Протокол разделения полушарий для морфологического наблюдения и комбинированного выделения РНК и белков из областей мозга мыши

Xinyu Zhu; Yukun Li; Lianjun Zhang; Yiyun Zou; Shanxiang Gao; Yuan Tian; Jing Xu; Chunqing Liu

doi:10.3791/71465

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Протокол разделения полушарий для морфологического наблюдения и комбинированного выделения РНК и белков из областей мозга мыши

71 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71465

⸱

1 сентября 2026 г.

Xinyu Zhu^*¹^,² , Yukun Li^*³ , Lianjun Zhang³ , Yiyun Zou³ , Shanxiang Gao³ , Yuan Tian³ , Jing Xu⁴ , Chunqing Liu¹

¹College of Medical Laboratory, Dalian Medical University, ²The Transvascular Implant Instrument Research Institute, ³The Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University, ⁴College of Basic Medical Sciences of Dalian Medical University

^* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Данный протокол описывает процедуру разделения головного мозга мыши на две половины. Одно полушарие используется для морфологического окрашивания, а другое — для экстракции РНК и белков. Такая стратегия позволяет сократить количество используемых животных, соответствует принципам 3R и сводит к минимуму межиндвидуальную вариабельность.

Аннотация

В повседневных нейробиологических исследованиях морфологическое окрашивание и молекулярный анализ нуклеиновых кислот/белков обычно требуют использования разных экспериментальных животных, что увеличивает их число и противоречит принципу 3Rs по обеспечению благополучия животных. В данном протоколе описывается рабочий процесс распределения тканей мозга мыши, который позволяет проводить парный морфологический и молекулярный анализы на одном животном. После транскардиальной перфузии 0.9% физиологическим раствором мозг разделяют на два полушария. Одно полушарие фиксируют в 4% параформальдегиде для иммуногистохимии и иммунофлуоресценции; срезы, хранящиеся в растворе сахарозы, этиленгликоля и поливинилпирролидона (PVP), сохраняют стабильное качество окрашивания до семи лет. Контралатеральное полушарие криоконсервируют при -80 °C для совмежного выделения РНК и белка в количествах, достаточных для последующего проведения qPCR и вестерн-блоттинга. Метод, протестированный на панчах энторинальной коры массой 9–10 mg, обеспечивает более низкий выход РНК и белка по сравнению с их раздельной экстракцией, однако количество извлеченных биомолекул остается достаточным для молекулярного детектирования. Такой рабочий процесс снижает расход животных и устраняет межиндивидуальные различия между парными морфологическими и молекулярными анализами. Он представляет собой осуществимый метод подготовки тканей для многомерного профилирования отдельных отделов мозга мыши.

Введение

Исследования в области нейронаук за последние десятилетия значительно расширились, раскрыв ключевые механизмы, определяющие физиологию человеческого мозга, возникновение неврологических заболеваний и разработку методов терапии. Модели на животных остаются незаменимыми для нейробиологических исследований, предоставляя контролируемые и воспроизводимые платформы для изучения развития нервной системы, физиологических функций и патологических процессов. Экспериментальные манипуляции и гистологические наблюдения на мышах позволяют исследователям описывать нейрональную передачу сигналов, формирование нейронных цепей и связи между нейронными процессами и поведением. Параллельно с техническим прогрессом центральное место заняли вопросы этики экспериментов на животных. Принципы 3R (Замена, Сокращение и Прецизирование — Replacement, Reduction, and Refinement) в настоящее время являются общепринятыми мировыми стандартами для всех исследований с использованием животных¹^,², требуя от исследователей минимизировать количество используемых животных при сохранении надежности результатов экспериментов.

Инновационные инструменты, такие как системы условного нокаута, позволяют осуществлять точные генетические манипуляции в отдельных субрегионах мозга мыши³. Эти достижения стимулировали интенсивные исследования микромасштабных отделов мозга, таких как CA1, CA3 и DG гиппокампа, которые регулируют обучение, память и настроение⁴. Дешифровка функций высокого порядка этих крошечных областей мозга требует скоординированных измерений на морфологическом, транскрипционном и белковом уровнях. К сожалению, малый объем их ткани создает серьезные технические препятствия для параллельного многоиндексного детектирования.

Морфологическое окрашивание, количественное определение РНК и иммунодетекция белков представляют собой три основных рутинных метода анализа в нейронауках. Традиционные схемы исследований требуют использования трех отдельных когорт мышей для проведения этих трех типов тестов. Такая практика значительно увеличивает расход животных и вносит существенную межживотную биологическую вариабельность, что снижает сопоставимость гистологических и молекулярных наборов данных. Унифицированный рабочий процесс, позволяющий получать сопоставимые морфологические и молекулярные сигналы от одного животного, помог бы в значительной степени устранить эти два критических ограничения и лучше соответствовать принципу сокращения (Reduction) концепции 3R.

