Методическая статья

Редактирование генома в первичных клетках млекопитающих посредством электропорации редакторской РНК

154 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71449

⸱

31 июля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Genetic Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Biomedical Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 5Institute for NanoBioTechnology, Johns Hopkins University

В этой статье

Краткое содержание

Доставка редакторов геномов в виде РНК является особенно эффективным способом модификации геномов первичных клеток и клеточных линий млекопитающих. Цель этого протокола — доставить редакторы генома в виде мРНК в первичные клетки млекопитающих и клеточные линии, а затем целенаправленное секвенирование и анализ Illumina для количественной оценки результатов редактирования.

Аннотация

Редакторы CRISPR, включая нуклеазы, редакторы баз и прайм-редакторы, могут эффективно корректировать генетические варианты, вызывающие болезни, или нарушать работу целевых генов. Результаты редактирования обычно оцениваются в культивированных первичных клетках, клетках, полученных пациентами, или модифицированных клеточных линиях для изучения влияния генетической вариации или как первый шаг перед началом исследований на животных или клинической трансляции. Доставка редакторов в виде мРНК вместе с синтетическими направляющими РНК в клетки млекопитающих может повысить эффективность редактирования по сравнению с плазмидными методами и предотвратить такие проблемы, как интеграция ДНК или внецелевой редактирование, возникающие при длительной экспрессии. В этой статье представлен рабочий процесс подготовки мРНК редактора генома с помощью in vitro транскрипции (IVT), включая котранскрипционное капирование и химически модифицированные нуклеотиды, мРНК с электропорированным редактором и направляющие РНК в первичные человеческие фибробласти, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) или лимфобластоидные клеточные линии (LCL), а также количественную оценку результатов редактирования путём целевого секвенирования ампликонов на платформе Illumina с последующим анализом с использованием CRISPResso2. Этот рабочий процесс позволяет проводить количественное сравнение направляющих РНК, параметров электропорации и вариантов редакторов, а также поддерживает дальнейшие приложения, включая клонирование отдельных клеток, фенотипические анализы, доклинические исследования на животных и разработку терапевтических исследований.

Введение

Эффективное редактирование генома в первичных клетках млекопитающих способствует созданию генетических моделей и доклинической оценке кандидатов в терапевтические стратегии. Недавние достижения в технологиях на базе CRISPR, включая редактирование баз и прайм-редактирование, позволяют точно модифицировать нуклеотиды без введения разрывов двухцепочечной ДНК, тем самым повышая чистоту результатовредактирования 1,2. Эти технологии успешно применяются в моделировании заболеваний и терапевтических исследованиях редактирования генома, включая стратегии коррекции вариантов, приводящих к серповидноклеточнойанемии 3 имуковисцидозу 4.

Особенно эффективной стратегией доставки компонентов редактирования генома к клеткам млекопитающих является электропорация in vitro транскрибированной (IVT) мРНК, кодирующей редактирующий фермент, в сочетании со синтетическими направляющими РНК (gRNA). Доставка мРНК обеспечивает временную экспрессию редакторов генома, минимизируя длительную активность нуклеазы и снижая вероятность внецелевого редактирования. Достижения в технологии IVT повысили эффективность, выход и качество синтеза мРНК 4,5,6. Шаблоны плазмидной ДНК и ДНК, полученные с помощью ПЦР, часто используются для транскрипции in vitro, и каждый из них имеет свои преимущества и ограничения. В этом протоколе предпочитаются шаблоны, генерируемые с помощью ПЦР, чтобы избежать проблем, связанных с распространением длинных поли(A) трактов в плазмидах, которые склонны к рекомбинации и изменяющейся длине. Однако использование шаблонов ПЦР, описанных в этом протоколе, требует дорогого обратного праймера, который содержит 120-нуклеотидный поли(A) хвост, и ПЦР может быть более подвержен ошибкам, чем бактериальное распространение плазмид для последовательностей, не кодированных в праймерах. В качестве альтернативы коммерческие провайдеры, такие как Elegen и 4basebio, могут предоставлять высокоточные шаблоны ДНК, предлагая надёжный, но более дорогой вариант для создания транскрипционных шаблонов.

Тщательное проектирование направляющей РНК — ещё один важный компонент успешных экспериментов по редактированию генома. Было разработано несколько вычислительных инструментов для помощи исследователям в выявлении оптимальных последовательностей gRNA на основе прогнозируемой эффективности по цели и минимальной активности вне целевой цели. Широко используемые платформы включают CHOPCHOP и CRISPOR, которые позволяют идентифицировать направляющие последовательности, совместимые с требованиями PAM к ферментам Cas с протоспейсером, а также предоставляют показатели оценки для приоритизации кандидатов с высокой предсказанной активностью испецифичностью 7,8. Основные принципы и лучшие практики проектирования направляющей РНК подробно описаны в литературе CRISPR9, 10, 11, 12, 13.

Электропорация часто используется для доставки реагентов для редактирования генома к клеткам млекопитающих, поскольку она обеспечивает высокую эффективность доставки у типов клеток, которые обычно устойчивы к липидным методам трансфекции. Электропорация временно проникает мембрану клетки, позволяя экзогенным нуклеиновым кислотам, таким как мРНК и гРНК, попадать в цитоплазму. Были разработаны оптимизированные протоколы электропорации для различных типов клеток млекопитающих, включая первичные клетки, фибробласты, лимфобластоидные линии и индуцированные плюрипотентные стволовыеклетки 14. Коммерческие платформы электропорации, такие как системы Lonza 4D и Amaxa, предоставляют специализированные программы и реагенты для конкретного типа клеток, направленные на повышение эффективности доставки при сохранении жизнеспособности ячеек. Высокопроизводительные электропорационные системы, такие как платформа Amaxa с 96 лунками Shuttle, дополнительно позволяют масштабировать эксперименты по редактированию генома в различных экспериментальных условиях. Система неоновой электропорации также широко применяется, но не является основным элементом этого протокола.

После доставки компонентов редактирования генома результаты редактирования обычно оцениваются с помощью целевого секвенирования следующего поколения (NGS) геномной области вокруг места редактирования. Библиотеки секвенирования генерируются путём ПЦР-амплификации целевого локуса, за которой следует индексирование и высокопроизводительное секвенирование. Полученные чтения секвенирования анализируются с помощью специализированных биоинформатических конвейеров, предназначенных для экспериментов по редактированию генома. В этом протоколе результаты редактирования количественно оцениваются с помощью CRISPResso2 — широко используемой вычислительной платформы, позволяющей детально анализировать результаты редактирования генома на основе данныхсеквенирования 15. CRISPResso2 выравнивает чтения секвенирования с эталонной последовательностью и количественно оценивает результаты редактирования, включая общую эффективность редактирования, частоты вставки–удаления (indel), точные нуклеотидные замещения и распределение редактирования по целевой области. Программа также предоставляет графические визуализации и статистические сводки, которые облегчают сравнение экспериментальных условий и оптимизацию параметров редактирования.

