи и масса тела с учётом метаболических изменений всего тела, а также клинических проявлений энтероколита, таких как диарея и ректальное кровотечение. Протокол эффективен и воспроизводим, одновременно вызывая энтероколит у нескольких мышей и позволяет оценивать метаболическую дисрегуляцию в модели воспалительных заболеваний кишечника. Дальнейшие исследования с использованием этого протокола могут изучить влияние энтероколита на другие компоненты метаболической дисрегуляции, такие как расход энергии и состав тела, выявляя более широкие связи между воспалительными заболеваниями кишечника и метаболизмом хозяина.

Введение

Болезнь Крона и язвенный колит, в совокупности известные как воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), представляют собой хронические аутоиммунные заболевания желудочно-кишечного тракта, характеризующиеся воспалением слизистой слизистой с клиническими проявлениями, включая боль в животе, потерю веса, гематохезию и диарею. ВЗК затрагивает миллионы людей по всему миру, при этом наибольшая распространённость наблюдается в западных^{обществах. 1}. В США, по оценкам, более 3 миллионов человек страдают^{от 2,3}, при этом частота и распространённость увеличиваются, особенно среди детей и^{молодежи, 4,5}.

Точные механизмы, лежащие в основе патогенеза ВЗК, до сих пор не до конца изучены, но широко считается, что заболевание является результатом преувеличенного иммунного ответа на кишечную микробиоту у генетически восприимчивых людей. Цитокина, модулирующие воспалительные реакции, играют ключевую роль в поддержании гомеостаза кишечника и развитии ВЗК. Среди них интерлейкин-10 (IL-10) — хорошо изученный противовоспалительный цитокин, который помогает поддерживать иммунологический гомеостаз у человека, регулируя как врождённые, так и адаптивные руки иммунного^{ответа 6,7}. В частности, полиморфизмы в IL-10 и его рецепторе (IL-10RA/B) были выявлены у младенцев с очень ранним началом ВЗК (VEO-IBD), классически проявляющейся перианальной болезнью в первые несколько месяцев^{жизни 8}. Эта связь дополнительно подтверждается крупномасштабным экзомным секвенированием взрослых пациентов с болезнью Крона, которое выявило IL-10RA как локус восприимчивости к болезни при немоногенном^{ВЗК 9}. Кроме того, у пациентов с VEO-IBD описан негенетический путь, связанный с нейтрализующими антителами к IL-10, что дополнительно подчёркивает важность этого пути для поддержания гомеостаза слизистой^{иммунной слизистой 10}.

Основываясь на исследованиях на людях, указывающих на участие IL-10 в ВЗК, были разработаны мыши интерлейкина-10-нокаут (IL-10-KO) в качестве модели для изучения роли IL-10 в ВЗК. Известно, что мыши IL-10-KO развивают спонтанный энтероколит с преувеличенным ответом CD4+ Th1 на стимулы, обычно начиная с 8–12 недель в^{возрасте 11} лет. Однако развитие спонтанного энтероколита у мышей с IL-10-KO может быть непредсказуемым при отсутствии ускоряющего^агента 12,13,14, в зависимости от генетического штамма, состава микробиоты и условий^{содержания 15,16}. Использование надёжного протокола для вызова колита критически важно для практической эффективности модели IL-10-KO. В предыдущих исследованиях использовались нестероидные противовоспалительные препараты (НПВС), такие как пироксикам, для индукции энтероколита у мышей с^{IL-10-KO 17,18}. Однако эти исследования в основном сосредоточены на иммунологических изменениях, с относительно небольшим акцентом на влияние энтероколита на метаболизм или роль пола при тяжести^{колита 19}. Авторы описывают использование диеты, обогащённой пироксикамом, для индукции энтероколита у мышей с IL-10-KO, а также характеризуют метаболическую дисрегуляцию и слизисто-воспалительные реакции в этой модели с использованием как самцов, так и самок мышей. Этот протокол измеряет массу тела и потребление пищи, чтобы отразить метаболические изменения всего организма, а также клинические проявления колита и гистологические и транскриптомические изменения, отражающие воспаление слизистой железы. Эта эффективная и воспроизводимая модель предоставляет ценный инструмент для изучения связи между ВЗК и метаболизмом хозяина.

Протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколом, утверждённым Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) при Медицинском центре Юго-Западного университета Техаса, в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных» [Номер одобрения: 2017-102011]. Эвтаназия проводилась в соответствии с институциональными рекомендациями. Для проведения процедур анестезия не требовалась. Конкретные детали материалов описаны в Таблице материалов.

1. Установление модели энтероколита, ускоренного пироксикамом у мышей IL-10-KO

1. Содержать мышей IL-10-KO в специализированном помещении без патогенов (SPF) в 12-часовом световом цикле с импровированным доступом к еде и воде.
2. Индивидуально содержат мышей возраста 7–8 недель, соответствующих возрасту и полу в микроизоляторных клетках. Позвольте мышам привыкнуть к одиночному содержанию и ежедневному обращению как минимум за неделю до начала эксперимента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что вес тела составляет >20 г для мужчин или >17 г для самок, а мыши свободны от боевых ран.
3. Распределите мышей в экспериментальную и контрольную группу. Для экспериментальной группы замените стандартную еду на еду, усиленную пироксикамом. Для контрольной группы дайте свежую стандартную еду. Добавьте 50 г еды в каждый бункер клетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выделяйте не менее пяти мышей на каждую группу. Обогащённая пироксикамом чау (200 ppm) была приготовлена компанией Teklad с использованием пироксикама, предоставленного исследователями, для приготовления индивидуального рациона лабораторных животных. Чтобы минимизировать вариативность от партии к партии, рекомендуется, чтобы все животные в данном эксперименте получали пищу из одной и той же производственной партии. По возможности одна и та же партия следует использовать в разных экспериментах для повышения воспроизводимости.

2. Мониторинг массы тела и поведения в питании

1. Используя аналитические весы, записывайте вес тела каждой мыши. Взвешивайте каждую мышь по отдельности в одно и то же время каждый день, ежедневно в течение 7 дней подряд. На 0-й день сообщайте о суточной массе тела в процентах от базового веса (установите 100%).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Потеря веса более 20% указывает на чрезмерный стресс и риск неминуемой смерти. Мышей следует усыпить, если этот порог достигнут.
2. С помощью аналитических весов зафиксируйте начальный вес еды, усиленной пироксикамом, и стандартного чау в каждой клетке.
3. Затем измеряйте оставшуюся еду в каждом контейнере клетки в одно и то же время каждый день, ежедневно в течение 7 дней подряд.
4. Рассчитайте ежедневное потребление чау, вычитая дневной вес чау из оставшегося чау за предыдущий день.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Регулярно проверяйте количество еды и пополняйте еду, если оно ниже 10 г. Вкусность пироксикам-чау не влияет на употребление и должна быть очень похожа на стандартную еду.

3. Мониторинг активности заболеваний

1. На 0 и 7 дни визуально осмотрите фекальные гранулы отдельных мышей и определите наличие крови в кале.
2. Если не видно крови, проведите тест на скрытую кровь калом, нанеся гранулу на тест-карту, затем добавив предоставленный проявительный реагент. Результаты результатов по таблице 1.
3. На 0 и 7 дни визуально осматривайте свежевыпущенные фекальные гранулы для оценки консистенции кала. Используйте плоские щипцы для определения консистенции. Результаты результатов по таблице 1.
4. В дни 0 и 7 определите степень пролапса прямой кишки, осматривая перианальную область. Результаты результатов по таблице 1.
5. Измерьте массу тела, как описано выше. Результаты результатов по таблице 1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оценка индекса активности заболевания (DAI) должна проводиться вслепым образом одним и тем же исследователем на протяжении всего эксперимента для обеспечения последовательности, минимизации смещения наблюдателей и повышения надёжности оценки.

