Методическая статья

Мультиплексная флуоресцентная мРНК in situ гибридизация развивающихся краниофациальных тканей в образцах мышей FFPE

DOI:

10.3791/71475

⸱

8 мая 2026 г.

 ,  , 
1Center for Engineering in Medicine and Surgery, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, 2Department of Surgery, Harvard Medical School, 3Shriners Hospital for Children, 4Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Традиционная in situ гибридизация испытывает трудности с визуализацией мРНК в краниофациальных тканях из-за сложной архитектуры, высокого фона, ограниченной специфичности зонда и чувствительности. Этот протокол описывает мультиплексный метод гибридизации флуоресцентной РНК in situ для чувствительного, специфического обнаружения нескольких мРНК-мишень в эмбриональных черепно-лицевых тканях мышей FFPE, преодолевая прежние ограничения.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Краниофациальное развитие зависит от координированной активности различных специализированных популяций клеток, которые взаимодействуют в сложных тканевых архитектурах для формирования и поддержания нормальной структуры и функции тканей. Понимание того, как эти клетки взаимодействуют друг с другом и с их локальной микросредой, крайне важно для определения молекулярных механизмов, регулирующих их формирование и гомеостаз. Нарушение этих процессов может привести к врождённым краниофациационным заболеваниям, включая агенезию зубов, расщелины нёба и расщелины губы, как самостоятельно, так и в составе синдромных расстройств. Хотя количественные методы, такие как RT-PCR, обладают высокой чувствительностью и динамическим диапазоном, они требуют экстракции РНК из гомогенизированной ткани, что приводит к потере пространственного и клеточного контекста, что особенно критично для гетерогенных краниофациальных тканей, где клеточное происхождение транскриптов невозможно определить. Мультиплексная флуоресцентная РНК in situ гибридизация преодолевает это ограничение, обеспечивая чувствительное и специфическое обнаружение множества транскриптов мРНК при сохранении архитектуры тканей. Этот продвинутый подход позволяет точно локализовать экспрессию генов на клеточном уровне, предоставляя ценное понимание пространственной регуляции процессов развития и механизмов заболеваний в краниофациальной биологии.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Полимеразная цепная реакция в реальном времени (RT-PCR) является золотым стандартом анализа экспрессии генов благодаря высокой чувствительности и широкому динамическому диапазону; однако требуется экстракция РНК из гомогенизированных тканей, что приводит к потере пространственного и клеточногоконтекста 1. Это ограничение особенно проблематично для гетерогенных тканей, таких как краниофациальные ткани, во время эмбрионального развития, где клеточный источник обнаруженных транскриптов не может быть уделен. Гибридизация РНК in situ (ISH), метод, разработанный в 1968 году Джозефом Галлом и Мэри Лу Пардью, преодолевает это ограничение, позволяя локализовать экспрессию мРНК внутри целостной тканевойархитектуры 2. Тем не менее, традиционная РНК-ISH технически требовательна и сильно зависит от оптимальной фиксации тканей и подготовки образца для сохранения целостностиРНК 3. Эти проблемы усугубляются в сильно кальцифицированных тканях, которые требуют процедур декальцификации, часто включающих агрессивные химикаты или длительную обработку, приводящую к деградации РНК. В результате РНК ISH в черепно-лицевых тканях, которые включают сложные смеси типов клеток, требует тщательной оптимизации и технической экспертизы, занимает много времени и несёт значительный риск неоптимального окрашивания. Сложность визуализации экспрессии мРНК особенно выражена в зубных тканях, обладающих высокой сложной структурой и составом. Зубы состоят из минерализированных компонентов, таких как эмаль, дентин, цемент и окружающая кость, а также из более мягких тканей, включая пульпу и пародонтальную связку. Эти ткани населены разнообразными типами клеток, которые играют важную роль в развитиизубов 4. Эти функции требуют тщательной стандартизации для обеспечения надёжного обнаружения сигнала. В результате описанный протокол особенно подходит для изучения экспрессии генов на этапах развития и после рождения зубов.