В совокупности интеграция высококачественного производства мРНК IVT, оптимизированной подачи с помощью электропорации и высокоразрешающего секвенирующего анализа обеспечивает надёжный рабочий процесс для оценки стратегий редактирования генома в культивированных клетках (см. рисунок 1). Этот подход позволяет итеративно оптимизировать эффективность редактирования, специфичность и параметры экспериментов перед продвижением стратегий редактирования генома для исследований in vivo и потенциальных терапевтических применений.

Протокол

Этическое заявление:
Все процедуры с использованием клеточных линий, полученных от человека, проводились в соответствии с институциональными рекомендациями и утверждёнными протоколами.

1. Генерировать линейный шаблон ДНК с помощью ПЦР

Внимание: выполняйте все этапы РНК с использованием расходников и рабочих поверхностей без РНаз. При выборе подходящего редактора для предполагаемой геномной модификации учитывайте перечисленные редакторы мРНК и их различные варианты (Таблица 1).

  1. Собрать ПЦР-реакцию на плазмидной ДНК, извлечённой из бактерий, с помощью минипрепа или мидипреп-набора (midiprep). Используйте 20 нг плазмидной ДНК на 50 мкл ПЦР-реакцию с ферментом NEBNext Ultra II Q5 Master Mix, собирая ПЦР, как описано в таблице 2.
    1. Используйте прямой праймер, который корректирует неактивный промотор T7 на плазмиде, предотвращая круговую транскрипцию.
    2. Используйте обратный праймер, который вводит 120-нтный поли(A)₁₂₀ хвост для поддержки эффективной транскрипции и стабильности мРНК.
    3. Используйте N1-метил-псевдоуридин вместо урацила и включите CleanCap AG для улучшения трансляции мРНК и снижения врождённой иммунной активации 1,2,3,4 (Рисунок 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Доступны и другие аналоги нуклеотида и реагенты для каппинга, но они стабильно демонстрируют высокую активность в геномных мРНК редактирования. Доставка на основе наночастиц является подходящей альтернативой, но в данном протоколе не рассматривается.
  2. Усилить последовательность кодирования редактора с помощью PCR на 30 циклов с помощью праймеров, которые вводят функциональный промотор T7 выше кодирующей области и последовательность poly(A) ниже (Таблица 2 и Таблица 3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нуклеотидная последовательность шаблона IVT подчеркнута в таблице 4.
  3. Проверьте и очистите продукт ПЦР
    1. Пропустите 5 мкл ПЦР-продукта на 1% агарозном геле в буфере TE при 180 В в течение 30 минут. Подтвердите наличие одной полосы примерно при 4000-6500 п.п. (в зависимости от редактора, который транскрибуется), прежде чем приступить к очистке продуктов ПЦР.
    2. Очистите продукт ПЦР с помощью набора для очистки ПЦР (таблица материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если наблюдаются несколько диапазонов или низкое качество ПЦР-продукта, оптимизируйте условия термоциклирования (Таблица 5 — Таблица устранения неполадок).
    3. Измерите очищенную ДНК с помощью флюорометрического анализа dsDNA. Для анализа dsDNA Кубит подготовьте главную смесь буфера и красителя, объединив 796 мкл высококачественного рабочего раствора Кубит с 4 мкл красителя, оба включены в комплект.
    4. В отдельных пробирках смешайте 198 мкл главной смеси буферного красителя с 2 мкл низкоконцентрационного стандарта S1, высококонцентрационного стандарта S2 и образца. Вставьте каждый стандарт и образец по запросу в приборе Qubit для измерения концентрации запаса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если образцы выходят за пределы диапазона анализа, может потребоваться подготовка разбавлений.

2. Транскрибировать мРНК

  1. Подготовьте реакцию IVT на льду с использованием T7 РНК-полимеразы, NTP — аналога капсулы для котранскрипционного каппинга, а также N1-метил-псевдоуридинтрифосфата в качестве заместителя уридина для снижения врождённой иммуннойактивации 1˒5˒6.
  2. Приготовьте реакционную смесь IVT согласно таблице 4. Используйте аннотированную последовательность шаблонов, приведённую в таблице 4. Собрать каждую транскрипционную реакцию в итоговый объём 40 мкл.
  3. Подготовьте 5–10 реакционных трубок для получения достаточного количества мРНК для нескольких экспериментов. Каждая реакция на 40 мкл генерирует примерно 100 мкг мРНК. При использовании 1 мРНК для электропорации основного редактирования и 3 мкг мРНК для электропорации базового редактирования этого достаточно для ~33–100 электропораций.
  4. Транскрибировать РНК
    1. Тщательно перемешайте реакцию IVT с помощью пипетирования. Инкубировать реакцию при 37 °C в течение 2 часа.
  5. Очистить РНК
    1. Перенесите в трубку объёмом 1,5 мл и добавьте в реакцию IVT раствор хлорида лития (LiCl) объемом 7,5 М, равным половине общего объёма реакции, чтобы получить окончательную концентрацию LiCl 2,5 м. Для реакции 40 мкл IVT добавьте 20 мкл 7,5 М LiCl. Тщательно перемешайте с помощью аккуратного пипетирования.
    2. Инкубировать реакцию при -20 °C в течение 30 минут. Центрифугуйте образец при 16 000 × г при 4 °C в течение 15 минут.
    3. Удалите супернатант пипеткой и выбросьте его. Промой гранулы 1 мл этанола 70% при 4 °C. Беспокоить гранулу не обязательно. Центрифуга при 16 000 × г при 4 °C в течение 5 минут.
    4. Полностью удалите этанол и дайте грануле высохнуть на воздухе 1-2 минуты в шкафчике с биобезопасностью без РНаз. Не пересушивайте пеллеты, иначе может быть сложно повторно взвешивать.
  6. Повторная суспензия и количественная оценка РНК
    1. Суспензировать РНК в воде без нуклеаз. Сначала каждую реакцию ресуспендировать в 50 мкл воды без нуклеазы и дополнительно разбавить после измерения концентрации РНК. Измерите РНК с помощью флюорометрического РНК-анализа, такого как нанодроп.
      Точка паузы: После количественного определения РНК и алицитирования храните мРНК аликвоты при -80 °C до электропорации. Избегайте повторяющихся циклов замораживания и оттаивания; Разморозьте каждый аликвот только один раз перед использованием.
    2. Подтвердите, что выход очищенной мРНК составляет примерно 100-400 мкг на реакцию 40 мкл IVT. Разведите мРНК до 2 мкг·μL-1 безнуклеазной водой перед алицитированием. Храните аликвоты при −80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте повторяющихся циклов замораживания и оттаивания. Приготовьте одноразовые аликвоты и отбрасывайте неиспользованный размораживанный материал. Подготовьте 12,5 мкл аликвотов в ПЦР-полосках для 8–20 электропораций на аликвоту.
  7. Оценка целостности РНК
    1. Оценка размера и целостности РНК с помощью агарозного гелевого электрофореза или автоматического электрофореза (рисунок 2)
    2. Приготовьте гель с агарозой 0,8%, содержащий 10 000 разбавленных SYBR Gold. Используйте одноцепочечную РНК-лестницу, например, NEB ssRNA Marker.
    3. Денатурируйте мРНК с помощью 2x РНК-гелевого нагрузочного красителя и нагревайте образцы до 65 °C в течение 10 минут перед загрузкой образцов на гель.
    4. Подтвердите, что мРНК появляется как доминирующая полоса примерно на 4000-6500 нт, в зависимости от редактора, который транскрибирается, с минимальным размазыванием или низкомолекулярными продуктами. Отбрасывайте образцы РНК, которые демонстрируют значительное разрушение, размазывание или несколько неожиданных полос.

