Методическая статья

Трансляционная модель преждевременного поросята для неонатального сепсиса

134 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71456

⸱

10 июля 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1Comparative Pediatrics, Department of Veterinary and Animal Sciences, University of Copenhagen, 2BRIDGE Translational Excellence Programme, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Модели бактериального сепсиса у недоношенных новорождённых являются необходимыми, однако существующие модели грызунов не имеют клинической значимости. Была разработана высокотрансляционная модель неонатального сепсиса с использованием недоношенных поросят, инфицированных живым Staphylococcus epidermidis.

Аннотация

Преждевременно рожденные дети особенно подвержены бактериальным инфекциям, которые могут быстро перерасти в опасный для жизни сепсис — состояние чрезмерного воспаления и нарушения функции органов. Для изучения механизмов заболевания и продвижения в терапевтической разработке крайне необходимы надёжные трансляционные животные модели, воспроизводящие сложную патофизиологию и клинические проявления неонатального сепсиса. Этот протокол представляет клинически значимую модель неонатального сепсиса у недоношенных поросят, вызванную внутриартериальной инфузией живого Staphylococcus epidermidis вскоре после рождения или на третий день после родов. Поросята рождаются на 90% беременности кесаревым сечением и содержатся в условиях неонатальной интенсивной терапии. К ним относятся инкубаторы с контролируемой температурой и кислородом, а также катетер внутреннего пуповина, который позволяет доставлять парентеральное питание и серийно брать образцы крови. После заражения S. epidermidis поросят находятся под наблюдением в течение 24–48 часов. Частота и тяжесть сепсиса могут зависеть от дозы бактерий и поступления парентеральной глюкозы. Повышенное количество парентеральной глюкозы ускоряет провоспалительный иммунный ответ, что приводит к клиническому ухудшению. Летальный сепсис и гуманные конечные точки определяются параметрами газов артериальной крови (pH ≤ 7,1) в сочетании с клиническими признаками гемодинамического нарушения, такими как вялость, изменение цвета кожи и тахипноэ. Эта модель предоставляет уникальную платформу для изучения того, как энергетический метаболизм и иммуномодуляторы влияют на очищение бактерий, системное воспаление и повреждение тканей во время неонатальной инфекции. Он обладает значительным потенциалом для формирования клинических стратегий профилактики и лечения неонатального сепсиса.

Введение

Неонатальная инфекция является ведущей причиной смертности и долгосрочной заболеваемости во всём мире, особенно среди недоношенных младенцев, а также у младенцев с низкой массой при рождении или перинатальнымиосложнениями 1,2. Ранняя диагностика остаётся сложной из-за неспецифических клинических признаков, незрелых и сильно изменчивых иммунных ответов, а также отсутствия чувствительных и специфических биомаркеров, способных отличить инфекцию от неинфекционноговоспаления 3,4. В результате клиницисты часто начинают эмпирическую терапию широкого спектра антибиотиков, часто до микробиологического подтверждения, что способствует чрезмерному использованию антибиотиков, нарушению микробной колонизации в раннем возрасте и развитию антимикробнойрезистентности 5.

Неонатальный сепсис — это угрожающее жизни состояние, вызванное нарушением реакции хозяина на инфекцию, что приводит к нарушению функцииорганов 4. Хотя инфекция и сепсис представляют собой разные биологические и клинические образования, эти термины часто используются взаимозаменяемо в неонатологической литературе. Клинически неонатальный сепсис обычно классифицируется как ранний или поздний сепсис (EOS, LOS), возникающий до или после 72 часов жизни соответственно1. EOS обычно вызывается патогенами, перенесёнными при рождении, такими как Escherichia coli или стрептококк группы B. В отличие от этого, ЛОС часто проявляется с неспецифическими симптомами, может быть негативным по культуре и связан с такими факторами риска, как инвазивные процедуры, парентеральное питание и длительная госпитализация. Наиболее распространёнными причинителями являются коагулаза-отрицательные стафилококки, особенно Staphylococcus epidermidis, а также грамотрицательные бактерии, хотя также встречаются грибковые и полимикробныеинфекции 1,2,6. Независимо от этиологии, неонатальные инфекции могут сходиться на распространённом фенотипесепсиса 1,2. Важно, что недоношенные младенцы демонстрируют незрелость как врождённого, так и адаптивного иммунитета, а также ограниченные метаболические резервы, что может влиять на реакцию наинфекцию 7.

Прогресс в диагностике и лечении был замедлен ограничениями существующих экспериментальных систем. Подходы in vitro позволяют проводить механистические исследования иммунных путей, но не охватывают интегрированную физиологию сложных иммунных ответов. Модели грызунов, хотя и ценны для генетических и молекулярных исследований иммунных ответов новорождённых, существенно отличаются от человеческих по иммунному онтогенезу, обмену веществ иразмеру 8,9. Клиническое лечение сепсиса трудно изучать в этих моделях из-за ограниченных возможностей интенсивного мониторинга, повторного анализа крови и тестирования клинически реалистичной поддерживающей или терапевтической помощи.

Крупные животные модели, особенно недоношенные новорождённые, предлагают мощный дополнительный подход. Свиньи имеют близкие анатомические, физиологические и иммунологические сходства с людьми, включая сопоставимые популяции иммунных клеток, сигнализацию рецепторов распознавания паттернов и метаболическуюрегуляцию 10,11,12,13,14. Важно, что свиньи широко используются как модели для взрослыхсепсисов 13,15. Физический масштаб свиней позволяет использовать клинически значимые инструменты, непрерывный физиологический мониторинг, повторный биопробный анализ и стандартизированные интенсивные вмешательства, такие как парентеральное питание, жидкостная терапия, антибиотики и респираторная поддержка. Экспериментальная инфекция также может изучаться в контексте развивающей незрелости, что позволяет изучать траектории болезни, реакции хозяина и эффекты лечения при условиях, близких к клинической практике.

В этой статье описывается стандартизированная модель неонатального сепсиса у недоношенных поросят, разработанная как гибкая трансляционная платформа. Модель позволяет контролируемо индукцировать системную бактериальную инфекцию и проводить продольную оценку клинических, иммунологических и метаболических ответов, что может быть использовано для изучения патофизиологии неонатального сепсиса и оценки эффективности новых профилактических и терапевтических вмешательств.

Протокол

Все детализированные процедуры проводились в соответствии с директивой ЕС 2010/63/EU для экспериментов на животных и утверждён Датской инспекцией по экспериментам на животных (номер лицензии: 2020-15-0201-00520).