Существуют методы множественной флуоресценции in situ гибридизации (FISH) для обнаружения пространственной РНК, включая амплифицированную РНК на основе зондовFISH 5,6,7,8,9, цепную реакцию гибридизацииFISH 6, одномолекулярную РНК FISH 10, усиление сигнала обменной реакцией FISH 5 и высокомультиплексированные платформы FISH, такие какMERFISH 11 иseqFISH 12,13. Среди них широко используется мультиплексная флуоресцентная РНКISH 7,8,9 благодаря высокой чувствительности к обнаружению одной молекулы РНК, возникающей в результате конструкции двойного Z-зонда, при котором два соседних зонда должны гибридизироваться с целевой последовательностью для инициации амплификации сигнала. Эта конструкция двойного распознавания значительно повышает специфичность и снижает сигнал вне цели. Метод поддерживает мультиплексное обнаружение 2–4 мишеней (с возможностью расширения до 12 и более мишеней с помощью аналогичных методов), сохраняет морфологию тканей и совместим с формалин-фиксированными парафино-вложёнными (FFPE)7,8,9, свежезамороженными и выбранными кальцифицированными тканями, что делает его подходящим для сложных образцов, таких как те, что встречаются при краниофациальном и стоматологическом развитии. Метод стандартизирован, воспроизводим, поддерживается хорошо зарекомендовавшими зондовыми библиотеками и широко валидирован, обеспечивая доступность и надёжность результатов в различных лабораториях.

Мультиплексная флуоресцентная РНК ISH использует несколько зондов, направленных на отдельные области одного и того же транскрипта, в сочетании с усиленным усилением сигнала, что обеспечивает высокочувствительное и специфическое обнаружение даже для мРНК с низким количеством или частичнодеградированными 14,15. В то время как мультиплексная флуоресцентная РНК ISH успешно применялась к декальцифицированным образцамкости 16, а его применение в сложных краниофациальных тканях ранеесообщалось 7,8,9; Однако подробный пошаговый протокол, описывающий его применение в этом контексте, пока не опубликован.

Краниофациальные структуры включают сложные тканевые архитектуры с разнообразными типами клеток, включая остеобласты, остеокласты, остеоциты, амелобласты, одонтобласты, фибробласты, стволовые клетки, иммунные клетки, сосудистые и сенсорные нейроны, чьи пространственно координированные взаимодействия необходимы для формирования, функций, регенерации и иммунологической защитытканей 4. Изучение локализованных экспрессий генов в этих тканях крайне важно, и мультиплексная флуоресцентная РНК ISH является ведущим подходом для таких анализов.

В этом исследовании мы описали, как мультиплексная флуоресцентная РНК ISH на основе зондов и технологий РНК-скопов может быть применена для изучения сложных краниофациальных тканей (рисунок 1). Кроме того, мы создали оптимизированный рабочий процесс секции FFPE, который сохраняет целостность РНК и позволяет проводить высококачественный пространственно разрешённый анализ экспрессии генов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры на животных были одобрены Национальным институтом здоровья, Комитетом по уходу и использованию животных Национального института здоровья детей и развития человека (IACUC) в соответствии с Протоколом исследования животных #24-031.

1. Спаривание по времени и сбор ткани эмбриона

  1. Организуйте спаривание по времени.
    1. Спарите здорового, плодовитого самца и самку мышечного мышца поздним вечером. На следующее утро проверьте наличие вагинальной пробки. Обозначите день наблюдения пробки как эмбриональный день (E) 0,5.
  2. Усыпить беременной женщине.
    1. На желаемой стадии развития усыпить беременную мышь с помощью вдыхания CO₂ с последующим вывихом шейки матки в соответствии с институциональными рекомендациями по уходу за животными.
    2. Положите мышь на спину на стерильную впитывающую поверхность. Дезинфицируйте область живота 70% этанола вдоль предполагаемого места разреза.
  3. Обнажите и изолируйте рога матки.
    1. Сделайте разрез по средней линии живота стерильными хирургическими ножницами, затем откройте брюшинную стенку микрохирургическими ножницами, чтобы обнажить рога матки.
    2. Используйте тупые щипцы, чтобы аккуратно выделить цепочку матки. Освободить ткань матки вдоль миометрия и разрезать яйцеток и среднюю часть рога матки, чтобы изолировать эмбрионы.
  4. Переносите целые эмбрионы.
    1. Немедленно перенесите цепочку матки, содержащую эмбрионы, в чашку Петри диаметром 10 см, содержащую ледяную стерильную 1× PBS (pH 7,4).
  5. Вскрытие отдельных эмбрионов.
    1. Аккуратно отделяйте каждый эмбрион от окружающих матки, амниотических и хорионных перепон.
    2. Перенесите очищенные эмбрионы в свежую чашу диаметром 10 см с ледяной стерильной PBS.
  6. Вскрытие эмбриональных голов мышей.
    1. Используя стерильный хирургический клинок, вскрытие головок и промывание головок в ледяной температуре PBS перед дальнейшей обработкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Собрать и вскрыть новорождённых мышей на желаемой стадии развития в соответствии с животным протоколом.