3. Проектирование и подготовка направляющих РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Идентифицируйте последовательности протоспейсерных мотивов (PAM) в целевом геномном локусе и выберите направляющие РНК, совместимые с выбранным редактором и предполагаемой геномной модификацией. Платформы для проектирования направляющих РНК, такие как CHOPCHOP, CRISPOR, CRISPRware, IDT Cas9 Checker, Benchling и VectorBuilder, могут использоваться для приоритизации направляющих РНК с благоприятной прогнозируемой активностью испецифичностью 6,7,8,9,10,11,12,13.

  1. Определите PAM-сайты в целевом геномном локусе, совместимые с выбранным вариантом нуклеазы, включая варианты, совместимые с NGN, с помощью инструментов проектирования направляющей РНК.
  2. Выбирайте направляющие РНК с высокой прогнозируемой активностью на цель и низкой прогнозируемой внецелевой активностью. Подтвердите окно редактирования направляющей РНК.
  3. Для приложений для базового или прайм-редактирования выберите направляющие РНК, которые помещают предполагаемую правку в оптимальное окно активности выбранного редактора.
  4. Закажите sgRNA или pegRNA с аналогами 2'-O-метиловых оснований для первых 3 и последних 3 нуклеотидов, а также 3' фосфоротиоатную связь между первыми тремя и последними двумя основами направляющих.
  5. Восстановить направляющие РНК в воде без нуклеазы или в буфере TE (100 мкм). Приготовьте аликвоты массой 5 мкл и храните их при −80 °C. В момент использования разморозьте и разведите в буфере электропорации перед электропорациями.

4. Подготовка клеточной культуры

ПРИМЕЧАНИЕ: Оцените целостность клетки с помощью микроскопии и тестов жизнеспособности перед электропорированием.

  1. Культивировать первичные фибробласти или HEK293T клетки в DMEM с добавлением 10% FBS, 4,5 г· L-1 глюкоза, глутаМАКС и 110 мг· L-1 пируват натрия. Пластины клеток на стерильных колбах T75 (поверхность TC) с 20% совпадения на колбу. Сохраняйте клетки между проходами 1-20. Разделяйте ячейки при 80% слияния и используйте ячейки при 70-80% слияния для электропорации.
  2. Культивировать плюрипотентные стволовые клетки в среде mTeSR Plus. Поместите клетки на стерильные колбы T75, покрытые Geltrex с 20% совпадением на колбу. Меняйте среду ежедневно и поддерживайте клетки между проходами 1-20. Добавьте коктейль CEPT в медиа в течение 24 часов после каждого отрывка. Разделяйте ячейки при 80% слияния и используйте ячейки при 70-80% слияния для электропорации.
  3. Поддерживайте ячейки при 37 °C при 5% CO₂, пока они не достигнут нужной плотности для электропорации, обычно 70–80% слияния.
  4. Удаляйте среду, когда ячейки достигнут нужного количества и сосхождения для электропорации.
  5. Добавьте фермент TrypLE Express в клетки (1 мл для колбы T75) и инкубировать при 37 °C в течение 5 минут. Аккуратно пипетируйте клетки к колбо, чтобы получить суспензию на одну ячейку. Остановите диссоциацию, добавив 3 мл среды клеточной культуры, и подтвердите отсутствие крупных клеточных сгустков перед подсчётом.
  6. Пеллетуйте клетки при 1000 × г в течение 5 минут, затем промыйте клетки 15 мл физиологическим раствором Dulbecco, буферированным фосфатом (DPBS), и снова центрифугуйте клетки.
  7. Оценивайте концентрацию и жизнеспособность клеток с помощью автоматизированного анализа жизнеспособности, такого как Nucleocounter NC-3000 с раствором 13. Комбинируйте 11,4 мкл клеток с 0,6 мкл раствора 13 перед измерением на нуклеосчетчике. Электропорация следует проводить только при условии жизнеспособности клетки не менее 85%, а образцы отбрасывать или заново готовить ниже этого порога.
  8. Ресуспензировать клетки при плотности примерно 0,5 × 106–2 × 106 клеток·мЛ-1 в DPBS. Подсчитайте клетки и оцените жизнеспособность с помощью гемоцитометра или счётчика клеток.
  9. Продолжайте только если жизнеспособность клетки ≥ 85%.
  10. Суспензировать клетки в электропорационном буфере. Суспензировать 2 × 105 элементов в 5 мкл холодного электропорационного буфера за каждую реакцию.
  11. Подготовьте электропорационный буфер с раствором добавки согласно инструкциям производителя непосредственно перед использованием и храните буфер на льду.
  12. Держите камеры холодными и действуйте быстро. Держите клетки на льду и немедленно приступайте к установке электропорации.