4. Извлечение тканей толстой кишки

1. Усыпить мышей с помощью асфиксии_CO2 и вывиха шейки матки, как сообщалось в^{других источниках 20}.
2. Положите мышь в положение на спине и распылите 70% этанола на брюшную область живота.
3. Поднимите кожу щипцами и используйте хирургические ножницы для режения по средней линии. Обнажите брюшную полость и найдите толстую кишку.
4. Обнажите толстой кишку и слепую цепь с помощью тупой вскрытия. Удалите толстой кишку в блоке, включая слепую и анальную манжету.
5. Положите кишку на ровную поверхность и удалите соединительные ткани.
6. Измерьте и запишите длину толчья кишки.
7. После измерения длины толстой кишки удаляйте слепую грудь, разрезав в месте пересечения цеко-толстой кишки.
8. Приготовьте шприц объемом 10 мл, наполненный фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS), с прикреплённой 22-калиметровой шаровой иглой с многоразовой стальной иглой. Введите иглу в кишечник и выведите содержимое кишечника.
9. Поместите промытый кишечник в чашку Петри с PBS и прополоскайте, чтобы удалить остатки. После очистки используйте его для дальнейших анализов.

5. Гистологический анализ

1. Положите толстую кишку ровно на стеклянную горку. Используйте щипцы, чтобы обернуть ткань вокруг себя, начиная с дистального конца, чтобы получить «швейцарский рулон». Таким образом, дистальный или анальный конец останется во внутреннем роле, а более проксимальные области будут проходить к внешнему.
2. Используя иглу 27 калибра, закрепите свернутую кишку для поддержания рулона и поместите её внутрь кассету для встраивающей ткани.
3. Для фиксации тканей погружайте тканевые кассеты в 10% буферный раствор формалина на 16 часов при 4 °C.
   ВНИМАНИЕ: 10% формалина вреден при контакте с кожей и может вызвать сильные ожоги и повреждение глаз. Обращайтесь осторожно в защитных перчатках и научных очках. Остаточный формалин должен утилизироваться соответствующим образом в соответствии с институциональными рекомендациями.
4. После фиксации формалина обрабатывайте ткани для вложения парафина и разрезайте их для установки на стеклянные стекла.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы должны быть отправлены в гистологическую лабораторию с необходимым оборудованием для обработки тканевых кассет в парафине, сечения свитков, монтажа на стекли и окрашивания гематоксилином и эозином.
5. Окрашивать тканевые слайды гематоксилином и эозином (HE) согласно установленным^{протоколам 21}.
6. Используя гистологическую систему оценки, описанную в Таблице 2, оцените следующие гистологические особенности в каждом разделе: повреждение тканей от энтероколита, инфильтрация воспалительных клеток Lamina propria и процент задействованной площади. Объедините баллы в каждом разделе, чтобы получить общий балл (Таблица 2).
   Общий балл = Признаки × вовлечённости (повреждение тканей) + признаки × вовлечённости (инфильтрация воспалительных клеток Lamina Propria) (1)
7. Репрезентативные гистопатологические изображения повреждения тканей и инфильтрации клеток можно найти в публикации Эрбена и^{др. 22}.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гистологическая оценка должна проводиться вслепую, желательно обученным патологом, чтобы обеспечить последовательность и надёжность оценки.

