Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Тайм-лапс визуализация антитело-опосредованного фагоцитоза клеток трижды негативного рака молочной железы, меченных зеленым флуоресцентным белком, макрофагами

165 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71461

⸱

14 августа 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, National Taiwan University Hospital, 2School of Chinese Medicine, China Medical University, 3Graduate Institute of Biomedical Science, China Medical University, 4Chinese Medicine Research Center, China Medical University, 5Cancer Biology and Precision Therapeutics Center, China Medical University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данном протоколе описывается метод таймлапс-визуализации живых клеток для наблюдения за антителозависимым фагоцитозом макрофагами клеток трижды негативного рака молочной железы, меченных зеленым флуоресцентным белком, с использованием макрофагов, полученных из мононуклеарных клеток периферической крови, и автоматизированного микроскопа.

Аннотация

Антителозависимый клеточный фагоцитоз представляет собой ключевой механизм, с помощью которого макрофаги поглощают опсонизированные антителами раковые клетки. В данном протоколе описывается метод таймлапс-визуализации живых клеток для наблюдения за антителозависимым фагоцитозом макрофагами клеток трижды негативного рака молочной железы, экспрессирующих CD24 и меченных зеленым флуоресцентным белком. Макрофаги получают из мононуклеарных клеток периферической крови человека, дифференцируют с помощью колониестимулирующего фактора макрофагов и поляризуют с использованием интерферона гамма и липополисахарида для создания провоспалительного фенотипа. Раковые клетки опсонизируют моноклональным антителом к CD24 перед совместным культивированием с макрофагами при определенном соотношении эффекторных клеток к мишеням. Процессы фагоцитоза регистрируют в течение 16 h с помощью автоматизированного микроскопа, оснащенного системой контроля окружающей среды для поддержания физиологических условий. Визуализация проводится в светлом поле и в каналах флуоресценции, что позволяет идентифицировать раковые клетки и контролировать их интернализацию макрофагами. Репрезентативные таймлапс-изображения демонстрируют постепенное поглощение флуоресцентных раковых клеток с течением времени. Для проведения количественной оценки в параллельном конечном анализе при идентичных условиях совместного культивирования неинтернализированные раковые клетки удаляют перед визуализацией, что позволяет точно измерить количество актов фагоцитоза. Данный метод представляет собой стандартизированный и воспроизводимый подход к визуализации антителозависимого фагоцитоза макрофагами in vitro. Важно, что интеграция таймлапс-визуализации с количественным анализом по конечной точке позволяет дополняюще оценивать кинетику и выраженность фагоцитоза. Этот протокол применим для оценки терапевтических антител и иммунотерапии рака, направленной на макрофаги, в контролируемых условиях in vitro.

Введение

Рак молочной железы является наиболее часто диагностируемым злокачественным новообразованием среди женщин во всем мире; ежегодно регистрируется примерно 2,3 миллиона новых случаев1. Заболевание клинически гетерогенно и классифицируется как минимум на четыре основных молекулярных подтипа в зависимости от статуса гормональных рецепторов — рецептора эстрогена (ER) и рецептора прогестерона (PR) — и экспрессии онкогена рецептора 2 человеческого эпидермального фактора роста (HER2)2. Опухоли люминального типа А экспрессируют ER и/или PR без гиперэкспрессии HER2 (ER/PR+ и HER2−); опухоли люминального типа B коэкспрессируют ER/PR и HER2 (ER/PR+ и HER2+); опухоли HER2+ характеризуются высокой экспрессией HER2 независимо от статуса гормональных рецепторов; а трижды негативный рак молочной железы (TNBC) характеризуется отсутствием экспрессии всех трех маркеров (ER−, PR− и HER2−)2,3. Среди этих подтипов TNBC представляет собой наиболее сложную с клинической точки зрения форму и составляет примерно 15%–20% всех случаев рака молочной железы. Пациенты с TNBC демонстрируют наиболее агрессивное течение заболевания с наихудшим прогнозом и самым коротким показателем 5-летней общей выживаемости из-за низкой эффективности стандартной химиотерапии и отсутствия действенной таргетной терапии3,4. Кроме того, TNBC характеризуется значительно высокой склонностью к висцеральному метастазированию, особенно в легкие в течение 5 лет после постановки диагноза, а медиана выживаемости пациентов с распространенным или метастатическим TNBC (mTNBC) редко превышает 2 лет5,6. Эти статистические данные подчеркивают острую и неудовлетворенную потребность в новых терапевтических стратегиях для лечения TNBC.

Опухолевое микроокружение (ОМО) играет ключевую роль в прогрессировании рака молочной железы и уклонении от иммунного ответа. Опухолеассоциированные макрофаги относятся к числу наиболее многочисленных иммунных клеток в ОМО и в последнее время признаны критически важными медиаторами врожденного противоопухолевого иммунитета7,8,9. Хотя исторически TAM разделяли на провоспалительные состояния «M1» и проопухолевые «M2», эта бинарная модель не позволяет в полной мере оценить истинную степень гетерогенности макрофагов. Вместо этого TAM занимают динамический функциональный спектр, развиваясь в ответ на разнообразные биохимические сигналы внутри ОМО. В этом сложном ландшафте раковые клетки активно подавляют активность макрофагов с помощью различных стратегий уклонения от иммунитета, в частности, за счет гиперэкспрессии сигналов «не ешь меня». Ось CD47/SIRPα стала первой идентифицированной контрольной точкой врожденного иммунитета в данном контексте6,10, а недавно CD24 был определен как новый и мощный антифагоцитарный сигнал1,12. CD24 представляет собой небольшой, сильно гликозилированный гликопротеин муцинового типа, закрепленный в клеточной мембране с помощью гликозилфосфатидилинозитольного якоря13. В физиологических условиях он экспрессируется в различных линиях иммунных клеток, но часто гиперэкспрессируется в солидных опухолях, включая рак молочной железы, яичников, поджелудочной железы и колоректальный рак14. На опухолевых клетках CD24 взаимодействует с ингибиторным рецептором сиалокислот-связывающим иммуноглобулиноподобным лектином 10 (Siglec-10), экспрессируемым на макрофагах. Это взаимодействие запускает фосфорилирование доменов иммунорецепторного тирозин-содержащего ингибиторного мотива в цитоплазматическом хвосте Siglec-10, что активирует фосфатазы SHP-1 и SHP-2, подавляющие нижележащие фагоцитарные сигнальные пути1. Было показано, что блокада взаимодействия CD24/Siglec-10 моноклональными антителами значительно усиливает фагоцитоз CD24-экспрессирующих опухолей человека макрофагами. Наше недавнее исследование также показало, что нокаут CD24a в клетках рака молочной железы повышает их чувствительность к фагоцитозу макрофагами в мышиной модели трижды негативного рака молочной железы9.