1. Процедуры, связанные с родами

  1. Проводите плановое кесарево сечение для родов недоношенных поросят на 90% срока беременности (106–107 дни беременности).
    1. Заведите беременную свиноматку (Landrace × Large White, третья или четвёртая паритета) на коммерческой ферме, свободной от специфических патогенов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Свиноматка должна быть оплодотворена искусственным оплодотворением (× Дюрок), чтобы точно знать дату зачатия.
    2. Постите свиноматку на ночь (минимум 12 часов) с импровизованным доступом к воде перед операцией. Индуцировать седацию с помощью внутримышечной инъекции коктейля, содержащего атропин (2 мл на свиноматку), буторфанол (2 мл/100 кг массы тела; 10 мг/мл) и Золетил 50 Вет (3,3 мл/100 кг массы тела; тилетамин 25/мл и золазепам 25 мг/мл).
    3. После седации введите катетер в ушную вену и индуцируйте общую анестезию пропофолом (10 мг/мл), затем титруйте до потери пальпебрального рефлекса и тонуса челюсти.
    4. Проведите эндотрахеальную интубацию под прямой ларингоскопией для закрепления дыхательных путей. Поддерживайте хирургическую плоскость анестезии на протяжении всего кесаревого сечения с использованием испарённого изофлурана, подаваемого в 100% кислороде (1–2 л/мин) с помощью калиброванного вапорайзера.
    5. Начинайте с 5% и поддерживайте концентрацию 1,5–2,5%, повышая концентрацию до минимальной эффективной дозы в зависимости от частоты сердечных сокращений и насыщения кислорода периферии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если возникает апноэ, начните искусственную вентиляцию вентиляции воздуха для обеспечения достаточного насыщения кислородом.
    6. Разместите свиноматку в правом боковом положении. Проведите асептическую обработку места операции. Введите общий объём лидокаина 120 мл (10 мг/мл) через подкожную и внутримышечную инфильтрацию вдоль предполагаемой линии разреза левого фланга.
    7. Проведите лапаротомию на левом боку с помощью скальпеля, чтобы обнажить и экстерьерить рога матки. Разрезать рога матки вдоль большей кривизны, чтобы родить индивидуальных поросят.
    8. Перед пересечением пуповины доите пуповину 2–3 раза в сторону поросёнка, чтобы увеличить концентрацию гемоглобина и запасы железа. Надевайте пупоковый зажим с маркировкой A–Z вокруг пуповины вместе с марлей, чтобы предотвратить кровотечение, и перерезайте пуповину.
    9. Сразу после родов поместите каждого поросёнка в полиэтиленовый мешок, оставив голову открытой. Мешок минимизирует потери тепла, тем самым снижая риск гипотермии.
    10. Введите фиксированный объём 0,1 мл доксапрама (20 мг/мл) и 0,1 мл флумазенила (0,1 мг/мл) внутримышечно в шею. Доксапрам стимулирует спонтанное дыхание, тогда как флумазенил, антагонист бензодиазепинов, частично отменяет анестезию, передаваемую от свиноматки во время кесарева сечения.
    11. Переведите поросят в отделение интенсивной терапии новорождённых.
  2. Реанимация, рандомизация и катетеризация
    1. Взвесьте и определите пол каждого поросёнка после перевода в отделение интенсивной терапии новорождённых.
    2. Для поросят, не способных дышать самостоятельно, проводите реанимацию индивидуально. Повторяйте дозы доксапрама и/или флумазенила, обеспечивая вентиляцию с положительным давлением при необходимости для стабилизации дыхания.
    3. Когда поросята будут физиологически стабильны и всё ещё находятся под анестезией после материнской анестезии, используйте асептическую технику для установки пупочного артериального катетера (4 Fr ПВХ-трубка) в одну из артерий перерезанной пуповины. Продвигайте кончик катетера к дорсальной аорте. Закрепите катетер на коже швами и подключите его к инфузионной линии для парентерального питания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: У недоношенных поросёнок внутриартериальное введение является установленным стандартом по пупке вены, чтобы избежать возможного некроза печени, вызванного высоким риском неправильного расположения кончика катетера в печени паренхимы, а не в венозномпротоке 21.
    4. Стратифицируйте поросят по весу при рождении и полу и случайным образом распределите их по группам лечения.
  3. Жилищные условия
    1. Каждое поросёнок помещается по отдельности в подогреваемый, мягкий инкубатор с контролируемой вентиляцией.
    2. Дайте дополнительный кислород (1–2 л/мин) в течение 12 часов после рождения, чтобы предотвратить гипоксию.
    3. Следите за температурой прямой кишки в первые 12 часов после рождения. Регулировать условия нагрева по необходимости, чтобы поддерживать температуру ядра 38–39 °C (цель: 38,5 °C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидается короткий период гипотермии сразу после рождения и во время установки катетера.

2. Пассивная иммунизация с помощью плазменной инфузии

ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку свиньи не переносят иммуноглобулины трансплацентарно, проводите частичную пассивную иммунизацию для экспериментов, длящихся более 24 часов, чтобы предотвратить спонтанные инфекции.

  1. Соберите материнскую кровь свиноматки после кесарева сечения в стерильный контейнер, покрытый гепарином. Центрифугуйте кровь в стерильных трубках Falcon при 4 °C, 2500 × g, в течение 10 минут, повторите один раз. После отделения аккуратно соберите плазму в новые стерильные трубки Falcon и храните при 4 °C до использования.
  2. В течение 12 часов после рождения введите плазму в дозе 8 мл/кг в виде 30-минутной непрерывной внутриартериальной инфузии с помощью инфузионного насоса.

3. Индукция экспериментальной инфекции

ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальная инфекция может быть вызвана либо через 3–4 часа после рождения, либо на 3-й день после родов.