5. Электропорация

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте монтажный груз в трубках ПЦР-полосы для облегчения многоканального пипетирования. После электропорации клетки снова суспендируют в среде с добавлением коктейля CEPT для повышения выживаемостиклетки 12.

  1. Подготовьте РНК-груз.
    1. Подготовьте груз РНК на льду, объединив редактор mRNA и направляющую РНК в буфере электропорации.
    2. Для базовых редакторов и нуклеазов подготовьте окончательный раствор электропорации, содержащий 1,5 мкл (3 мкг) мРНК, 0,5 мкл (50 пмоль) направляющей РНК и 15 мкл электропорационного буфера на образец.
    3. Для основных редакторов подготовьте финальный раствор электропорации, содержащий 0,5 мкл (1 мкг) мРНК, 1,5 мкл (150 пмоль) направляющих РНК и 15 мкл электропорационного буфера на образец.
    4. Подготовьте решения для РНК-груза как мастер-смесь 1,2× для компенсации потерь объёма при переносе и обработке образцов. Оптимизируйте объёмы и соотношения реагентов для каждого целевого сайта и варианта редактора по мере необходимости.
  2. Раздайте элементы, груз и электропорат.
    1. Добавьте 5 мкл суспензии ячейки в каждую электропорационную яму.
    2. Добавьте 17 мкл груза РНК в буфере электропорации к 5 мкл клеток. Смешивайте подвеску, дважды пипетируя.
      Внимание: Действуйте быстро после объединения клеток и груза РНК, поскольку РНазы, выделяемые клетками, могут быстро разрушать редакторскую мРНК. Завершите электропорирование в течение 2 минут после смешивания клеток и РНК-нагрузки.
    3. Запустите программу электропорации, оптимизированную для выбранного типа ячейки (Таблица 6; Рисунок 2; Рисунок 3).
      1. Для первичных фибробластов кожи человека или HEK293T клеток используйте систему электропорации Lonza 4D с буферным SF. Добавьте 200 000 клеток за каждую реакцию к электропорационной кувете объёмом 20 мкл. Запусти программу CM-130. Сразу добавьте 80 мкл предварительно подогретого DMEM + 10% FBS, 4,5 г· L-1 глюкоза, 4 мМ L-глутамин и 110 мг· L-1 пируват натрия. Восстанавливать клетки в течение 10 минут, а затем разбавлять в пластины с 96- или 24 лунками.
      2. Для плюрипотентных стволовых клеток используйте систему электропорации Lonza 4D с буфером P3. Добавьте 200 000 элементов за реакцию в электропорационный кувет объёмом 20 мкл. Запусти программу DN-100. Сразу добавьте 80 мкл предварительно нагретого mTeSR Plus носителя. Восстанавливайте клетки в течение 10 минут, а затем разбавляйте в пластины с 24 лунками.
    4. Ежедневно исследуйте клетки после нанесения пластины, чтобы отслеживать их здоровье и восстановление.

6. Экстракция геномной ДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что геномная ДНК имеет достаточное качество и не содержит ингибиторов до амплификации ПЦР, так как качество ДНК может влиять на подготовку библиотеки секвенирования и точную количественную оценку результатов редактированиягенома 9,10,11.

  1. Промыть и убрать клетки.
    1. Собирайте клетки через 2-3 дня после электропорации. Промыйте клетки DPBS и сразу приступите к извлечению геномной ДНК.
    2. Подготовьте неполный лизисный буфер, объединив 10 мл раствора 1 M Tris-HCl (pH 8,0), 5 мл 10% (масса/объём) натрия додецилсульфата (SDS) и безнуклеазной воды до конечного объёма 1 L. Храните неполный буфер лизиса при комнатной температуре до 6 месяцев.
    3. Свежеприготовление полного лизисного буфера добавить, добавив протеиназу K в разбавлении 1:1 000 (вол/воль) к аликвоту неполного лизисного буфера. Добавьте полный буфер лизиса к клеткам для инициации лизиса. Добавьте 40 мкл полного лизисного буфера в каждую скважину, содержащее примерно 80 000 клеток в пластине на 96 луц. Не поднимайте трубы вверх и вниз, так как это может привести к потере образца.
  2. Переварите образцы.
    1. Инкубировать образцы при 37 °C в течение 60 минут для завершения лизиса клеток и пищеварения протеиназы K.
  3. Инактивировать протеиназу K.
    1. Перенесите лизаты в ПЦР-трубки или в пластину с 96 лунами. Инкубировать образцы при 80 °C в течение 30 минут, чтобы инактивировать протеиназу K.
  4. Храни лизаты.

Точка паузы: Храните лизаты при −20 °C до усиления ПЦР.

7. Целевая последовательность ампликонов для анализа редактирования

ПРИМЕЧАНИЕ: Собирайте продукты ПЦР в эквимолярных количествах до секвенирования. Примерно 10 000 чтений секвенирования на выборку обычно достаточно для количественной оценки результатов массового редактирования генома.

  1. Спроектировать локус-специфические праймеры для генерации примерно 300 ампликонов с частотой не менее 25 bp вверх по потоку и 25 bp ниже участка редактирования (Таблица 7).
  2. Амплифицировать целевой геномный локус путём проведения PCR1 в соответствии с условиями, указанными в таблице 8, таблице 9.
  3. Добавьте уникальные индексы выборок с помощью PCR, используя продукт PCR1 в качестве шаблона, например, с праймерами, показанными во вкладке Таблицы 7 «Примеры праймеров индексирования ПЦР». Используйте условия ПЦР, как показано на вкладке 2 таблицы 8 и 9.
  4. Пропустите продукты PCR1 и PCR2 на геле агарозы с содержанием 1,5%, чтобы подтвердить наличие отдельных полос в ожидаемых размерах.
  5. Объедините продукты PCR2 в эквимолярных количествах. Очистите объединённую библиотеку PCR2 с помощью соотношения шариков к выборке AMPure XP 0,65:1 согласно инструкциям производителя. Элюируйте очищенную библиотеку в 30 мкл воды без нуклеазы и подтвердите удаление адаптерных димеров с помощью гель-электрофореза перед секвенированием.
  6. Количественно определите итоговую объединённую библиотеку с помощью флюорометрического анализа dsDNA. Оценить распределение размера фрагментов с помощью капиллярного электрофореза.
  7. Секвенируйте библиотеки с помощью одноконцевых 300-тактовых считываний на инструменте Illumina MiSeq. Разбавите последнюю объединённую библиотеку до 4 нм. Объедините 5 мкл объединённой библиотеки 4 нМ с 5 мкл 0,1 млн NaOH и пипеткой для смешивания. Инкубировать 5 минут при комнатной температуре до денатурации, затем добавьте 990 мкл охлаждённого HT-буфера, входящего в комплект MiSeq, чтобы нейтрализовать раствор и разбавить до 20 вечера. Скачок в 15% контроля PhiX. Загрузите библиотеку на картридж Illumina MiSeq и запустите одноконцевое 300-тактовое секвенирование с использованием стандартных настроек производителя. Стремитесь генерировать примерно 30 000 чтений на выборку, хотя для анализа редактирования достаточно 10 000 чтений насэмпл. 12. Секвенирование MiSeq можно выполнять на основе отдельных выборок в некоторых компаниях, таких как Genewiz или Quintara.