6. Иммунофлуоресцентное окрашивание формалин-фиксированной парафиновой ткани

1. Положите салфетки в стойку для слайдов и в сушилку при температуре 55 °C на 1 час, чтобы парафин расплавился.
2. Положите слайды на решетку для окрашивания и последовательно погружайте её на 3 минуты в банки для морилки с ксилолом. Повторяйте этот шаг три раза.
3. Окуните решётку для окрашивания на 3 минуты в банки с 100% этанолом. Повторяйте этот шаг три раза.
4. Окуните решётку для окрашивания на 3 минуты в банку с 95% этанолом.
5. Окуните решётку для морилки на 3 минуты в банку с 80% этанолом.
6. Погрузите решётку для окрашивания на 5 минут в банки с деионизированной (DI) водой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все предыдущие этапы должны выполняться в вентилируемой вытяжке из-за паров ксилола. Обращайтесь осторожно в защитных перчатках и научных очках. Остаточный ксилол следует правильно утилизировать в соответствии с институциональными нормами.
7. Перенесите стекла на стойку для стекла и погрузите в банку для окрашивания с раствором для извлечения 1× цитрата.
8. Поместите банку с окрашиванием в опору для окрашивающей посуды.
9. Поставьте опору для окрашивания посуды в скороварку.
10. Готовьте 15 минут в скороварке.
11. Уберите стекла из скороварки и дайте им остыть до комнатной температуры.
12. Инкубировать стекли с блокирующим буфером объемом 300 мкл (3,5% козьей сыворотки, разбавленной в PBS) в течение 1 часа в увлажнённой камере. Убедитесь, что ткань полностью покрыта блокирующим буфером.
13. Подвергайте стекла воздействию 300 мкл первичного антитела, разбавленных в блокирующем буфере, в течение 16 часов при 4 °C внутри увлажнённой камеры. Убедитесь, что ткань полностью покрыта первичным антителом. Использовалось следующее первичное антитело: Anti-S100A8/S100A9 (1:500).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавление антител будет специфичным для реагента и должно соответствовать рекомендациям поставщика.
14. Промывайте слайды, последовательно погружая их в PBS на 5 минут, три раза в банке с пятнами.
15. Подвергайте стекла воздействию 300 мкл разбавленной флуоресцентной вторичной антитела в блокирующем буфере в течение 1 часа при комнатной температуре в увлажнённой камере. Убедитесь, что ткань полностью покрыта вторичным антителом. Использовалось следующее флуоресцентное вторичное антитело: козьий анти-Rabbit Alexa Fluor 555 (разбавление 1:150).
    ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента стекли должны быть защищены от света, чтобы предотвратить фотоотбеливание флуорофоров. Разбавление вторичных антител будет специфичным к реагентам и должно соответствовать рекомендациям поставщика.
16. Промывайте слайды, последовательно погружая их в PBS на 5 минут, три раза в банке с пятнами.
17. Подвергайте стекла ядерному окрашиванию, погружая в раствор Hoechst, разбавленный 1:5000 в PBS, на 20 минут в банке для окрашивания.
18. Промывайте слайды, последовательно погружая их в PBS на 5 минут, три раза в банке с пятнами.
19. Аккуратно стирайте все PBS с стекло с помощью неабразивной салфетки. Добавьте 50 мкл монтажного материала против фейда и накладку.

7. Экстракция РНК

1. Заморозьте всю кишку или фрагмент в жидком азоте и храните при -80 °C. В качестве альтернативы погрузите в 1,5 мл раствора для сохранения RNALater и храните в соответствии с инструкциями производителя.
2. Разморозьте ранее замороженную кишку и положите на ровную поверхность. Разрушать и гомогенизировать ткань с помощью ручного гомогенизатора.
3. Изолируйте РНК с помощью набора, следуя инструкциям производителя.
4. Измеряйте концентрацию РНК с помощью спектрофотометра. Соотношения₂₆₀/_{A 280} > 1,8 и_{A 260}/_{A 230} 2,0–2,2 указывают на приемлемую чистоту РНК.
5. Проводите обратную транскрипцию, затем qPCR с SYBR зелёным интеркалирующим красителем.
6. Анализируйте результаты с помощью платформы количественной оценки или аналогичного инструмента.

Результаты

Самцы и самки мышей IL-10-KO развивают энтероколит после краткого воздействия диеты, обогащённой пироксикамом (рисунок 1A–E). Ко второму дню мыши, подвергшиеся воздействию пироксикама, статистически значительно увеличили потерю веса, чем их контрольные группы того же пола, регулярно кормленные едой, и сопоставимая потеря веса наблюдалась у всех полов (рисунок 1B). Очевидное ежедневное потребление пищи оставалось неизменным на протяжении всего воздействия пироксикама и развития энтероколита, напоминая стандартный корм, что указывает на то, что потеря веса в этой модели в первую очередь обусловлена не снижением потребления, а другими факторами, способствующими метаболическим расходам (рисунок 1C).

Для дальнейшего изучения прогрессирования воспаления кишечника активность заболевания оценивалась с помощью комбинированной оценки потери веса, выделения крови в кале, консистенции кала и степени пролапса прямой кишки. Модифицированный индекс активности заболевания (DAI) оценивался на исходном уровне и на 7-й день; результаты 7-го дня показаны на рисунке 1D. Кроме того, развитие энтероколита, наблюдавшегося у мышей с воздействием пироксикама, было связано с сильной тенденцией к увеличению смертности, хотя эта разница статистически не была значимой (p = 0,12; Рисунок 1E). В этой модели ранняя смертность вторична по сравнению с достижением гуманных целей мышей (потеря веса > 20%) и преимущественно затрагивает самцов (рисунок 1E). Если смертность является востребованной экспериментальной конечной точкой, можно рассмотреть большее количество экспериментальных животных, чем используемое здесь. В этом исследовании авторы использовали минимальное количество животных, необходимое для достижения статистической способности за счёт завершения исследования, учитывая ожидаемую смертность.