  1. Подготовка бактериальной суспензии
    1. Разморозить замороженный флакон S. epidermidis (WT-1457, 15–25% глицерила) при комнатной температуре. Кратковременно (2–3 секунды) вихрь для получения однородной суспензии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Согласно классификации группы риска инфекционных агентов, S. epidermidis относится к микроорганизмам группы риска ВОЗ 1. Микроорганизмы группы риска ВОЗ 1 вряд ли вызывают заболевания у человека и не требуют особых соображений.
    2. Подготовьте ночной посев, инокуляцируя 20 мл бульона для инфузии мозга (BHI) 5 мл размораженного бульона S. epidermidis в стерильную колбу Erlenmeyer объемом 100 мл. Инкубировать при 37 °C с орбитальными колебаниями при 180 об/мин в течение ~16 часов, позволяя культуре перейти в стационарную фазу. Включите невакцинированный контроль бульона BHI в аналогичных условиях для проверки средней стерильности.
    3. Приготовьте новую культуру, инокуляцируя 20 мл BHI бульона 200 мл ночной культуры (разбавление 1:100) в стерильную колбу Erlenmeyer объёмом 100 мл. Подготовьте достаточный посев для заражения всех поросят (см. расчёты в шагах 3.1.4 – 3.1.6). Инкубировать при 37 °C с орбитальными колебаниями при 180 об/мин в течение 2,5 часа, пока бактерии не достигнут ранней логарифмической фазы роста (дополнительный рисунок 1A).
    4. Оценить общий объём культуры, необходимый для заражения всех поросят, исходя из титрированной целевой дозы, средней массы тела, количества поросят и плотности культуры.
    5. Предположим, что культура достигнет оптической плотности при 600 нм (OD) ≥1 (дополнительный рисунок 1B) после 2,5 часа инкубации и используйте установленную коэффициент преобразования OD 1 = 3 × 108 единиц формирования колоний (CFU)/мл.
    6. Включите 15% дополнительного объёма для учёта убытков. Рассчитайте оценочный объём посева с помощью формулы:
      V Оценка = [Целевая доза (CFU/кг BW) × BW) × BW × N × 1,15] / 3 × 108 CFU/mL (1)
      где:
      VОценка = оценочный общий объем культуры (мл)
      BW = средний вес тела поросёнка (кг)
      N = общее количество поросят
    7. После инкубации определите дозу культуры. Разбавлять образец по мере необходимости, чтобы показания оставались в линейном диапазоне спектрофотометра.
    8. Рассчитайте окончательный объём культуры, необходимый для достижения целевой концентрации КФУ, используя формулу:
      VФинал = OD1 · Оценка V / Измеренный передоз (2)
      где:
      VFinal = требуемый конечный объём культуры (mL)
    9. Перенесите рассчитанный VFinal в трубки Falcon объёмом 50 мл и центрифугуйте при 3 000 × г в течение 10 минут при комнатной температуре.
    10. Аккуратно отбросьте супернатант.
    11. Суспензировать бактериальную гранулу в 3 x V Final стерильного раствора 0,9% физиологического раствора для подготовки к внутриартериальному вводу (3 мл/кг массы тела за 3 минуты). Убедитесь, что раствор свободен от заполнителей.
    12. Приготовьте инфузионные шприцы объемом 50 мл с бактериальной суспензией.
    13. Приготовьте отдельный инфузионный шприц на 50 мл с стерильным раствором 0,9% для неинфицированных контролей.
  2. Процедура заражения
    1. Вводите бактериальную суспензию или стерильный физиологический раствор каждому поросёнку через пуповинный артериальный катетер с помощью инфузионного насоса, чтобы доставить целевую дозу в течение 3 минут. Соблюдайте 5-минутный интервал между поросятами подряд.
    2. Сразу после заражения начните непрерывную инфузию парентерального питания для промывки катетера и обеспечения полной дозы.
    3. Подтвердите дозу, сохраняя бактериальную суспензию при 4 °C. Позже её можно разбавить и покрыть на пластинах кровяного агара, чтобы определить плотность бактерий (см. шаг 8).

4. Парентеральное питание

  1. Обеспечивать поросят полным парентеральным питанием (TPN) на протяжении всего эксперимента. Например, используйте трёхкамерный человеческий TPN-пакет, например Kabiven 1900 ккал, модифицированный для удовлетворения потребностей новорождённых поросяток в макронутриентах.
  2. Приготовьте парентеральное питание в стерильных условиях.
    1. Удалите 300 мл из глюкозной камеры.
    2. Удалите 70 мл из липидной камеры.
    3. Добавьте 155 мл 50% глюкозы в глюкозную камеру.
    4. Добавьте 214 мл Вамина в глюкозную камеру.
    5. Добавьте 150 мл стерильной воды в глюкокамеру.
    6. Добавьте 0,1 мл гепарина (5000 IE/mL) в глюкозную камеру.
    7. Тщательно перемешайте содержимое всех трёх камер.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это приводит к парентеральному питательному раствору с составом макронутриентов, указанным в Таблице 1. Используйте эту формулу как стандартную контрольную диету при оценке влияния альтернативных питательных режимов на реакцию на инфекцию.
    8. Парентеральное питание храните при 4 °C до использования. Готовьте раствор партиями и не используйте его дольше 48 часов после подготовки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Модель может быть модифицирована для оценки эффектов энтерального кормления и стимуляции кишечника, установив поросяткам орогастральные трубки для кормления.
  3. Доставка парентерального питания
    1. Наполните стерильные инфузионные шприцы объёмом 50 мл парентеральной пищей и вводите их непрерывно через внутриартериальный катетер с помощью инфузионного насоса.
    2. Установите скорость инфузии на 6 мл/кг/ч. Взвешивайте поросят ежедневно и корректируйте дозу в зависимости от обновлённого веса тела.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для долгосрочных исследований, если наблюдается периферический отёк (перегидратация), снижайте скорость инфузии до 4 мл/кг/ч.
    3. Регулярно следите за инфузионными насосами, чтобы шприцы не опустели. Заправляйте шприцы по мере необходимости.

5. Клинический мониторинг

  1. Регулярно оценивайте поросят на протяжении всего исследования, чтобы определить, нужны ли действия. После бактериальной инфузии животных следует наблюдать каждые 1–2 часа опытным персоналом до плановой эвтаназии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клиническое ухудшение, переход от отсутствия симптомов к гуманным конечным показателям, может произойти быстро — в течение 30–60 минут.
    1. Обратите внимание на симптомы, связанные с дыханием, включая тахипноэ, дыхательные недостаточности, цианоз и агональное дыхание.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В случаях гипоксии (насыщение кислородом < 80%) необходимо инициировать или увеличить подачу кислорода.
    2. Наблюдайте симптомы, связанные с кровообращением, включая изменение цвета, холодные конечности, длительное время пополнения капилляров, тахикардию и брадикардию.
    3. Наблюдайте симптомы, связанные с активностью, включая вялость, неспособность стоять или ходить (актуально с третьего дня после родов), а также реактивность на болевые стимулы.
    4. Обратите внимание на симптомы, связанные с свертываемостью, такие как экхимоз или петехиальное кровотечение в коже. Аккуратно давите на обесцвеченные участки; Если покраснение не бланширует, можно отнести это к кровотечению с кожи.
  2. Если наблюдаются клинические симптомы, проводите измерения газов в крови для оценки pH, лактата, насыщения кислородом и парциального давления углекислого газа относительно исходных значений (см. шаг 6.3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Непрерывный клинический мониторинг (например, артериального давления, частоты сердечных сокращений и частоты дыхания) может использоваться, но в этих экспериментах он не применяется рутинно.

6. Анализ крови

ПРИМЕЧАНИЕ: Продольный анализ крови у поросят может проводиться через внутриартериальный катетер или яремную венинкцию. Общий объём анализируемой анализации крови не должен превышать 7,5% от предполагаемого общего объёма крови (~7% от массы тела). Все процедуры анализа крови должны соответствовать местным этическим нормам.