8. Анализ результатов редактирования генома

Примечание: анализ CRISPResso2 позволяет количественно оценивать общую эффективность редактирования, частоты преобразования нуклеотидов и частоты вставки/удаления (indel), а также может использоваться для характеристики результатов редактирования в экспериментальныхусловиях 15.

  1. Демультиплексируя секвенирующие данные и организуя файлы FASTQ по геномному локусу и экспериментальному состоянию.
  2. Установите CRISPResso2 согласно инструкциям, предоставленным в репозитории Github (https://github.com/pinellolab/crispresso2).
  3. Запустите пакетный анализ CRISPResso2 с использованием batch.txt файлов, которые указывают входные FASTQ-файлы и параметры анализа (примеры приведены в Таблице 7). Установите минимальный балл качества чтения на уровне 30. Установить ширину окна «w» на 20. Если использовать редакторы с цитозиновым основанием, некоторые индели могут быть сосредоточены вокруг нуклеотидов, редактируемых в основании, а не на сайте Nick. В таком случае настройте центр окна «wc» на -10, а не стандартный центр на nick site, чтобы лучше зафиксировать эти indels.
  4. Извлекайте количественные выходы, такие как частоты преобразования нуклеотидов, частоты вставки/удаления (indel) и (если применимо) частоты HDR или простого редактирования из соответствующих файлов сводного вывода. Обычно они находятся в файлах с названиями «CRISPRessoBatch_quantification_of_editing_frequency.txt» и «Nucleotide_percentage_summary.txt», которые можно открыть в Microsoft Excel или другом программном обеспечении для редактирования таблиц.
  5. Экспортировать количественные значения редактирования для дальнейших графиков и интерпретации данных, как на рисунках 3-4. Используйте файлы «alleles_frequency_table_around_sgRNA.pdf» (как показано на рисунке 5) для оценки результатов аллельного редактирования.

Результаты

Использование эффективного редактора с легко доступным тестовым сайтом, такого как базовый редактор ABE8e с контрольным сайтом HEK3, часто может привести к эффективности редактирования выше 90%, если система доставки хорошо подходит для используемых ячеек эксперимента. Снижение эффективности редактирования может возникнуть, если возникают проблемы с мРНК редактора, направляющей РНК, целевым сайтом или условиями доставки, которые делают его менее подходящим для редактирования. Использование вариантов Cas9, которые получают доступ к более универсальным PAM-последовательностям, но менее плотно их связывают, или нацеление редакторов на нуклеотиды, выходящие за пределы их идеального окна редактирования, может снизить эффективность редактирования. Успешные редакторные мРНК, генерируемые IVT, обычно выглядят как одна доминирующая полоса с минимальным размазыванием или низкомолекулярными продуктами деградации, что указывает на высокую целостность транскрипта, подходящую для последующей электропорации (см. рисунок 2).

После электропорации редакторных мРНК и синтетических направляющих РНК большинство клеток восстанавливаются в течение 24–48 часов и сохраняют свою типичную морфологию с помощью соответствующих программ электропорации (см. рисунок 3–4). Условия электропорации следует адаптировать под конкретный тип клетки, так как разные буферы могут давать существенно разные результаты. Онлайн-центр знаний Lonza предлагает рекомендации по буферным и электропорационным кодам для распространённых типов клеток, а Lonza предлагает отдельные наборы оптимизации для клеточных линий и первичных клеток. Эмпирическое сравнение буферов может помочь выявить оптимальные условия для эффективной доставки. Неподходящие программы могут привести к полному отсутствию доставки или быть крайне токсичными для клеток (потерять более 50% или препятствовать продолжению клеточного цикла). Репрезентативные оптимизационные эксперименты показали значительные различия в результатах редактирования в условиях электропорации: одни программы обеспечивали высокую эффективность редактирования, а другие — минимальное редактирование, что подчёркивает важность эмпирической оптимизации для каждого типа ячеек (см. рисунок 3–4).

В iPSC, фибробластах и LCL для количественной оценки эффективности редактирования и побочных продуктов используется таргетированное секвенирование ампликонов с последующим анализом CRISPResso2 (см. рисунок 4). Здесь показана аденин-базовая обработка тестового локуса HEK3 (рисунок 4), что привело к предполагаемым нуклеотидным преобразованиям с низкими инделовыми частотами в анализируемых образцах. Анализ CRISPResso2 позволяет визуализировать редактированные и нередактированные аллели в целевом локусе и облегчает количественную оценку предполагаемых превращений нуклеотидов, частот инделя и других побочных продуктов редактирования, обеспечивая всестороннюю оценку результатов редактирования (см. рисунок 5). Эффективность редактирования количественно измеряется частотой этого точного однонуклеотидного замещения в целевом участке. Локус HEK3 используется как модельный локус благодаря хорошо охарактеризованному профилю редактирования и воспроизводимости в экспериментальных системах, что позволяет надёжно оценивать производительность базового монтажа при различных условиях. Рекомендуем проверить это руководство как положительный контроль в человеческих клетках при оптимизации новых процедур редактирования. Редактирование баз обычно обогащается для предполагаемых нуклеотидных преобразований с низкими инделовыми частотами, тогда как основное редактирование даёт смесь точных правок и низкочастотных побочныхэффектов 3,12. Эффективность редактирования варьировалась в зависимости от состояния, при этом были заметны различия между типами клеток и программами электропорации (рисунок 3-4). Эти вариации, вероятно, отражают различия в клеточном поглощении, жизнеспособности и активности репарации ДНК, а также влияние параметров электропорации на эффективность доставки. В совокупности эти результаты подчёркивают важность оптимизации параметров электропорации по типу клеток для достижения последовательных и максимальных результатов редактирования.