Антителозависимый клеточный фагоцитоз (ADCP) представляет собой ключевой механизм, с помощью которого антитела направляют макрофаги на фагоцитоз опухолевых клеток15,16. После связывания с экспрессируемыми опухолью антигенами Fc-фрагмент антитела взаимодействует с Fcγ-рецепторами (FcγRs) на макрофагах, запуская внутриклеточные сигнальные каскады, которые приводят к перестройке цитоскелета, формированию фагоцитарной чаши и поглощению клетки-мишени17.

В данном исследовании мы разработали и валидировали протокол тайм-лапс визуализации живых клеток для измерения антителозависимого фагоцитоза клеток рака молочной железы макрофагами. В методе используются макрофаги, полученные из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) здоровых доноров-людей, дифференцированные с помощью колониестимулирующего фактора макрофагов (M-CSF) и впоследствии стимулированные липополисахаридом (LPS) и интерфероном гамма (IFN-γ). Анализ методом проточной цитометрии подтвердил повышение экспрессии CD80 в популяции CD1b⁺ после стимуляции (Рисунок 1), что свидетельствует о классически активированном фенотипе. Данное состояние активации обеспечивает высокую способность к антитело-опосредованному фагоцитозу, что делает его подходящим для оценки антителозависимого клеточного фагоцитоза (ADCP). GFP-меченные CD24-положительные клетки рака молочной железы служат клетками-мишенями и опсонизируются терапевтическими моноклональными антителами к CD24 перед совместным культивированием. Акты фагоцитоза регистрируются в течение 16 ч с использованием автоматизированного микроскопа в контролируемых условиях окружающей среды. Для проведения количественной оценки параллельно с динамической визуализацией выполняется отдельный конечный анализ в идентичных условиях совместного культивирования, что позволяет точно измерить фагоцитоз после удаления неинтернализованных клеток-мишеней. Данный протокол представляет собой стандартизированную, воспроизводимую и визуально информативную платформу для оценки ADCP, опосредованного антителами к CD24. Важно, что интеграция тайм-лапс визуализации с дополнительной стратегией количественного определения по конечной точке позволяет одновременно оценивать кинетику и величину фагоцитоза. Метод может быть адаптирован для исследования других иммунотерапевтических мишеней, направленных на макрофаги. Этот протокол наиболее подходит для оценки ADCP, опосредованного терапевтическими моноклональными антителами к поверхностным антигенам раковых клеток. Он хорошо подходит для сравнительного скрининга антител-кандидатов, характеристики зависимости «доза-ответ» и механистических исследований взаимодействия Fc–FcγR, включая эффекты блокады сигналов «не ешь меня» (например, CD47–SIRPα). Поскольку в анализе используются первичные макрофаги человека, он также подходит для трансляционных исследований, требующих оценки вариабельности между донорами перед началом клинической разработки.

Схема выделения мононуклеарных клеток периферической крови с последующей проточной цитометрией для анализа макрофагов.
Рисунок 1Получение и валидация методом проточной цитометрии макрофагов, полученных из мононуклеарных клеток периферической крови и стимулированных IFN-γ/ЛПС. Верхняя панель: мононуклеарные клетки периферической крови (МНКПК) выделяют из крови здоровых доноров методом центрифугирования в градиенте плотности с использованием раствора Ficoll при 40 × g в течение 30 мин при 20°C, при условии предварительного уравновешивания всех реагентов по температуре до 20°C ± 2°CВыделенные PBMC культивируют в среде ImmunoCult-SF с добавлением макрофаг-колониестимулирующего фактора (M-CSF) в концентрации 10 нг/мл в течение 7 дней для стимуляции дифференцировки макрофагов (дни 0–7), с добавлением свежей среды на 5-й день. На 8-й день дифференцированные макрофаги стимулируют IFN-γ в концентрации 10 нг/мл и 1 µg/mL ЛПС в течение 48 ч (дни 8–10). Затем клетки подвергают анализу методом проточной цитометрии. Нижняя панель: Проточная цитометрия макрофагов. Клетки окрашивали панелью поверхностных маркеров, состоящей из CD1b-FITC, CD80-PE и CD206-PerCP-Cy5.5, с последующим добавлением DAPI перед сбором данных для исключения мертвых клеток. Стратегия гейтирования: сначала выделяли живые клетки (DAPI⁻), затем идентифицировали CD1b⁺ клетки на графике CD1b-FITC в зависимости от FSC-A для подтверждения принадлежности к макрофагам. Живые CD11b⁺ события анализировали на точечном графике CD80 в зависимости от CD206 для подтверждения наличия популяции CD80⁺CD206⁻, индуцированной стимуляцией IFN-γ/ЛПС. Справа: Репрезентативный точечный график CD1b-FITC в зависимости от FSC-A, показывающий, что 9,8% гейтированных клеток были CD11b⁺, что подтверждает принадлежность к макрофагам. Слева: Большинство CD1b⁺ клеток попало в гейт CD80⁺CD206⁻ (Q1: 95,2%), что указывает на ожидаемый провоспалительный фенотип в данных условиях стимуляции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

При применении данного метода следует учитывать несколько ограничений. Во-первых, вариабельность доноров при использовании макрофагов, полученных из PBMC, может привести к существенному разбросу показателей фагоцитоза, поэтому мы рекомендуем использовать нескольких доноров (n ≥ 3) с представлением индивидуальных данных каждого донора наряду с общими результатами. Во-вторых, формат 2D-сокультивирования не воспроизводит микроокружение опухоли, и полученные результаты должны быть подтверждены в 3D-моделях или моделях in vivo перед формулированием клинических выводов. В-третьих, 16-часовое окно визуализации позволяет зафиксировать ранние фагоцитарные события, но не отражает более длительные процессы, такие как презентация антигена или вторичная иммунная активация. Таким образом, комбинированное использование визуализации в режиме реального времени и конечного количественного анализа обеспечивает взаимодополняющую основу, которая повышает как интерпретируемость, так и воспроизводимость измерений ADCP.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Данный протокол предполагает использование первичных макрофагов, полученных из образцов крови здоровых доноров. Сбор и обработка образцов проводились в соответствии с правилами Институционального наблюдательного совета (IRB) Медицинского университета Китая.