  1. Внутриартериальный катетерный анализ крови
    1. Используя чистые, в перчатках руки, аккуратно подключитесь к катетерному порту. Перед открытием продезинфицируйте место доступа этанолом. Избегайте загрязнения инфузионной линии.
    2. Убрать минимум 2 мл крови и отложить её, так как этот объём может быть загрязнен парентеральной пищей из инфузионной линии. Поддерживайте стерильность изъятия образца.
    3. Соберите необходимый объём крови для анализа. Например, для гематологических анализов для анализа крови следует собирать в пробирках с ЭДТА, а образцы для анализа газов крови — с помощью шприцев, покрытых гепарином.
    4. После завершения отбора образцов повторно введите изначально изъянные 2 мл крови в поросёнка и аккуратно подключите катетер к парентеральной линии инфузии.
  2. Анализ яремной вены крови
    1. Вынимите поросёнка из инкубатора и поместите его в спинное положение, чтобы обнажить область шеи. Надёжно фиксируйте поросёнка, чтобы предотвратить движение и обеспечить безопасный доступ к яремной вене.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Венипункция яремной вены связана с потенциальными рисками, включая кровоизлияние, образование гематомы и повреждение дыхательных путей. Решение о проведении этой процедуры следует тщательно взвесить с научной значимостью результатов.
    2. Определите приблизительное анатомическое расположение яремной вены и продезинфекцируйте место прокола этанолом.
    3. Проведите венипункцию яремной вены с помощью системы Vacutainer и соберите необходимый объём крови. Например, соберите 0,2 мл крови и храните образец при 4 °C до бактериального покрытия.
    4. Оказывайте давление на место венипункции до достижения гемостаза. Затем верните поросёнка в его инкубатор.
    5. Продолжайте наблюдать за поросёнком на предмет признаков возобновления кровотечения. Если происходит значительное кровотечение, усыпьте поросёнка. Также следите за образованием подкожной гематомы или внутренним кровотечением, которые могут навредить дыхательным путям.
  3. Измерения газов крови
    1. Проверьте образец крови в гепаринизированном шприце на наличие пузырьков воздуха. Если пузырьки присутствуют, аккуратно выделяйте или смещайте их, постукая по шприцу, чтобы не изменять размеры газа.
    2. Транспортируйте образец к газоанализатору крови и следуйте инструкциям производителя. Убедитесь, что образец обработан своевременно для поддержания точности.

7. Критерии сепсиса и гуманные конечные показатели

  1. Усыпить поросят после достижения заранее определённых гуманных целей, свидетельствующих о сепсисе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для других патологий или ятрогенных повреждений обратитесь к местным этическим рекомендациям для гуманных конечных целей.
    1. Используйте pH крови как основной индикатор сепсиса и основную гуманную конечную точку. Немедленно усыпить поросят с pH крови ≤ 7.1. Для поросят с pH крови ≤ 7,2 повторяйте измерения газов каждые 15–30 минут и следите за безопасными гуманными конечными точками.
    2. В качестве вторичных гуманных целей эвтаназия поросят независимо от pH крови при проявлении распространённого внутрисосудистого свертывания, включая экхимоз или петехиальное кровотечение, остановку дыхания, глубокую вялость и/или отсутствие реакции на болевые стимулы (подтверждение отсутствием отмены после лёгкого защиптывания межпальцевого пространства анатомическими щипцами).
  2. Анестезия поросёнка с помощью внутримышечной инъекции смеси на основе золетила (0,1 мл/кг).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Восстановите один флакон Золетила 50 Вет (тилетамин 125 мг, золазепам 125 мг) до 10 мл, используя 6,25 мл ксилазина (20 мг/мл), 1,25 мл кетамина (100 мг/мл) и 2,5 мл буторфанола (10 мг/мл). Конечные концентрации — по 12,5 мг/мл тилатамина, золазепама, ксилазина, кетамина и 2,5 мг/мл буторфанола.
  3. Подтвердить адекватную глубину анестезии при отсутствии отменного рефлекса в ответ на болезненный стимул (см. шаг 7.1.2).
  4. Провести эвтаназию путём внутрисердечной инъекции передозировки пентобарбитала натрия (3 мл/кг; 400 мг/мл).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Внутрисердечный анализ крови может проводиться перед эвтаназией с использованием системы Вакутейнера.

8. Бактериальное покрытие и количественная оценка

  1. Количественно измерить плотность бактерий в крови с помощью образцов венипункции яремной вены, собранных во время эксперимента, и образцов сердечных пункций, взятых при эвтаназии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте кровь, взятую из артериального катетера, так как она может содержать остаточные бактерии от первоначальной экспериментальной инфекции, которые могут запутать количественные оценки.
    1. Подготовьте тарелку для агарной овечьей крови для каждого образца крови, отметьте квадранты 0, -1, -2 и -3 внизу, а на пластине отметьте идентификатор животного и временную точку.
    2. Используя 50 мкл крови из каждого образца, приготовьте 10-кратное разбавление 10-1, 10-2 и 10-3 в 450 мкл стерильного PBS в микроцентрифугных пробирках объёмом 1,5 мл.
    3. Определите каждую пластину с тремя каплями по 20 мкл соответствующего разбавления в назначенном квадранте, распределяя расстояния для предотвращения контакта или переноса и предотвращения аэрозолизации.
    4. Инкубировать тарелки на ночь при 37 °C, затем хранить тарелки при 4 °C до подсчёта.
    5. Посчитайте все бактериальные колонии в разбавлении, содержащие примерно 10 колоний на пятно. Включают только колонии S. epidermidis, которые обычно белые, круглые и гладкие. Тщательно осматривайте и фиксируйте любые колонии с изменённой морфологией, так как они могут указывать на загрязнение, например, в результате отбора проб. Вычислите CFU/mL с помощью следующего уравнения:
      (CFU/mL) = [(количество колоний · коэффициент разбавления)/(3 · 20 μL)] · [1000μл/мл] (3)

Результаты

Эксперимент с доза-ответом был проведён на недоношенных поросятах, выращиваемых до 5-го дня после рождения (рисунок 1). На третий день после родов поросяткам была введена либо низкая доза S. epidermidis (109 КОЕ/кг, n = 9), либо высокая доза S. epidermidis (5 × 109 КОЕ/кг, n = 9), либо физиологический раствор в качестве контроля (n = 3), и наблюдали их в течение 44 часов.