2. Фиксация и обработка тканей

  1. Починьте салфетку.
    1. Немедленно погрузите вскрытую ткань в 10% нейтральный буферный формалин и зафиксируйте на ночь при комнатной температуре на шейкере.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Правильное сохранение РНК имеет решающее значение для успеха анализа гибридизации in situ. Многочисленные исследования показали, что стандартный подход — фиксация образцов тканей в 10% нейтральном буферном формалине в течение длительности от 6 до 48 часов, в зависимости от конкретного размера и возраста ткани — даёт надёжные результаты для сохраненияРНК 16,17,18,19. На ранних эмбриональных стадиях (E12.5 и ниже) фиксация быстроя, и время фиксации следует сокращать, чтобы предотвратить чрезмерную фиксацию. Начиная с эмбрионального дня 17,5 (E17,5), а также в послеродовых образцах, проникновение фиксатива может быть менее эффективным из-за наличия кожи на голове, которая служит физическим барьером. Поэтому кожу следует снимать со всей головы для эффективного проникновения раствора фиксации. Декальцификация может проводиться при 0,5 M EDTA (pH 8,0), содержащем 0,5% формальдегида без метанола при температуре 4 °C 7. Продолжительность декальцификации можно контролировать с помощью быстрого микроКТ и корректировать в зависимости от степени минерализации и конкретного типа ткани; для эмбрионов E18.5 обычно достаточно 24–48 ч.
  2. Прополосните и обработайте ткань.
    1. Удалите фиксатор и промите образцы в PBS. Перенесите ткань на 70% этанол и храните при 4 °C до дальнейшей обработки (1–4 недели)20. Проведите обезвоживание, очистку и инфильтрацию парафина тканей с помощью автоматизированного процессора тканей согласно инструкциям производителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Типичный протокол обработки тканей такой: 70% этанола в течение 30 минут, затем 95% этанола в течение 30 минут (2 раза) и 100% этанола в течение 30 минут (3 раза) для обезвоживания; очищение в ксилоле в течение 1 часа (3 раза), затем инфильтрация с помощью парафинового воска при 60 °C в течение 1 часа (3 раза) перед погружением в парафиновые тканевые блоки.
  3. Внедрить ткань.
    1. Встраивайте головки в парафин и ориентируйте образцы либо в корональной, либо сагиттальной плоскости, в зависимости от экспериментальных требований.
    2. Перенесите вложенные блоки на холодную пластину из парафинового блока, чтобы воск затвердел примерно на 30 минут, с регулировкой времени по мере необходимости в зависимости от размера блока.
  4. Храните блоки FFPE.
    1. Дайте парафину полностью затвердеть. Достаньте блоки из форм, положите их в герметичные контейнеры или пакеты с зип-локом и храните при 4 °C до готовности к секциям.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Блоки FFPE с хорошо сохранившейся РНК могут храниться несколько лет до сечения без ущерба целостности тканей.

3. Обработка ткани FFPE для мультиплексной флуоресцентной РНК ISH

  1. Подготовьте рабочее пространство без RNase.
    1. Продезинфицируйте все рабочие поверхности и приборы 70% этанолом. Обработайте поверхности, инструменты и перчатки раствором для дезинфекции РНК, чтобы минимизировать деградацию РНК.
    2. Настройте микротом и установите новый клинок. Установить угол зазора на 10°. Перед использованием обрабатывайте пинцет и щётки раствором для дезинфекции РНазы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте новое лезвие для сечения, чтобы получить точные срезы ткани. Угол лопасти существенно влияет на качество сечения, целостность ткани, однородность толщины и сохранение морфологических особенностей.
  2. Приготовьте водную баню.
    1. Наполните плавучую водную ванну ультрачистой лабораторной водой.
    2. Регулируйте температуру в диапазоне 40–43 °C по мере необходимости, в зависимости от эмбриональной стадии и характеристик ткани.
  3. Подрежьте и установите блок FFPE.
    1. Уберите избыток парафина вокруг вложенной ткани. Охладите блок FFPE на льду и закрепите его на холодной стадии микротома.
  4. Подключитесь к интересующей области.
    1. Выровняйте лицо парафинового блока с клинком микротома и обрезайте на 12 мкм шагах, пока интересующая область (например, прилегающая к моляру или резцу) не появится в коронных срезах.
    2. Переставляйте блок и лезвие по мере необходимости для симметричных, правильно ориентированных корональных или сагиттальных сечений целой головы.
  5. Разрезать ткани.
    1. После достижения интересующей области отрежьте срезы размером 5–7 мкм. Поплавите секции на водяной бане, чтобы можно было легче расслабиться и расплющить, прежде чем перенести их на слайды.
  6. Закрепите и высушите секции.
    1. Закрепите секции на стеклянные стекла с положительным зарядом. Осмотрите стекла под световым микроскопом, чтобы подтвердить правильную ориентацию и целостность тканей.
    2. Перед проведением мультиплексного флуоресцентного анализа РНК ISH высушите стекли на подогревателе при температуре 40 °C.