1. Подготовка макрофагов, полученных из PBMC

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры с использованием крови человека должны проводиться при наличии одобрения институционального наблюдательного совета (ИОН/IRB, например, CMUH IRB). Перед забором крови необходимо получить информированное согласие от здоровых доноров.

ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Все работы с продуктами человеческой крови следует проводить в условиях уровня биобезопасности 2 (BSL-2), соблюдая универсальные меры предосторожности.

  1. Сбор крови
    1. Соберите цельную кровь у здорового донора в вакутайнеры объемом 10 mL, содержащие этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA).
  2. Разведение крови
    1. Разведите цельную кровь в соотношении 1:1 ледяным фосфатно-солевым буферным раствором (PBS; без Ca2⁺ и Mg2⁺) (например, 10 mL крови + 10 mL PBS).
    2. Перемешайте путем переворачивания пробирки от трех до пяти раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Храните PBS на льду перед использованием. Низкая температура помогает сохранить жизнеспособность клеток в процессе обработки.
  3. Наслоение градиента плотности
    1. Осторожно наслоите разведенную кровь на Ficoll–Paque PLUS в соотношении объемов 2:1 (v/v) в конической пробирке (например, 8 mL крови на 4 mL Ficoll в пробирке объемом 15 mL или 30 mL на 15 mL в пробирке объемом 50 mL).
    2. Перед наслоением доведите разведенную кровь и Ficoll–Paque PLUS до температуры 20°C ± 2°C.
    3. Извлеките Ficoll–Paque PLUS из условий хранения при 4°C минимум за 30 мин до использования или кратковременно прогрейте на водяной бане при 20°C ± 2°C.
    4. Не используйте холодные реагенты, так как плотность Ficoll откалибрована для 20°C ± 2°C, и отклонения приведут к снижению эффективности разделения и выхода PBMC.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наклоните пробирку под углом 45° и медленно вносите кровь пипеткой вдоль стенки, чтобы сохранить четкую границу раздела фаз. Не нарушайте слой Ficoll.
  4. Центрифугирование
    1. Центрифугируйте при 400 × g в течение 30 мин при 20°C с выключенным тормозом (Рисунок 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Торможение нарушит градиент плотности и снизит выход PBMC.
  5. Сбор PBMC
    1. С помощью серологической пипетки осторожно аспирируйте только слой лейкоцитов (белесый интерфейс между слоями плазмы и Ficoll), не затрагивая плазму сверху или слой Ficoll снизу.
    2. Перенесите собранный слой в новую коническую пробирку объемом 50 mL.
  6. Промывка PBMC
    1. Добавьте PBS, чтобы довести общий объем до 25 mL в конической пробирке объемом 50 mL.
    2. Используйте пробирку объемом 50 mL для обеспечения правильного центрифугирования и балансировки.
    3. Центрифугируйте при 30 × g в течение 10 мин.
  7. Лизис эритроцитов
    1. Удалите супернатант.
    2. Ресуспендируйте осадок в 5 mL буфера для лизиса эритроцитов (RBC) путем осторожного пипетирования вверх-вниз серологической пипеткой до полного диспергирования осадка и исчезновения видимых комков.
    3. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 мин.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Полное диспергирование необходимо для обеспечения равномерного лизиса; при этом избегайте интенсивного пипетирования или вортексирования, которые могут повредить PBMC. Не превышайте время инкубации с буфером для лизиса эритроцитов 5 мин, так как длительное воздействие может снизить жизнеспособность PBMC.
  8. Осаждение PBMC
    1. Центрифугируйте при 50 × g в течение 5 мин для осаждения PBMC и удаления остатков лизированных эритроцитов.
  9. Финальное ресуспендирование
    1. Удалите супернатант.
    2. Ресуспендируйте осадок в 5 mL среды для макрофагов ImmunoCult-SF.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В стандартных условиях 10 mL цельной крови обычно дают 1,5–2,0 × 107 PBMC.

2. Дифференцировка макрофагов (дни 0–7)

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте чашки Петри без TC-обработки (необработанные для культур тканей), чтобы отобрать дифференцированные макрофаги, полученные из моноцитов путем адгезии. Неадгезивные лимфоциты будут удалены при последующем промывании культуры.

  1. День 0: Посев клеток
    1. Проведите подсчет клеток и посейте 1 × 107 PBMC в чашку Петри диаметром 10 см без TC-обработки.
    2. Доведите общий объем до 10 mL, используя среду для макрофагов ImmunoCult-SF, дополненную 10 ng/mL M-CSF (приготовленной путем добавления стокового раствора M-CSF непосредственно в полную среду перед использованием и перемешивания путем осторожного переворачивания).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно масштабировать пропорционально в зависимости от выхода PBMC от донора, используя базовую плотность посева от 1 × 106 клеток/mL.
  2. Инкубация и мониторинг
    1. Инкубируйте при 37°C с 5% CO₂ в увлажненном инкубаторе.
    2. Ежедневно контролируйте образование плавающих кластеров моноцитов и появление адгезивных клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: По мере дифференцировки моноциты будут постепенно увеличиваться в размере и образовывать кластеры. Некоторые моноциты начнут прикрепляться к пластику. На данном этапе никаких действий не требуется.
  3. День 5: Добавление среды
    1. Осторожно добавьте в чашку 5 mL свежей среды для макрофагов ImmunoCult-SF, дополненной 10 ng/mL M-CSF, стараясь не беспокоить адгезивные макрофаги.
    2. Продолжайте культивирование в течение еще 2 дней (до 7-го дня).
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Добавляйте свежую среду осторожно по стенке чашки, чтобы избежать повреждения адгезивных макрофагов, так как механическое воздействие может повлиять на эффективность дифференцировки и выход клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте полной замены среды для сохранения аутокринных/паракринных факторов, поддерживающих дифференцировку макрофагов.
  4. День 7: Морфологическая оценка
    1. Оцените эффективность дифференцировки макрофагов с помощью инвертированного микроскопа.
    2. Адгезивные клетки демонстрируют характерную морфологию макрофагов: они крупные, распластанные, неправильной формы, с видимыми псевдоподиями.
    3. К 7-му дню должны быть видны хорошо дифференцированные макрофаги.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Морфологическая оценка на 7-й день является критическим условием для последующей валидации методом проточной цитометрии. Хорошо дифференцированные макрофаги должны быть отчетливо видны под микроскопом; большая доля адгезивных клеток с морфологией макрофагов свидетельствует о более высокой эффективности дифференцировки (показатель успешной дифференцировки считается достигнутым при konfluency адгезивных макрофагов с характерной морфологией примерно 70%). Культуры с низкой адгезией, преимущественно округлыми клетками или в целом плохой морфологической дифференцировкой вряд ли дадут надежные результаты проточной цитометрии, и такие образцы не следует подвергать стимуляции и окрашиванию.