После инфузии S. epidermidis бактериальная нагрузка в крови оставалась выше на протяжении 44-часового периода наблюдения у поросят, получавших высокую дозу, по сравнению с низкодозированной группой (см. рисунок 2A, P < 0,05). Только поросята из группы высоких доз (3/9) развили сепсис, начало которого наступало примерно через 12–15 часов после инфекции (рисунок 2B). В соответствии с этим, поросята, получавшие высокую дозу S. epidermidis , демонстрировали более низкий pH крови через 12 часов (рисунок 2C, P < 0,001), сопровождавшееся заметным повышением парциального давления углекислого газа (pCO₂) (рисунок 2D, P < 0,01) по сравнению с группой с низкой дозировкой.

Во время острой фазы инфекции (6 ч) обе инфицированные группы демонстрировали более низкий избыток оснований и более высокий уровень лактата по сравнению с физиологическими контрольными растворами, при этом более выраженные изменения сохранялись до 12 часов в группе с высокими дозами S. epidermidis (рисунок 2E, F, P < 0,01 – 0,05). Уровень глюкозы в крови не различался между группами (см. рисунок 2G).

Через 6 часов обе инфицированные группы также показали устойчивое истощение нейтрофилов в крови по сравнению с неинфицированными контролями (рисунок 3A, обе P< 0,001). Позже, в ходе инфекции, в обеих инфицированных группах наблюдалось восстановление нейтрофилов, но было выше в группе с низкой дозой S. epidermidis (рисунок 3A, P < 0,05). Обе инфицированные группы развили тромбоцитопения во время эксперимента; однако количество тромбоцитов снижалось раньше и более заметно в группе с высокими дозами S. epidermidis по сравнению как с низкодозированной, так и с неинфицированными контролями (рисунок 3B, P < 0,01–0,05). Уровни TNF-α, IL-6 и IL-10 в плазме были повышены в обеих инфицированных группах через 6 и 12 часов после заражения по сравнению с контрольными группами (рисунок 3C, P < 0,001–0,05). Через 24 часа уровни TNF-α и IL-10 в плазме оставались повышенными только в группе с высокими дозами S. epidermidis по сравнению с неинфицированными контролями (P < 0,05), тогда как к 44 часам уровень TNF-α оставался повышенным (P < 0,05).

При эвтаназии, когда поросята либо достигали гуманных конечных точек, либо были эвтаназированы в запланированный момент через 44 часа после заражения, измерялись уровни отрицательных реагентов острой фазы и маркеров повреждения органов в плазме (рисунок 4A–G). Среди них только холестерин (отрицательный реагент острой фазы) был значительно ниже у поросят, инфицированных высокой дозой S. epidermidis , по сравнению с низкодозированной группой (рисунок 4B, P < 0,05). Средние уровни маркеров повреждения печени, включая аланинаминотрансферазу и аспартатаминотрансферазу, а также маркеров повреждения почек, таких как креатинин и азот мочевины крови, были численно выше в группе с высокими дозами S. epidermidis , чем в неинфицированных контролях (рисунок 4D–G).

figure-results-1
Рисунок 1: Экспериментальный дизайн. Недоношенные поросята рождались кесаревым сечением на 90% срока беременности. На третий день после родов поросятам была введена внутриартериальная инфузия живого S. epidermidis при температуре 109 или 5 × 109 CFU/кг, либо физиологического раствора в качестве контроля. После заражения поросят наблюдали в течение 44 часов, при этом продольный анализ анализов крови проводился в определённые временные моменты. Фигура, созданная с помощью Biorender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: Бактериальная нагрузка в крови, выживаемость и параметры газов в крови у недоношенных поросят после артериальной инфузии физиологическим раствором (CON) или заражения живой S. epidermidis. (A) Плотность S. epidermidis в образцах крови, собранных через 6, 24 и 44 часа после заражения. (B) Кривые выживаемости, показывающие время до гуманного окончания или запланированной эвтаназии через 44 часа после заражения. (C–G) Параметры газов артериальной крови через 0, 6, 12, 24 и 44 часа после инфекции. Данные представлены в виде среднего ± SD (A), кривых выживаемости (B) или точечных диаграмм скрипки, включая медиану (сплошную линию) и IQR (пунктирные линии) (C–G). n = 9 для каждой инфицированной группы; n = 3 для контроля неинфицированных. Данные анализировались с использованием линейной модели смешанных эффектов, включающей взаимодействия групп × времени (A, C–G) или пропорциональной модели опасности Кокса (B). *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. Сокращения; CON = управление; pCO2 = парциальное давлениеCO 2; SE = S. epidermidis. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: Циркулирующие воспалительные маркеры у недоношенных поросят после артериальной инфузии физиологическим раствором (CON) или заражения живой S. epidermidis. (A, B) Количество циркулирующих нейтрофилов и тромбоцитов через 6, 12, 24 и 44 часа после заражения. (C) Уровни TNF-α, IL-6 и IL-10 в плазме через 6, 12, 24 и 44 часа после заражения. Данные представлены в виде точечных диаграмм на скрипке, включая медиану (сплошную линию) и IQR (пунктирные линии) (A–C). n = 9 для каждой инфицированной группы; n = 3 для контроля неинфицированных. Данные анализировались с использованием линейной модели смешанных эффектов, включая взаимодействия группы × времени (A–C). *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. Сокращения; CON = управление; IL = интерлейкин; SE = S. epidermidis; TNF = фактор некроза опухоли. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4: Биохимические параметры плазмы у недоношенных поросят после артериальной инфузии физиологическим раствором (CON) или заражения живой S. epidermidis (109 или 5 × 109 CFU/кг). (A–G) Уровни альбумина, холестерина, ALP, ALAT, ASAT, креатинина и BUN в организме на гуманной конечной точке или при плановой эвтаназии через 44 часа после заражения. Данные представлены в виде диаграмм усов, показывающих весь диапазон (от минимума до максимума) (A–G). Отдельные точки данных тёмно-фиолетового цвета указывают на поросят, у которых развился сепсис. n = 9 для каждой инфицированной группы; n = 3 для контроля неинфицированных. Данные анализировались с помощью модели множественной линейной регрессии (A–G). *P < 0.05. Сокращения; ALAT = аланинаминотрансфераза; ALP = щелочная фосфатаза; ASAT = аспартатаминотрансфераза; BUN = азот мочевины крови; CON = управление; SE = S. epidermidis. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Общая суммаКонцентрация
Энергия7762kJ3525kJ/L
Макроэлементы
Аминокислоты92g42g/l
Жир66g30g/l
Глюкоза221g100g/l
Микроэлементы
На64ммол29mmol/l
K48ммол22mmol/l
Mg8ммол4mmol/l
Ca4ммол2mmol/l
PO418ммол8mmol/l
SO48ммол4mmol/l
CL93ммол42mmol/l
Ацетат78ммол35mmol/l

Таблица 1: Состав модифицированного общего парентерального питания. Общие количества и концентрации энергии, макронутриентов (аминокислот, жиры и глюкозы) и микроэлементов в парентеральном растворе питания.