В данной работе мы представляем воспроизводимый протокол разделения полушарий ткани мозга мыши. После системной перфузии физиологическим раствором весь мозг разделяют на два полушария: одно полушарие фиксируют для морфологических исследований, а контралатеральное полушарие криоконсервируют для одновременной ко-экстракции РНК и белков. Ткани, фиксированные и хранимые в защитном буфере на основе сахарозы, этиленгликоля и поливинилпирролидона (PVP), сохраняют стабильные высококачественные сигналы окрашивания при иммуногистохимическом и иммунофлуоресцентном анализе на срок до семи лет. Мы валидировали этот метод, используя крошечные панчи массой 9–10 mg энторинальной коры — ткани, масса которой меньше, чем в обычно исследуемых областях, таких как гиппокамп и префронтальная кора. Успешное обнаружение в таком малом образце ткани указывает на то, что данный рабочий процесс совместим и с более мелкими подзонами мозга, такими как гипоталамус и миндалевидное тело. Хотя данный протокол обеспечивает более низкие концентрации РНК и белков, чем специализированные наборы для экстракции одного типа биомолекул, выделенные биомолекулы обладают достаточным качеством для проведения стандартных последующих анализов с помощью qPCR и вестерн-блоттинга. Такой рабочий процесс снижает количество используемых животных и устраняет межиндивидуальные различия между парными морфологическими и молекулярными анализами. Он представляет собой осуществимый метод подготовки тканей для многомерного профилирования отдельных подзон мозга мыши.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Заявление об этике

Все эксперименты на животных, проведенные в данном исследовании, были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Даляньского медицинского университета (разрешение № AEE18026 для экспериментов на крысах и № AEE24261 для экспериментов на мышах), Китайская Народная Республика. Все протоколы экспериментов были реализованы в соответствии с этическими принципами работы с лабораторными животными и полностью соответствовали принципам 3R (сокращение, замена и совершенствование) при проведении экспериментов на животных. На протяжении всего экспериментального процесса принимались строгие меры для эффективного облегчения страданий и дистресса животных. В то же время количество экспериментальных животных было ограничено минимальным числом, необходимым для обеспечения надежности и достоверности результатов статистического анализа. См. Список материалов для получения полного списка реагентов, расходных материалов и оборудования, использованных в данном протоколе.

1. Подготовка экспериментальных животных и операция по транскардиальной перфузии

Анестезия и предоперационная подготовка
1. Для данного протокола используйте взрослых самцов крыс линии Sprague-Dawley или мышей C57BL/6, сертифицированных как свободные от специфических патогенов (SPF). Содержите животных в условиях с контролируемой температурой (22 ± 2 °C) и 12-часовым циклом свет/темнота. Обеспечьте животным свободный доступ к стерильному корму и воде.
2. Для введения в состояние наркоза введите животным пентобарбитал натрия внутрибрюшинно в дозе 80 mg/kg для крыс или 50 mg/kg для мышей (см. Рисунок 1).
Процедура транскардиальной перфузии
1. Зафиксируйте анестезированных животных в положении на спине на хирургическом столе.
2. С помощью прямых ножниц рассеките брюшную стенку по средней линии от мечевидного отростка до лобкового симфиза. Рассеките боковые стенки грудной клетки с обеих сторон для полного обнажения сердца.
3. Проведите перфузию животного ледяным 0.9% физиологическим раствором с постоянной скоростью потока: 100–150 mL за 10–15 min для крыс и 20–30 mL за 5–8 min для мышей.
Извлечение мозга и разделение полушарий
1. После завершения перфузии проведите декапитацию животных большими хирургическими ножницами. Разрежьте кожу головы по средней линии, чтобы обнажить череп.
2. С помощью стерильного шпателя осторожно извлеките мозг из черепной коробки. Быстро перенесите весь мозг в стерильную чашку Петри, помещенную на лед.
3. Используя стерильное, свободное от РНказ лезвие бритвы, симметрично разделите мозг на левое и правое полушария по сагиттальному шву.
4. Немедленно перенесите левое полушарие в центрифужную пробирку объемом 15 mL, содержащую 10 mL ледяного 4% раствора параформальдегида для фиксации. Перенесите правое полушарие в маркированную, свободную от РНказ криопробирку, подвергните быстрому замораживанию в жидком азоте и храните при -80 °C до экстракции РНК и белков.