4. День 1: Депарафинизация и регидратация

  1. Выпечь слайды.
    1. Выпекайте слайды с FFPE-секциями в течение 1 часа при 60 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если затвор не используется сразу, храните его не запечённым при комнатной температуре (RT) с десикантами в течение 1–4 недель. Длительное хранение может привести к деградации РНК.
  2. Уравновесьте слайды.
    1. Дайте тканевому слайду FFPE уравновеситься при комнатной температуре (RT) в течение 10 минут.
  3. Депарафинизируйте и увлажняйте участки.
    1. Погрузите стекли в ксилол или заменитель ксилола с мягким перемешиванием на 5–10 минут при RT. Повторите этот шаг один раз, чтобы обеспечить полное удаление парафина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Работа с ксилолом должна проводиться в химическом выхлопчике. Если используется заменитель ксилола с низкой токсичностью, его можно применять вне химического выхлопа.
    2. Переведите препараты на 100% этанол и инкубируйте 2 минуты при RT. Повторите один раз, чтобы удалить остаточный ксилол. Увлажните секции в 70% этаноле на 2 минуты.
    3. Прополосните секции 3 раза с помощью PBS. Затем добавьте каплю PBS, чтобы полностью охватить разделы, и сразу перейти к следующему этапу.

5. Мультиплексная флуоресцентная РНК ISH на срезах ткани FFPE

ПРИМЕЧАНИЕ: Это исследование следовало инструкциям производителя по проведению мультиплексного флуоресцентного РНК ISH на срезах ткани FFPE с использованием технологииRNAscope 21.