3. Поляризация макрофагов (дни 8–10)

  1. Сбор и очистка кондиционированной среды
    1. На 8-й день осторожно аспирируйте 15 mL среды из культурального планшета, не тревожа адгезивные макрофаги, и перенесите её в стерильную коническую пробирку объемом 50 mL.
    2. Центрифугируйте собранную среду при 40 × g в течение 5 min для осаждения клеточного дебриса.
    3. Сохраните очищенный супернатант для следующего этапа.
  2. Стимуляция интерфероном гамма (IFN-γ) и липополисахаридом (LPS)
    1. Перенесите очищенные 15 mL супернатанта в новую стерильную пробирку и добавьте 10 ng/mL IFN-γ и 1 µg/mL LPS.
    2. Тщательно перемешайте путем осторожного пипетирования вверх-вниз (5–10 раз), чтобы обеспечить равномерное распределение цитокинов, не создавая пузырьков.
    3. Верните все 15 mL среды с добавлением цитокинов в исходный культуральный планшет, осторожно пипетируя вдоль внутренней стенки, чтобы не потревожить адгезивные макрофаги.
    4. Инкубируйте при 37°C с 5% CO₂ в течение 48 h (с 8-го по 10-й день).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте кондиционированную (старую) среду для сохранения аутокринных/паракринных факторов. Данная комбинация IFN-γ и LPS используется для поляризации макрофагов в провоспалительный фенотип. В условиях стимуляции IFN-γ (10 ng/mL) и LPS (1 µg/mL), используемых в данном протоколе, макрофаги демонстрируют характерные морфологические изменения, включая удлиненные ламеллиподии, соответствующие активированному провоспалительному состоянию, а также экспрессию CD1b и CD80.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Работайте с LPS в соответствии с правилами лабораторной безопасности, так как это биоактивный эндотоксин, который может вызвать воспалительную реакцию при воздействии.

4. Подтверждение маркеров воспалительного фенотипа макрофагов, стимулированных IFN-γ и LPS, методом проточной цитометрии

  1. Сбор клеток
    1. Соберите часть поляризованных макрофагов на 10-й день для фенотипирования.
    2. Добавьте 10 мМ ЭДТА в ПСБ и инкубируйте в течение 10–15 мин при 37°C.
    3. Отделите клетки путем осторожного пипетирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Продлите инкубацию с ЭДТА еще на 30 мин при 37°C если клетки остаются адгезивными, повторите осторожное пипетирование. Избегайте интенсивного пипетирования или механического соскабливания, чтобы сохранить жизнеспособность клеток и целостность поверхностных маркеров.
  2. Подготовка к окрашиванию антителами
    1. Окрасьте клетки антителами, конъюгированными с флуорохромами, против CD1b (маркер всей линии макрофагов), CD80 (маркер воспаления) и CD206 (антивоспалительный маркер, используемый в качестве маркера негативной селекции для идентификации воспалительного фенотипа).
  3. Процедура окрашивания
    1. Перенесите 5 × 105 отделившие macrophages в пробирку для проточной цитометрии, содержащую 100 µL холодного ПСБ (фосфатно-солевого буфера).
    2. Добавьте антитела CD11b-FITC, CD80-PE и CD206-PerCP-Cy5.5 до конечной концентрации 1 µg/mL каждый.
    3. Перемешайте клеточную суспензию осторожным пипетированием.
    4. Инкубируйте образцы на льду в течение 1 ч в защищенном от света месте.
    5. Центрифугируйте образцы при 30 × g в течение 1 мин при 4°C.
    6. Осторожно аспирируйте супернатант.
    7. Добавьте 0,5 мл холодного ПСБ для промывки осадка клеток.
    8. Центрифугируйте образцы при 30 × g в течение 1 мин при 4°C.
    9. Удалите супернатант.
    10. Ресуспендируйте осадок клеток в 200 µL холодного фосфатно-солевого буферного раствора (PBS).
    11. Добавьте DAPI до конечной концентрации 1 µg/mL.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Включите соответствующие изотипические контроли и краситель для определения жизнеспособности (например, DAPI или фиксируемый краситель Viobility 405/452).
  4. Проточный цитометрический анализ
    1. Проведите анализ окрашенных образцов с помощью проточного цитометра.
    2. Подтвердите экспрессию CD1b и CD80 в популяции макрофагов.
    3. Переходите к анализу фагоцитоза только после подтверждения экспрессии маркеров, соответствующих воспалительному фенотипу.
  5. Сбор данных и настройка проточной цитометрии
    1. Настройка прибора
      1. Настройте проточный цитометр, используя следующие каналы: Pacific Blue/V450 (DAPI), FITC (CD1b), PE (CD80) и PerCP-Cy5.5 (CD206).
      2. Установите параметры сбора данных таким образом, чтобы в каждом образце было зарегистрировано 10 0 событий внутри определенного родительского гейта.
    2. Калибровка порога и коэффициента усиления
      1. Откройте четыре диаграммы рассеяния (dot plot), где по оси x отложен параметр FSC, а по оси y — один из каналов флуорохромов.
      2. Подготовьте клетки, окрашенные соответствующими изотипическими контрольными антителами, подобранными к каждому флуорофору.
      3. Подготовьте образцы изотипического контроля.
      4. Отрегулируйте усиление для каждого канала так, чтобы популяция изотипического контроля находилась ниже 10.1 в логарифмическом масштабе.
      5. Используйте этот порог для определения уровней фонового сигнала.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте логарифмическую шкалу с диапазоном 101 до 101·5 для обеспечения надежного разграничения фонового и специфического сигналов.
    3. Компенсация
      1. Добавьте одну каплю компенсаторных гранул в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
      2. Добавьте соответствующее антитело, конъюгированное с флуорофором, до конечной концентрации 1 µg/mL.
      3. Инкубируйте в течение 30 минут на льду в защищенном от света месте.
      4. Центрифугируйте при 40 × g в течение 1 мин.
      5. Удалите супернатант.
      6. ресуспендируйте гранулы в 200 µL холодного ФСБ.
      7. Соберите данные для одноцветных контролей.
      8. Примените спектральную компенсацию для коррекции перекрытия спектров флуорофоров.
    4. Стратегия гейтирования
      1. Селекция живых клеток
        1. Отобразите Pacific Blue/V450 (DAPI) по оси y, а FSC — по оси x.
        2. Установите гейт на события, отрицательные по DAPI (ниже 101) для селекции живых клеток.
      2. Идентификация макрофагов
        1. Установите популяцию живых клеток в качестве родительского гейта.
        2. Отобразите FITC (CD1b) по оси y, а FSC — по оси x.
        3. Установите гейт на события CD1b⁺ (выше 101).
      3. Идентификация воспалительного фенотипа
        1. Установите популяцию CD11b⁺ в качестве родительского гейта.
        2. Отобразите PE (CD80) по оси y и PerCP-Cy5.5 (CD206) по оси x.
        3. Примените квадрантное гейтирование при 101.5 по обеим осям.
        4. Идентифицируйте клетки CD80⁺CD206⁻ в верхнем левом квадранте (Q1).
  6. Критерии приемлемости
    1. Подтвердите, что ≥90% клеток в родительском гейте CD1b⁺ являются CD80⁺CD206⁻.
    2. Переходите к анализу фагоцитоза только после достижения этого порогового значения.
    3. Повторите выделение PBMC, дифференцировку с использованием M-CSF и стимуляцию IFN-γ/LPS, если образцы не соответствуют этому критерию.