figure-results-1
Рисунок 1. Подготовка редактора мРНК с помощью in vitro транскрипции.
Схематический обзор генерации мРНК редактором. (Шаг 1) Подготовка шаблона плазмиды с последовательностью кодирования редактора и промотором T7. (Шаг 2) Амплификация ПЦР для получения линейного шаблона ДНК. (Шаг 3) Транскрипция in vitro с использованием T7 РНК-полимеразы для синтеза закрытой мРНК. (Шаг 4) Очистка мРНК для удаления шаблонной ДНК, ферментов и свободных нуклеотидов. Полученная капсулированная мРНК подходит для передачи в клетки млекопитающих с помощью электропорации или липидных наночастиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2. Пример изображения мРНК-гель-электрофореза 
Электрофорезное изображение трёх мРНК редактора генома работает на 1% агарозном геле с использованием окраски SYBR Gold. Лестница ssRNA из NEB показана слева с маркерами размера, отмеченными по длине. Отсутствие значительного размазивания или малых полос указывает на то, что эти мРНК имеют подходящее качество. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3. Оптимизация условий электропорации для редактирования генома в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (iPSC). 
Показана эффективность редактирования, достигнутая при различных условиях электропорирования в iPSC. Клетки были электропорированы с помощью нескольких буферов и программных комбинаций, включая буфер CB-150 P4, CD-118 P3, DN-100 P3, DC-100 P3, все на 4D-нуклеофектионном устройстве Lonza. Монтаж оценивался с помощью неонового электропорационного устройства с параметрами (1600 В, 20 мс, 1 импульс). Эффективность редактирования количественно оценивалась с помощью целенаправленного анализа секвенирования редактированного локуса. N=1 на выборку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4. Оптимизация условий электропорирования для редактирования генома в фибробластах.
Эффективность редактирования после электропорации с использованием различных программ нуклеофекции. Фибробласты были электропорированы с помощью нескольких программ нуклеофектора Лонза (CA-137, CM-138, DS-150, EH-100, EN-150, EO-114 и FF-113), а результаты редактирования количественно оценивались с помощью целенаправленного секвенирования. Результаты показаны для двух репликат (P2, P3). Включен негативный контроль без доставки редактора. Сравнение кодов электропорации выявляет различия в эффективности редактирования между условиями электропорации, позволяя определить оптимальные параметры для редактирования генома фибробластов. N=1 на выборку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-5
Рисунок 5. Характеристика результатов редактирования генома на целевом локусе. 
Выход таблицы частот аллелей из CRISPResso2, которая показывает относительную объёмность редактированных и нередактированных аллелей вокруг целевой области sgRNA, определяемую с помощью высокопроизводительного секвенирующего анализа после редактирования. Красные аннотации указывают на окно редактирования базы и уже существующий гетерозиготный полиморфизм, присутствующий в используемой клеточной линии. Последовательность направляющих РНК-спейсеров подчеркнута серым цветом. «Предсказанное положение расщепления», показанное пунктирной линией, смещено относительно типичного положения «PAM минус 3» для SpCas9 из-за изменения центра окна «wc» в нашем анализе пакетного файла (пример в таблице 8). Это фактически не меняет истинное предсказанное местоположение расщепления, но выход показывается таким образом, чтобы показать, что индели вокруг пунктирной линии в окне из 20 нуклеотидов будут оцениваться, фиксируя как индели, центрированные в истинном месте разрыва, так и те, что расположены в деаминированных нуклеотидах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1. Редакторы и последовательности, использованные в этом исследовании 
Колонка 1: Редакторы геномов доступны на AddGene для транскрипции in vitro. Имена и идентификаторы Addgene для доступных плазмид, которые поддаются транскрипции in vitro, как описано в данном протоколе. Колонка 2: Последовательности направляющих РНК-спейсеров, использованных в этом исследовании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2. ПЦР-реагенты для амплификации шаблона плазмиды мРНК.
Список реагентов и компонентов реакций, используемых для ПЦР-амплификации шаблона плазмиды с целью генерации линейной ДНК для последующих приложений, а также последовательность прямых и обратных транскрипционных праймеров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 3. Условия цикла ПЦР для амплификации шаблона мРНК. 
В этой таблице приведены условия термоциклирования, используемые для амплификации ПЦР-амплификации мРНК-шаблона из плазмидной ДНК до последующих приложений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 4. Реагенты, используемые для in vitro. транскрипционных реакций (IVT). 
В этой таблице перечислены реагенты и компоненты реакции, используемые для in vitro транскрипции с целью синтеза мРНК редактора из линейного шаблона ДНК. Пример последовательности шаблонов (ABE8e) показан с элементами, кодированными цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 5. Руководство по устранению неполадок для ключевых этапов в процессе редактирования генома. 
В этой таблице обобщены распространённые технические проблемы, которые могут возникать при подготовке мРНК редактора с помощью in vitro транскрипции (IVT) и анализа секвенирования MiSeq. На каждом этапе рабочего процесса предоставляются потенциальные проблемы, возможные причины и рекомендуемые решения, которые помогают оптимизировать эффективность редактирования и обеспечивать точное обнаружение результатов редактирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 6. Оптимальные программы электропорации для различных типов клеток млекопитающих. 
В этой таблице перечислены коды программ электропорации и условия буфера, используемые для эффективной доставки редактора мРНК и направляющих РНК в различные типы клеток млекопитающих. Перечисленные параметры электропорации были протестированы для выявления условий, максимизирующих эффективность редактирования генома при сохранении жизнеспособности клетки. Одна и та же программа может не работать для каждой ячеточной линии или источника первичных ячеек, поэтому рекомендуется протестировать альтернативы из этого списка, если редактирование изначально не удаётся. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 7. Параметры анализа CRISPResso2 для количественной оценки результатов редактирования генома. 
На первой вкладке приводится пример конструкции капсулы HTS1, используемой для усиления локуса цели. Вторая вкладка содержит пример примеров индексационных праймеров, используемых при подготовке библиотеки. Третья вкладка иллюстрирует пример системы индексирования, используемой для присвоения уникальных индексов каждому выборке при секвенировании. Четвёртая вкладка содержит пример входного пакетного файла для анализа CRISPResso2, а пятая вкладка предоставляет дополнительный пример входного пакетного файла анализа CRISPResso2. Обратите внимание, что окна в центре «wc» настраивается для редакторов оснований, чтобы облегчить обнаружение инделов, центрированных на деаминированных основаниях, помимо тех, что расположены на месте нуклеазного выреза или зареза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 8. PCR1 (Tab 1) и PCR2 (Tab 2) — реагенты для подготовки библиотеки MiSeq.
В этой таблице перечислены реагенты и компоненты реакции, используемые в Tab 1 (PCR1) для амплификации целевых геномных локусов и в Tab 2 (PCR2) для включения специфических индексных последовательностей и адаптеров секвенирования Illumina, генерирующих библиотеки, готовые к секвенированию для анализа MiSeq. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 9. Условия циклирования PCR1 (Tab 1) и PCR2 (Tab 2) для подготовки библиотеки MiSeq.