Укорочение толстой кишки — это признак, связанный с тяжестью колита в моделях мышей. Во время сбора и самцы, и самки мышей IL-10-KO, питавшиеся пироксикамом, имели короче кишечник, чем у тех, кто получал обычную еду (рисунки 2A–B). При гистологической оценке колонки из группы, питаемой пироксикамом, выявили повреждение эпителия и усиленную инфильтрацию иммунных клеток, изменения, связанные с колитом (см. рисунок 2C). Эти результаты привели к более высокому гистологическому баллу (рисунок 2D). Кроме того, были оценены транскрипционные уровни провоспалительных цитокинов, участвующих в моделях колита с ВЗК у человека^{и мышиных моделей 23}. В соответствии с предыдущими данными, у мышей IL-10-KO, питаемых пироксикамом, наблюдалось значительное повышение уровня провоспалительных цитокинов на уровне транскрипции (рисунок 3A–D). Стоит отметить, что такое изменение транскрипции не наблюдалось у мышей с IL-10-KO, получающих регулярную пищу или WT, обогащённых пироксикамом, что указывает на то, что транскрипционный сигнатур был вызван сочетанием дефицита IL-10 и пироксикама, а не только одним из факторов. Наконец, авторы подтвердили, что транскрипционная подпись, наблюдаемая в толстой кишке у мышей, обработанных пироксикамом, была связана с повышенным окрашиванием кальпротектина в слизистой оболитой толстой кишки (рисунок 3E)^24,25.

Рисунок 1: Энтероколит, ускоренный Пироксикамом, у мышей IL-10-KO. (A) Схематический обзор экспериментального протокола. (B) Масса тела, (C) потребление пищи, (D) индекс активности заболевания на 7-й день (DAI), (E) кривая выживаемости у 8-недельных мальчиков и 8-недельных самок мышей IL-10-KO, получающих рацион, обогащённый пироксикамом, или обычный рацион. Мужская контрольная: n = 5, мужская пироксикам: n = 5, женская контрольная: n = 6, женская пироксикам: n = 6 дюймов (B), (C) и (D). Мужская контрольная: n = 6, самцы пироксикам: n = 10, женская контрольная: n = 6, женская пироксикам: n = 7 дюймов (E). * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001 путём парного сравнения самцов мышей (верхние звёздочки) и самок (нижние звёздочки) мышей в (B). Статистический анализ проводился с использованием двухстороннего непарного t-теста в (B), (C) и (D), а также логарифмического теста в (E). Показаны средние значения и полоски ошибок, представляющие стандартную ошибку среднего значения (SEM). В гистограммах отдельные измерения отображаются с помощью графиков джиттера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Укорочение толстой кишки и гистологическая оценка. (A) Представительные образцы толстой кишки у 8-недельных самцов и самок мышей с интерлейкин-10-нокаутом (IL-10-KO), получающих диету пироксикамом (сверху) или обычный рацион (снизу) в течение 7 дней. Шкала = 1 см. (B) Длина толстого кишечника на 7-й день (мужской контроль: n = 5, самец пироксикам: n = 5, женский контроль: n = 6, женский пироксикам: n = 6). (C) Репрезентативные изображения толстой кишки, окрашенной HE. Шкала = 100 мкм. (D) Гистологический балл на 7-й день. Двуххвостый непарный t-тест в (B) и (D). Показаны средние значения и полоски ошибок, представляющие SEM. В гистограммах отдельные измерения отображаются с помощью графиков джиттера. Не значимо (NS), * p ≤ 0,05, *** p ≤ 0,001, **** p ≤ 0,0001 по парному сравнению. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Воспалительные изменения при энтероколите, ускоренном пироксикамом. Количественные результаты RT-ПЦР (A) Tnf, (B) Il6, (C) Il1b и (D) Ifng в ткани толстой кишки у 8-недельных самцов дикого типа (WT) и интерлейкин-10-нокаут (IL-10-KO) на момент сбора сбора. Для панелей A–D WT пироксикам n = 7, KO пироксикам n = 6, контроль KO n = 3. (E) Репрезентативное кальпротектиновое иммунофлуоресцентное окрашивание ткани толстой кишки 8-недельных мышей с IL-10-KO во время сбора. Статистический анализ проводился с использованием двухстороннего непарного t-теста. Показаны средние значения и полоски ошибок, представляющие стандартную ошибку среднего значения (SEM). В гистограммах отдельные измерения отображаются с помощью графиков джиттера. Шкала в (E) = 200 мкм. Не значимо (NS), * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001 по парному сравнению. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Домен	Партитура
Вес	0 – Без изменений
	1 – Потеря 1–5%
	2 – Потеря 6–10%
	3 – Потеря 11–20%
	4 – ; Потеря более 20%
Консистенция кала	0 – Нормальный ;
	1 - Мягкая, но сформированная
	2 – Жидкий стул (не водянистый)
	4 – Диарея (жидкий кал)
Кровотечение	0 – Нет
	2 – Гематооккультный положительный стул
	3 – Видимая кровь в кале
	4 – Грубое кровотечение в прямой кишке
Ректальный пролапс	0 – Отсутствует
	1 – настоящее время
Общий счёт	Общий балл: сумма (Баллов по домену) для каждого домена