5. Анализ антителозависимого фагоцитоза

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед подготовкой анализа проверьте стабильность экспрессии GFP в раковых клетках. Перед началом анализа подтвердите экспрессию CD24 на клетках-мишенях. Для достижения оптимальных результатов используйте раковые клетки с позитивностью по CD24 в диапазоне 50%–10%. Клетки MDA-MB-468, используемые в данном протоколе, обладают 100% позитивностью по CD24.

  1. Посев макрофагов
    1. Произведите посев макрофагов, стимулированных IFN-γ и LPS (согласно валидации на этапе 4), в 24-луночный планшет для культивирования тканей из расчета 2 × 105 клеток на лунку.
    2. Инкубируйте планшет при 37°C в статических условиях при 5% CO₂ в течение 12–16 ч для обеспечения адгезии клеток (Рисунок 2A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед переходом к следующему этапу убедитесь в прочной адгезии макрофагов. Плохо прикрепившиеся макрофаги могут отделиться в процессе визуализации, что приведет к искажению результатов.
  2. Подготовка раковых клеток
    1. Культивируйте CD24-положительные GFP-меченые клетки рака молочной железы (MDA-MB-468) до достижения 70%–80% конфлюэнтности.
    2. Аспирируйте культуральную среду.
    3. Однократно промойте монослой клеток PBS.
  3. Открепление раковых клеток
    1. Добавьте в чашку с культурой 10 mM EDTA в PBS.
    2. Инкубируйте клетки при 37°C в течение 5–10 мин.
    3. Открепите клетки путем осторожного пипетирования до полного высвобождения клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте использования трипсина для открепления клеток. Ферментативное расщепление может привести к отщеплению CD24 от поверхности клетки и нарушить связывание антител.
  4. Сбор и подсчет раковых клеток
    1. Соберите открепленные клетки в центрифужную пробирку.
    2. Центрифугируйте клетки при 30 × g в течение 5 мин.
    3. Удалите супернатант.
    4. Ресуспендируйте клеточный осадок в полной среде RPMI.
    5. Подсчитайте количество жизнеспособных клеток.
  5. Опсонизация раковых клеток антителами
    1. Ресуспендируйте раковые клетки с плотностью 2 × 105 клеток/мл в 0,5 мл полной среды RPMI.
    2. Добавьте моноклональные антитела к CD24 до конечной концентрации 1 µg/mL.
    3. Перемешайте клеточную суспензию осторожным пипетированием для обеспечения равномерного распределения антител.
    4. Инкубируйте клетки при 37°C в течение 30 мин в статических условиях.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве отрицательного контроля антителозависимого фагоцитоза используйте изотипический IgG-контроль в той же концентрации.
  6. Подготовка к совместному культивированию
    1. Не промывайте клетки после опсонизации.
    2. Переходите непосредственно к совместному культивированию, чтобы сохранить слой антител на поверхности клеток.
  7. Постановка совместного культивирования
    1. Добавьте 1 × 105 опсонизированных антителами GFP-меченых раковых клеток молочной железы в каждую лунку с макрофагами.
    2. Поддерживайте соотношение эффекторных клеток к мишеням 2:1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте соотношение эффекторных клеток к мишеням в соответствии с планом эксперимента. Используйте более высокие соотношения макрофагов к раковым клеткам, чем указанное здесь 2:1 (например, 3:1 или 5:1), чтобы увеличить частоту межклеточных контактов и повысить эффективность регистрации актов фагоцитоза.