2. Фиксация, секционирование и длительное хранение тканей мозга

Фиксация и дегидратация
1. Полностью погрузите левое полушарие в 4% раствор параформальдегида и фиксируйте ткань при 4 °C в течение 24 ч. По завершении фиксации перенесите полушарие мозга в центрифужную пробирку объемом 15 mL, содержащую 30% раствор сахарозы, и проведите дегидратацию ткани при 4 °C.
2. Заменяйте 30% раствор сахарозы каждые 24 ч до тех пор, пока ткань мозга не опустится на дно пробирки.
Приготовление криосрезов
1. Извлеките дегидратированное полушарие мозга из раствора сахарозы и аккуратно удалите излишки жидкости стерильной фильтровальной бумагой.
2. Закрепите полушарие мозга на предметном столике криостата, используя среду для заливки OCT (optimal cutting temperature).
3. С помощью криостата выполните серийное корональное секционирование мозга с толщиной срезов 30 µm. Соберите последовательные срезы в 24-луночный планшет с разлитым стерильным 0.01 M PBS.
Длительное хранение срезов мозга
1. Заранее приготовьте криопротекторный раствор для консервации срезов мозга: добавьте 2 g PVP400, 60 g сахарозы и 60 mL этиленгликоля к 100 mL 0.01 M PBS. Перемешивайте раствор при комнатной температуре до полного растворения всех компонентов и храните при 4 °C до использования.

3. Экстракция РНК с помощью TRIzol

Гомогенизация тканей и разделение фаз
1. Гомогенизируйте ткань энторинальной коры в 1 mL реагента TRIzol с помощью ультратонкого гомогенизатора и инкубируйте гомогенат на льду в течение 15 min. Центрифугируйте при 8,000 × g в течение 5 min при 4 °C.
2. Добавьте 200 µL хлороформа и перемешайте на вортексе в течение 10 s. Центрифугируйте при 5,600 × g в течение 15 min при 4 °C. Затем перенесите верхнюю водную фазу в пробирку, свободную от РНКаз. Добавьте 500 µL изопропанола и инкубируйте при -20 °C в течение ночи для осаждения РНК. Центрифугируйте повторно.
Осаждение, промывка и оценка качества РНК
1. Удалите супернатант и промойте осадок РНК 1 mL 75% этанола. Центрифугируйте при 5,600 × g в течение 5 min при 4 °C. Удалите супернатант, высушите осадок на воздухе в течение 10 min и растворите РНК в 20 µL воды, обработанной DEPC, в течение 10 min.
2. Измерьте концентрацию и чистоту РНК (A₂₆₀/A₂₈₀) с помощью спектрофотометра. Храните РНК при -80 °C до проведения дальнейшего анализа.

4. Экстракция общего белка с помощью набора Minute

Лизис и гомогенизация тканей
1. Предварительно охладите спиновую колонку и пробирку для сбора на льду. Гомогенизируйте ткань в 100 µL буфера для лизиса клеток с помощью ультратонкого гомогенизатора. Промойте гомогенизатор еще 100 µL буфера для лизиса клеток и объедините полученные лизаты.
Выделение и количественное определение белка
1. Перенесите гомогенат в спиновую колонку и инкубируйте в течение 2 min при комнатной температуре.
2. Центрифугируйте при 11,000–14,300 × g в течение 2 min.
3. Сразу после центрифугирования поместите пробирку для сбора на лед и удалите спиновую колонку. Определите концентрацию белка с помощью BCA-анализа.

5. Одновременная экстракция РНК и белков из энторинальной коры (9–10 mg)