Таблица 1: Показатель активности заболевания (DAI). Система оценок для определения активности заболевания по снижению веса, консистенции кала, крови в кале и пролапсу прямой кишки. Адаптировано из Sifuentes-Dominguez и^{др. 26}.

Повреждение тканей					Инфильтрация воспалительных клеток Lamina Propria
Особенности		Участие			Особенности		Участие
0	Нет	1	1–25% поверхности		0	Редко	1	1–25% поверхности
1	Редко;	2	26–50% поверхности		1	Увеличились, некоторые нейтрофилы	2	26–50% поверхности
2	Слизистые эрозии и язвы	3	51–75% поверхности		2	Подслизистое присутствие кластеров воспалительных клеток	3	51–75% поверхности
3	Обширные повреждения глубоко в стенке кишечника	4	76–100% поверхности		3	Инфильтрации трансмуральных клеток	4	76–100% поверхности

Таблица 2: Гистологическая система оценки. Система подсчёта очков для определения гистологических изменений и урона. Адаптировано из Sifuentes-Dominguez и^{др. 26}.

Обсуждение

Воспалительное заболевание кишечника — это сложное полигенное заболевание, при котором доклинические модели служат бесценным инструментом для анализа путей, способствующих патогенезу ВЗК, и разработки новых диагностических и терапевтических стратегий. В настоящее время многие доклинические модели ВЗК используют химическое воздействие, такие как декстрансульфат натрия (DSS), оксазолон и тринитробензол сульфоновая кислота (TNBS), благодаря их простоте использования. Также доступны генетические модели, развивающие спонтанный колит. Среди них модель IL-10-KO особенно ценна, поскольку генетические вариации пути IL-10 вызывают воспаление кишечника у людей, а у мышей с IL-10-KO развивается спонтанный хронический энтероколит, напоминающий человеческую болезнь. Однако основным ограничением этой модели является неспособность учитывать фенотипическую вариабельность. Хотя энтероколит развивается спонтанно, его начало может варьироваться в зависимости от фона деформации и условий^{вивария 27}.

Сочетая химическое воздействие с генетической моделью, описанный здесь протокол обеспечивает надёжную и воспроизводимую мышиную модель экспериментального колита. Энтероколит ускоряется у мышей IL-10-KO с помощью пироксикама, а заболевание начинается в течение 7 дней после контакта с диетой, обогащённой пироксикамом. Этот протокол позволяет синхронизировать развитие колита. Модель повторяет характеристики, наблюдаемые в других широко используемых моделях колита у мышей, включая потерю веса, кровь в кале, диарею, укорочение толстой кишки, гистологические повреждения и транскрипционные изменения. Кроме того, эта модель воспроизводима в широко используемом штаму C57Bl/6J, что облегчает изучение дополнительных дефектов генов, связанных с ВЗК, благодаря относительной простоте генерации мышей с дополнительными мутациями в этом штамме.