Дополнительный рисунок 1: Кинетика роста S. epidermidis WT-1457. Бактерии культивировались в бульоне для инфузии мозга при 37 °C при орбитальном колебании при 180 об/мин. Оптическая плотность измерялась на 600 нм со временем. Данные представлены на логарифмической (A) и линейной (B) шкале (n = 3 независимых эксперимента). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Стандартизированная модель неонатального сепсиса у недоношенных поросят была разработана для изучения системной бактериальной инфекции при клинически значимых условиях неонатальной незрелости. Модель объединяет контроль гестационного возраста, реанимацию и поддержку интенсивной терапии, время заражения и продольную анализацию крови. Этот подход направлен на преодоление разрыва между экспериментальными системами грызунов и in vitro, а также сложной физиологией, с которой сталкиваются инфицированные новорождённые. Важно, что эта модель была использована для подтверждения известной связи пола, низкой массы при рождении и гестационного возраста, с наблюдаемой чувствительностью к сепсису у недоношенных младенцев 16,17,18.

Свиньи являются очень значимой моделью крупных животных для исследований инфекций благодаря значительному сходству с людьми в иммунной функции и физиологии. Ключевые компоненты врождённой иммунной системы, включая лейкоцитарные подмножества, сигнализацию рецепторов распознавания паттернов и цитокиновые ответы, демонстрируют тесную связь между свиньями и людьми. Основные иммунологические различия между новорождёнными поросятами и людьми связаны с адаптивными иммунными ответами. Поскольку во время беременности свиней не происходит трансплацентарный перенос иммуноглобулина G (IgG), новорождённые поросята рождаются наивнымив этом отношении 19. Точно так же, в то время как B-клетки младенцев не проходят изоформный сдвиг с IgM на IgG раньше 3–6 месяцев, B-клетки свиней способны проявлять IgG-ответы вскоре послерождения 20 месяцев.

В этой модельной системе эти различия смягчаются за счёт индуцирования инфекции вскоре после рождения, до наступления адаптивных иммунных ответов, а также за счёт материнского переливания иммуноглобулинов в плазму. Этот подход приводит к циркулирующему уровню IgG, сопоставимому с новорождёнными очень недоношёнными детьми, подвергающимися прерванному трансплацентарному переносу IgG из-за преждевременныхродов 17. Кроме того, сравнительно большой размер тела при рождении (~800 г) ещё больше усиливает модель по сравнению с новорождёнными мышами (~3 г). В результате влияние окружающей среды, такие как температура, влажность и напряжение кислорода, больше напоминают новорождённые. Эта шкала также позволяет использовать клиническое оборудование, инвазивный мониторинг и поддерживающие методы ухода, такие как сосудистый доступ, респираторная поддержка и непрерывный физиологический мониторинг, что невозможно в моделях новорождённых грызунов. В частности, сосудистый доступ для инфузий, таких как парентеральное питание, в модели недоношенных свиней достигается с помощью пупокового артериального катетера. Хотя это отличается от стандартного внутривенного пути, используемого в клинической неонатологии, оно обусловлено анатомическими ограничениями недоношенных поросят, когда катетеры пуповины редко спонтанно проходят через венозный проток и вместо этого вызывают неправильное расположение в паренхимепечени 21. Внутриартериальная доставка обеспечивает надёжный и воспроизводимый путь для непрерывной инфузии без высокого риска некроза печени, связанного с неправильным расположением пупоковой вены. Аналогично, это позволяет брать пробы артериальной крови для анализа газов крови.

Системная инфекция в этой модели вызывается внутриартериальной инфузией живого S. epidermidis, ведущей причины позднего сепсиса в отделениях интенсивной терапииноворождённых 1,2. Однако разнообразный набор патогенов вызывает неонатальный сепсис, а коагулаза-отрицательные стафилококки, такие как S. epidermidis, также известны тем, что вызывают менее тяжёлые инфекции и снижают риск сепсиса по сравнению с другими, более вирулентными патогенами, такими как E. coli 1,2. Хотя модель использует патоген с низкой вирулентностью, наблюдаемое клиническое ухудшение, воспалительная активация и физиологическая нестабильность отражают ключевые признаки неонатального сепсиса. Неинфицированная контрольная группа (n = 3) в данном исследовании служит базовым ориентиром для демонстрации физиологического состояния «здоровых» недоношенных поросят при идентичных условиях интенсивной терапии. Хотя это приводит к дисбалансу в конструкции, эти сравнения призваны отражать реакцию хозяина на инфекцию. Как показано на рисунке 2, существовала чёткая связь между дозой и ответом при увеличении доз S. epidermidis, что соответствует предыдущим данным у поросят, инфицированных на первый деньжизни 22. Только поросята, получавшие самую высокую дозу S. epidermidis, ухудшались до гуманных конечных точек, требующих эвтаназии. Однако обе инфицированные группы развили метаболический ацидоз, тогда как значительный респираторный компонент (повышенный pCO₂) наблюдался только в группе с высокими дозами S. epidermidis. Аналогично, в обеих группах наблюдалась выраженная нейтропения через 6 часов после заражения, за которой следовало восстановление нейтрофилов через 24 часа, что было выше в группе с низкой дозой. Тромбоцитопения также присутствовала в обеих группах, сопровождалась увеличением плазменных цитокинов и маркеров повреждения органов, при этом более выраженные реакции проявлялись у поросят, получающих наивысшую дозу S. epidermidis.

У недоношенных поросят инфекция S. epidermidis на первый день после родов вызывает те же параклинические признаки неонатального сепсиса (метаболический ацидоз, лейкопения, тромбоцитопения, воспаление), а также вялость, коагулопатию и потреблениекомплемента 17,22,23. Инфекция также вызывает системные нарушения энергетического обмена, в частности снижение окислительного фосфорилирования митохондрий, а также изменения в протеоме и метаболоме плазмы, аналогичные тем, что отмечались у пациентов с неонатальнымсепсисом 24,25,26. Кроме того, недоношенные поросята (90% беременности) гораздо чаще заболеют сепсисом, чем поросята, рожденные на полномсроке 17 лет. Состав питательных веществ дополнительно влияет на клинические и иммунологические реакции. TPN на основе глюкозы управляет гликолитическим метаболизмом, который усиливает провоспалительный иммунный ответ, одновременно снижая толерантность к болезням в периферическихтканях 24,26. Сочетание этих реакций связано с повреждением органов и прогрессированием к фенотипусепсиса 27. Модуляция состава TPN, либо за счёт снижения содержания глюкозы, либо замены глюкозы альтернативными макроэлементами, такими как галактоза, глюкогенные аминокислоты или β-гидроксибутират28,29, ослабляет воспалительные реакции и сохраняет толерантность тканей к болезням. Высокое содержание глюкозы через TPN также приводит к гипергликемии (≈10–20 мМ). Однако остаётся неясным, насколько наблюдаемые воспалительные, связанные с гликолизом, напрямую опосредованы повышенным уровнем глюкозы в крови.