Предварительная подготовка к эксперименту и приготовление реагентов
1. Для всех этапов экстракции используйте набор для выделения ДНК/РНК/белка. Используйте только сертифицированные расходные материалы, не содержащие РНказ и ДНказ (см. Рисунок 2).
2. Приготовьте лизирующий буфер непосредственно перед использованием: добавьте коктейль ингибиторов протеаз в лизирующий буфер из набора в разведении 1:100.
Лизис тканей и разделение фаз
1. Извлеките замороженное правое полушарие мозга из хранилища при -80 °C и поместите его на лед. Используя стерильный панч, не содержащий РНказ, отберите 9–10 mg ткани из целевой области мозга.
2. Полностью гомогенизируйте ткань на льду с помощью электрического гомогенизатора тканей до полного исчезновения видимых фрагментов ткани. Инкубируйте гомогенат на льду в течение 10 min для обеспечения полного лизиса.
3. Добавьте к гомогенату 200 µL реагента для разделения фаз из набора. Интенсивно перемешайте содержимое пробирки на вортексе в течение 30 s и инкубируйте при комнатной температуре в течение 3 min. Центрифугируйте пробирку при 8,000 × g в течение 15 min при 4 °C для достижения полного разделения фаз.
Очистка и элюция РНК
1. Осторожно соберите верхнюю водную фазу, используя наконечник пипетки, не содержащий РНказ. Перенесите собранную водную фазу в новую пробирку объемом 1,5 mL, не содержащую РНказ. Добавьте к водной фазе равный объем 100% этанола и перемешайте.
2. Перенесите 700 µL смеси в колонку для очистки РНК из набора. Центрифугируйте колонку при 5,600 × g в течение 1 min при комнатной температуре.
3. Добавьте в колонку 500 µL промывочного буфера 1 для РНК из набора. Центрифугируйте колонку при 5,600 × g в течение 1 min при комнатной температуре.
4. Добавьте в колонку 500 µL промывочного буфера 2 для РНК из набора и снова центрифугируйте. Центрифугируйте пустую колонку при 8,000 × g в течение 2 min при комнатной температуре для полного удаления остаточного этанола из мембраны колонки.
5. Перенесите колонку в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 mL, не содержащую РНказ. Добавьте 30–50 µL воды, не содержащей РНказ (предварительно нагретой до 60 °C), непосредственно в центр мембраны колонки. Инкубируйте колонку при комнатной температуре в течение 2 min. Центрифугируйте колонку при 8,000 × g в течение 1 min при комнатной температуре для элюции РНК.
Осаждение и растворение белка
1. Добавьте 750 µL изопропанола к оставшейся органической фазе и интерфазе в исходной пробирке после удаления водной фазы для экстракции РНК. Инкубируйте смесь при -20 °C в течение 30 min для осаждения белков.
2. Центрифугируйте пробирку при 8,000 × g в течение 10 min при 4 °C. Удалите супернатант, сохранив осадок белка на дне пробирки.
3. Добавьте к осадку белка 1 mL 95% этанола. Кратковременно перемешайте пробирку на вортексе для промывки осадка. Центрифугируйте пробирку при 8,000 × g в течение 5 min при 4 °C и удалите супернатант. Повторите этот этап промывки еще два раза.
4. Высушите осадок белка на воздухе при комнатной температуре в течение 5–10 min, пока осадок не станет полупрозрачным и не исчезнут видимые следы этанола.
5. Добавьте 50–100 µL 5–10% раствора SDS к высушенному осадку. Интенсивно перемешайте пробирку на вортексе в течение 1 min и инкубируйте на льду в течение 10 min для полного растворения белка. Центрифугируйте пробирку при 8,000 × g в течение 5 min при 4 °C. Соберите супернатант в качестве конечного белкового экстракта.

6. Иммуногистохимическое (ИГХ) окрашивание

Предварительная обработка срезов и инактивация эндогенных ферментов
1. Извлеките срезы мозга из криопротектора, хранившегося при -20 °C. С помощью стеклянной иглы перенесите срезы в 24-луночный планшет с 0.01 M PBS (pH 7.4).
2. Промойте срезы трижды 0.01 M PBS по 5 мин за одну промывку при комнатной температуре на шейкере.
3. Инкубируйте срезы с 3% раствором блокатора пероксидазы (перекиси водорода) при комнатной температуре в течение 10 мин для инактивации эндогенной пероксидазной активности. После блокировки повторите этапы промывки.
Пермеабилизация и неспецифическое блокирование
1. Инкубируйте срезы в 0.5% Triton X-100 в течение 30 мин при комнатной температуре на шейкере для пермеабилизации клеточных мембран. Повторите этапы промывки.
2. Инкубируйте срезы в 4% бычьем сывороточном альбумине в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего инкубируйте с ингибитором неспецифического окрашивания еще в течение 30 мин при комнатной температуре.
Инкубация с первичными и вторичными антителами
1. Разведите первичные антитела в 1% растворе BSA в следующих оптимизированных пропорциях: doublecortin (DCX, 1:4000), neuronal nuclear antigen (NeuN, 1:3000), ionized calcium-binding adapter molecule 1 (Iba-1, 1:2000) и glial fibrillary acidic protein (GFAP, 1:2000).
2. Добавьте по 200 µL разведенного раствора первичных антител в каждую лунку, обеспечив полное погружение срезов.
3. Добавьте по 200 µL вторичных антител, меченных биотином, в каждую лунку. Инкубируйте срезы при комнатной температуре в течение 30 мин.
4. Промойте срезы трижды 0.01 M PBS по 5 мин за одну промывку. Добавьте по 300 µL конъюгата стрептавидин-пероксидазы в каждую лунку. Инкубируйте срезы при комнатной температуре в течение 30 мин. После инкубации повторите этапы промывки.
Хромогенное проявление 3,3′-диаминобензидином (DAB) и заключение под покровное стекло
1. Добавьте по 200 µL рабочего раствора DAB в каждую лунку. Контролируйте хромогенную реакцию под световым микроскопом.
2. С помощью стеклянной иглы перенесите срезы на стеклянные предметные стекла, покрытые желатином. Полностью высушите стекла на воздухе при комнатной температуре.
3. Дегидратируйте стекла в серии возрастающих концентраций этанола (50%, 70%, 90%, 95%, 100%, 100% этанол, по 5 мин в каждом), затем проведите просветление в ксилоле дважды по 5 мин.

7. Иммунофлуоресцентное (ИФ) окрашивание

Предварительная обработка и пермеабилизация срезов
1. Извлеките срезы мозга из криопротектора, хранившегося при -20 °C. Перенесите срезы в 24-луночный планшет с 0.01 M PBS (pH 7.4).
2. Промойте срезы трижды 0.01 M PBS по 5 мин за одну промывку при комнатной температуре на шейкере.
3. Инкубируйте срезы в 0.5% Triton X-100 в течение 30 мин при комнатной температуре на шейкере.
4. После пермеабилизации промойте срезы трижды 0.01 M PBS по 10 мин за одну промывку.
Блокировка и инкубация с первичными антителами
1. Инкубируйте срезы в блокирующем растворе, содержащем 4% BSA и ингибитор неспецифического окрашивания, в течение 1 ч при комнатной температуре во влажной камере.
2. Аспирируйте блокирующий раствор. Разведите первичные антитела в 1% растворе BSA до оптимальных концентраций и добавьте по 300 µL разведенного раствора первичных антител в каждую лунку. Инкубируйте срезы в течение ночи при 4 °C во влажной светонепроницаемой камере.
Инкубация со вторичными антителами
1. На следующий день выдержите срезы при комнатной температуре в течение 1 ч в темноте. Удалите раствор первичных антител и промойте срезы трижды 0.01 M PBS по 10 мин за одну промывку на шейкере в темноте.
2. Разведите конъюгированные с флуорофором вторичные антитела в 1% растворе BSA согласно рекомендациям производителя. Добавьте по 300 µL раствора вторичных антител в каждую лунку. Инкубируйте срезы при комнатной температуре в течение 1–2 ч в темноте.
3. Промойте срезы пять раз 0.01 M PBS по 5 мин за одну промывку в темноте.

8. Количественный анализ методом ПЦР в реальном времени (qPCR)

Удаление гДНК из РНК и обратная транскрипция
1. Проведите обратную транскрипцию для синтеза кДНК с использованием набора для обратной транскрипции, используя 1 µg суммарной РНК на 20 µL реакционной смеси. Используйте программу термоциклирования, рекомендованную производителем: 25 °C в течение 5 min, 50 °C в течение 15 min, 85 °C в течение 5 min, хранение при 4 °C.
2. Разведите синтезированную кДНК в соотношении 1:5 водой, не содержащей РНКаз. Храните кДНК при -20 °C до проведения кПЦР-амплификации.
Подготовка системы кПЦР и амплификация
1. Подготовьте реакционную смесь для кПЦР на льду в специальном ПЦР-боксе, свободном от РНКаз. Реакционная смесь объемом 20 µL включает: 10 µL мастер-микса для кПЦР, 0.4 µL прямого праймера (10 µM), 0.4 µL обратного праймера (10 µM), 2 µL разведенной матрицы кДНК, 7.2 µL воды, не содержащей РНКаз.
2. Проведите кПЦР-амплификацию по следующей программе: начальная денатурация при 95 °C в течение 30 s; 40 циклов: 95 °C в течение 10 s и 60 °C в течение 30 s; затем анализ кривых диссоциации от 60 °C до 95 °C с шагом 0.5 °C каждые 5 s.

9. Вестерн-блоттинг

Количественное определение белка и подготовка образцов
1. Разведите белковые экстракты до одинаковых концентраций, используя 5–10% раствор SDS, на основании результатов BCA-анализа.
Электрофорез в SDS-PAGE и перенос белков
1. Приготовьте 10% разделяющий гель и 5% концентрирующий гель в соответствии со стандартными протоколами молекулярной биологии.
2. Внесите в каждую лунку геля 20 µg общего белка. Для экспериментов с градиентной нагрузкой внесите в лунки по 15 µg, 30 µg и 45 µg белка.
3. Проведите электрофорез при 80 V в течение 30 мин, пока маркер белков не войдет в разделяющий гель, затем увеличьте напряжение до 120 V на 60–90 мин, пока краситель бромфеноловый синий не достигнет нижней части геля.
4. Соберите «сэндвич» для переноса в следующем порядке (от катода к аноду): губка, фильтровальная бумага, гель, PVDF-мембрана, фильтровальная бумага и губка. Убедитесь, что между гелем и мембраной не осталось пузырьков воздуха.
5. Выполните «влажный» перенос при постоянном токе 300 mA в течение 90 мин на ледяной бане.
Блокировка мембраны и инкубация с антителами
1. После завершения переноса коротко промойте PVDF-мембрану буфером TBST. Инкубируйте мембрану в 5% BSA в течение 2 ч при комнатной температуре на шейкере для блокировки неспецифических сайтов связывания.
2. Разведите первичные антитела в 5% растворе BSA до оптимизированных концентраций. Инкубируйте мембрану с раствором первичных антител в течение ночи при 4 °C на шейкере.
3. На следующий день трижды промойте мембрану буфером TBST по 10 мин за каждую промывку на шейкере.
4. Разведите вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP), в 5% растворе обезжиренного молока в разведении, рекомендованном производителем. Инкубируйте мембрану с раствором вторичных антител в течение 2 ч при комнатной температуре на шейкере.
5. После инкубации с вторичными антителами трижды промойте мембрану буфером TBST по 10 мин за каждую промывку. Инкубируйте мембрану с раствором ECL-субстрата в течение 1–2 мин в темноте.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Определение концентрации РНК, электрофорез в агарозном геле и кПЦР