Схема таймлапс-съемки взаимодействия макрофага и клетки, меченной GFP, в ходе эксперимента по визуализации.
Рисунок 2Таймлапс-визуализация антителозависимого клеточного фагоцитоза. (A) Схематический обзор системы совместного культивирования и установки для таймлапс-визуализации. Параметры визуализации включали 10-минутный интервал при общем времени сбора данных 16 ч (97 кадров) с использованием объектива 10× в каналах фазового контраста и GFP. (B) Репрезентативные таймлапс-изображения от 1 ч до 16 ч, демонстрирующие акты фагоцитоза, характеризующиеся интернализацией GFP-положительных раковых клеток макрофагами с течением времени. Желтыми пунктирными кругами выделены типичные акты фагоцитоза. В канале фазового контраста поглощенные раковые клетки выглядят как фазово-светлые внутриклеточные структуры в цитоплазме макрофагов (белые стрелки). В канале GFP флуоресценция, локализованная внутри макрофагов, подтверждает интернализацию. (C) Увеличенные изображения репрезентативных актов фагоцитоза в моменты 0, 1, 4 и 16 ч, иллюстрирующие последовательный процесс поглощения GFP-меченых раковых клеток макрофагами. Данная последовательность изображений была выбрана как репрезентативная на основании четкой визуализации актов фагоцитоза, опосредованных макрофагами. Белые стрелки указывают на макрофаги, взаимодействующие с клетками-мишенями и интернализирующие их. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

6. Таймлапс-визуализация (Автоматизированная система визуализации живых клеток)

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед проведением анализа настройте протокол визуализации с помощью автоматизированной системы визуализации живых клеток Lionheart и программного обеспечения Gen5 для автоматизированной визуализации живых клеток. Пройдите соответствующее обучение перед работой с системой визуализации, чтобы обеспечить правильную настройку, оптимальную производительность и безопасность использования.

  1. Подготовка прибора
    1. Включите систему визуализации, модуль контроля окружающей среды и подачу CO₂ как минимум за 1 ч до начала съемки.
    2. Откройте панель управления средой (Environment Control) в программном обеспечении для автоматизированной визуализации живых клеток.
    3. Установите температуру 37°C и содержание CO₂ 5%.
    4. Перед установкой планшета убедитесь, что температура в камере стабилизировалась в пределах ± 0.2°C, а уровень CO₂ составляет 5.0% ± 0.1%.
  2. Подготовка планшета
    1. Поместите 24-луночный планшет в камеру системы визуализации.
  3. Первоначальная конфигурация
    1. Откройте диспетчер задач (Task Manager) программного обеспечения для автоматизированной визуализации живых клеток.
    2. Выберите [Imager manual mode] (Ручной режим имиджера).
    3. Нажмите [Capture now] (Снять сейчас) для инициализации параметров визуализации.
    4. Выберите объектив 10×.
    5. В настройках фильтра выберите microplate (микропланшет).
    6. Выберите 24-луночный планшет из библиотеки планшетов программного обеспечения для автоматизированной визуализации живых клеток.
  4. Настройка фокуса и изображения
    1. Выберите канал фазового контраста (Phase Contrast).
    2. Выберите репрезентативную лунку (например, A1).
    3. Активируйте автофокус перед началом таймлапс-съемки.
    4. Сделайте снимок, используя значок камеры.
    5. Проверьте морфологию клеток и качество фокусировки.
    6. Перейдите в раздел [Process/Analyze] (Обработка/Анализ).
    7. Выберите [Create experiment from an image set] (Создать эксперимент из набора изображений) для настройки эксперимента.
  5. Параметры таймлапс-съемки
    1. Откройте панель настроек [Procedure] (Процедура).
    2. Установите температуру 37°C и содержание CO₂ 5%.
    3. В разделе [Start Kinetic] установите время работы 16:0:0.
    4. Установите интервал съемки 0:10:0.
    5. Установите общее количество чтений 97.
    6. Используйте интервал съемки 10–15 мин, чтобы сбалансировать временное разрешение и фототоксичность при фиксации ранних фагоцитарных событий.
  6. Конфигурация каналов визуализации
    1. Назначьте Каналу 1 фазовый контраст.
    2. Назначьте Каналу 2 GFP (Ex 469/35, Em 525/39).
    3. Выберите объектив 10× для обеспечения оптимального поля зрения и разрешения.
    4. Установите освещение, время интеграции и усиление в режим [Auto] (Авто) или настройте их вручную.
    5. Используйте типичное время экспозиции для GFP 10–30 ms, чтобы избежать насыщения сигнала.
    6. Примените идентичные настройки визуализации для всех лунок.
  7. Настройка позиций визуализации
    1. Откройте меню [Define beacons] (Определить маяки).
    2. Отключите сбор Z-стеков.
    3. Отключите сбор монтажных серий.
    4. Выполняйте съемку в одной фокальной плоскости.
    5. Определите позиции визуализации вручную, выбирая репрезентативные неперекрывающиеся области в каждой лунке с помощью значка микроскопа.
    6. Соблюдайте идентичность позиций визуализации для всех временных точек.
    7. Выберите не менее 4–6 полей зрения на одну лунку.
  8. Таймлапс-съемка
    1. Нажмите [Play] (Запуск) для начала автоматизированной таймлапс-визуализации.
  9. Экспорт и визуализация данных
    1. После завершения съемки откройте сохраненный файл эксперимента.
    2. Выберите позиции визуализации.
    3. Экспортируйте данные таймлапса в формате MP4.
    4. Откройте [Process Tool] (Инструмент обработки).
    5. При необходимости примените [Image Deconvolution] (Деконволюция изображения) для улучшения визуализации и выявления репрезентативных событий фагоцитоза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте таймлапс-визуализацию только для качественной оценки. Непоглощенные GFP-положительные раковые клетки могут перекрываться или временно ассоциироваться с макрофагами, что приводит к ложноположительным сигналам. Проводите количественный анализ с помощью отдельного конечного анализа.

7. Количественное определение фагоцитоза в конечной точке

  1. Удаление неинтернализованных клеток
    1. Проведите анализ в идентичных условиях совместного культивирования.
    2. Завершите эксперимент через 4 часа.
    3. Удалите культуральную среду.
    4. Добавьте 10 мМ ЭДТА в ПСБ.
    5. Инкубировать при 37°C в течение 5 мин.
    6. Осторожно промойте PBS, чтобы удалить неинтернализованные GFP-положительные клетки.
    7. Добавьте свежую среду для макрофагов.
  2. Сбор изображений для количественного анализа
    1. Выполните получение изображений в фазово-контрастном канале и канале GFP.
    2. Сделайте снимки как минимум 4–6 полей зрения для каждой лунки.
    3. Проанализируйте не менее трех лунок для каждого условия.
  3. Определение фагоцитарных событий
    1. Идентифицируйте макрофаги, содержащие GFP-положительные сигналы, которые полностью расположены внутри клеточной границы.
  4. Анализ изображений
    1. Откройте изображения в программном обеспечении ImageJ.
    2. Используйте плагин Cell Counter.
    3. Подсчитайте общее количество макрофагов.
    4. Подсчитайте количество макрофагов, содержащих интернализированные GFP-положительные клетки.
  5. Расчет индекса фагоцитоза
    1. Вычислите: Формула индекса фагоцитоза; отношение поглощенных GFP-положительных клеток к общему числу макрофагов; уравнение.
    2. Проводите анализ слепым методом.
    3. Повторите не менее трех раз в независимых экспериментах.
  6. Представление данных
    1. Представьте репрезентативные изображения таймлапс-съемки в хронологическом порядке (Рисунок 2B и Рисунок 2C).
    2. Представьте репрезентативные конечные изображения (Рисунок 3A и Рисунок 3B).

Анализ фагоцитоза: кокультивирование макрофагов, анти-CD24 мАТ; микроскопические изображения, сравнение графиков данных.
Рисунок 3Количественное определение антителозависимого фагоцитоза макрофагами с помощью конечного анализа. (A) Репрезентативные изображения в фазовом контрасте и GFP-флуоресценции макрофагов, культивируемых совместно с GFP-маркированными клетками рака молочной железы в течение 4 ч, с последующим удалением не поглощенных клеток путем обработки EDTA. Каналы фазового контраста и GFP были совмещены для идентификации макрофагов и интернализованных GFP-положительных мишеней. Количество макрофагов (счетчик 0) и GFP-положительных фагоцитирующих макрофагов (счетчик 1) определяли с помощью плагина Cell Counter в ImageJ. В контрольной группе с IgG событий фагоцитоза не наблюдалось, тогда как обработка моноклональными антителами к CD24 приводила к появлению четких внутриклеточных GFP-положительных сигналов в макрофагах, что указывает на активный фагоцитоз. Масштабная линейка = 200 µm(B) Количественное определение индекса фагоцитоза, определенного как процент макрофагов, содержащих интернализованные GFP-положительные клетки, относительно общей популяции макрофагов. Моноклональное антитело anti-CD24 значительно увеличило индекс фагоцитоза по сравнению с контролем IgG (0,0 ± 0,0% против 18,76 ± 4,01%, среднее значение ± SD; n = 6 полей на группу; ***p < 0,01, непарный t-критерий Уэлча). Данные являются репрезентативными как минимум для трех независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Успешная генерация и поляризация макрофагов из PBMC были подтверждены с помощью морфологической оценки и анализа методом проточной цитометрии (Рисунок 1). PBMC, выделенные путем центрифугирования в градиенте плотности, культивировали в среде с добавлением M-CSF, что к 7-му дню привело к появлению адгезивных клеток с характерной морфологией макрофагов. После стимуляции IFN-γ и LPS клетки продемонстрировали фенотип, соответствующий активации в заданных условиях. Анализ методом проточной цитоме...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Несколько этапов данного протокола имеют решающее значение для получения надежных и воспроизводимых результатов. Во-первых, качество и чистота выделения PBMC напрямую влияют на выход макрофагов и эффективность их дифференцировки. Для сохранения интерфейса лейкоцитарного слоя крайне важно осторожно наслоить разведенную кровь на градиент Ficoll и проводить центрифугирование с выключенным тормозом. Неполный лизис эритроцитов или чрезмерная инкубация с лизирующим буфером приведут к снижению жизнеспособности PBMC. Во-вторых, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Данная работа была поддержана Центром биологии рака и прецизионной терапии Медицинского университета Китая в рамках программы исследовательских центров приоритетных направлений проекта «Росток высшего образования» Министерства образования (MOE) Тайваня (CBPTC-PROJ-5-2).