Экспериментальные наблюдения показывают явные различия в клинических реакциях в зависимости от послеродового дня инфекции. Риск развития сепсиса и тяжесть клинических симптомов наиболее высоки, если инфекция вызвана вскоре после рождения. Индукция инфекции на 3-й день после родов приводит к более мягкому фенотипу сепсиса с поведением, респираторным и метаболическим ацидозом в течение первых 24 часов после индукции, после чего следует клиническое восстановление, несмотря на повышенные маркеры повреждений органов. Механизмы, лежащие в основе этих различий между ранней и поздней индукцией, в настоящее время неизвестны и представляют собой область продолжающихся исследований. Однако гомеостаз глюкозы после начала парентерального питания улучшается в первые три послеродовых дня у недоношенных поросят, что приводит к снижению гипергликемии, несмотря на одинаковое потребление глюкозы. В целом, изменение послеродового дня инфекции и обеспечения глюкозы позволяет модели отражать признаки как острого тяжёлого, так и угрожающего жизни сепсиса, либо более мягкого фенотипа. В совокупности эти корректировки позволяют тестировать целевые вмешательства, адаптированные к определённым фенотипам заболеваний. Клиническая применимость этой модели может быть дополнительно усилена, если бы она была согласована с устоявшимися системами оценки неонатальных заболеваний, связанными с сепсисом, такими как неонатальная последовательная оценка органной недостаточности (nSOFA). Система оценки на основе nSOFA в реальном времени не была внедрена в текущем исследовании из-за невозможности непрерывного мониторинга артериального артериального давления и немедленного количества тромбоцитов, необходимых для оценки сердечно-сосудистых и гематологических заболеваний. Будущие усовершенствования протокола могут включать адаптированную структуру nSOFA для более эффективной классификации тяжести заболевания.

Несмотря на трансляционные преимущества, эта модель имеет несколько важных ограничений. Эти эксперименты требуют много ресурсов и требуют специализированных учреждений и высококвалифицированного персонала для проведения кесарева сечения, неонатальной реанимации, послеродового содержания и ухода за недоношенными поросятами. Эксперименты с инфекцией также требуют постоянного практического мониторинга со стороны двух-трёх опытных сотрудников для обеспечения благополучия животных и надёжного сбора данных, а долгосрочное наблюдение увеличивает затраты. По сравнению с моделями на грызунах, доступность видоспецифических реагентов более ограничена, особенно для иммуногистохимии и проточной цитометрии, хотя многие человеческие антитела могут быть успешно использованы после соответствующей валидации. Кроме того, непокровенный характер свиней приводит к значительным биологическим вариациям внутри и между помётом, что требует увеличения размеров групп для выявления умеренных различий в реакции на инфекцию. Хотя эта вариабельность увеличивает сложность экспериментов, она также более близко отражает гетерогенность, наблюдаемую в клинических неонатальных популяциях, тем самым повышая трансляционную значимость модели. В заключение, этот проверенный протокол при неонатальном сепсисе станет полезным инструментом для будущих исследований в неонатологии и для тестирования новых профилактических и терапевтических вмешательств.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликтов интересов, которые нужно раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана сотрудниками группы сравнительной педиатрии Копенгагенского университета и финансируемой Фондом Ново Нордиск (NNF23OC0085457 и NNF22OC0078747).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
 0.1–10 μL pipette tips “Optifit”Sartorius790010
1 mL disposable syringes (sterile)e-power150001S
1 mL syringe with 25 G X 16 mm needle (sterile)B. Braun Melsungen AG9161465V
1.5 mL tubesEppendorf30125215
10 mL disposible syringe (sterile)e-power150010S
100 mL Erlenmeyer flasksDuran Wheaton Kimble212162403
1000 μL pipetteSartorius 46880171
12 G “Intraflon 2” needles (sterile)Vygon122.27
16 G X 40 mm “Microlance 3” needles (sterile)Becton Dickinson300637
18 G X 40 mm “Microlance 3” needles (sterile)Becton Dickinson303262
19 G X 40 mm “Sterican” needles (sterile)B. Braun Melsungen AG466 5112
2 mL disposible syringe (sterile)e-power150002S
2-0 70 cm suture “ Vicryl plus” (sterile)Johnson & Johnson  VCP453
20 G X 25 mm “Microlance 3” needles (sterile)Becton Dickinson304827
20 mL disposable syringe (sterile)e-power150020S
20 μL pipetteSartorius46886095
200 μL pipetteSartorius39486615
20G Venflon "Pro" 1.1 x 32 mmBeckton Dickinson393255
21 G x 25 mm Vacutainer blood collection needles (sterile)Becton Dickinson301746
21 G X 40 mm “Sterican” needles (sterile)B. Braun Melsungen AG4665643
22 G X 50 mm “Microlance 3” needles (sterile)Becton Dickinson300094
23 G X 25 mm “Medoject” needles (sterile)Chirana T. InjectaCH23100
25 G X 16 mm “Microlance 3” needles (sterile)Beckton Dickinson300600
25 G X 25 mm “Sterican” needles (sterile)B. Braun Melsungen AG9186158
25 mL plastic pipettes (sterile)LP Italian Spa162510
30 mL disposible syringes (sterile)e-power150030S
4L plastic freezer bagsCater.LineABN-105004
5–350 μL pipette tips “Optifit”Sartorius790350
5 mL disposible syringe (sterile)e-power150005S
5 mL syringe (sterile) B. Braun Melsungen AG4617053V
50–1200 μL pipette tips “Optifit”Sartorius791200
50 mL Luer Lock Original Perfusor Syringe B. Braun Melsungen AG8728844F-06
50 mL tubes (sterile)Sarstedt AG and Co. KG62.547.254
82% ethanol + 0.5% chlorhexidine disinfection wipesMediq527497
Atropine "ATROpin" 1 mg/mLAmgros741124
Bandage scissors, stainless steel, 180 mmB. Braun Melsungen AGBC849R
Blood gas machine ABL90Radiometer994-667 (service manual)
Brain Heart Infusion broth (BHI/B)Produced in-houseN.A. Commercially available equivalent product: Brain Heart Infusion Broth (Merck, Cat. No. 53286)
Butorphanol "Butomidor vet" 10 mg/mLVetViva Richter53 19 43
Cell incubator “HeraCell 150i”Thermo Fisher Scientific51032719
Centrifuge, Rotina 380 RHettich 1701
Clinical chemistry system “Advia 2120i”Siemens Healthcare GmbH10488923
Closing cones “Combi-Stopper” (sterile)B. Braun Melsungen AG4495101
Columbia agar + 5% sheep blood platesBioRad63784
Disposable soft underpads, Abri-Soft classicAbena4115
Doxapram-V 20 mg/mLDechra34144/G
EDTA 3 mL collection tubes (sterile)Becton Dickinson368856
Endotracheal tube (12 mm x 55 cm, 150 cc), Silicone, cuffedMilaGVPmL-METC955
Enteral feeding tube 04Fr-L.40cm - PVC (sterile)Vygon310.04Used as umbilical arterial catheter
Ethanol 70% VWR83801.36
Extension line “Q-Style” (sterile)Becton Dickinson385151
Flowmeter for oxygenDamecaP/N 32018-00
Flumaznil 0.1 mg/mLHamelm pharmacy gmbh33659
Gloves, “Gentle Skin” (sterile)Meditrade9021