В этой таблице перечислены условия термоциклирования, используемые в Tab 1 (PCR1) для амплификации целевых геномных областей и в Tab 2 (PCR2) для включения специфических индексных последовательностей и адаптеров секвенирования Illumina, генерирующих библиотеки, готовые к секвенированию для анализа MiSeq. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Обсуждение

Этот протокол обеспечивает рабочий процесс редактирования генома в первичных клетках млекопитающих с использованием электропорации мРНК редактора и синтетических направляющих РНК. Доставка как мРНК, как правило, обеспечивает более эффективное редактирование по сравнению с доставкой плазмид, и мРНК, как правило, проще и более согласована между партиями по сравнению с редакторским белком или рибонуклеопротеином. Когда мРНК и рибонуклеопротеиновые формы базовых редакторов сравнивались в предыдущих исследованиях, мРНК показала лучшую эффективностьредактирования 3. По сравнению с методами доставки плазмид или вирусов, доставка на основе мРНК обеспечивает экспрессию временных веществ и снижает риск интеграции генома, хотя может требоваться оптимизация для различных типов клеток. Помимо снижения эффективности редактирования, использование плазмидной ДНК для редактирования генома несёт риск случайной интеграции в геном целевых клеток и может увеличить риск внецелевого редактирования из-за длительной экспрессии редактора. Сочетание целевого ампликонного секвенирования и CRISPResso2 позволяет стандартизированную количественную оценку эффективности редактирования и характеристику любых аллельныхрезультатов 3.

Для успеха решаются несколько факторов. Ключевые шаги в этом протоколе включают поддержание целостности РНК с помощью строгого обращения без РНаз, выбор оптимальных направляющих РНК и тщательную оптимизацию условий электропорации для каждого типа клеток. Целостность РНК и тщательный контроль РНаз сильно влияют на результаты, а выбор направляющих РНК остаётся основным фактором эффективности и профилей побочных продуктов. Настройки электропорации требуют эмпирической оптимизации по типу ячейки, и некоторые программы с высоким уровнем редактирования также могут вызывать токсичность. Если наблюдается низкая эффективность редактирования, следует рассмотреть оптимизацию параметров электропорации, качества РНК или проектирования направляющей РНК. Если возникает чрезмерная токсичность, снижение силы электропорации или ввода РНК может повысить жизнеспособность клетки. Дополнительные стратегии оптимизации включают тестирование альтернативных буферов электропорации и программ, адаптированных к типу целевых клеток, а также модификацию редакторов или направляющих концентрации РНК. Этот рабочий процесс предоставляет практическую платформу для тестирования редакторов и создания модифицированных ячеек перед последующим клонированием отдельных клеток, фенотипированием, исследованиями in vivo или трансляционной разработкой. Этот рабочий процесс широко применим для оценки стратегий редактирования генома в первичных клетках, позволяя систематически сравнивать методы редактирования в геномных контекстах и типах клеток. Он поддерживает моделирование заболеваний через введение или коррекцию клинически значимых вариантов, а также функциональный анализ кодирующих и некодируемых регуляторных элементов. Кроме того, он предоставляет платформу для оптимизации терапевтических методов редактирования, включая оценку эффективности точности цели, активности вне цели и долговечности редактирования. Рабочий процесс также может использоваться для скрининга и приоритизации направляющих РНК и систем редактирования, оценки стратегий доставки и тестирования специфических вариантов пациента в рамках прецизионной медицины. В совокупности он служит универсальным мостом между базовой биологией генома, трансляционными исследованиями и доклиническими разработками. Ограничением этого метода является то, что эффективность электропорации и жизнеспособность ячеек могут существенно различаться между типами ячеек, что требует эмпирической оптимизации. Кроме того, результаты редактирования могут зависеть от конструкции и чистоты направляющей РНК, а также от доступности целевого локуса, что может ограничивать воспроизводимость между различными экспериментальными системами. Несмотря на эти ограничения, тщательная оптимизация экспериментальных параметров и проектирование направляющих позволяет минимизировать вариабельность, обеспечивая надёжное и воспроизводимое применение этого подхода в различных клеточных системах.

Раскрытие информации

N.W. и E.V.B. подали патентные заявки на технологии редактирования генома через Университет Джонса Хопкинса. G.A.N. подала патентные заявки, связанные с технологиями редактирования генома, через Институт Броуда и Университет Джонса Хопкинса.

Вклад автора:
M.V., J.N.W., E.V.B, D.M.E., J.D. и G.A.N. каждый подготовил отдельные разделы текста. М.В. собрал и отредактировал итоговый текст, после чего последовали правки от всех авторов.