Описанная здесь модель предоставляет полезный инструмент для изучения метаболических изменений во время воспаления кишечника. В этой модели мыши, подвергшиеся воздействию пироксикама, у которых развился ускоренный энтероколит, продолжают питаться нормально без значительного снижения ежедневного потребления. Это указывает на то, что потеря веса в этой модели связана не с нарушением кормления, а с дополнительными факторами. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, связаны ли эти результаты с повышенным расходом калорий из-за воспаления, чрезмерной потерей калорий из-за диареи или нарушением термогенеза. Кроме того, самцы и самки мышей демонстрируют схожие закономерности тяжести заболевания, что контрастирует с предыдущими наблюдениями на моделях IL-10-KO и^DSS 28,29,30.

Существует несколько важных шагов по устранению неполадок, чтобы обеспечить воспроизводимость этой модели. Во-первых, мышей следует привыкнуть к ежедневному обращению и наблюдениям в течение одной недели перед воздействием пироксикама. Это предотвращает потерю веса, связанного со стрессом. Во-вторых, клетки должны содержать не более трёх мышей, и в эксперимент должны быть включены только мыши, расположенные гармонично. Мыши, проявляющие боевое поведение или боевые раны, более подвержены развитию колита и могут умереть до сбора^{урожая. 31,32}. В-третьих, если питание должно контролироваться на протяжении всего эксперимента, мышей следует содержать отдельно для точного измерения потребления еды. Кроме того, в бункеры для кормления следует помещать только крупные, целые пищевые гранулы, чтобы предотвратить их рассыпание в подстилку, что может повлиять на измерения. Методы количественной оценки потребления пищи, описанные здесь, соответствуют опубликованным рекомендациям по потреблению пищи^{грызунов 33}. Наконец, во время эксперимента следует избегать изменений в клетках, так как внезапные изменения окружающей среды могут снизить потребление пищи на 1–2 дня, особенно у молодых мышей.

У этого протокола есть несколько ограничений. Во-первых, оценка метаболических изменений ограничивается массой тела и потреблением пищи, в то время как другие показатели системного метаболизма, такие как коэффициент дыхательного обмена (RER), расход энергии и физическая активность, не оценивались. Кроме того, механизмы, лежащие в основе потери веса, не были изучены; Таким образом, относительный вклад снижения потребления пищи, изменения энергозатрат, мальабсорбции и других факторов, связанных с воспалениями кишечника, остаётся неясным. Во-вторых, были собраны и проанализированы только ткани толстой кишки, тогда как другие органы, участвующие в метаболической регуляции, включая жировую ткань, печень и скелетные мышцы, не исследовались. В-третьих, этот протокол был разработан с использованием мышей C57BL/6 IL-10-KO, которые могут проявлять разную восприимчивость к колиту по сравнению с другими генетическими фонами. Несмотря на эти ограничения, протокол можно легко адаптировать для включения дополнительного метаболического фенотипирования и анализа тканей внекишечника, что позволяет исследовать механизмы потери веса, а также связь между воспалениями кишечника и системными метаболическими^{изменениями 34} или оценить новые противовоспалительные^{наноматериалы 35}. Кроме того, этот подход должен применяться и к другим штаммам мышей IL-10-KO, хотя необходимы дополнительные валидационные исследования.