Ссылки

  1. Shane, A. L., Sánchez, P. J., Stoll, B. J. Neonatal sepsis. The Lancet. 390 (10104), 1770-1780 (2017).
  2. Strunk, T., Molloy, E. J., Mishra, A., Bhutta, Z. A. Neonatal bacterial sepsis. The Lancet. 404 (10449), 277-293 (2024).
  3. Wynn, J. L., et al. Time for a neonatal-specific consensus definition for sepsis. Pediatric critical care medicine : a journal of the Society of Critical Care Medicine and the World Federation of Pediatric Intensive and Critical Care Societies. 15 (6), 523-528 (2014).
  4. Schlapbach, L. J., et al. International Consensus Criteria for Pediatric Sepsis and Septic Shock. JAMA. 331 (8), 665-674 (2024).
  5. Fleiss, N., Hooven, T. A., Polin, R. A. Can we back off using antibiotics in the NICU?. Seminars in Fetal and Neonatal Medicine. 26 (3), 101217 (2021).
  6. Strunk, T., et al. Impaired Cytokine Responses to Live Staphylococcus epidermidis in Preterm Infants Precede Gram-positive, Late-onset Sepsis. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 72 (2), 271-278 (2021).
  7. Collins, A., Weitkamp, J. H., Wynn, J. L. Why are preterm newborns at increased risk of infection?. Archives of Disease in Childhood - Fetal and Neonatal Edition. 103 (4), F391-F394 (2018).
  8. Kowalski, G. M., Bruce, C. R. The regulation of glucose metabolism: implications and considerations for the assessment of glucose homeostasis in rodents. Am J Physiol Endocrinol Metab. 307 (10), E859-E871 (2014).
  9. Bailey, M., Christoforidou, Z., Lewis, M. C. The evolutionary basis for differences between the immune systems of man, mouse, pig, and ruminants. Veterinary Immunology and Immunopathology. 152 (1-2), 13-19 (2013).
  10. Mair, K. H., et al. The porcine innate immune system: An update. Developmental & Comparative Immunology. 45 (2), 321-343 (2014).
  11. Ezquerra, A., et al. Porcine myelomonocytic markers and cell populations. Developmental & Comparative Immunology. 33 (3), 284-298 (2009).
  12. Gerner, W., Käser, T., Saalmüller, A. Porcine T lymphocytes and NK cells – An update. Developmental & Comparative Immunology. 33 (3), 310-320 (2009).
  13. Meurens, F., Summerfield, A., Nauwynck, H., Saif, L., Gerdts, V. The pig: a model for human infectious diseases. Trends in Microbiology. 20 (1), 50-57 (2012).
  14. Pabst, R. The pig as a model for immunology research. Cell and Tissue Research. 380 (2), 287-304 (2020).
  15. Goldfarb, R. D., Dellinger, R. P., Parrillo, J. E. Porcine models of severe sepsis: emphasis on porcine peritonitis. Shock (Augusta, Ga). 24 Suppl 1 (SUPPL. 1), 75-81 (2005).
  16. Bæk, O., Ren, S., Brunse, A., Sangild, P. T., Nguyen, D. N. Impaired neonatal immunity and infection resistance following fetal growth restriction in preterm pigs. Frontiers in Immunology. 11, 1808 (2020).
  17. Bæk, O., et al. Diet Modulates the High Sensitivity to Systemic Infection in Newborn Preterm Pigs. Frontiers in Immunology. 11, 1019 (2020).
  18. Bæk, O., et al. Sex-Specific Survival, Growth, Immunity, and Organ Development in Preterm Pigs as Models for Immature Newborns. Frontiers in Pediatrics. 9, (2021).
  19. Porter, P. Transfer of immunoglobulins IgG, IgA, and IgM to lacteal secretions in the parturient sow and their absorption by the neonatal piglet. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure. 181 (2), 381-392 (1969).
  20. Butler, J. E., et al. The piglet as a model for B-cell and immune system development. Veterinary immunology and immunopathology. 128 (1-3), 147-170 (2009).
  21. Sangild, P. T., et al. The preterm pig as a model in pediatric gastroenterology. Journal of Animal Science. 91, 4713-6359 (2013).
  22. Brunse, A., Worsøe, P., Pors, S. E., Skovgaard, K., Sangild, P. T. Oral Supplementation with Bovine Colostrum Prevents Septic Shock and Brain Barrier Disruption During Bloodstream Infection in Preterm Newborn Pigs. SHOCK. , 1 (2018).
  23. Krogh, A. K. H., Brunse, A., Thymann, T., Bochsen, L., Kristensen, A. T. Staphylococcus epidermidis sepsis induces hypercoagulability in preterm pigs. Research in veterinary science. 127, 122-129 (2019).
  24. Bæk, O., et al. Altered hepatic metabolism mediates sepsis preventive effects of reduced glucose supply in infected preterm newborns. eLife. 13, (2024).
  25. Wu, Z., et al. Regulation of host metabolism and defense strategies to survive neonatal infection. Biochimica et biophysica acta. Molecular basis of disease. 1870 (8), (2024).
  26. Muk, T., Brunse, A., Henriksen, N. L., Aasmul-Olsen, K., Nguyen, D. N. Glucose supply and glycolysis inhibition shape the clinical fate of Staphylococcus epidermidis–infected preterm newborns. JCI Insight. 7 (11), (2022).
  27. Zhong, J., et al. Reduced parenteral glucose supply during neonatal infection attenuates neurological and renal pathology associated with modulation of innate and Th1 immunity. Biochimica et biophysica acta. Molecular basis of disease. 1871 (4), (2025).
  28. Wu, Z., et al. Harnessing systemic glycolysis-TCA cycle axis to boost host defense against neonatal infection. EMBO Molecular Medicine. , (2026).
  29. Bæk, O., et al. Rethinking parenteral nutrition as supportive therapy for neonatal sepsis. Med. , (2026).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

233233
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи