Многоцветный протокол визуализации высокого разрешения 3D-STORM для минерализации коллагена в самособранных рекомбинантных коллагеновых фибриллах типа I

Summary

Здесь мы представляем протокол для различия внутрифибриллярной и экстрафибриллярной минерализации в рекомбинантных коллагеновых фибриллах с использованием многоцветного 3D-STORM, интегрируя оптимизированное маркирование, визуализацию и количественный колокализационный анализ.

Abstract

Этот протокол описывает многоцветный трёхмерный стохастический оптический микроскопический метод реконструкции (3D-STORM) для наномасштабной визуализации минерализации коллагена в самособранной фибрилной модели коллагена типа I. Метод позволяет одновременно визуализировать коллаген, неколлагеновые белки (например, хондроитин сульфат) и минеральные фазы фосфата кальция. Подготовка образца включает аминосиланизацию и самосборку коллагена, затем минерализацию с использованием кальциефосфатной среды, которая на ранней стадии (30 минут) образует аморфный кальциевой фосфат (ACP) и созревает в гидроксиапатит (HAP) к 6 часам. Затем проводится мультиплексированная иммунофлуоресцентная маркировка, образцы сначала оцениваются с помощью конфокальной микроскопии, а затем получают 3D-STORM изображения с помощью буфера для изображений, поглощающего кислород. Обработка и анализ данных осуществляются с использованием общедоступного программного обеспечения. По сравнению с традиционной электронной или конфокальной микроскопией, этот протокол сочетает молекулярную специфичность с наноуровневым разрешением (типичная боковая точность 20–30 нм, аксиальная 50–60 нм), что позволяет трёхмерно визуализировать внутрифибриллярные и экстрафибриллярные минерализационные паттерны. Репрезентативные результаты показывают чёткую визуализацию коллагеновых сетей, связанных неколлагеновых белков и минеральных фаз в трёхмерном пространстве. Количественные метрики, включая коэффициент корреляции Пирсона (0,89 ± 0,04) и коэффициент перекрытия Мандерса (0,91 ± 0,03), приведены в разделе «Результаты». Этот протокол является мощным инструментом для исследователей в области биоматериаловедения, биоминерализации и инженерии костной ткани, которым требуется наномасштабное понимание динамики минерализации.

Introduction

Минерализация коллагена — это фундаментальный биологический процесс, играющий ключевую роль в формировании твёрдых тканей, таких как кости и^{зубы 1}. Сложная структура коллагеновых волокон в сочетании с тонкой регуляцией минерального отложения придаёт этим тканям выдающуюся механическую прочность и структурную^{целостность 2}. Коллаген служит не просто пассивным каркасом, а активным участником, организуя точное отложение минералов через сложные молекулярные и физические^{взаимодействия 3}. Разъяснение этих механизмов крайне важно для понимания патологических состояний, таких как остеопороз и кариес, а также для разработки биомиметических материалов для регенеративной терапии⁴.

Диаметр коллагеновых волокон в твёрдых тканях варьируется примерно от 50 до 100 нм, при этом частицы гидроксиапатита (HAP) ещё меньше (обычно толщина 2–5 нм и длина 20–30 нм) и вставлены в фибриллярные^{промежутки 5}. Хотя зоны зазоров могут выступать в роли нуклеационных зон, в родных тканях минералы изначально образуются в межфибриллярных пространствах, а затем расширяются в внутрифибриллярные компартменты. Традиционные методы характеристики включают гистологическое окрашивание, конфокальную лазерную сканирующую^{микроскопию 6,7} и электронную^{микроскопию 8,9}. Гистологическое окрашивание обеспечивает макроскопическую оценку, но не может оценивать состояния наноминерализации. Конфокальная микроскопия позволяет наблюдать определённые компоненты, но ограничена дифракцией (~200 нм латерально), не способна различать внутрифибриллярную и экстрафибриллярную^{минерализацию 10}. Электронная микроскопия обладает высоким разрешением, но не обладает молекулярной специфичностью. Хотя маркировка иммунозолота может обеспечить молекулярную специфичность для электронной микроскопии, она требует специализированной обработки и менее подвержена мультиплексированной трёхмерной визуализации множества компонентов по сравнению с STORM, а также включает длительные экспериментальные циклы и высокие^{затраты 11}.

Стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия (STORM) преодолевает дифракционный предел, локализуя отдельные флуорофоры с высокой точностью, достигая бокового разрешения ~20 нм¹². В сравнении с другими сверхразрешающими методами, такими как микроскопия с стимулированным эмиссией (STED⁾¹³и микроскопия структурированного освещения (SIM⁾¹⁴, STORM обеспечивает более высокую точность локализации (~20 нм по бокам и ~50 нм по оси) и совместима с более широким спектром органических флуорофоров. В частности, STED требует специализированных красителей и высокой мощности лазера, способных повредить биологические образцы, тогда как SIM обеспечивает разрешение только ~100 нм, что недостаточно для разрешения фибрильных (50–100 нм) особенностей. STORM обеспечивает практический баланс между разрешением, возможностью мультиплексирования и совместимостью с образцами. Опубликованные рекомендации описывают стандартизированные тестовые образцы для оптимизации параметров изображения STORM и оценки разрешения¹⁵. В сочетании с трёхмерными возможностями съёмки 3D-STORM позволяет одновременно визуализировать наномасштаб нескольких^{компонентов 16}. Недавние достижения расширили STORM на многоцветное и мультиплексированное изображение, позволяя визуализировать несколько целей в одной^{выборке 17,18}.

Этот протокол использует биомиметическую модель in vitro, основанную на самособранных рекомбинантных коллагеновых фибриллах типа I, и специально разработан для in vitro рекомбинантных коллагеновых моделей типа I, чтобы отличать внутрифибриллярную минерализацию от экстрафибриллярной на наноуровне. Он не подходит для живых клеток, так как STORM требует фиксированных образцов и буферов для поглощания кислорода. Он также не подходит для нативных высокоминерализированных тканей (например, зрелой кости) без предварительной декальцификации или забора антигена. Если только оценка общей плотности минералов или морфологии большой площади, то традиционная конфокальная или электронная микроскопия будет более эффективной.

Общая цель этого протокола — обеспечить стандартизированный, поэтапный рабочий процесс для использования многоцветного 3D-STORM для визуализации наномасштабного распределения минералов и неколлагеновых белков внутри отдельных коллагеновых фибрилл, с особым акцентом на различение внутрифибриллярной и экстрафибриллярной минерализации. Этот протокол интегрирует оптимизированную иммуномаркировку с индивидуальным буфером визуализации, позволяя одновременно отслеживать несколько органических компонентов (коллаген, неколлагеновые белки) и неорганические фазы (ACP, HAP) в трёх^{измерениях 19}. Ключевым новшеством является количественная оценка внутрифибриллярных и экстрафибриллярных моделей минерализации. Количественная оценка достигается по двум независимым критериям: (1) расчёт коэффициента колокализации Пирсона между каналами минерала (кальциевый индикаторный краситель (например, кальцеин)) и коллагена (далеко-красный флуоресцентный краситель) с помощью модуля колокализации в программном обеспечении для анализа изображений (коэффициент >0,8 указывает на сильную ассоциацию); (2) Анализ сохраняемости минерального сигнала во всех Z-срезах отдельных фибрилл: если минеральный сигнал присутствует в центральных срезах (Z = 0–±120 нм от вертикального центра фибриллы) с интенсивностью ≥50% от максимальной, он классифицируется как внутрифибриллярный. В отличие от традиционной электронной или конфокальной микроскопии, этот протокол сочетает молекулярную специфичность с наноуровневым разрешением, обеспечивая трёхмерное пространственное распределение внутрифибриллярной минерализации.

Этот протокол разработан для исследователей в области биоматериаловедения, биоминерализации и инженерии костной ткани, требующих наномасштабного понимания динамики минерализации. Стандартизированная процедура также может быть адаптирована для изучения других минерализованных коллагеновых систем, таких как деминерализованные дентиновые срезы или гидрогели на основе коллагена, соответственно корректируя начальные этапы подготовки образцов.

Protocol

Все эксперименты с биологическими образцами проводились в соответствии с руководящими принципами и нормативами Основных учреждений Медицинской школы Чжэцзянского университета и были одобрены Институциональным комитетом по биобезопасности (Сертификат одобрения No BSL20235710079). Описанный здесь экспериментальный протокол использует коммерческие реагенты и биомиметические системы in vitro. В ней не участвуют люди, животные или образцы человеческих тканей, поэтому не требуется этическое одобрение институционального контрольного совета.

ВНИМАНИЕ: Все процедуры, связанные с опасными химикатами, должны проводиться в вытяжке с соответствующими средствами индивидуальной защиты (лабораторный халат, перчатки, защитные очки). Утилизировать химические отходы в соответствии с институциональными нормативами. Для NaN₃ собирайте отходы в специальный контейнер с маркировкой «азидные отходы» и не смешивайте с кислотами (риск взрывного газа). Для глутаральдегида инактивируйте с 10% избытком бисульфита натрия перед утилизацией. Для β-меркаптоэтанола окисьте отбеливателем (1:10 В/В) в течение 1 часа перед сливом.

ПРИМЕЧАНИЕ: Иммунофлуоресцентная маркировка ДОЛЖНА проводиться ДО минерализации, чтобы избежать маскировки эпитопов минеральными отложениями. Для применений, требующих пост-минерализационной маркировки, может потребоваться извлечение антигенов.

1. Подготовка минерализационной среды

1. Подготовка минерализационной среды для восстановленных коллагеновых фибрилл
   1. Приготовьте кальциевый бульонный раствор, добавив 100 мкл 5 мг/мл полиаспартиновой кислоты (p-Asp, Mw 9-11 кДа) по капле до 5 мл раствора CaCl₂ 3,44 мл в конической трубке объёмом 15 мл.
   2. Вихрь смешивать в трубке 30 секунд, пока не станет однородным.
   3. Добавляйте p-Asp медленно и тщательно перемешивайте, чтобы стабилизировать аморфный кальцийфосфат (ACP).
   4. Добавьте 5 мл раствора фосфатов (19 мМ Na₂HPO₄ + 300 мМ NaCl) в кальциевый стандартный раствор.
   5. Вихревой микс на 1 минуту.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Итоговые концентрации после смешивания: 1,67 мМ CaCl₂, 9,5 мМ Na₂HPO₄, 150 мМ NaCl и 50 мкг/мл p-Asp.
   6. Подготовьте минерализационную среду непосредственно перед использованием. Не храните; немедленно используйте нестабильный прекурсор ACP для достижения стабильных результатов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хранение приводит к преждевременной кристаллизации.
2. Подготовка минерализационной среды для коллагеновых гелей/деминерализованного дентина
   1. Приготовьте раствор, содержащий кальций, растворив 8,77 г NaCl, 0,01 г NaN₃, 6,06 г Tris и 1,11 г CaCl₂ в 800 мл деионизированной воде.
   2. Увеличите объём до 1 л с помощью деионизированной воды.
   3. Добавьте 350 мкг/мл полиакриловой кислоты (PAA, Mw ~1800) в раствор, содержащий кальций.
   4. Вихрь на 1 минуту.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте PAA вместо p-Asp для лучшей стабилизации при более высоких концентрациях кальция.
   5. Приготовьте фосфатный раствор, растворив 0,85 г Na₂HPO₄ в 1 л деионизированной воде для получения 6 мМ Na₂HPO₄.
   6. Фильтруйте-стерилизуйте фосфатный раствор с помощью мембраны диаметром 0,22 мкм.
   7. Комбинировать равные объёмы (например, по 500 мл каждый) растворов кальция и фосфатов с магнитным перемешиванием при 300 об/мин.
   8. Регулируйте pH до 7,4 с помощью 1 M HCl или NaOH при мониторинге с помощью pH-метра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте pH на уровне 7,4 ± 0,1. Не допускайте отклонений pH >0,2, которые вызывают преждевременную кристаллизацию.

2. Подготовка рекомбинантных коллагеновых волокон

1. Аминосиланизация чашек с стеклянным дном
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этой обработке используется (3-аминопропил) триэтоксисилан (APTES) для внесения положительно заряженных аминогрупп (-NH₂) на поверхность стекла, что способствует электростатической адсорбции и стабилизации отрицательно заряженных мономеров коллагена.
   1. Добавьте 200 мкл раствора APTES (5% в абсолютном этаноле) в каждую чашу с стеклянным дном (35 мм, толщина #1,5H, 0,17 мм ± 0,005 мм).
   2. Обеспечить полное покрытие поверхности тарелки с помощью раствора APTES.
   3. Инкубировать в темноте 2 часа при комнатной температуре (20–25 °C).
   4. Полосните посуду три раза абсолютным этанолом (2 мл за одну стирку).
   5. Ультразвуковое действие в деионизированной воде в течение 10 минут при частоте 40 кГц. Полностью удалите остаточный APTES, чтобы предотвратить неспецифическое связывание.
   6. Силанизированные блюда можно хранить сухой при 4 °C до 1 недели.
   7. (По желанию) Запекайте для большей стабильности: поместите вымытую и высушенную посуду в духовку при 100–120 °C на 30–60 минут.
   8. Дайте остыть до комнатной температуры перед началом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании пластиковой посуды уменьшайте температуру ниже 80 °C, чтобы предотвратить деформацию. Адаптируйте процедуру силанизации из Биттера и^{Мьюира 20}.
2. Самосборка и сшивание коллагена
   1. Пипетка — 100 мкл раствора коллагена I (50 мкг/мл в уксусной кислоте 0,1 м) на каждую силанизированную чашу.
   2. Инкубировать при 37 °C в течение 10 часов в камере с влажностью (> 90% относительной влажности). Поддерживайте стабильную влажность, чтобы предотвратить испарение раствора.
   3. Проверьте образование фибрилл с помощью фазово-контрастной или конфокальной микроскопии; Успешная подготовка показывает тонкую, паутиновую фибрильную сеть.
   4. Для проверки правильного образования фибрилл на ультраструктурном уровне подготовьте отдельный образец на поливиниловой формальной/углеродом покрытой TEM-сетке с тем же условиями самосборки (коллаген-I 50 мкг/мл, 37 °C, 10 ч, влажность > 90%).
   5. Покрасьте 1% фосфотунгстической кислотой (pH 7.0) в течение 10 минут.
   6. Мойте деионизированной водой.
   7. Осмотрите под трансмиссионным электронным микроскопом. Успешный фибриллогенез обозначен характерным D-периодическим полосатым рисунком 67 нм (см. рисунок 3).
   8. Аккуратно впитывайте остаточный раствор коллагена из чашок с стеклянным дном.
   9. Добавьте 2 мл раствора хондроитин сульфата (CS) (50 мг/мл в PBS, pH 5,5) в каждую тарелку.
   10. Инкубировать при 4 °C в течение 12 часов, чтобы обеспечить электростатическую адсорбцию CS на коллагенных фибриллах.
   11. Приготовьте раствор для сшивания EDC/^{NHS 21}: растворите 0,2 млн EDC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид) и 0,05 млн NHS (N-гидроксисукцинимид) в буфере MES (0,1 млн МЭС, pH 5,5).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер MES можно подготовить, растворив свободную кислоту MES в деионизированной воде и регулировав pH до 5,5 с NaOH.
   12. Удалите CS-решение и добавьте 2 мл решения для перекрёстного сшивания EDC/NHS.
   13. Инкубировать при комнатной температуре в течение 2 часов, чтобы ковалентно обездвижить CS на коллагене.
   14. Помойте посуду три раза с PBS (по 5 мл каждая, по 5 минут), чтобы удалить нереагированные реагенты.
   15. Храните обработанные коллагеновые волокна в PBS при 4 °C до 24 часов до минерализации.

3. Иммунофлуоресцентная маркировка (выполняется ДО минерализации)

1. Подготовка образца
   1. Промывайте коллагеновые фибриллы три раза раствором NaCl на 500 мл (10 мл за стирку, по 5 минут каждая).
   2. Промывайте три раза деионизированной водой (по 10 мл на одну стирку, по 5 минут каждая).
   3. Выполняйте промывки на горизонтальной шейкерной платформе, вращающейся со скоростью 50 об/мин, чтобы обеспечить тщательную промывку и минимизировать сдвиговые силы, которые могут отсоединить собранные волокна.
2. Блокировка и инкубация первичных антител
   1. Инкубировать с блокирующим буфером (5% бычий альбумин в PBS) при 37 °C в течение 1 часа в увлажнённой камере.
   2. Приготовьте коктейль с антителами в блокирующем буфере: антиколлаген-I (разбавление 1:100) и мышиный анти-хондроитин сульфат (разбавление 1:100).
   3. Добавьте 200 мкл коктейля с антителами на образец.
   4. Покройте образцы лабораторной герметизирующей пленкой.
   5. Инкубировать при 4 °C ночью (12–16 часов).
   6. Защищайте от света с помощью алюминиевой фольги. После инкубации первичных антител образцы могут храниться в PBS при 4 °C до 24 часов.
3. Вторичное окрашивание антител
   1. Удалите несвязанные первичные антитела, помыв посуду три раза буфером для стирки (0,1% Tween-20 в PBS), по 10 минут за каждую стирку.
   2. Приготовьте смесь флуоресцентных вторичных антител в блокирующем буфере (200 мкл на чашу 35 мм), содержащей: козий антикроличий IgG, конъюгированный с красным флуоресцентным красителем (1:100) и козий антимышиный IgM, конъюгированный с красным флуоресцентным красителем (1:100).
      ПРИМЕЧАНИЕ: С этого этапа защищайте образцы от света, чтобы предотвратить фотоотбеливание фторофора.
   3. Инкубировать образцы при комнатной температуре (20–25 °C) в течение 1 часа в темноте.
   4. Помойте посуду три раза с помощью буфера (по 10 минут каждый), чтобы удалить несвязанные вторичные антитела.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Храните промеченные образцы в PBS при 4 °C (защищённых светом) до 48 часов перед визуализацией. Включайте контрольные системы без первичных антител для проверки аутофлуоресценции.

4. Минерализация волокон коллагена (выполняется ПОСЛЕ маркировки)

1. Процесс минерализации
   1. Добавьте по 2 мл свежеприготовленной минерализационной среды на блюдо.
   2. Инкубировать при 37 °C в течение 30 минут (краткосрочно) для раннего образования минерала (ACP).
   3. Альтернативно, инкубировать при 37 °C в течение 6 часов (длительно) для кристаллизации зрелого минерала (HAP).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте точную температуру на уровне 37 °C ± 0,5 °C с помощью откалиброванного инкубатора.
   4. Аккуратно аспирируйте минерализационную среду.
   5. Прополосните три раза деионизированной водой (по 5 мл на одну стирку, с интервалом 1 минута).
2. Маркировка кальциев-фосфатом
   1. Добавьте 4 мкм кальциевого индикатора красителя (например, кальцеина) в PBS (200 мкл на чашку).
   2. Инкубировать при комнатной температуре (20–25 °C) в течение 30 минут в темноте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кальциевый индикаторный краситель (например, кальцеин) связывается с ионами кальция и не различает аморфные и кристаллические фазы; назначение фаз основано на времени минерализации (30 мин = ACP, 6 ч = HAP). Её следует защищать от света янтарными трубками или фольгой.
   3. Промывайте пять раз: три раза деионизированной водой и два раза с 70% этанолом (по 1 минуте каждая), чередуя оба раза.
3. Подготовка образца для визуализации
   1. Погрузите образцы в буфер для визуализации: 10% (w/v) глицерина в PBS. По желанию добавьте антифейдный реагент согласно инструкции производителя.
   2. Примените достаточный объём (20–50 мкл) буфера для изображения, чтобы покрыть образец.
   3. Положите на образец накладку.
   4. Храните образцы при 4 °C в темноте до 72 часов.

5. Наблюдение под лазерным конфокальным микроскопом

1. Перенос образцов с 4 °C в комнатную температуру (20–25 °C).
2. Дайте 10 минут равновесия, чтобы предотвратить конденсацию.
3. Сохраняйте лёгкую защиту с помощью янтарных контейнеров или фольгированной плёнки.
4. Проверьте, что буфер изображения покрывает весь образец.
5. Настройте конфокальный микроскоп со следующими настройками:
   1. Для коллагеновой визуализации (красный флуоресцентный краситель): лазер 647 нм, эмиссионный фильтр 650-710 нм.
   2. Для кальциев-фосфатной визуализации (кальциевый индикаторный краситель (например, кальцеин)): лазер 488 нм, эмиссионный фильтр 500-550 нм.
   3. Цель: 100× масляное погружение (NA 1.4).
   4. Диаметр отверстия: 1 аэродинамическая единица (AU).
   5. Время пребывания пикселя: 1-2 мкс.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед визуализацией выполните лазерное выравнивание и калибровку отверстия.
6. Проведите последовательное сканирование: первое сканирование с возбуждением 647 нм (коллаген).
7. Проведите второе сканирование с возбуждением 488 нм (минерал).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Собирайте каналы последовательно, чтобы избежать протока.
8. Для 3D-реконструкции установите размер шага Z-стека на 0,5 мкм или меньше для обеспечения достаточного отбора проб.
9. Сохраняйте файлы с сохранением метаданных.
10. Для анализа колокализации используйте программное обеспечение для анализа изображений, способное вычислять коэффициент корреляции Пирсона (например, общедоступное программное обеспечение с подходящими плагинами).

6. Визуализация с помощью трёхмерной стохастической оптической реконструкционной микроскопии (3D-STORM)

1. Подготовка буфера для визуализации^{STORM 22}
   ПРИМЕЧАНИЕ: В буфер визуализации добавляются оксидаза глюкозы и каталаза для извлечения кислорода, тем самым уменьшая фотоотбеливание и продлевая мигание флюорофоров, что необходимо для локализации по одной молекуле в STORM.
   1. Приготовьте стандартный раствор глюкозооксидазы (GOx) при 8 мг/мл в буфере ацетата натрия с концентрацией 50 мм (pH 5,1).
   2. Приготовьте раствор набора каталазы при 160 мкг/мл за 1× PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Запасы фермента в аликвотах, быстро заморозьте их с помощью жидкого азота или ванны с сухим льдом/этанолом, и храните при -20 °C или -80 °C. Избегайте повторяющихся циклов замораживания и оттаивания.
   3. Подготовьте свежий буфер для STORM на льду, защищённый от света.
   4. Комбинируйте следующие компоненты в указанном порядке в итоговом объёме 1 мл: стерильный безнуклеазный H₂O (до 1 мл), 1 М NaCl (10 мкЛ, 10 мМ финал), 1 М трис-HCl pH 8,0 (50 мкл, 50 мМ финал), свежеприготовленный 1 М цистимарин (МЭА), скорректированный до pH ~7,0 (50 мкл, 50 мМ финал), 50% (w/v) глюкозы (200 мкл, 10% с финалом), запас GOx (200 мкл, 1,6 мг/мл финал), каталазный запас (200 мкл, 32 мкг/мл финал).
   5. Аккуратно перемешивайте с помощью пипета или инверсии. Не вихрьте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер должен быть приготовлен свежим и храниться на льду, защищённом от света. Используйте в течение 30 минут после подготовки. Для подробной оптимизации условий визуализации STORM обратитесь к установленным протоколам с использованием тестовых^{образцов 15}.
   6. Добавьте 200 мкл свежеприготовленного буфера для STORM, чтобы полностью покрыть образец.
2. Конфигурация системы 3D-STORM
   1. Убедитесь, что путь изображения направлен на электронно-умножающую CCD-камеру (EMCCD).
   2. Включите цилиндрический объективный модуль для 3D-съёмки.
   3. Установите программное обеспечение в режим 3D STORM.
   4. Настройте оптические фильтры для используемых красителей.
   5. Включите лазер на 647 нм и установите мощность на низкий уровень (1-5 мВт).
   6. Используя объектив погружения маслом 100× (NA ≥1.4), определите интересующую область в режиме широкопольного или TIRF live preview.
   7. Получите традиционное широкоугольное флуоресцентное изображение для последующего сравнения.
   8. Переключитесь в режим подсветки TIRF.
   9. Откалибруйте угол TIRF для получения узкого поля освещения (~100-200 нм) для минимизации фоновой флуоресценции.
   10. Регулируйте время экспозиции камеры (10-30 мс) в зависимости от начальной интенсивности сигнала.
   11. Регулируйте мощность лазера визуализации исходя из начальной интенсивности сигнала.
   12. Проведите кратковременное тестовое приобретение.
   13. Проверьте, правильно ли настроены параметры без быстрого фотоотбеливания.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что ось цилиндрической линзы точно выравнивается с плоскостью образца. Большинство современных систем имеют автоматическую калибровку. Для ручной калибровки используйте 100-нм флуоресцентные шарики для проверки симметричных функций распределения круглых точек (PSF).
   14. Начинайте с экспозиции 10–30 мс при мощности лазера 647 нм мощностью 1–2 кВт/^см².
   15. Убедитесь, что плотность мигания равна 0,1–1 молекуле на^{мкм 2}.
   16. Если плотность слишком мала или слишком высока, регулируйте мощность лазера или время экспозиции соответственно.
   17. Повторяйте проверку и корректировку до достижения идеальной плотности.
3. Сбор данных 3D-STORM
   1. Установите программное обеспечение для получения в режим «Непрерывная активация».
   2. Установите лазер визуализации (647 нм) на высокую мощность (100-500 мВт оптоволокно) для перехода большинства флуорофоров в тёмное состояние.
   3. Установите лазер активации (405 нм) на низкую мощность (0,1–5 мВт).
   4. Эмпирически оптимизировать мощность 405 нм для поддержания 100–200 локализованных молекул на кадр в области 256×256 пикселей.
   5. Установите общее количество кадров на 10 000–20 000.
   6. Используйте 1 кадр активационного света (405 нм), затем 5 кадров изображения (647 нм) за цикл.
   7. Начинайте приобретение.
   8. Работайте с EMCCD с максимальной чувствительностью (приложенное усиление EM)
   9. Используйте экспозицию 10–30 мс на кадр.
   10. Во время сбора контролировать плотность активных молекул.
   11. Отрегулировать мощность лазера 405 нм для поддержания стабильного потока одномолекулярных событий.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Сырые данные фильма можно хранить на стандартном жёстком диске для долгосрочного архивирования перед восстановлением.
4. Анализ данных о минерализации коллагена (с использованием программного обеспечения для анализа изображений с модулем STORM)
   1. В программном обеспечении для анализа выберите соответствующий драйвер камеры (модуль STORM).
   2. Нажмите [Analysis GUI] в панели STORM. Открывается окно анализа.
   3. Нажмите [Открыть файл]. Выберите исходный микроскопический файл для анализа. Нажмите «Открыть».
   4. Определите минимальное значение флуоресценции (минимальную высоту) для допустимых сигналов.
   5. Найдите самое тёмное пятно, которое всё ещё можно распознать как сигнал из одной молекулы.
   6. Переместите мышь в центр.
   7. Прочитайте значение Peak Height.
   8. Запишите это значение.
   9. Нажмите [Настройки идентификации]. В диалоге установите следующие параметры: Минимальная высота (введите значение, записанное в шаге 6.4.8), Максимальная высота (20000), Базовая линия CCD (100), а для 3D-STORM проверка данных «3D» (снимите галочку для 2D).
   10. Нажмите >> , чтобы расширить больше параметров. Установка: Минимальная ширина (нм) до 200, Максимальная ширина (нм) до 700 (400 для 2D), Начальная ширина посадки (нм) до 300, Максимальное осевое отношение до 2,5 (1,3 для 2D) и Максимальное перемещение (pix) к 1.
   11. Нажмите OK, чтобы закрыть диалог.
   12. Проведите тестовый анализ для проверки параметров. Снимите галочку «Коррекция дрейфа».
   13. Установить периоды на 1.
   14. Нажмите [Тест].
   15. После анализа нажмите OK в диалоговом окне.
   16. Проверьте, правильно ли идентифицированы сигнальные пятна. Фоновый шум не должен быть выбран неправильно. Настоящие места нельзя пропускать.
   17. Если неудовлетворительно, повторяйте шаги 6.4.9–6.4.16, чтобы скорректировать параметры до правильного результата.
   18. После прохождения тестового анализа проведите полный анализ. Проверьте коррекцию дрейфа.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение для анализа выполняет коррекцию дрейфа с использованием резервного алгоритма перекрёстной корреляции (RCC), который максимизирует корреляцию между временными сегментами молекулярных локализаций. Фидуциальные^{бусины не требуются 23}.
   19. Сохранять периоды = 1.
   20. Нажмите [Start] (или снова нажмите [Test], затем [Start]).
   21. Дождитесь завершения анализа. Нажмите OK в диалоговом окне.
   22. После анализа два файла результатов (.bin и .txt) генерируются в той же папке, что и файл .nd2.
   23. Для анализа колокализации (каналы 647 нм и 488 нм) отображайте оба канала одновременно в списке каналов окна анализа.
   24. Выберите подходящий регион интереса (ROI).
   25. Используйте модуль колокализации для вычисления коэффициента корреляции Пирсона. Если это не предоставляется автоматически, вручную экспортируйте данные облака точек в плагин колокализации в общедоступном программном обеспечении для анализа изображений. Запишите значение.
   26. Проведите анализ Z-срезов для подтверждения внутрифибриллярной минерализации. В главном меню выберите View > Z-step > Slice.
   27. Извлекать отдельные плоскости с интервалом 60 нм.
   28. Наблюдайте минеральный сигнал (зелёный, канал 488 нм). Проверьте, сохраняется ли сигнал в центральных срезах (Z = 0 нм ±120 нм). Персистенция подтверждает внутрифибриллярную минерализацию.
   29. Опционально: выполнить фильтрацию плотности для снижения пересчета от плотно упакованных эмиттеров. Откройте восстановленное изображение STORM в общедоступном программном обеспечении для анализа изображений с помощью плагина для анализа локализации по одной^{молекуле 24}.
   30. Чтобы уменьшить пересчет от плотно упакованных эмиттеров, применяйте фильтрацию по плотности (например, медианный фильтр или порог локальной плотности) на основе плотности сигнала.
   31. Если коррекция дрейфа не была включена на шаге 6.4.18 или требуется дополнительная коррекция, выполните коррекцию дрейфа. Верно, исходя из PSF фидуциальных маркеров. В качестве альтернативы используйте алгоритмы перекрёстной корреляции (например, коррекция дрейфа, реализованная в том же плагине).
   32. Выполните спектральное размикшение для устранения перекрёстных помех каналов. В окне анализа STORM нажмите на инструмент удаления перекрёстных помещений (обычно в правом нижнем углу).
   33. Установить радиус на 25,0 нм (рекомендую). Выберите исходный канал. Выберите метод удаления: рекомендуется статистический метод.
   34. Чтобы устранить перекрёстную активацию, вызванную возбуждающим лазером, выберите Вычитать в дополнение к NSA > Кросс-активация. Нажмите ОК. Новый канал, Nonspecific Activation-Xt, генерируется автоматически.
   35. Проверьте уровни автофлуоресценции и фоновые сигналы с помощью неокрашенных контрольных образцов. Убедитесь, что все сигналы имеют конкретную маркировку.
   36. Выполните 3D-визуализацию. Выберите область интереса (ROI) в окне анализа.
   37. Нажмите кнопку [3D] (или [Показать 3D]). Сгенерируйте 3D-проекцию или рендеринг объёма.
   38. Кликните правой кнопкой мыши, чтобы настроить параметры рендеринга. Экспортировать видео в обычных форматах (например, .avi или .mp4).
   39. Чтобы классифицировать минеральный сигнал как интрафибриллярный, проводите Z-срезовый анализ, как в 6.4.26–6.4.28. Профили интенсивности экспорта.
   40. Определим центр фибриллы как Z-плоскость, где сигнал коллагена максимальн.
   41. Минеральный сигнал считается внутрифибриллярным, если его интенсивность в Z = 0 (центр) и при Z = ±60 нм равна ≥50% от максимальной интенсивности минерала в этой фибрилле. Если сигнал опускается ниже 30% при Z = 0, классифицируется как экстрафибриллярный.
   42. Запишите классификацию не менее 50 фибрилл на каждое состояние, чтобы рассчитать процент внутрифибриллярной минерализации.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативные публично доступные плагины также доступны для фильтрации плотности, коррекции дрейфа и спектрального разведения.

Results

Успешная реализация этого протокола обеспечивает высокоразрешающую трёхмерную визуализацию минерализованных коллагенных фибрилл с использованием многоцветных 3D-STORM. Следующие результаты иллюстрируют типичные результаты, контроль качества и количественные оценки.

На рисунке 1 показана многоцветная 3D-STORM-реконструкция коллагеновой сети, минерализированной аморфным кальциевым фосфатом (ACP). Коллаген (маркированный красным флуоресцентным красителем) представлен как хорошо очерченная фибриллярная сеть. Хондроитин сульфат (GAG, помечен красным красителем) тесно связан с коллагеновыми фибриллами, а области колокализации на слиянном изображении выглядят голубыми. Важно, что частицы ACP (зелёные, маркированные кальциевым индикаторным красителем) наблюдаются внутри коллагеновых фибрилл, демонстрируя внутрифибриллярную минерализацию на ранней стадии (30 мин). Этот рисунок подчёркивает способность протокола одновременно разрешивать три различных компонента (коллаген, GAG, минерал) на наноуровне, что невозможно с помощью традиционной конфокальной микроскопии (см. рисунок 5 для сравнения разрешения изображения). Наномасштабная колокализация ACP внутри фибрилл подтверждает, что аморфный предшественник может проникнуть внутрь фибрилляра до кристаллического превращения.

Рисунок 2 приводит количественные доказательства интрафибриллярного проникновения зрелого гидроксиапатита (HAP) после 6 часов минерализации. На рисунке 2A показаны 2D изображения STORM, показывающие обширную колокализацию коллагена (красный) и HAP (зелёный), при этом объединённые каналы выглядят жёлтыми. Рисунок 2B — это реконструкция 3D-тома, иллюстрирующея интегрированную архитектуру. На рисунке 2C показан анализ срезов по оси Z с интервалами 60 нм от вершины (Z = −120 нм) до центра (Z = 0) и до более глубоких срезов (Z = +120 нм). Сигнал HAP сохраняется в центральных срезах (Z = 0–±120 нм) с интенсивностью ≥50% от максимума, что соответствует критериям классификации внутрифибриллярной минерализации, определённым в шагах протокола 6.4.39–6.4.41. Количественный колокализационный анализ из трёх независимых экспериментов (n = 3 реплики, каждый с 5 интересующими областями) дал коэффициент корреляции Пирсона 0,89 ± 0,04 и коэффициент перекрытия Мандерса 0,91 ± 0,03 (средний ± SD). Эти значения указывают на сильную и специфическую связь между коллагеном и HAP внутри фибрилл, подтверждая, что зрелая кристаллическая фаза также находится внутрифибриллярно.

Рисунок 3 подтверждает структурную целостность самособирающегося коллагенового каркаса с помощью трансмиссионной электронной микроскопии. Коллагеновые фибриллы, окрашенные 1% фосфотунгстической кислотой (pH 7,0), демонстрируют характерный D-периодический перекрестный рисунок 67 нм, что является диагностическим фактором нативного фибриллогенеза. Этот этап контроля качества необходим перед переходом к экспериментам по минерализации, так как подтверждает, что каркас структурно целостен и способен поддерживать внутрифибриллярное минеральное отложение. Без такого полосатого узора коллаген может быть денатурирован или неправильно собран, что приводит к артефактическим узорам минерализации.

Рисунок 4 иллюстрирует репрезентативный отрицательный результат, полученный при неправильном контроле условий минерализации (например, отсутствие полиаспартиновой кислоты или pH > 7.6). При таких неоптимальных условиях отложения HAP (зелёные) наблюдаются исключительно на стеклянном субстрате за пределами коллагеновых фибрилл (красные), без внутрифибриллярной инвазии. Этот результат служит важным контролем: он демонстрирует, что внутрифибриллярная минерализация, наблюдаемая на рисунках 1 и 2 , не связана с неспецифическим осадками или неполным промывыванием, а требует точного контроля химической среды (pH 7,4 ± 0,1, наличие полиаспартиновой кислоты и немедленное использование свежей минерализационной среды). Исследователям следует включать такие негативные меры для подтверждения собственной системы.

Рисунок 5 показывает репрезентативные изображения конфокальной микроскопии, полученные до получения STORM для предварительного скрининга образцов. Коллагеновый канал (рисунок 5A) показывает чёткую фибриллярную сеть, а HAP-канал (рисунок 5B) показывает минералы, связанные с фибриллами. Объединённое изображение (рисунок 5C) подтверждает колокализацию на дифракционно ограниченном уровне (~200 нм). Эти изображения служат двум целям: (1) они проверяют качество образца (адекватная маркировка, минимальная агрегация и специфическая минеральная ассоциация) перед переходом к трудоёмкому STORM-съёмке; и (2) они направляют выбор интересующих регионов для получения 3D-STORM. Важно, что конфокальные изображения не имеют достаточного разрешения для различия между внутрифибриллярной и экстрафибриллярной минерализацией. Обратите внимание, что минеральный сигнал кажется непрерывным вдоль фибрилл, не раскрывая, находится ли он внутри или снаружи. Это ограничение подчёркивает необходимость подхода с суперразрешением, описанного здесь.

На рисунке 6 представлены два контрольных эксперимента. Рисунок 6A (контроль без первичных антител) не показывает специфического сигнала при применении только вторичного антитела, что подтверждает, что наблюдаемые сигналы в маркированных образцах не связаны с неспецифическим связыванием вторичных антител. Рисунок 6B (неокрашенный контроль) не показывает сигнала флуоресценции (полностью чёрный), что исключает значительную автофлуоресценцию образца или подложки. Эти контроли необходимы для проверки специфичности маркировки иммунофлуоресценцией. Любой уловимый сигнал в этих органах управления указывает на необходимость корректировки шагов блокировки или промывки.

При оптимизированных условиях съёмки система 3D-STORM достигла типичной точности локализации 20–30 нм по бокам и 50–60 нм по оси, что соответствует оригинальной литературе по 3D-STORM²⁵. Коррекция дрейфа выполнялась во время постобработки с использованием встроенного алгоритма избыточной перекрестной корреляции (RCC), который исключает необходимость в экзогенных фидуциальных^{маркерах 23}. Для назначения фазы ACP была назначена на минерализацию 30 минут, а HAP — на 6 часов, исходя из установленной кинетики созревания. Возможность временно различать эти две фазы в сочетании с локализацией наноуровней позволяет исследователям изучать динамику внутрифибриллярной минеральной трансформации.

В итоге репрезентативные результаты показывают, что этот протокол позволяет наномасштабно различать внутрифибриллярную и экстрафибриллярную минерализацию в модели рекомбинантного коллагена с помощью количественных показателей колокализации и соответствующих отрицательных контролей. Этот метод особенно ценен для исследователей, изучающих механизмы биоминерализации, биомиметические материалы и инженерию костной ткани.

Дополнительная таблица 1 обобщает распространённые проблемы, возникающие во время процедур минерализации и STORM, а также их возможные причины и рекомендуемые решения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Рисунок 1: Многоцветная 3D-STORM реконструкция минерализованных коллагеновых фибрилл. Коллаген (красный, далеко-красный флуоресцентный краситель) и хондроитин сульфат (GAG, синий, красный флуоресцентный краситель) изображены одновременно. Колокализация коллагена и GAG проявляется в виде пурпурной в слияном канале, а области, где все три перекрываются, выглядят белыми. Также показан аморфный кальциевой фосфат (ACP, зелёный, кальциевый индикаторный краситель). ACP наблюдается в пределах коллагеновых фибрилл, что указывает на локализацию внутрифибриллярной клетки. Шкала масштаба: 1 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: 3D-STORM-визуализация внутрифибриллярной гидроксиапатитовой (HAP) минерализации. (A) 2D изображения STORM коллагена (красный, красный флуоресцентный краситель), HAP (зелёный, кальциевый индикаторный краситель) и объединённого канала. (B) 3D-реконструкция объёма. (C) анализ срезов по оси Z с интервалом 60 нм (Z = −120, −60, 0, +60, +120 нм). Стойкий сигнал HAP в центральных срезах (Z = 0–±120 нм) соответствует критериям классификации внутрифибриллярной минерализации (интенсивность ≥50% от максимума). Количественная колокализация, рассчитанная по этому рисунку: r Пирсона = 0,89 ± 0,04, перекрытие Мандера = 0,91 ± 0,03. Шкалы: 0,1 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Валидация самособранных коллагеновых фибрилл с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (TEM). Коллагеновые фибриллы были окрашены 1% фосфорной кислотой (pH 7,0). Диагностический 67-нм D-периодический перекрестный полосный рисунок подтверждает успешный фибриллогенез и структурную целостность. Масштабная планка: 200 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Репрезентативный отрицательный результат: экстрафибриллярная минерализация. Коллаген (красный, красно-красный флуоресцентный краситель) и HAP (зелёный, кальциевый индикаторный краситель). HAP откладывается исключительно на стеклянном субстрате вне коллагеновых фибрилл, без внутрифибриллярной инвазии. Этот неоптимальный результат включается в отрицательный контроль для иллюстрации диапазона возможных результатов. Шкала масштаба: 0,1 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5: Репрезентативные конфокальные изображения, используемые для предварительного скрининга. (A) Канал коллагена (красный, далеко красный флуоресцентный краситель) показывает прозрачную фибриллярную сеть. (B) Канал HAP (зелёный, кальциевый индикаторный краситель) показывает минеральную ассоциацию. (C) Объединённое изображение показывает колокализацию коллагена и HAP. Шкала = 2 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6: Контрольные эксперименты. (A) Контроль без первичных антител: применяются только вторичные антитела; Никакого конкретного сигнала. (B) Неокрашенный контроль: не применяются фторофоры или антитела; Нет сигнала флуоресценции (полностью чёрный). Шкала = 1 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Дополнительная таблица 1: Руководство по устранению неполадок. Распространённые проблемы, возникающие при минерализации и анализе 3D-STORM, а также их возможные причины и рекомендуемые решения. См. текст для подробных номеров шагов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Discussion

Этот протокол обеспечивает комплексный рабочий процесс для наномасштабной визуализации минерализации коллагена с помощью многоцветного 3D-STORM. Несколько критически важных шагов требуют особого внимания для обеспечения успешных результатов.

Во-первых, подготовка образцов является основой для высококачественной STORM-съёмки. Аминосиланизация чашек с стеклянным дном должна быть тщательной, чтобы обеспечить стабильное прикрепление волокон коллагена на протяжении последующих этапов мытья и маркировки. Остаточный APTES может вызывать неспецифическое связывание и высокий фон, тогда как неполная силанизация может привести к отслоению фибриллы. Рекомендуемый этап ультразвуковой обработки (10 минут при 40 кГц) эффективно удаляет несвязанный силан, сохраняя при этом функционализацию поверхности. Для сшивания коллагеновых волокон рекомендуется^{EDC/NHS 21} для высокой специфичности. В качестве альтернативы можно использовать 0,1% глутаральдегид (инкубировать 30 минут при комнатной температуре, затем тщательно промыть), но он менее специфичен. Крайне важно, чтобы прежде чем приступать к минерализации, мы рекомендуем проверить правильное образование фибрилл с помощью TEM. Как показано на рисунке 3, наличие характерного D-периодического полосатого рисунка диаметром 67 нм подтверждает, что процесс самосборки привёл к образованию структурно целостных, нативных коллагенных^{фибрилл 26}. Этот этап контроля качества предотвращает неправильное толкование результатов, возникающих из-за плохо сформированных или денатурированных коллагеновых каркасов.

Во-вторых, минерализационная среда должна быть подготовлена с точным контролем pH (7,4 ± 0,1) и использована немедленно. Предшественник аморфного кальциевфосфата (ACP) очень чувствителен к pH и ионной силе; Небольшие отклонения могут привести к преждевременной кристаллизации. Поэтому минерализационную среду необходимо использовать сразу после приготовления. Для исследований, требующих сравнения в нескольких временных точках, подготовьте свежую среду для каждого эксперимента вместо использования хранящихся решений. Когда условия минерализации не контролируются должным образом (например, недостаток полиаспартиновой кислоты или неправильный pH), преобладает экстрафибриллярная минерализация, как показано на рисунке 4. В этом отрицательном контроле HAP осаждается исключительно на стеклянном субстрате за пределами коллагеновых фибрилл, без интрафибриллярной инвазии. Включение таких отрицательных результатов необходимо для подтверждения того, что внутрифибриллярный сигнал, наблюдаемый на рисунках 1 и рисунке 2 , действительно обусловлен контролируемой внутрифибриллярной минерализацией, а не неспецифическим осадками или неполным промывыванием. Кроме того, предыдущие исследования подчёркивали, что для различения внутрифибриллярной и экстрафибриллярной минерализации требуется тщательный контроль местной химической среды и наличие стабилизирующих добавок, таких как полиаспариновая^{кислота27}.

В-третьих, маркировка иммунофлуоресценции требует тщательной оптимизации. Концентрация антител (1:100) хорошо работает для описанной системы коллагена и хондроитинсульфатов, но может потребоваться титрование для различных антител или типов образцов. Всегда включайте контроли без первичных антител для оценки аутофлуоресценции и неспецифического связывания. Начиная с вторичного антитела, необходима строгая светозащита для предотвращения фотоотбеливания флюорофоров.

В-четвёртых, буфер STORM должен быть подготовлен свежим и использован в течение 30 минут. Система поглощания кислорода (глюкозооксидаза/каталаза) со временем теряет активность, а цистимин одновременно чувствителен к свету и кислороду. Предварительное цитирование ферментных запасов и их хранение при -80 °C обеспечивает стабильную работу во всех экспериментах. Плотность мигания следует отслеживать в реальном времени и регулировать с помощью мощности лазера 405 нм; слишком мало молекул продлевает время усвоения, а слишком много вызывает перекрывающиеся PSF и снижение точности локализации. Для детальной оптимизации параметров изображения STORM мы направляем читателей к установленным протоколам тестовых^{образцов 15}.

В-пятых, обработка данных требует стандартизированных параметров для значимых сравнений между выборками. Минимальный порог количества фотонов (обычно 500-1000 фотонов) исключает локализации с низкой доверительностью. Если сигналы образца слабы, их можно уместно уменьшить до 300 фотонов, но не рекомендуется опускаться ниже 200 фотонов. Коррекция дрейфа с использованием фидуциальных маркеров или алгоритмов перекрестной корреляции необходима для поддержания разрешения, особенно для 3D-реконструкций²⁸. Спектральное разметывание помогает устранить перекрёстные помехи между каналами, что критически важно для точного анализа колокализации. Устранение распространённых проблем описано в Дополнительной таблице 1.

Протокол имеет несколько ограничений. Он оптимизирован для биомиметических моделей in vitro; Применение к нативным, сильно минерализованным тканям (например, зрелой кости) может потребовать дополнительных этапов, таких как декальцификация или более агрессивное извлечение антигенов, что может повлиять на ультраструктуру. Зависимость от определённых антител может вызвать проблемы с плотностью маркировки или стерические препятствия, особенно в плотно упакованных структурах. Эта техника требует много оборудования, что требует доступа к высококлассному микроскопу STORM с соответствующими лазерными линиями и камеры EMCCD. Кроме того, общее время (~53 часа от подготовки образца до анализа данных) может ограничить пропускную способность для некоторых приложений.

Несмотря на эти ограничения, этот протокол обладает значительными преимуществами по сравнению с альтернативными методами. По сравнению с электронной микроскопией, она обеспечивает молекулярную специфичность за счёт иммунофлуоресцентной маркировки, позволяя одновременно визуализировать множество органических и неорганических компонентов. По сравнению с конфокальной микроскопией, она достигает ~10 раз большего пространственного разрешения, что позволяет различать интрафибриллярные и экстрафибриллярные минерализационные паттерны. 3D-возможности предоставляют объемную информацию, необходимую для понимания распределения минералов в матрице коллагена.

Метод имеет широкое применение в биоминерализационных исследованиях. Возможные применения включают изучение роли неколлагеновых белков в нуклеации минералов, оценку биомиметических материалов для регенерации костей, изучение патологической минерализации при таких заболеваниях, как остеопороз и кариес, а также оценку влияния терапевтических вмешательств на распределение минералов. При соответствующих модификациях протокол можно адаптировать для изучения других органико-неорганических интерфейсов в тканях или биоматериалах.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Полиаспарагиновая кислота (p-Asp)	Сигма-Олдрич	P9903	Стабилизатор для аморфного кальциевфосфата
Хлорид кальция (CaCl2)	Сигма-Олдрич	C1016	Источник кальция
Дибазовый натрий фосфат (Na2HPO4)	Сигма-Олдрич	S0876	Источник фосфатов
Хлорид натрия (NaCl)	Сигма-Олдрич	S9888	Регулятор ионной силы
Полиакриловая кислота (PAA)	Сигма-Олдрич	323667	Стабилизатор для высококонцентрационного кальция
База Трис	Сигма-Олдрич	T1503	Компонент буфера
Натрий азид (NaN3)	Сигма-Олдрич	S2002	Антимикробное средство
(3-аминопропил)триэтоксисилан (APTES)	Сигма-Олдрич	440140	Агент для функционализации стеклянной поверхности
Абсолютный этанол	Сигма-Олдрич	459836	Растворитель
Раствор коллагена первого типа (50 & mu; г/мл в 0,1 млн уксусной кислоты)	Корнинг	354249	Самосборочные строительные леса
Хондроитин сульфат (ХС)	Сигма-Олдрич	C9819	Неколлагеновый имитатор белка
ЭДК (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид)	Сигма-Олдрич	E7750	Кросслинкер
NHS (N-гидроксисукцинимид)	Сигма-Олдрич	130672	Активатор перекрестного сшивателя
Свободная кислота MES	Сигма-Олдрич	M5287	Буфер для перекрёстного соединения
Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS)	Gibco	10010023	Буфер промывания и разбавления
Бычий сывороточный альбумин (BSA)	Сигма-Олдрич	A3059	Блокирующий агент
Антитело к коллагену I у кроликов	Abcam	ab34710	Первичное антитело к коллагене
Антитела к ондроитинсульфату у мышей	Сигма-Олдрич	C8035	Первичное антитело к ХС
Козий антикроличий IgG, конъюгированный с красным флуоресцентным красителем (Alexa Fluor 647)	Термо Фишер Сайентифик	A-21244	Вторичные антитела к коллагену
Козий противомышиный IgM, конъюгированный с красным флуоресцентным красителем (Alexa Fluor 568)	Термо Фишер Сайентифик	A-11031	Вторичное антитело к ХС
Кальцеин (кальциевый индикаторный краситель)	Сигма-Олдрич	C0875	Метка кальциев-фосфата
Tween-20	Сигма-Олдрич	P1379	Моющее средство для стирки в буфере
Глицерин	Сигма-Олдрич	G5516	Компонент буфера изображения
Глюкозооксидаза (GOx)	Сигма-Олдрич	G7141	Поглощатель кислорода
Каталазе	Сигма-Олдрич	C1345	Поглощатель кислорода
Cysteamine (MEA)	Сигма-Олдрич	M6500	Тиол для мигания флуорофора
D-глюкоза	Сигма-Олдрич	G6152	Субстрат для глюкозооксидазы
Ацетат натрия	Сигма-Олдрич	S2889	Буфер для GOx stock
Соляная кислота (HCl)	Сигма-Олдрич	320331	Корректировка pH
Гидроксид натрия (NaOH)	Сигма-Олдрич	71690	Корректировка pH
Фосфотунгстическая кислота	Сигма-Олдрич	P4006	Отрицательная окрашивание для TEM
Посуды для культуры с стеклянным дном (35 мм, #1,5H)	MatTek	P35G-1.5-14-C	Образец субстрата; Толщина 0,17 мм
Ультразвуковой очиститель (40 кГц)	Брэнсон	B200	Чистящее устройство
Камера влажности	Термо Фишер Сайентифик	11-432-10	Для самосборки коллагена
Трансмиссионный электронный микроскоп	Hitachi	HT7800	TEM-визуализация
Формвар/углеродно-покрытые TEM-сетки (200 меш)	Сигма-Олдрич	FCF200-CU	Поддержка сэмплов TEM
Горизонтальная платформа-шейкер	Labnet	S2030-RC	Аккуратное мытье
Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп	Nikon	A1	Предварительный отбор
3D-STORM микроскопическая система (с лазерами 405/488/647 нм, цилиндрической линзой, EMCCD)	Nikon	N-STORM	Сверхразрешённая визуализация
100 и больше раз; Цель масляного погружения (NA 1.49)	Nikon	MRD01991	Высокоразрешающая визуализация
pH-метр	Меттлер Толедо	FiveGo F2	Контроль pH
Программное обеспечение для получения и анализа STORM	Nikon	NIS-Elements (модуль STORM)	Сбор и обработка данных STORM
Формат файла .nd2 (необработанный микроскопический файл)	Nikon	Н/Д	Формат RAW-файла, созданный микроскопами Nikon.
Общедоступное программное обеспечение для анализа изображений	Открытый исходный код	Н/Д	например, ImageJ с плагином ThunderSTORM для анализа локализации одной молекулы (колокализация, коррекция дрейфа)
Парафильм	Бемис	PM996	Покрытие образца во время инкубации
Алюминиевая фольга	Любой поставщик лабораторий	Н/Д	Для защиты от света (например, обёртывание образцов)
Янтарные микроцентрифугные трубки	Fisher Scientific	05-669-21	Для световой защиты флуорофоров
Коверслипы (No 1.5)	Корнинг	2855-18	Монтаж образца