Мы благодарим Центр биологии рака и прецизионной терапии за предоставление финансирования и академическую поддержку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Стоковый раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) 0,5 MSigma-Aldrich (или эквивалент)E7889 (или эквивалент)Используется для приготовления 10 мМ рабочего раствора ЭДТА в PBS для отсоединения клеток
24-луночные планшеты для культивирования тканей (с TC-обработкой)Corning (или эквивалент)3524Используется для совместного культивирования макрофагов и раковых клеток при проведении анализа фагоцитоза
Антитела к CD206 человека (проточная цитометрия)BioLegend (или эквивалент)321122 (или эквивалент)Маркер альтернативного фенотипа макрофагов
Моноклональное антитело к человеческому CD24Thermo Fisher Scientific (или эквивалент)MA1-91384 (или эквивалент)Используется для опсонизации раковых клеток с целью обеспечения антителозависимого фагоцитоза
Автоматизированная система визуализации живых клеток с камерой контроля окружающей среды (например, Lionheart FX)Agilent Technologies (или эквивалент)Автоматизированный микроскоп BioTek Lionheart FXобеспечивает возможность проведения длительной таймлапс-визуализации при контролируемой температуре и 2 условия
Программное обеспечение для автоматизированной визуализации живых клеток (например, Gen5)Agilent Technologies (или эквивалент)Нет данныхИспользуется для получения и анализа данных таймлапс-визуализации
Центрифуга (с ротором с поворотными стаканами)Thermo Fisher Scientific (или эквивалент)Центрифуга Multifuge X4R Pro с ротором TX-1000 (или эквивалентом)Используется для выделения PBMC и этапов промывки клеток
2 инкубатор (37°C, 5% 2)Thermo Fisher Scientific (или эквивалент)Forma Direct Heat 2 Инкубатор (или аналог)Обеспечивает физиологические условия для культивирования клеток
2 газовая подача с регулятором давленияAgilent Technologies (или эквивалент)Нет данныхМатериалы и оборудование 2 для контроля параметров окружающей среды в инкубаторе и системе визуализации
Конические пробирки (15 мл и 50 мл)Corning (или эквивалент)352070 (или эквивалент)Используется для выделения, промывки и центрифугирования мононуклеарных клеток периферической крови (МНКПК)
Пробирки для сбора крови с ЭДТА-покрытием (вакутайнеры)BD Biosciences (или эквивалент)367863 (или эквивалент)Используется для забора образцов цельной крови у доноров
Ficoll-Paque PLUSCytiva (или эквивалент)17144003 (или эквивалент)Среда с градиентом плотности для выделения мононуклеарных клеток периферической крови (МНКПК)
Проточный цитометр (например, FACSCanto II)BD Biosciences (или эквивалент)BD FACSCanto II Используется для фенотипического анализа макрофагов
Компенсационные бусины (проточная цитометрия)Biolegend (или эквивалент)424602Используется для контролей одноцветной компенсации
антитела к CD11b человека, конъюгированные с FITC (проточная цитометрия)BioLegend (или эквивалент)101205 (или эквивалент)Маркер, используемый для идентификации макрофагов
антитела к CD80 человека, конъюгированные с PE (проточная цитометрия)BioLegend (или эквивалент)375410 (или эквивалент)Маркер, ассоциированный с фенотипом активированных макрофагов
Линия клеток рака молочной железы, экспрессирующая GFP (MDA-MB-468)ATCC (или эквивалент)HTB-132 (или эквивалент)Клетки-мишени, используемые в анализе фагоцитоза; GFP обеспечивает визуализацию
среда для макрофагов ImmunoCult-SFSTEMCELL Technologies (или эквивалент)10961 (или эквивалент)Бессывороточная среда, используемая для дифференцировки макрофагов
Дульбекко’модифицированная среда Игла в Дулозе (DMEM)Thermo Fisher Scientific (или эквивалент)12100046Используется для культивирования и ресуспендирования раковых клеток
Изотипический контрольный антитело (IgG)Bio X Cell (или эквивалент)BE0297 (или эквивалент)Отрицательный контроль для анализа антителозависимого фагоцитоза
Липополисахарид (ЛПС)Sigma-Aldrich (или эквивалент)L2630 (или эквивалент)Стимул, используемый для активации макрофагов в сочетании с IFN-γ
Рекомбинантный интерферон гамма человека (IFN-γ)STEMCELL Technologies (или аналог)78020 (или эквивалент)Цитокин, используемый для активации макрофагов
Рекомбинантный человеческий макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF)STEMCELL Technologies (или аналог)78057 (или эквивалент)Фактор роста, используемый для дифференцировки макрофагов
Пипетки Пастера или градуированные пипеткиJetbiofil (или эквивалент)GSP010010 (или эквивалент)Используется для работы с жидкостями при выделении PBMC и культивировании клеток
ФСБ (без Ca2+)2+-/Mg2+-свободный)Thermo Fisher Scientific (или эквивалент)BP399-500 (или эквивалент)Буфер, используемый для промывки клеток и стадий разведения
Чашки Петри (100 мм, нестерильные)–(обработанный для культивирования тканей)Corning (или эквивалент)430591Используется для дифференцировки макрофагов методом селекции по адгезии
Буфер для лизиса эритроцитовBioLegend (или эквивалент)420301 (или эквивалент)Используется для удаления эритроцитов при выделении мононуклеарных клеток периферической крови (МНКПК)
Фиксируемый краситель Viability 405/452Miltenyi Biotec (или эквивалент)130-130-404 (или эквивалент)Используется для оценки жизнеспособности клеток при проведении проточного цитометрического анализа
DAPISigma-Aldrich (или эквивалент)D9542 (или эквивалент)Используется для исключения мертвых клеток при проточной цитометрии

Ссылки

  1. Sung H, et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209-249.
  2. Perou CM, et al. Molecular portraits of human breast tumours. Nature. 2000;406(6797):747-752.
  3. Foulkes WD, Smith IE, Reis-Filho JS. Triple-negative breast cancer. N Engl J Med. 363(20):1938-1948.
  4. Dent R, et al. Triple-negative breast cancer: Clinical features and patterns of recurrence. Clin Cancer Res. 2007;13(15 Pt 1):4429-4434.
  5. Lin NU, et al. Sites of distant recurrence and clinical outcomes in patients with metastatic triple-negative breast cancer: High incidence of central nervous system metastases. Cancer. 2008;113(10):2638-2645.
  6. Bianchini G, De Angelis C, Licata L, Gianni L. Treatment landscape of triple-negative breast cancer - expanded options, evolving needs. Nat Rev Clin Oncol. 2022;19(2):91-113.
  7. Lecoultre M, Dutoit V, Walker PR. Phagocytic function of tumor-associated macrophages as a key determinant of tumor progression control: A review. J Immunother Cancer. 2020;8(2).
  8. Mantovani A, Allavena P, Marchesi F, Garlanda C. Macrophages as tools and targets in cancer therapy. Nat Rev Drug Discov. 2022;21(11):799-820.
  9. Chan SH, Lin CY, Tseng HJ, Wang LH. Cd24a knockout results in an enhanced macrophage- and cd8⁺ t cell-mediated anti-tumor immune responses in tumor microenvironment in a murine triple-negative breast cancer model. J Biomed Sci. 2025;32(1):73.
  10. Majeti R, et al. CD47 is an adverse prognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stem cells. Cell. 2009;138(2):286-299.
  11. Barkal AA, et al. CD24 signalling through macrophage siglec-10 is a target for cancer immunotherapy. Nature. 2019;572(7769):392-396.
  12. Wang X, et al. CD24-siglec axis is an innate immune checkpoint against metaflammation and metabolic disorder. Cell Metab. 2022;34(8):1088-1103.e1086.
  13. Chan SH, et al. Identification of the novel role of CD24 as an oncogenesis regulator and therapeutic target for triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. 2019;18(1):147-161.
  14. Huang S, Zhang X, Wei Y, Xiao Y. Checkpoint CD24 function on tumor and immunotherapy. Front Immunol. 2024;15:1367959.
  15. Weiskopf K, Weissman IL. Macrophages are critical effectors of antibody therapies for cancer. MAbs. 2015;7(2):303-310.
  16. Cao X, et al. Promoting antibody-dependent cellular phagocytosis for effective macrophage-based cancer immunotherapy. Sci Adv. 2022;8(11):eabl9171.
  17. Aderem A, Underhill DM. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annu Rev Immunol. 1999;17:593-623.
  18. Flannagan RS, Jaumouille V, Grinstein S. The cell biology of phagocytosis. Annu Rev Pathol. 2012;7:61-98.
  19. Denardo DG, Ruffell B. Macrophages as regulators of tumour immunity and immunotherapy. Nat Rev Immunol. 2019;19(6):369-382.
  20. Horsthemke M, Wilden J, Bachg AC, Hanley PJ. Time-lapse 3d imaging of phagocytosis by mouse macrophages. J Vis Exp. 2018;(140). doi:10.3791/57566.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

CD24

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.