Как показано, общая РНК и белок были совместно экстрагированы из биоптатов энторинальной коры (9–10 mg) с помощью набора для выделения ДНК/РНК/белка. В качестве контроля использовались параллельные образцы, обработанные с помощью TRIzol (РНК) или набора для экстракции белка. Данный протокол позволил получить 235 ± 12 ng µL⁻¹ РНК, что на 36 % меньше, чем при использовании TRIzol (p < 0.05...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В исследованиях на мышах морфологический анализ, а также анализы нуклеиновых кислот и белков часто требуют использования отдельных образцов тканей животных из-за различий в процедурах их подготовки. Это увеличивает количество используемых животных и вносит межвидовую биологическую вариабельность, что может снизить сопоставимость гистологических и молекулярных наборов данных. Для устранения этих ограничений мы разработали рабочий процесс, который позволяет получать гистологические и молекулярные данные от одного и того же...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет известных конфликтов финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.

Благодарности

This work was supported by grants from the Education Department of Liaoning Province (General Research Project JYTMS20230571) and Dalian Medical University’s 2023 “Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Health and Wellness” initiative (H0.2XY2023KY10), both awarded to Prof. CQ Liu; and by the 2025 Liaoning Province Undergraduate Innovation & Entrepreneurship Training Program(S202510161061) and Dalian Medical University’s Undergraduate Innovative Talent Training and Teaching Reform Fund (112307010209), both awarded to YK Li.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, свободные от РНказ	Axygen	MCT-150-C-S	Сбор тканевых трепанов и выделение фракций РНК/белка.
конические центрифужные пробирки объемом 15 мл	Биопленка	CFT010150	Фиксация, дегидратация сахарозой и хранение в растворе.
24-луночные планшеты для культивирования клеток	NEST	702001	Сбор, окрашивание и длительное хранение свободно плавающих срезов головного мозга.
30% раствор сахарозы	Приготовлено в лаборатории	Нет данных	Криопротекция фиксированных полушарий мозга перед криосекционированием.
4% раствор параформальдегида	Biosharp	BL539A	Иммерсионная фиксация полушария мозга, предназначенного для морфологического исследования.
5× буфер для нанесения белков	Beyotime Biotechnology	DL101	Подготовка образцов белка для электрофореза в ПААГ с ДСН.
Агароза	Solarbio	Кат.: A8201	Оценка целостности РНК методом электрофореза в агарозном геле.
Антитела к даблкортину	Abcam	ab18723	Первичные антитела для иммуногистохимического анализа даблкортина.
Антитела к ERK	Beyotime	AB2014	Первичные антитела для вестерн-блоттинга на общий ERK.
антитела к GFAP	Abcam	ab10062	Первичные антитела для иммунофлуоресцентного окрашивания глиального фибриллярного кислого белка.
Антитела к Iba1	Wako	NCNP24	Первичные антитела для иммунофлуоресцентного окрашивания адапторного белка 1, связывающего ионизированный кальций.
Антитела к NeuN	Millipore	A60	Первичные антитела для окрашивания ядерного нейронального антигена.
анти-NF-κантитело к p65	HUABIO	ET1603-12	Первичные антитела к NF-κВестерн-блоттинг p65.
Антитела к фосфо-ERK	Beyotime	ET1610-13	Первичные антитела для вестерн-блоттинга фосфорилированной ERK.
антитела к PSD95	HUABIO	ET1602-20	Первичные антитела для вестерн-блоттинга PSD95.
Антитела к ULK1	HUABIO	ET1704-63	Первичные антитела для вестерн-блоттинга ULK1.
Анти-βантитело к $\alpha$-тубулину	ABclonal	AC021	Первичные антитела для контроля загрузки при вестерн-блоттинге.
Среда для заключения препаратов с антифейдинговым эффектом	Beyotime	P0126-5	Среда для заключения срезов, окрашенных методом иммунофлуоресценции.
Набор для пероксидазного детектирования с биотином и стрептавидином	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Система вторичного детектирования для иммуногистохимического окрашивания с использованием DAB.
Бычий сывороточный альбумин	Qiansheng Biotech Co., Ltd.	QO3000	Блокирующий буфер для иммуноокрашивания и вестерн-блоттинга.
мыши линии C57BL/6	Liaoning Changsheng Biotechology Co., LTD	мыши линии C57BL/6 в возрасте 4 недель	Экспериментальные животные для забора тканей мозга мыши, если предусмотрено.
Система хемилюминесцентной визуализации	Clinx Science Instruments Co., Ltd.	ChemiScope 6200 Touch	Детекция хемилюминесцентных сигналов при вестерн-блоттинге.
Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп	Leica Microsystems CMS GmbH	SN: 591974	Сбор изображений иммунофлуоресцентных срезов.
Раствор криопротектора для консервации	Приготовлено в лаборатории	Нет данных	Длительное хранение свободно плавающих срезов головного мозга при −20 °C.
Криостат	Leica	CM1950	Приготовление 30 μm корональные срезы головного мозга.
Набор хромогенного субстрата DAB	Sigma	SLBP7387V	Хромогенное проявление для иммуногистохимии.
Раствор DAPI для окрашивания ядер	Coolaber	SL7100	Ядерное контрастирование для иммунофлуоресценции.
Цифровой световой микроскоп	Ningbo Yongxin Optics Co., Ltd.	Модель NE910+FL-900	Мониторинг проявления DAB и получение изображений срезов, окрашенных методом светлого поля.
ДНКаза I	Vazyme	R223-01	Удаление остаточной геномной ДНК перед обратной транскрипцией.
Ослиные антитела к IgG кролика, конъюгированные с 488	Thermo Fisher Scientific	A21206	Флуоресцентное вторичное антитело для иммунофлуоресценции.