В итоге авторы сообщают об эффективном и воспроизводимом протоколе, который одновременно вызывает энтероколит у нескольких мышей с IL-10-KO и позволяет оценивать поведение при кормлении. Необходимы дальнейшие исследования для изучения влияния энтероколита на энергопотребление и состав организма в этой модели, что позволяет выявить более широкие связи между ВЗК и метаболизмом хозяина.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
10% buffered formalin	StatLab	28600-1	1 Galllon
27 G needles	BD	305109
Anti-S100A8 + S100A9 antibody	Abcam	AB288715
Balance	Fisher scientific	S94792D	Fisher Science Education Portable Balances, 300 g
Citrate buffer	Sigma Aldrich	C9999-1000mL
DI water	Fisher scientific	STLSL301
Dissecting forceps	Fisher scientific	22-327379
Ethanol, 100% 200 proof	Fisher scientific	NC1675398	Pharmco Products ETHYL ALCOHOL 200 PROOF
Ethanol, 190 proof, 95%	Fisher scientific	AC615110010
Ethanol, 80%	Fisher scientific	T08204K7
EZ-Quick Slide Staining Dish	IHC world	IW-2511	Staining jar
EZ-Quick Slide Staining Rack	IHC world	IW-2512	Slide rack
Feeding needle	Fisher scientific	NC9924986	22 gauge, 25 mm
Fine scissors	Fisher scientific	14060-11
Flat forceps	Fisher scientific	21-125-109
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 555	Thermo Fisher	AB_2535849
Handheld homogenizer	Fisher scientific	15-340-167
HemoCue	Danlee Medical Products, Inc.	BCK 64151A	Hemoccult Dev/ Single Slide Test Cards - CLIA Waived
Hoechst 33342	Invitrogen	62249
IL-10 KO Mice	The Jason Laboratory	Strain #: 002251	IL10-KO mice, genotype: B6.129P2-IL-10tm1Cgn/J
IVC mouse caging	Allentown	Mouse 500
Liquid nitrogen	Airgas	NI UHP300
Microscope cover glass	Fisher scientific	12541033
Nanodrop	Thermo Fisher	ND-ONE-W
Normal Goat serum	Vector labs	S-1000-20
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	D8537
Petri dishes	Fisher scientific	FB0875713
Piroxicam	Sigma Aldrich	P0847	supply to inotiv for preparation of custom animal diet
Piroxicam-fortified chow	Inotiv	Custom	200 ppm
Primer: Mouse GAPDH forward	Sigma Aldrich	N/A	5' AGGTCGGTGTGAACGGATTTG 3' forward
Primer: Mouse GAPDH reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA 3' reverse
Primer: Mouse IFN-G forward	Sigma Aldrich	N/A	5' ACTGGCAAAAGGATGGTGAC 3' forward
Primer: Mouse IFN-G reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' TGAGCTCATTGAATGCTTGG 3' reverse
Primer: Mouse IL-10 forward	Sigma Aldrich	N/A	5' CTTGCACTACCAAAGCCACA 3' (common)
Primer: Mouse IL-10 reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' GTTATTGTCTTCCCGGCTGT 3' (Wild type reverse)
Primer: Mouse IL-10 reverse (2)	Sigma Aldrich	N/A	5' CCACACGCGTCACCTTAATA 3' (Mutant reverse)
Primer: Mouse IL-1B forward	Sigma Aldrich	N/A	5' GCTGAAAGCTCTCCACCTCA 3' forward
Primer: Mouse IL-1B reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' AGGCCACAGGTATTTTGTCG 3' reverse
Primer: Mouse IL-6 forward	Sigma Aldrich	N/A	5' GTTCTCTGGGAAATCGTGGA 3' forward
Primer: Mouse IL-6 reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' TTTCTGCAAGTGCATCATCG 3' reverse
Primer: Mouse TNF forward	Sigma Aldrich	N/A	5' GCAGGTTCTGTCCCTTTCAC 3' forward
Primer: Mouse TNF reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' AGTGCCTCTTCTGCCAGTTC 3' reverse
QuantStudio 7 Pro	Thermo Fisher	A43183
RNAlater solution	Invitrogen	AM7020	RNA Stabilization Solution, 100 mL
Rneasy mini kit	Qiagen	74104
SHURDry SD-II Slide Dryer	General data	SD-ll-120
Simport Scientific EasyDip Slide Staining Rack	Fisher scientific	22-038-494	Staining rack
SlowFade Gold antifade reagent	Invitrogen	S36936
Staining dish support	BioSB	BSB7086
Staintray IHC slide staining system	IHC world	M918-1	Humidified chamber for IHC
SuperScript VILO	Invitrogen	11755050
SYBR Green Master mix	Applied Biosystems	A46109
Tintoretriever pressure cooker	BioSB	BSB7008
Tissue cassettes	Fisher scientific	50-197-8152	Research Products International Corp Tissue Processing Cassette, Pink, 500 per Case
Xylene	Pharmco	399000000	1 Gallon