Благодарности

Благодарим Беатрис Олалла Састре за полезные обсуждения, связанные с этим протоколом. Эта работа была поддержана наградой Big Beat Challenge от Британского фонда сердца для CureHeart (номер награды). BBC/F/21/220106), Фонду муковисцидоза (награда NEWBY23XX0) и Национальных институтов здравоохранения США (R00HL163805 и DP2OD038783 к G.A.N.). J.N.W. подтверждает поддержку гранта NIH No T32 GM148383.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1M Tris-HCl, pH 8.0Thermo Fisher Scientific15568025
Агароза Thermo Fisher Scientific R0491 Агароза UltraPure 16500500 ThermoFisher 500г
AMPure XP SPRI Beads Beckman Coulter B23317 A63880, AMPure XP Beads для очистки ДНК, 5 мл, Beckman Coulter
АТФ (100 мМ) New England Biolabs N0450 
Коктейль CEPT Bio-Techne / Tocris 7200 
Реагент CleanCap AG TriLink Biotechnologies N-7113 CleanCap AG 3’ OMe CleanScript IVT Kit, 125 x 20 мкл реакций, 
ЦТФ (100 мМ) New England Biolabs N0450 
Настраиваемые ДНК-праймеры Integrated DNA Technologies Настраиваемые 
ДНК-краситель для загрузки New England Biolabs B7024 
DPBS (фосфатный буфер Dulbecco) Thermo Fisher Scientific 14190-144 D8537-100ML
Модифицированная среда Дульбекко (DMEM) Thermo Fisher Scientific 11965-092 DMEM с высоким содержанием глюкозы [4,500 мг/л] с [4,0 мМ] L-глутаминной кислоты и [110 мг/л] натрия пирувата, 500 мл
Набор для извлечения гелированной ДНК Qiagen 28704 
ГТФ (100 мМ) New England Biolabs N0450 
Праймеры индексации Illumina Illumina FC-131-2001 10 мкМ запасы
Секвенсор Illumina MiSeq Illumina SY-410-1003 
Раствор для осадки РНК с хлоридом лития Thermo Fisher Scientific AM9480 
Система нуклеоэкфекции Lonza 4D Lonza AAF-1002X 
ssRNA Ladder NEBNEBN0362S5мкл/реакция
Набор реагентов MiSeq v3 (300 циклов) Illumina MS-102-3002 
N1-Метил-псевдоуридин-5’-трифосфат TriLink Biotechnologies N-1081 
NEBNext Ultra II Q5 Master Mix New England Biolabs M0544 
Безнуклеазиды вода Thermo Fisher Scientific AM9937 
NucleoCounter NC Slide A8 ChemoMetec 941-0008 
NucleoCounter NC-3000 ChemoMetec NC-3000 10 мкл клеточного раствора и 0.4167 мкл раствора DAPI 
Решение 15, Hoechst 33342, 1 мл 910-3015 ChemometecChemometec910-3013 500 мкг/мл ~ 0.9 мМ ~ 0.05%
Nucleocuvette Strips Lonza V4XP-3032 
Решение для нуклеоэкфекции P3 Primary Cell Lonza V4XP-3032 1 х 0.675 мл P3 Primary Cell Nucleofector® Solution
Phusion High-Fidelity ДНК-полимераза Thermo Fisher Scientific F530L 
Протеиназа К Thermo Fisher Scientific EO0491 Количество: 1мл, >600 U/мл (~20 мг/мл)
Q5 High-Fidelity ДНК-полимераза New England Biolabs M0491 2,000 единиц/мл 100 единиц 
Набор для очистки ПЦР QIAquick Qiagen 28104 
Набор для определения чувствительности Qubit dsDNA Thermo Fisher Scientific Q33230 
Набор для определения чувствительности Qubit RNA Thermo Fisher Scientific Q10211 
Тестовые пробирки Qubit™Thermo Fisher ScientificQ32856
Краситель для загрузки РНК в гель (2x)Thermo Fisher ScientificR06415мкл/реакция
Набор для очистки РНК Zymo Research R1017 
RNase Away Thermo Fisher Scientific 1236B62 
Раствор СДС, 10%Thermo Fisher Scientific 15553027
SYBR Gold красители для гелевого окрашивания нуклеиновых кислотThermo Fisher ScientificS11494
SYBR Safe DNA Gel Stain Thermo Fisher Scientific S33102 
Синтетические sgRNA / pegRNA Synthego / IDT Настраиваемые 2мкг 
Комплект для синтеза РНК HiScribe T7 High Yield, 250 реакцийNew England Biolabs E

Ссылки

  1. Gao H, Gao S, Kan G, Valentovich LN, An Y. Research progress of base editing and prime editing tools based on the CRISPR/Cas system. Mol Ther Nucleic Acids. 2025;36.
  2. Chen PJ, Hussmann JA, Yan J, et al. Enhanced prime editing systems by manipulating cellular determinants of editing outcomes. Cell. 2021;184(22):5635–5652. doi:10.1016/j.cell.2021.09.018.
  3. Newby GA, Yen JS, Woodard KJ, et al. Base editing of haematopoietic stem cells rescues sickle cell disease in mice. Nature. 2022;595(7866):295-302. doi:10.1038/s41586-021-03609-w.
  4. Sousa AA, Hemez C, Lei L, et al. Systematic optimization of prime editing for the efficient functional correction of CFTR F508del in human airway epithelial cells. Nat Biomed Eng. 2024;9(1):7. doi:10.1038/s41551-024-01233-3.
  5. Mayuranathan T, Newby GA, Feng R, et al. Potent and uniform fetal hemoglobin induction via base editing. Nat Genet. 2023;55(7):1210-1217.
  6. He W, Zhang X, Zou Y, et al. Effective synthesis of high-integrity mRNA using in vitro transcription. Molecules. 2024;29(11).
  7. Popova PG, Lagace MA, Tang G, Blakney AK. Effect of in vitro transcription conditions on yield of high-quality messenger and self-amplifying RNA. Eur J Pharm Biopharm. 2024;198.
  8. Zhang F, Wang Y, Wang X, et al. RT-IVT method allows multiplex real-time quantification of in vitro transcriptional mRNA production. Commun Biol. 2023;6(1).
  9. Montague TG, Cruz JM, Gagnon JA, Church GM, Valen E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Res. 2014;42(W1)-W407.
  10. Concordet JP, Haeussler M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Res. 2018;46(W1)-W245.
  11. Mohr SE, Hu Y, Ewen-Campen B, Housden BE, Viswanatha R, Perrimon N. CRISPR guide RNA design for research applications. FEBS J. 2016;283(17):3232-3245.
  12. Huang TP, Newby GA, Liu DR. Precision genome editing using cytosine and adenine base editors in mammalian cells. Nat Protoc. 2021;16(2):1089-1106. doi:10.1038/s41596-020-00450-9.
  13. Doman JL, Sousa AA, Randolph PB, Chen PJ, Liu DR. Designing and executing prime editing experiments in mammalian cells. Nat Protoc. 2023;18(6):1780-1818. doi:10.1038/s41596-022-00724-4.
  14. Chicaybam L, Barcelos C, Peixoto B, et al. An efficient electroporation protocol for the genetic modification of mammalian cells. Front Bioeng Biotechnol. 2017;4:99.
  15. Clement K, Rees H, Canver MC, et al. CRISPResso2 provides accurate and rapid genome editing sequence analysis. Nat Biotechnol. 2019;37(3):224-230.

Перепечатки и разрешения

Теги

233233IVT
Редактирование генома в первичных клетках млекопитающих посредством электропорации редакторской РНК
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.