  1. День 1: Предобработка и гибридизация зонда
    1. Нарисуйте гидрофобный барьер.
      1. Используя барьерную ручку, нарисуйте гидрофобный барьер вокруг каждого участка ткани. Дайте стеклам высохнуть на воздухе примерно 10 минут при комнатной температуре (RT).
      2. Убедитесь, что срезы тканей всегда покрываются PBS, чтобы предотвратить высыхание.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте салфетку без ворса (салфетку для линзы), чтобы высушить слайд вокруг ткани, сохраняя при этом увлажнённую ткань. Убедитесь, что чернила для барьерного пера не соприкасаются с тканевой секцией.
    2. Проведите предварительное лечение.
      1. Нанесите специальный реагент для полного покрытия каждого участка. Инкубировать слайды в течение 30 минут при 40 °C в увлажнённой камере внутри печи для гибридизации.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для всех реагентов, подаваемых в бутылках с пипеткой, добавьте достаточно капель, чтобы полностью покрыть участок внутри барьера. Убедитесь, что все реагенты доставлены в RT перед использованием.
    3. Промывайте секции.
      1. Промывайте секции несколько раз PBS, затем инкубируют свежий PBS в течение 2 минут при RT.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 5-мловую трансферную пипетку для мытья каждого затвора по отдельности с помощью PBS. Во время двухминутной мойки убедитесь, что секции полностью покрыты PBS.
    4. Потушить эндогенной пероксидазную активность.
      1. Нанесите 3% перекиси водорода на каждую секцию и инкубуйте в RT в течение 10 минут, чтобы блокировать активность эндогенной пероксидазы.
    5. Повторите стирку.
      1. Помой стекли в PBS в течение 2 минут на RT. Повторяйте дважды.
    6. Подготовьте зонды.
      1. Предварительно прогрейте зонды при 40 °C в течение 10 минут. Дайте зондам остыть до RT перед использованием.
    7. Приготовьте смесь для зонда.
      1. Зонд C1 поставляется в виде рабочего решения 1×; Используйте это напрямую.
      2. В отличие от этого, зонды C2, C3 и C4 представлены в виде концентратов по 50×; разбавить эти зонды раствором зонда C1. Если зонд C1 не используется, разбавьте зонды C2, C3 и/или C4 с помощью разбавителя датчика, предоставленного производителем.
    8. Гибридизуйте зонды.
      1. Нанесите 30–40 мкл смеси зонда на каждый участок ткани, обеспечивая полное покрытие. Инкубировать затворы в течение 2 часов при 40 °C в увлажнённой камере в гибридизационной печи.
        ПРИМЕЧАНИЕ: При изучении техники РНКскопа рекомендуется включать как отрицательные, так и положительные контрольные зонды во время испытаний. Такой подход помогает подтвердить результат анализа и качество процедуры. Возможное ограничение, о котором стоит знать, заключается в том, что некоторые производители положительные контрольные зонды могут не проявлять интерес в ткани. Для решения этой проблемы можно использовать зонды, специфичные для типа клеток. Например, Col1a1 является надёжным положительным контролем соединительных тканей. Окрашивание для Col1a1 (или другого гена с известной высокой экспрессией) может быть проведено как первый шаг для оценки сохранения РНК и морфологии тканей в образцах. После достижения владения техникой отрицательные контроли обычно проводятся путем обработки слайдов без зондов, но с помощью всех других растворов. Этот метод предоставляет критически важную информацию о фоновых сигналах во всех каналах обнаружения. Стандартный комплект Multiplex V2 позволяет одновременно окрашивать и визуализировать до четырёх различных зондов. Когда уровни экспрессии генов устанавливаются с помощью предыдущих исследований транскриптомики, рекомендуется назначить гены с низкой экспрессией каналам Cy5 и Cy7. Гены с высокой экспрессией следует размещать в каналах GFP и RFP для оптимального обнаружения. В случаях, когда ни один из зондов не нацелен на гены с высокой экспрессией, канал GFP должен оставаться неиспользованным. Это позволяет каналу GFP служить ориентиром для фонового вычитания из RFP-канала, повышая точность обнаружения сигнала для целей с низким уровнем выражения.
    9. Полосните с буфером для стирки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерчески доступный 20× Wash Buffer был разведён до 1× водой без РНазы перед использованием.
      1. Помой затворы 2 минуты в RT в буфере для мойки 1×, который идёт в комплекте. Повторите дважды.
    10. Инкубировать в буфере 5x с солевым раствором и натрием цитратом (SSC).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерчески доступный буфер SSC 20× (3 млн NaCl, 0,3 млн цитрат натрия, pH 7,0) был разведён до 5× водой без РНазы перед использованием.
      1. После промывки инкубировать секции на ночь в буфере 5× SSC на RT.
  2. День 2: усиление сигнала, флуоресцентная маркировка и монтаж
    1. Помой слайды.
      1. Мойте стекли в буфере для стирки 1× в течение 2 минут при комнатной температуре (RT). Повторите дважды.
    2. Выполните шаги усиления.
      1. Нанесите реагент Amplification 1 на каждую секцию и инкубуйте 30 минут при 40 °C в увлажнённой камере.
      2. Промывайте дважды за 1× Wash Buffer в течение 2 минут на RT.
      3. Примените реагент Amplification 2 и инкубируем 30 минут при 40 °C.
      4. Промывайте дважды за 1× Wash Buffer в течение 2 минут на RT.
      5. Нанесите реагент Amplification 3 и инкубуйте 15 минут при 40 °C.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Все три шага усиления необходимы независимо от того, какие каналы (зонды) разрабатываются.
      6. Промывайте дважды за 1× Wash Buffer в течение 2 минут на RT.
    3. Развиваются пероксидаза конской редьки (HRP) и фторофор.
      1. Рассчитать объём необходимого флуорофора (обычно 100–200 мкл на слайд) и разбавить запасы флуорофора Opal.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемый диапазон разбавления для флуорофора составляет 1:300–1:1500. В этих экспериментах Opal Polaris 780 (реагент фторофора) разбавлялся в пропорции 1:500 в антителовом растворе, а все остальные красители — 1:1000 в буфере TSA. По возможности минимизировать освещение на стеклах.
      2. Примените реагент HRP-C1 и инкубуйте 15 минут при 40 °C.
      3. Промывайте дважды за 1× Wash Buffer в течение 2 минут на RT.
      4. Наносите 30–40 мкл опалового красителя (например, Opal 570 или Opal 690) на каждую секцию. Инкубировать 30 минут при 40 °C.
      5. Промывайте дважды за 1× Wash Buffer в течение 2 минут на RT.
      6. Нанесите блокатор HRP и инкубуйте 15 минут при 40 °C.
      7. Промывайте дважды за 1× Wash Buffer в течение 2 минут на RT.
      8. Примените реагент HRP-C2 или HRP-C3 и инкубируете при 40 °C в течение 15 минут.
      9. Промывайте дважды за 1× Wash Buffer в течение 2 минут на RT.
      10. Нанесите 30–40 мкл второго опалового красителя и инкубируете 30 минут при 40 °C.
      11. Промывайте дважды за 1× Wash Buffer в течение 2 минут на RT.
      12. Нанесите блокатор HRP и инкубуйте 15 минут при 40 °C.
      13. Промывайте дважды за 1× Wash Buffer в течение 2 минут на RT.
      14. Нанесите реагент HRP-C3 или HRP-C4 и инкубируете 15 минут при 40 °C.
      15. Промывайте дважды за 1× Wash Buffer в течение 2 минут на RT.
    4. Проведите амплификацию сигнала тирамида — дигоксигенин (TSA-DIG) и маркировку флуорофора (если применимо).
      1. Нанесите 30–40 мкл разбавлённого реагента TSA-DIG на секцию и инкубируете 30 минут при RT.
      2. Промывайте дважды за 1× Wash Buffer в течение 2 минут на RT.
      3. Нанесите блокирующий реагент и инкубуйте 15 минут при 40 °C.
      4. Промывайте дважды за 1× Wash Buffer в течение 2 минут на RT.
      5. Нанесите 30–40 мкл разбавлённого фторофорного реагента и инкубируете 30 минут при 40 °C.
      6. Промывайте дважды за 1× Wash Buffer в течение 2 минут на RT.
    5. Проведите контрокрашивание и монтаж.
      1. Нанесите 4′,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) и инкубировать 5 минут на RT в темноте.
      2. Промывайте DAPI и быстро закрепляйте секции с помощью крепления против фейда, аккуратно наносите защитное покрытие и избегайте попадания пузырьков воздуха. Выберите размер покрытия тканей, который соответствует размеру ткани.
      3. Сушите стекли в течение 2 часов на RT в темноте, затем держите затворы при 4 °C для длительного хранения.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресценция может сохраняться до года, если хранить при температуре 4 °C в темноте с правильным установкой против затухания.
    6. Проведите визуализацию.
      1. Проведите визуализацию с помощью многоканального флуоресцентного микроскопа с светодиодным освещением и фильтрами для спектрального разделения (рисунок 2A). Используйте длины волн возбуждения и излучения следующим образом: DAPI (353/465 нм), FITC (495/519 нм), Cy3 (548/561 нм), Cy5 (650/673 нм) и Cy7 (747/773 нм). Специфические фильтры минимизируют спектральные перекрытия и различают синие, зелёные, оранжевые, красные и ближние инфракрасные сигналы.
      2. Получайте все изображения с одинаковыми настройками экспозиции и освещения на разных образцах, обеспечивая согласованность и обеспечивая надёжный сравнительный анализ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Используя описанный протокол (рисунок 1), мы демонстрируем мультиплексное обнаружение флуоресцентных мРНК ISH транскриптов в целой голове мыши, сфотографированной на микроскопической платформе Zeiss (рисунок 2B). Конкретные виды изображений можно выбрать с помощью боковой вкладки (жёлтый блок), а несколько каналов можно визуализировать одновременно с помощью вкладки канала (красная коробка). Яркость, гамма и контрастность живого...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гибридизация in situ уже более четырёх десятилетий является основополагающим инструментом для изучения экспрессии генов и постоянно совершенствуется. Однако традиционные методы ISH часто ограничены низкой чувствительностью, высоким фоновым сигналом и длительными, трудоёмкими процедурами. Эти ограничения ограничили их более широкое применение, особенно в сложных краниофациальных тканях, где необходимо точное пространственное разрешение и обнаружение транскриптов с низким содержан...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликтов интересов, которые нужно раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Благодарим сотрудников ветеринарного хозяйства NICHD за помощь в уходе и разведении животных. Благодарим доктора Винсента Шрама из Центра микроскопии и визуализации (NIH/NICHD) за помощь в проведении флуоресцентной визуализации. Текущая рукопись поддерживается финансированием от NIH/NIDCR RO1DE033520 до M.B., Программы внутренних исследований, Национального института здоровья детей и развития человека (NICHD) для E.M., а также Национального института здоровья детей и развития человека (NICHD) исследовательского гранта ZIA HD009015. Фонд не участвовал в проектировании исследования, сборе и анализе данных, решении о публикации или подготовке рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 и раз; PBSТермо Фишер10010023Use  для проведения промывки во время рабочего процесса
20 с лишним раз; SSCТермо ФишерJ60839. K2Используйте для создания 1 и острые; Промывочный буфер
50 мл конических трубок (Ambion) без РНКТермо ФишерAM12502Используйте для хранения образцов в различных растворах
Продвинутый орбитальный шейкерVWR6683-470Используйте для встряхивания тканей в фиксационном растворе во время инкубации
Алкоголь — 70%, Fisherbrand, HistoPrepFisher ScientificHC-1000-1GLИспользуйте для очистки и дезинфекции всего рабочего пространства
Антитела разбавляется Akoya BiosciencesARD1001EAРазбавление для TSA-DIG
Автоматизированный процессор вакуумных тканейLeica BiosystemsASP300SИспользуйте для очистки обезвоживания, регидратации и инфильтрации образцов воском
Толщина стекла крышки 1,5, 25 мм x 25 мм Корнинг2850-25Использование для монтажа затвора в рабочем процессе Visium HD
Реагент для индивидуальной предварительной обработкиACD, Bio-Techne300040Оптимизировать проницаемость тканей и доступность целей
EDTAМиллипор Сигма03690Использование для декальцификации минерализованных тканей
Этанол 100%Группа AeroBase6505001050000Используйте для удаления ксилина и регидратации образцов во время обработки
Водяная ванна HistoCore Leica BiosystemsHIS2326Используйте для плавания секций под углом 40-43 градуса; C для удаления морщин на срезах FFPE 
Увлажняющая бумага HybEZACD, Bio-Techne310015Используйте внутри духовки HybEZ для поддержания влажности и предотвращения высыхания срезов тканей во время гибридизации
Духовка, противень и решётка HybEZACD, Bio-Techne310011, 310012, 310014Используйте для обеспечения контролируемой температуры, влажности и правильного расположения затвора во время этапов гибридизации и инкубации.
ImmEdge Гидрофобный барьерный загонВекторная лабораторияH-4000Используйте для проведения гидрофобных границ на стеклах, чтобы удержать реагенты в тканевой секции во время процедур окрашивания.
Одноразовые лопасти низкого профиля DB80LXLeica Biosystems14035843496Используйте разделение FFPE-блоков и bbsp;
Нейтральный буферизованный формалин 10%Azer ScientificNBF-4-GИспользуйте для фиксации тканей
ПАКЕТ РЕАГЕНТОВ OPAL 520Akoya Biosciences, Inc.FP1487001KTДля усиления и обнаружения сигналов целевых РНК с помощью флуоресцентной маркировки.
ПАКЕТ РЕАГЕНТОВ OPAL 570Akoya Biosciences, Inc.FP1488001KTДля усиления и обнаружения сигналов целевых РНК с помощью флуоресцентной маркировки.
ПАКЕТ РЕАГЕНТОВ OPAL 620Akoya Biosciences, Inc.FP1495001KTДля усиления и обнаружения сигналов целевых РНК с помощью флуоресцентной маркировки.
ПАКЕТ РЕАГЕНТОВ OPAL 690Akoya Biosciences, Inc.FP1497001KTДля усиления и обнаружения сигналов целевых РНК с помощью флуоресцентной маркировки.
Пакет реактивов Opal Polaris 780Akoya Biosciences, Inc.FP1501001KTДля усиления и обнаружения сигналов целевых РНК с помощью флуоресцентной маркировки.
Пролонг ДаймондТермо ФишерP36970Антифейдный монтажный медиум для сохранения флуоресцентных сигналов и защиты сигнала РНКскопа во время съёмки
RNAscope 4-Plex Вспомогательный набор СПЕЦИФИЧЕСКИЙ UIACD, Bio-Techne323120Дополнительные материалы, используемые в анализе RNAscope Multiplex Fluorescent v2
РНКскоп DAPIACD, Bio-Techne320858Флуоресцентное ядерное окрашивание, используемое в RNAscope для визуализации ядер клеток
Набор флуоресцентных реагентов RNAscope Multiplex v2ACD, Bio-Techne323100Для проведения мультиплексной флуоресцентной гибридизации in situ
RNAscope Multiplex TSA BufferACD, Bio-Techne322810Буфер, используемый в РНКскопе для разведения опальных красителей
Буферные реагенты RNAscope WashACD, Bio-Techne310091Используйте для промывания салфеток на стеклах во время анализа
Раствор для дезактивации RNaseZap RNaseZapТермо ФишерAM9782Используйте для очистки и удаления РНазы
Полуавтоматический вращательный микротомLeica BiosystemsRM2245Используйте разделение блоков FFPE, как указано в руководстве.
Слайд БрайтНаука об электронной микроскопии23401-01Для этапа депарафинизации перед обработкой в РНКскопе.
Подогреватель с крышкойПремьера XH2004Использование для инкубации затворов при разных температурах
Слайды Superfrost Plus Fisher Scientific12-550-15 Используйте для прикрепления секций для Vsium HD
Парапласт SurgipathLeica Biosystems39601006Используется для проведения инфильтрации тканей и вложения тканей
Тканевая культура DISH 100 x 20 мм 500/CSFisher Scientific877222Применение для сбора и вскрытия образцов в 1 и острое; PBS
КсилолFisher Scientific6.81001E+12Используется как очищающее средство для удаления спирта и повышения прозрачности тканей

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Artika, I. M., et al. Real-time polymerase chain reaction: current techniques, applications, and role in COVID-19 diagnosis. Genes. 13 (12), 2387(2022).
  2. Chu, Y. H., et al. In situ hybridization: introduction to techniques, applications and pitfalls in the performance and interpretation of assays. Semin Diagn Pathol. 36 (5), 336-341 (2019).
  3. Atout, S., et al. Evaluation of the suitability of RNAscope as a technique to measure gene expression in clinical diagnostics: a systematic review. Mol Diagn Ther. 26 (1), 19-37 (2022).
  4. Tseng, K. C., Crump, J. G. Craniofacial developmental biology in the single-cell era. Development. 150 (19), dev202077(2023).
  5. Kishi, J. Y., et al. SABER amplifies FISH: enhanced multiplexed imaging of RNA and DNA in cells and tissues. Nat Methods. 16 (6), 533-544 (2019).
  6. Lovely, A. M., et al. Hybridization chain reaction fluorescence in situ hybridization (HCR-FISH) in Ambystoma mexicanum tissue. Methods Mol Biol. 2562, 109-122 (2023).
  7. Raju, R., et al. Profiles of Wnt pathway gene expression during tooth morphogenesis. Front Physiol. 14, 1316635(2024).
  8. Piña, J. O., et al. Multimodal spatiotemporal transcriptomic resolution of embryonic palate osteogenesis. Nat Commun. 14, 5687(2023).
  9. Piña, J. O., et al. Spatial multi-omics reveals the role of the Wnt modulator Dkk2 in palatogenesis. J Dent Res. 103 (13), 1412-1420 (2024).
  10. Raj, A., et al. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
  11. Xia, C., et al. Spatial transcriptome profiling by MERFISH reveals subcellular RNA compartmentalization and cell cycle-dependent gene expression. Proc Natl Acad Sci USA. 116, 19490-19499 (2019).
  12. Lubeck, E., et al. Single-cell in situ RNA profiling by sequential hybridization. Nat Methods. 11, 360-361 (2014).
  13. Shah, S., et al. In situ transcription profiling of single cells reveals spatial organization of cells in the mouse hippocampus. Neuron. 92, 342-357 (2016).
  14. Gaspar, I., Ephrussi, A. Strength in numbers: quantitative single-molecule RNA detection assays. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (2), 135-150 (2015).
  15. Erben, L., Buonanno, A. Detection and quantification of multiple RNA sequences using emerging ultrasensitive fluorescent in situ hybridization techniques. Curr Protoc Neurosci. 87, e63(2019).
  16. Makareeva, E., et al. RNA-based bone histomorphometry: method and its application. J Bone Miner Res. 39 (2), 177-189 (2024).
  17. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  18. Monné Rodríguez, J. M., et al. Review of in situ hybridization techniques for drug research and development. Toxicol Pathol. 51 (3), 92-111 (2023).
  19. Colburn, M. E., et al. Effect of formalin-fixation and paraffin-embedded tissue storage times on RNAscope signal amplification. J Vet Diagn Invest. 36 (4), 498-505 (2024).
  20. Stumm, M. M., et al. Validation of a postfixation tissue storage and transport medium. Am J Clin Pathol. 137 (3), 429-436 (2012).
  21. RNAscope multiplex fluorescent reagent kit v2 user manual. , ACDbio. Available from: https://manuals.plus/m/0f24eea864dcf70b83735b261589c2e98f9c707b01c1c9c0455f349c8ab2eb0c (2025).
  22. Bankhead, P., et al. QuPath: open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7, 16878(2017).
  23. Hernández, S. C., et al. Single-cell and spatial transcriptomic profiling of cardiac fibroblasts following myocardial infarction. Sci Data. 13, 216(2026).
  24. Dropmann, A., et al. The TGF-β1 target WISP1 is highly expressed in liver cirrhosis and cirrhotic HCC microenvironment. Biochem Biophys Res Commun. 732, 150409(2024).
  25. Stolley, D. L., et al. RNA in situ hybridization with sequential protein immunofluorescence in tandem assay. J Vis Exp. (224), e68615(2025).
  26. Anderson, C. M., et al. Visualizing genetic variants, short targets, and point mutations in the morphological tissue context. J Vis Exp. (138), e58097(2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Multiplex Fluorescent HybridizationIn Situ HybridizationCraniofacial DevelopmentFFPE Mouse SamplesmRNA DetectionGene Expression LocalizationTissue ArchitectureCraniofacial TissuesCongenital Craniofacial DisordersSpatial Gene Expression

Похожие статьи