Ослиные антитела к IgG кролика, конъюгированные с 594	Abcam	ab150076	Флуоресцентное вторичное антитело для иммунофлуоресцентного анализа.
Набор E.Z.N.A. для выделения ДНК/РНК/белков	Omega Bio-Tek	D3892-01
Источник питания для электрофореза	Bio-Rad	1645050	Источник питания для электрофореза в агарозном геле и SDS-PAGE.
Этиленгликоль	Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd.	10009828	Компонент криопротекторного раствора для консервации.
Система визуализации гелей	Clinx Science Instruments Co., Ltd.	ChemiScope 6200 Touch	Визуализация агарозных гелей для оценки качества РНК.
Предметные стекла с желатиновым покрытием	CITOTEST LABWARE MANUFACTURING CO.,LTD	REF: 10127105P P/N: 80312-2101	Заключение в среду свободно плавающих срезов мозга, окрашенных с помощью DAB.
Программное обеспечение для анализа изображений	Национальные институты здравоохранения	ImageJ/Fiji	Денситометрический анализ полос вестерн-блоттинга и обработка изображений.
Изопропанол	Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd.	80109218	Осаждение белка из органической/интерфазной фракции.
Микроцентрифуга с охлаждением	Yancheng Kaite Laboratory Instrument Co., Ltd.	TGL16M	Центрифугирование во время этапов экстракции и промывки РНК/белка.
Набор для экспресс-экстракции белков Minute Protein Extraction Kit	Изобретать	MS-026
Нейтральный бальзамовый заключающий агент	Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., Шанхай, Китай	Каталожный № S30509, CAS 96949-21-2	Закрытие покровным стеклом дегидрированных срезов, окрашенных DAB.
среда для заморозки OCT	Сакура	4583	Среда для заливки фиксированных полушарий мозга при криосекционировании.
Оптические планшеты или пробирки для количественной ПЦР (qPCR)	Axygen	PCR-0208-C	Реакционные сосуды для амплификации методом кПЦР.
Parafilm	amcor	PM996	Герметизация многолуночных планшетов для длительного хранения срезов.
Пентобарбитал натрия	Hualan Bio	57-33-0	Анестетик перед транскардиальной перфузией.
Чашки Петри	Biosharp	BS-90-D	Работа с мозгом на льду и разделение полушарий.
Реагент для экстракции РНК на основе фенола и гуанидиния	Sparklade	AC0101-B	Регент-компаратор для контрольных экспериментов по экстракции РНК.
Коктейль ингибиторов фосфатаз	APExBIO	K1015-100	Сохранение фосфорилирования при экстракции белков.
Фосфатно-солевой буферный раствор	Biosharp	BL601A	Промывочный буфер, растворитель раствора сахарозы и растворитель криопротектора.
Поливинилиденфторидная мембрана	Millipore	IPVH08100	Мембрана для переноса при вестерн-блоттинге.
Поливинилпирролидон K40	Sigma	9003-39-8	Компонент криоконсервирующего раствора.
Коктейль ингибиторов протеаз	Beyotime	P1045	Предотвращение деградации белков при лизисе тканей.
Набор для экстракции белков	Изобрести	MS-026	Набор компараторов для контрольных экспериментов по экстракции общего белка.
Система ПЦР в реальном времени	Amolarray	MA6000	Количественная ПЦР-амплификация и анализ кривых плавления.
Додецилсульфат натрия	BioFroxx	3250GR500	Растворение осадка белка и подготовка проб для SDS-PAGE.
Стерильные лезвия бритвы	Biosharp	BS-RB-11	Разделение полушарий и обрезка ткани на льду.
Конъюгат стрептавидин-пероксидаза	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Реагент для усиления сигнала/детекции для иммуногистохимического анализа с использованием DAB.
Сахароза	Хуши	57-50-1	Раствор для криопротекции и раствор для криоконсервации.
мастер-микс для SYBR qPCR	Vazyme	Q711-02	Количественная ПЦР-амплификация.
Переносящее устройство	Bio-Rad	1703930	Влажный перенос белков из геля SDS-PAGE на мембрану.
Трис-солевой буфер с твином 20	Приготовлено в лаборатории	Данные отсутствуют	Буфер для промывки мембраны при вестерн-блоттинге.
Triton X-100	Sinopharm	9002-93-1	Пермеабилизация срезов мозга для иммуноокрашивания.
Trizol	Sparklade	AC0101-B
Набор для сверхчувствительного иммуногистохимического детектирования SP (для первичных антител мыши/кролика)	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Вторичные антитела/реагенты для детекции при иммуногистохимическом окрашивании с использованием DAB.
крыса линии Wistar	Liaoning Changsheng Biotechology Co., LTD	280–320 г, самец	Экспериментальные животные для забора тканей головного мозга крыс, если предусмотрено.
Ксилол	Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd.	10023418	Прозрачивание предметных стекол, окрашенных DAB, перед накрытием покровным стеклом.
Нейтральный бальзамовый заключающий агент	Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., Шанхай, Китай	Кат. № S30509, CAS 96949-21-2	Закрытие покровным стеклом дегидратированных срезов, окрашенных DAB.
Конъюгат стрептавидина с пероксидазой	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Реагент для усиления сигнала/детекции для иммуногистохимического окрашивания с использованием DAB.
Triton X-100	Sinopharm	9002-93-1	Пермеабилизация срезов головного мозга для иммуноокрашивания.
Набор для ультрачувствительного иммуногистохимического детектирования SP (для первичных антител к мыши/кролику)	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Вторичное антитело/реагент для детекции при иммуногистохимическом окрашивании с использованием DAB.
Ксилол	Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.	10023418	Прозрачивание предметных стекол, окрашенных DAB, перед накрыванием покровным стеклом.

Ссылки

Lauwereyns J, et al. Toward a common interpretation of the 3Rs principles in animal research. Lab Anim. 2024;53(12):347-50.
Hubrecht RC, Carter E. The 3Rs and humane experimental technique: implementing change. Animals (Basel). 2019;9(10):754.
Gavériaux-Ruff C, Kieffer BL. Conditional gene targeting in the mouse nervous system: Insights into brain function and diseases. Pharmacol Ther. 2007;113(3):619-34.
Basu J, Siegelbaum SA. The corticohippocampal circuit, synaptic plasticity, and memory. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015;7(11):a021733.
Wu J, et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio Protoc. 2021;11(5):e3988.
Taves MD, et al. Steroid concentrations in plasma, whole blood and brain: Effects of saline perfusion to remove blood contamination from brain. PLoS One. 2010;5(12):e15727.
Jordan JT. The rodent hippocampus as a bilateral structure: A review of hemispheric lateralization. Hippocampus. 2020;30(3):278-92.
Mundorf A, Ocklenburg S. Looking at both sides: Integrating data from both hemispheres is crucial in rodent neuroscience. Eur J Neurosci. 2025;62(5):e70249.
Watson RE, et al. Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology. Peptides. 1986;7(1):155-9.
Hoffman GE, Le WW. Just cool it! Cryoprotectant anti-freeze in immunocytochemistry and in situ hybridization. Peptides. 2004;25(3):425-31.
Rajput SK, et al. A column-based rapid method for the simultaneous isolation of DNA, RNA, miRNA and proteins. Cell Biol Int. 2012;36(9):779-83.
Morse SMJ, Shaw G, Larner SF. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 2006;40(1):54-8.
Puchades M, Westman A, Blennow K, Davidsson P. Removal of sodium dodecyl sulfate from protein samples prior to matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 1999;13(5):344-9.
Kachuk C, Stephen K, Doucette A. Comparison of sodium dodecyl sulfate depletion techniques for proteome analysis by mass spectrometry. J Chromatogr A. 2015;1418:158-66.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Разделение полушарий морфологическое окрашивание иммуногистохимия иммунофлуоресценция распределение тканей криоконсервация мозга вестерн-блоттинг анализ методом кПЦР

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Сообщать об обновлениях: