Методическая статья

Количественное определение фторидов в сыворотке крови, костях и зубах мышиной модели с использованием диффузии, облегченной гексаметилдисилоксаном, и измерений ионоселективным электродом

238 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71488

⸱

28 августа 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Oral Science and Translational Research, College of Dental Medicine, Nova Southeastern University, 2Department of Biological Sciences, Bauru School of Dentistry, University of São Paulo, 3Department of Restorative Dentistry and Endodontology, Osaka University Graduate School of Dentistry, 4Unit of Dentistry, Osaka University Hospital, 5Department of Biomedical Sciences, Adams School of Dentistry, The University of North Carolina at Chapel Hill

В этой статье

Краткое содержание

В данном протоколе описывается подготовка чашек для диффузии с использованием гексаметилдисилоксана (HMDS), за которой следуют измерения с помощью ион-селективного электрода для количественного определения массы ионов фтора в сыворотке крови, костях и зубах мышей. Этот метод представляет собой чувствительный подход на основе калибровки для оценки накопления фтора в биологических образцах.

Аннотация

Количественное определение уровней фторида в биологических тканях необходимо для понимания механизмов воздействия, метаболизма и токсичности фторидов. В данном протоколе описан чувствительный и воспроизводимый метод измерения массы ионов фторида в сыворотке крови, костной ткани и зубах с использованием диффузии, облегченной гексаметилдисилоксаном (HMDS), с последующим анализом с помощью ион-селективного электрода (ISE). Биологические образцы, включая сыворотку крови, бедренную кость и нижние резцы, собираются у мышей, подвергшихся контролируемому воздействию фторидов. Образцы костей и зубов озоливают, измельчают и гидратируют, в то время как сыворотку крови обрабатывают непосредственно. Каждый образец переносят в диффузионную чашку, содержащую ультрачистую воду, и герметично закрывают крышкой с прокладкой из вазелина, на которой помещены капли гидроксида натрия, служащие ловушками для фторида. Введение насыщенной HMDS серной кислоты инициирует высвобождение и диффузию фторида, что позволяет количественно улавливать освобожденные ионы фторида в ловушках. После ночной диффузии капли из ловушек фторида объединяют в один образец, подкисляют до требуемого диапазона pH и доводят до определенного объема для измерения с помощью ISE. Диффузионные чашки для калибровки, подготовленные с известными массами фторида, используются для построения стандартной кривой количественного определения, а образцы контроля качества позволяют проверить стабильность электрода. Репрезентативные результаты, полученные от подростковых и взрослых мышей, подвергавшихся воздействию 0 или 125 ppm фторида, демонстрируют способность метода обнаруживать возрастные и дозозависимые различия в уровнях фторида в сыворотке крови, костях и зубах. Данный протокол представляет собой надежный калибровочный подход для количественного определения фторида в различных биологических матрицах и хорошо подходит для исследований воздействия фторидов, их отложения в тканях и токсикологических последствий на моделях мышей. Ключевым преимуществом этого метода является возможность точного количественного определения фторида в крайне малых образцах, включая 3–5 mg золы, полученной из отдельных резцов мыши, поскольку процесс диффузии концентрирует весь высвобожденный фторид в измеряемом объеме пробы менее 100 µL.

Введение

Фторид представляет собой природный анион, и его оптимальный уровень эффективен для предотвращения кариеса зубов1,2,3,4,5. В Соединенных Штатах (США) фторирование муниципальных вод до уровня 0.7 ppm было внедрено в качестве стратегии общественного здравоохранения для снижения заболеваемости кариесом и укрепления здоровья полости рта6. Однако длительное употребление избыточного количества фторида может оказать неблагоприятное воздействие на множество тканей. Высокая экспозиция фторида нарушает формирование эмали7,8,9, изменяет процесс образования костной ткани10 и нарушает целостность скелета11.

На клеточном уровне воздействие фторидов вызывает ряд метаболических нарушений, включая окислительный стресс12, стресс эндоплазматического ретикулума13, эпигенетические модификации, изменяющие экспрессию генов14, и апоптоз амелобластов15,16,17,18. В глобальном масштабе повышенные концентрации фторидов в грунтовых водах (>1.5 ppm) представляют серьезную угрозу для здоровья. Согласно недавнему исследованию с использованием прогностического моделирования, примерно 180 миллионов человек во всем мире потенциально подвержены воздействию избыточного количества фторидов, при этом наибольшая нагрузка приходится на Азию и Африку1. Помимо питьевой воды, воздействие фторидов также происходит через пищу (например, морепродукты; ~1.9 ppm), напитки (например, чай; 0.5–6 ppm19) и стоматологические средства, такие как зубная паста20 (1,000–1,500 ppm).

Таким образом, понимание механизмов воздействия, метаболизма и депонирования фторидов в тканях имеет важное значение для оценки как их терапевтического эффекта, так и потенциальных токсикологических последствий. Точное количественное определение фторидов в биологических образцах, включая мочу, сыворотку крови, костную ткань и зубы, является критически важным компонентом этой работы. Однако проведение таких измерений представляет собой сложную аналитическую задачу из-за химических свойств фторидов и их высокого сродства к матриксам, богатым кальцием. Примерно 99% фторидов в организме сосредоточено в минерализованных тканях, таких как кости и зубы21. Для решения этих проблем был разработан ряд аналитических методов, включая потенциометрию с использованием ион-селективных электродов (ISE), ионную хроматографию, колориметрический анализ, титриметрические процедуры, а также ядерные методы или методы активации22. Среди них метод диффузии, облегченной гексаметилдисилоксаном (HMDS), в сочетании с измерением с помощью ион-селективного электрода на фторид-ионы стал одним из наиболее надежных и широко используемых подходов для биологических матриксов благодаря своей чувствительности, воспроизводимости и совместимости с различными типами образцов23,24,25,26,27,28,29.

Несмотря на доступность множества аналитических методов, каждый подход имеет свои ограничения, которые могут затруднить его использование в экспериментальных или клинических исследованиях. Ионная хроматография обеспечивает высокую чувствительность и селективность, но требует специализированного оборудования и длительной подготовки проб30,31. Колориметрические методы, такие как метод с использованием SPADNS (натриевая соль 2-(парасульфофенилазо)-1,8-дигидроксинафталин-3,6-дисульфоната), просты и недороги, однако они подвержены влиянию мутности и эндогенных хромофоров, что ограничивает их надежность при анализе сложных биологических образцов22,32,33. Титриметрические методы экономичны и просты в исполнении, но им не хватает чувствительности, необходимой для определения следовых количеств фторидов в большинстве биологических объектов34. Ядерные методы или методы на основе активации обладают исключительной чувствительностью, но требуют доступа к реакторам или ускорительным источникам нейтронов, что делает их непрактичными для рутинного лабораторного использования35. Напротив, диффузия, облегчаемая HMDS, с последующим измерением с помощью ISE, обеспечивает практический баланс чувствительности, стоимости и доступности, гарантируя при этом полное высвобождение фторидов как из мягких, так и из минерализованных тканей. Это особенно выгодно для исследований с использованием мелких животных, где количество доступных тканей ограничено, а минерализованные структуры, такие как резцы мыши, дают всего 3–5 mg золы на один зуб.

Способность метода диффузии-ИОС концентрировать весь высвобожденный фторид в небольшом определенном объеме позволяет проводить точный количественный анализ даже в крайне малых образцах. Это делает данный метод подходящим для токсикокинетических исследований, экспериментов по изучению зависимости «доза — ответ» и изучения метаболизма фторида на разных стадиях развития. Малые грызуны, в частности мыши линии C57BL/6J, широко используются в качестве животных моделей для изучения воздействия фторида7,9,12,29,36.

В данном протоколе авторы применяют метод диффузии с использованием гексаметилдисилазана (HMDS) с последующим измерением с помощью ион-селективного электрода на фторид-ионы для количественного определения содержания фтора в сыворотке крови, костной ткани и зубах мышей, подвергавшихся воздействию высокой дозы фтора (125 ppm), в сравнении с необработанным контролем. Далее авторы сравнивают накопление фтора у подростковых (6 недель на момент начала лечения) и взрослых (18 недель на момент начала лечения) мышей для оценки возрастных различий в метаболизме фтора и его отложении в тканях. Нижние резцы были выбраны в качестве репрезентативной зубной ткани, так как резцы грызунов прорезываются непрерывно и достигают стационарного баланса между прорезыванием и окклюзионным износом примерно к 7 неделям жизни. Такой характер непрерывного роста обеспечивает стабильный и доступный градиент развития эмали, что делает резцы мышей широко используемой и хорошо валидированной моделью для исследования формирования эмали и развития зубного флюороза.

Протокол

Все процедуры, описанные в данном протоколе, были выполнены в соответствии с руководствами и правилами использования позвоночных животных, утвержденными Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) в Nova Southeastern University (протокол № 2023.02.MSuz1), который аккредитован Ассоциацией по оценке и аккредитации ухода за лабораторными животными (AAALAC International). Вся работа с животными соответствовала руководству по уходу и использованию лабораторных животных и рекомендациям Американской ветеринарной медицинской ассоциации (AVMA) по эвтаназии животных. Все материалы, использованные в данном исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Животные, подготовка и введение фторида натрия в мышиной модели

  1. Животные: Распределите самцов мышей C57BL/6J по двум возрастным категориям: подростковые (6 недель на момент начала обработки) и взрослые (18 недель на момент начала обработки).
    1. Обеспечьте каждую группу либо деионизированной водой без фтора (0 ppm F⁻), либо питьевой водой с добавлением фторида натрия (125 ppm F⁻) в течение 6-недельного периода воздействия.
    2. Включите по пять животных в каждую возрастную группу и условие обработки (N = 5/группа).
    3. По окончании периода воздействия возьмите образцы сыворотки крови, бедренных костей и нижних резцов, затем подготовьте все собранные образцы для последующего анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образец: обработанный материал, такой как озоленная кость, озоленный зуб и сыворотка крови.
  2. Содержание и диета животных: Содержите мышей в стандартных лабораторных условиях со свободным доступом (ad libitum) к корму и воде.
    1. Обеспечьте безфтористый рацион, начиная за одну неделю до сбора образцов зубов, костей и сыворотки, чтобы минимизировать фоновые уровни фтора.
  3. Питьевая вода с фторидом натрия
    1. Для приготовления питьевой воды с добавлением фтора растворите фторид натрия (NaF) в деионизированной воде до достижения желаемой концентрации фтора (например, 125 ppm F⁻).
    2. Профильтруйте раствор через вакуумный фильтр 0.2 µm в автоклавированный флакон. Готовьте свежий раствор каждые 2 дня.
      ОСТОРОЖНО: NaF токсичен при проглатывании и может вызывать раздражение кожи и слизистой оболочки глаз. Работайте в вытяжном шкафу, используя лабораторный халат, нитриловые перчатки и защитные очки.
  4. Для контрольной воды без фтора профильтруйте деионизированную воду через вакуумный фильтр 0.2 µm в автоклавированный флакон. Готовьте свежую воду каждые 2 дня.
  5. Обеспечьте свободный доступ (ad libitum) к питьевой воде с фтором или без фтора в течение необходимого периода обработки фтором. Ежедневно контролируйте уровень воды и заменяйте флаконы каждые 2 дня.
  6. По окончании периода воздействия подвергните животных эвтаназии путем ингаляции диоксида углерода (CO₂) с последующим обезглавливанием. Процедуры эвтаназии проводились в соответствии с руководством AVMA по эвтаназии животных и были одобрены в рамках институционального протокола IACUC.
    ОСТОРОЖНО: CO2 является асфиксикантом. Проводите процедуры в хорошо проветриваемом помещении и убедитесь в исправности камеры. Избегайте прямого вдыхания газа.

2. Подготовка образцов для измерения содержания фторидов

  1. Сбор крови
    1. Эвтаназируйте мышей путем вдыхания CO₂ и немедленно соберите кровь с помощью терминальной пункции сердца, используя туберкулиновый шприц объемом 1 mL. Перенесите кровь в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 mL. Утилизируйте все использованные иглы и шприцы в утвержденный учреждением контейнер для острых отходов.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Иглы шприцев острые и могут вызвать колотые раны; обращайтесь с ними осторожно.
    2. Выдержите кровь в течение 30 min при комнатной температуре, затем центрифугируйте в течение 10 min при 2,000 × g.
    3. Перенесите супернатант (сыворотку) в микроцентрифужную пробирку и храните при −80 °C.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Морозильники сверхнизких температур представляют опасность обморожения. При работе с пробирками используйте теплоизоляционные перчатки и избегайте длительного контакта кожи с холодными поверхностями.
  2. Кости
    1. Извлечение бедренных костей: После эвтаназии препарируйте задние конечности в области тазобедренных суставов.
    2. Осторожно удалите все мягкие ткани с бедренных костей. Промойте ткани трижды деионизированной водой. Храните кости при -80 °C до дальнейшей обработки. Удаленные мягкие ткани и любые загрязненные материалы утилизируйте в поток биологических отходов учреждения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ткани можно фиксировать в 4% параформальдегиде с 2% сахарозой в течение 12–16 h для длительного хранения в 70% этаноле. Данная процедура фиксации не влияет на точность последующего количественного определения фторидов.
    3. Тщательно промойте кости деионизированной водой. Удалите избыток влаги безворсовой бумажной салфеткой.
    4. Перенесите кости в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 mL с открытыми крышками для обеспечения испарения и поместите их в сушильный шкаф при 60 °C на 12–16 h.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Сушильный шкаф может вызвать ожоги. При работе с образцами используйте термостойкие перчатки.
    5. Озоление костей: Перенесите высушенные кости в корундовые тигли. Поместите тигли в муфельную печь и нагрейте до 600 °C со скоростью 150 °C/h, затем выдержите в течение 6 h. Дайте печи остыть до температуры ниже 200 °C перед извлечением тиглей. Остатки фрагментов костей или загрязненные расходные материалы утилизируйте в поток биологических отходов учреждения.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Муфельная печь и тигли разогреваются до экстремальных температур, что представляет серьезную опасность ожогов. Всегда давайте печи остыть перед работой с тиглями. При извлечении тиглей надевайте лабораторный халат, защитные очки и термостойкие перчатки, а также используйте длинный пинцет, чтобы избежать прямого контакта с горячими поверхностями.
      КРИТИЧЕСКИЙ ЭТАП: Неполное озоление нарушит последующие анализы. Перед продолжением убедитесь, что костный материал достиг состояния полного окисления; любое остаточное содержание углерода будет препятствовать последующим измерениям.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Правильно озоленная кость должна иметь однородный светло-серый или белый цвет. Более темные частицы — особенно черные или напоминающие древесный уголь осадки — указывают на неполное сгорание. При наличии обесцвечивания увеличьте продолжительность озоления для полного удаления органического материала.
    6. Хранение озоленных костей: Сразу после озоления перенесите кости в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 mL. Герметизируйте пробирки Parafilm и храните их в вакуумном эксикаторе до использования.
  3. Зубы
    1. Извлечение нижних резцов: Сделайте горизонтальный разрез на уровне височно-нижнечелюстного сустава, чтобы отделить нижнюю челюсть от верхней.
    2. Выполните срединно-сагиттальные разрезы, чтобы разделить верхнюю и нижнюю челюсти на левую и правую половины.
    3. Промойте ткани трижды деионизированной водой и осторожно извлеките нижние резцы. Храните извлеченные резцы при -80 °C до дальнейшего использования. Удаленные мягкие ткани и любые загрязненные расходные материалы утилизируйте в поток биологических отходов учреждения.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Осторожно используйте острые инструменты для диссекции при выполнении разрезов в области височно-нижнечелюстного сустава и срединно-сагиттальной плоскости во избежание травм. Используйте соответствующие СИЗ, включая перчатки, лабораторный халат и защитные очки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ткани можно фиксировать в 4% параформальдегиде с 2% сахарозой в течение 12–16 h для длительного хранения в 70% этаноле. Данная процедура фиксации не влияет на точность последующего количественного определения фторидов.
    4. Подготовка зубов к озолению: Тщательно промойте зубы деионизированной водой и поместите их в 1% перекись водорода (H₂O₂) на 12–16 h. Утилизируйте отработанные растворы перекиси водорода как опасные химические отходы.
    5. Снова промойте деионизированной водой, быстро просушите безворсовой салфеткой и перенесите в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 mL с открытыми крышками. Поместите пробирки в сушильный шкаф при 60 °C на 12–16 h.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Перекись водорода является окислителем и может вызвать раздражение кожи и слизистой оболочки глаз. Работайте в вытяжном шкафу, используя лабораторный халат, нитриловые перчатки и защитные очки. Избегайте контакта с горючими материалами.
    6. Озоление зубов: Перенесите высушенные зубы в корундовые тигли и проведите озоление в муфельной печи при температуре выдержки 600 °C в течение 20 h, используя скорость нагрева 150 °C/h.
    7. Извлекайте тигли только после того, как печь остынет ниже 200 °C.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Муфельная печь и тигли разогреваются до экстремальных температур, что представляет серьезную опасность ожогов. Дайте печи остыть ниже 200 °C перед работой с тиглями. При извлечении тиглей надевайте лабораторный халат, защитные очки и термостойкие перчатки, а также используйте длинный пинцет, чтобы избежать прямого контакта с горячими поверхностями.
      КРИТИЧЕСКИЙ ЭТАП: Обеспечьте полное окисление; остаточный углерод будет препятствовать последующим анализам.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Озоленный зубной материал должен иметь однородный светло-серый или белый цвет. Повторите озоление, если остались черные осадки.
    8. Хранение образцов озоленных зубов: Сразу после озоления перенесите зубы в микроцентрифужные пробирки с круглым дном объемом 2 mL.
    9. Герметизируйте пробирки Parafilm и храните их в вакуумном эксикаторе до использования.

3. Подготовка чашек для диффузии с применением ГМДС

  1. Реагенты и материалы
    1. 6 N серная кислота: не менее чем за два дня до подготовки диффузионных чашек приготовьте запас 6 N серной кислоты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диффузионная чашка: герметичный сосуд, предназначенный для создания контролируемой закрытой среды, в которой компоненты, высвобождаемые из обработанного биологического материала, могут быть захвачены химической ловушкой, закрепленной на крышке. Герметичная конструкция предотвращает обмен с наружным воздухом и обеспечивает направление высвобождаемых аналитов к ловушке для последующего измерения.
    2. Поместите пластический стакан объемом 1 L с магнитным перемешивателем на магнитную мешалку и добавьте 416 mL ультрачистой воды.
    3. С помощью серологической пипетки объемом 50 mL медленно добавьте 84 mL 36 N H₂SO₄ в воду при постоянном перемешивании. Раствор нагреется; дайте ему остыть до комнатной температуры. Утилизируйте любые неиспользованные или отработанные растворы серной кислоты как опасные химические отходы в соответствии с правилами учреждения.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Серная кислота обладает сильным коррозионным действием. Работайте в вытяжном шкафу, используя кислотостойкие перчатки, лабораторный халат и защитные очки. В случае контакта немедленно промойте пораженное место большим количеством воды.
    4. 6 N серная кислота, насыщенная HMDS: перенесите 6 N серную кислоту в делительную воронку объемом 2 L и добавьте 15 mL гексаметилдисилоксана (HMDS).
    5. Убедитесь, что пробка и кран плотно закрыты, держите делительную воронку горизонтально и энергично встряхивайте до появления мелких капель HMDS.
    6. Откройте пробку для выпуска образующегося газа и повторите этот процесс еще два раза.
    7. Оставьте пробку приоткрытой на несколько часов. Храните делительную воронку с 6 N серной кислотой, насыщенной HMDS, в штативе внутри химического вытяжного шкафа. Утилизируйте серную кислоту, содержащую HMDS, и загрязненные материалы как опасные химические отходы.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: HMDS легковоспламеняем и токсичен при вдыхании. Работайте в вытяжном шкафу, используя лабораторный халат, перчатки и защитные очки. Держите вдали от источников возгорания.
    8. 0,05 N гидроксид натрия: растворите 1 g гранул NaOH в 25 mL ультрачистой воды для приготовления основного раствора 1 N.
    9. Смешайте 2 mL основного раствора 1 N NaOH с 38 mL ультрачистой воды для получения 0,05 N раствора NaOH.
    10. Разлейте 0,05 N NaOH по микроцентрифужным пробиркам объемом 1,5 mL для однократного использования, загерметизируйте крышки Parafilm и храните пробирки в вакуумном эксикаторе для минимизации абсорбции CO₂. Утилизируйте неиспользованные или отработанные растворы гидроксида натрия как опасные химические отходы.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Гидроксид натрия обладает сильным едким действием и может вызвать серьезные ожоги. Используйте лабораторный халат, перчатки и защитные очки. Обращайтесь с растворами осторожно, чтобы избежать брызг.
    11. 0,2 N уксусная кислота: добавьте 575 µL ледяной уксусной кислоты в ультрачистую воду и доведите общий объем до 50 mL для приготовления 0,2 N уксусной кислоты. Утилизируйте растворы уксусной кислоты как опасные химические отходы.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Уксусная кислота обладает коррозионным действием и может раздражать кожу, глаза и дыхательные пути. Работайте в химическом вытяжном шкафу, используя лабораторный халат, перчатки и защитные очки.
    12. Вазелин: расплавьте примерно 100 g вазелина при 60 °C в oven. Наберите жидкий вазелин в шприцы объемом 10 mL и дайте ему остыть и затвердеть. Шприцы, заполненные вазелином, могут храниться при комнатной температуре в течение нескольких недель.
    13. Чашка Петри: для подготовки диффузионных чашек используйте необработанные чашки Петри размером 60 × 15 mm.
    14. Проплавьте небольшое отверстие в крышке чашки Петри с помощью нагретой иглы шприца 18-G.
    15. Нанесите непрерывный слой вазелина на внутренний край крышки с помощью шприца объемом 10 mL, оснащенного тупоконечной иглой 14 G. Утилизируйте все использованные иглы в утвержденный контейнер для острых отходов учреждения.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Иглы шприцев острые и могут вызвать проколы. Обращайтесь с ними осторожно и утилизируйте в соответствующие контейнеры для острых предметов. При нагревании игл используйте термостойкие перчатки и средства защиты глаз для предотвращения ожогов.
    16. Основные растворы NaF для калибровочных диффузионных чашек. Растворите 4,19 g NaF в 1 L ультрачистой воды для приготовления основного раствора 100 mM. Приготовьте основные растворы 10 mM, 100 µM и 10 µM путем последовательных разведений 1:10 раствора 100 mM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Один моль NaF дает 19 g F⁻; следовательно, 1 µL 10 µM NaF содержит 0,19 ng F⁻, а 1 µL 10 mM NaF содержит 190 ng F⁻.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Калибровочные диффузионные чашки: диффузионные чашки, используемые специально для калибровки с известной массой ионов фтора (F¯).
  2. Приготовление диффузионных чашек для конкретных образцов
    1. Диффузионная чашка для сыворотки: внесите пипеткой 3 mL ультрачистой воды на дно чашки Петри и добавьте 75 µL сыворотки. Утилизируйте все материалы, загрязненные сывороткой, в поток биологических отходов учреждения. Перейдите к шагу 3.4.
    2. Диффузионная чашка для кости
      1. Пульверизация костного пепла: с помощью микрошпателя разотрите озоленные кости в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 mL до состояния мелкого порошка. Приступайте к обработке пульверизированного костного пепла немедленно. Утилизируйте расходные материалы, загрязненные костным пеплом, в поток химических отходов учреждения.
      2. Взвешивание и гидратация костного пепла
        1. Поместите пустое дно чашки Петри на чашу аналитических весов с дискретностью не менее 0,1 mg.
        2. Перенесите измельченный костный пепел из микроцентрифужной пробирки объемом 2 mL в небольшую фарфоровую чашку, чтобы минимизировать статический заряд и предотвратить дисперсию порошка.
        3. С помощью микрошпателя добавьте в чашку примерно 5 mg костного пепла и немедленно залейте порошок 3 mL ультрачистой воды перед тем, как снять чашку с аналитических весов, чтобы избежать разлета пепла.
        4. Запишите точный вес каждого образца костного пепла. Перейдите к шагу 3.4.
    3. Диффузионная чашка для зуба
      1. Измельчение озоленных зубов
        1. Перенесите озоленные резцы в микроцентрифужные пробирки с круглым дном объемом 2 mL и добавьте в каждую пробирку стальную бусину диаметром 5 mm. Закройте пробирки и загерметизируйте крышки Parafilm.
        2. Измельчите озоленные резцы в гомогенизаторе с бусинами при 2 500 rpm в течение 10 s. Приступайте к обработке измельченных зубов немедленно.
      2. Взвешивание и гидратация озоленных зубов
        1. Высыпьте все содержимое пробирки, включая стальную бусину, на дно диффузионной чашки, установленной на чаше аналитических весов. Утилизируйте загрязненные расходные материалы, содержащие зубной пепел, в поток химических отходов учреждения.
        2. Извлеките стальную бусину из чашки и запишите точный вес зубного пепла (обычно 3–4 mg на один нижний резец).
        3. Немедленно добавьте 3 mL ультрачистой воды, чтобы покрыть зубной пепел, перед тем как снять чашку с весов, чтобы предотвратить разлет пепла из-за статического разряда. Перейдите к шагу 3.4.
  3. Диффузионные чашки для калибровки и контроля качества
    1. Параллельно с диффузионными чашками для образцов приготовьте два набора калибровочных диффузионных чашек для калибровки по 5–6 точкам и один идентичный набор диффузионных чашек для контроля качества, включая холостую пробу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диффузионные чашки для контроля качества: готовятся идентично калибровочным, но используются периодически для проверки стабильности электрода и обеспечения согласованности результатов измерений.
    2. Внесите пипеткой 3 mL ультрачистой воды в каждую из 11 или 13 чашек Петри и добавьте основной раствор NaF так, чтобы охватить ожидаемый диапазон массы F¯ в образцах. Перейдите к шагу 3.4 для завершения сборки диффузионной чашки37.
  4. Завершение сборки диффузионной чашки
    1. Для создания осадка ловушки фторидов на внутреннюю поверхность крышки чашки Петри тремя каплями вносят 50 µl 0,05 N NaOH, значительно удаляя их от края крышки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ловушка фторидов (F¯-ловушка): компонент диффузионных чашек, который захватывает F¯, а именно гидроксид натрия (NaOH).
    2. Переверните крышку, не нарушая целостности капель NaOH, и плотно прижмите ее к дну чашки с помощью вазелина.
    3. Для приготовления 3 N раствора серной кислоты, насыщенной HMDS, смешайте равные объемы 6 N серной кислоты, насыщенной HMDS, и ультрачистой воды. Готовьте свежий раствор непосредственно перед использованием, так как он не подлежит хранению.
    4. Введите 3 mL приготовленной 3 N серной кислоты, насыщенной HMDS, через отверстие в крышке в воду на дне диффузионной чашки с помощью шприца объемом 10 ml, оснащенного иглой 20 G. Будьте осторожны, чтобы при введении или извлечении иглы шприца кислота не попала на внутреннюю поверхность крышки.
    5. Диффузия фтора, облегченная HMDS: немедленно загерметизируйте отверстие для инъекции каплей вазелина, полностью закрывающей отверстие, и поместите диффузионные чашки на встряхиватель-балансир, установленный на низкую скорость. Инкубируйте в течение ночи при комнатной температуре (Рисунок 1).

Статическое равновесие; схема чашки Петри; эксперимент с костной золой, водой и серной кислотой, насыщенной HMDS.
Рисунок 1: Схема диффузионной чашки для экстракции и улавливания фторидов из кости. На рисунке 1 представлена конструкция диффузионной чашки, собранной в необработанной чашке Петри размером 60 × 15 мм. В крышке имеется небольшое инъекционное отверстие, загерметизированное шариком вазелина. На внутренней поверхности крышки расположены три капли NaOH, служащие ловушками для ионов фтора (F⁻), которые подвешены к крышке во время диффузии. Крышка герметично прикреплена к основанию чашки с помощью вазелина. В нижней части чашки Петри находятся ультрачистая вода, серная кислота, насыщенная гексаметилдисилоксаном (HMDS), и костная зола, которые совместно создают реакционную среду для высвобождения и последующего улавливания фторидов. Данный рисунок был создан авторами с помощью BioRender и распространяется по лицензии CC BY. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

4. Измерение содержания фторидов с помощью ИСЭ

  1. Подготовка ион-селективного электрода (ISE)
    1. Заполните двухканальный фторид-селективный электрод соответствующим заполняющим раствором, подключите его к потенциометру и закрепите в держателе для электродов.
    2. Поместите необработанную чашку Петри на ножничный подъемник под сенсорную поверхность электрода, убедившись, что сенсорная поверхность параллельна дну чашки Петри, и поднимите стол подъемника так, чтобы чашка Петри почти касалась электрода (Рисунок 2).
  2. Подготовка образцов к измерению
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы: в данном протоколе под образцами понимаются только конечные продукты, измеряемые с помощью ион-селективного электрода (ISE), которые представляют собой ловушку F¯ после диффузии, впоследствии смешанную с уксусной кислотой и водой. 
    1. Для доведения pH образца до 5 снимите диффузионную чашку с качалки и после периода инкубации осторожно поднимите крышку, нарушив герметизацию вазелином. Переверните крышку на плоскую поверхность, следя за тем, чтобы три капли ловушки F¯ оставались неподвижными.
    2. С помощью дозатора P20 добавьте 15–20 µL 0,2 N уксусной кислоты в одну каплю, затем, не меняя наконечника дозатора, объедините все три капли в одну.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы с высокой концентрацией F¯, как правило, имеют более низкий начальный pH и, следовательно, требуют меньшего количества 0,2 N уксусной кислоты для доведения pH до 5 по сравнению с образцами с низким содержанием F¯. Поскольку объем образца, оставшийся после регистрации электродного потенциала (шаг 5.3), минимален, используйте любой имеющийся остаток образца для проверки pH с помощью индикаторной бумаги.
    3. Для корректировки объема образца установите дозатор P100 на 75 µL, аспирируйте весь объем ловушки F¯, не допуская попадания воздуха, и доведите объем образца ровно до 75 µL, используя сверхчистую воду.
    4. Выполните этот шаг осторожно, чтобы обеспечить точный объем для расчета концентрации фторида. Оставьте образец в наконечнике дозатора и немедленно переходите к шагу 4.3.
  3. Измерение исследуемых образцов, калибровочных и контрольных образцов
    1. Чтобы измерить электродный потенциал образца, внесите его в пространство между сенсорной поверхностью фторид-селективного электрода и чашкой Петри. Убедитесь, что вся сенсорная поверхность электрода полностью погружена в жидкость, не касаясь при этом дна чашки Петри. Дождитесь стабилизации показаний потенциометра и запишите потенциал (mV), отображаемый ISE.
    2. Постройте калибровочный график, последовательно измеряя первый набор калибровочных стандартов, начиная с самой низкой концентрации F¯ и переходя к самой высокой.
      1. Постройте зависимость электродного потенциала (mV) от логарифма F¯ (ng) для создания калибровочной кривой (Рисунок 3). Примените экспоненциальную регрессию для получения уравнения стандартной кривой и коэффициента детерминации (R2). Принимайте калибровочные кривые только при R2 ≥ 0,99.
    3. Измерьте каждый исследуемый образец и запишите электродный потенциал (mV).
    4. Для мониторинга стабильности электрода и выявления возможного дрейфа анализа периодически измеряйте образцы контроля качества на протяжении каждого аналитического цикла.
      1. Сравните значения образцов контроля качества непосредственно с соответствующими калибровочными образцами и подтвердите их соответствие в пределах примерно 5%, чтобы убедиться в стабильной работе электрода с течением времени.
      2. Периодически измеряйте холостую диффузионную чашку, чтобы подтвердить отсутствие загрязнения фторидами при работе с образцами и в процессе диффузии.
  4. Для расчета массы F¯ (ng) в каждом исследуемом образце используйте уравнение стандартной кривой. Затем разделите эту массу на объем (µL) сыворотки или массу (mg) золы кости или зуба, добавленную в диффузионную чашку.
    1. Пример расчета концентрации F¯ в золе кости (ng/mg)
      1. Масса золы кости, добавленная в диффузионную чашку: 5,1 mg; Электродный потенциал образца объемом 75 µL: –31,6 mV
      2. Шаг 1: Расчет массы фторида с использованием калибровочного уравнения
        1. Масса F⁻ (ng) = 3505,4 x e(-0,043x-31,6)
        2. Масса F⁻ (ng) = 13 641 ng
      3. Шаг 2: Расчет концентрации фторида в золе кости
        1. Концентрация F⁻ = 13 641 ng / 5,1 mg
        2. Концентрация F⁻ = 2 675 ng / mg (ppm)

Установка ион-селективного электрода (ISE) с потенциометром и образцом на ножничном домкрате для измерения ионов.
Рисунок 2: Схема установки для измерений с помощью ISE. На рисунке 2 показана конфигурация, используемая для измерения ионов фтора с помощью двухканального ион-селективного электрода (ISE). Чашка Петри размещена на ножничном домкрате для точной регулировки ее высоты относительно электрода. ISE подключен к потенциометру и ориентирован таким образом, чтобы его чувствительная поверхность была параллельна плоскости чашки Петри с соблюдением расстояния примерно 1–2 mm. После установки зазора в промежуток между чувствительной поверхностью и чашкой Петри пипетируется небольшой объем образца (75 µL), чтобы образец полностью покрывал чувствительную область электрода во время измерения. Данный рисунок был создан авторами с помощью Biorender и распространяется по лицензии CC BY. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Калибровочная кривая иона фтора; потенциал электрода в зависимости от концентрации; результат линейного регрессионного анализа.
Рисунок 3: Калибровочная кривая и соответствующая калибровочная таблица для количественного определения массы ионов фтора в образцах тканей зуба. Верхняя панель: Пример калибровочной кривой, используемой для определения массы ионов фтора в образцах тканей зуба. Ось x показывает потенциал электрода (mV, линейный масштаб), а ось y — соответствующую массу ионов фтора (ng F⁻, логарифмический масштаб). Измеренные калибровочные точки нанесены в виде сплошной линии, а аппроксимирующая экспоненциальная регрессия показана пунктирной линией. Во врезке приведены уравнение стандартной кривой и коэффициент детерминации (R2 = 0.99). Нижняя панель: Таблица, содержащая численные значения, использованные для построения калибровочной кривой. В первой строке перечислены пять значений потенциалов электрода (mV), зафиксированных для калибровочных образцов. Во второй строке указаны соответствующие массы ионов фтора (ng F⁻) для каждого калибровочного образца. В третьей строке приведены объемы (µL) исходного раствора NaF 10 mM, добавленные в калибровочные диффузионные чашки; эта добавленная масса ионов фтора эквивалентна массе, удерживаемой в каждом калибровочном образце после диффузии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Результаты

Для демонстрации применения данного протокола для измерения концентрации фторида (F-) в биологических материалах были подготовлены образцы сыворотки крови, костной ткани и нижних резцов, полученные от мышей, подвергавшихся контролируемому воздействию фторидов. Самцов мышей линии C57BL/6J разделили на две возрастные группы: подростков (6 недель) и взрослых особей (18 недель), которым в течение 6-недельного периода воздействия предоставляли либо деионизированную воду без фтора (0 ppm F⁻), либо питьевую воду с добавлением фторида натрия (125 ppm F⁻). В каждой возрастной группе и при каждом варианте обработки было по пять животных. По окончании периода воздействия были отобраны пробы сыворотки, бедренные кости и нижние резцы, после чего образцы были подготовлены и проанализированы в соответствии с протоколом. Репрезентативные значения концентрации фторида, измеренные в сыворотке, костной ткани и зубах, представлены ниже.

Влияние фторида на уровни F⁻; сыворотка, бедренная кость, резцы; данные столбчатой диаграммы; сравнение присутствия фторида.
Рисунок 4: Концентрации фторида, измеренные в сыворотке крови, бедренной кости и нижнечелюстных резцах. Самцов мышей C57BL/6J разделили на две возрастные категории: подростков (6 недель, пустой столбец) и взрослых особей (18 недель, закрашенный столбец), и обеспечили их либо деионизированной водой без фтора (0 ppm F⁻), либо питьевой водой с добавлением фторида натрия (125 ppm F⁻) в течение 6-недельного периода воздействия. По окончании периода воздействия уровни фторида были измерены в (A) сыворотке крови, (B) бедренной кости и (C) нижнечелюстных резцах животных из тех же групп лечения. Значения в сыворотке ниже предела обнаружения (<0.02 ppm) были нанесены на график для визуализации, но исключены из статистического анализа. Данные представлены как средние значения ± SD. Сравнения между группами подростков и взрослых особей проводились с использованием U-критерия Манна — Уитни с поправкой Бонферрони — Данна для множественных сравнений. *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5 в группе). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Концентрации фторида в сыворотке крови
В обеих группах (подростковой и взрослой), получавших 0 ppm фторида, концентрации фторида в сыворотке крови были ниже предела обнаружения ион-селективного электрода (<0.02 ppm). В группах, получавших 125 ppm, концентрация фторида в сыворотке крови увеличилась до 0.3 ± 0.2 ppm в подростковой группе и до 0.7 ± 0.2 ppm во взрослой группе (p = 0.06). Сравнение между подростковой и взрослой группами, получавшими 125 ppm, проводилось с использованием U-критерия Манна-Уитни с поправкой Бонферрони-Данна для множественных сравнений. *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5/группа). Группы, получавшие 0 ppm, были исключены из статистического анализа. (Рисунок 4A, Таблица 1).

Концентрация фторидов в бедренной кости
В группах с содержанием 0 ppm концентрация фторидов в бедренной кости была значительно ниже у подростков (292 ± 39 ppm) по сравнению со взрослыми животными (896 ± 55 ppm) (p < 0,01). Напротив, в группах с содержанием 125 ppm концентрация фторидов у подростков (4 108 ± 482 ppm) была значительно выше, чем у взрослых животных (2 966 ± 612 ppm) (p = 0,04). Сравнение между группами подростков и взрослых животных проводилось с помощью U-критерия Манна-Уитни с поправкой Бонферрони-Данна для множественных сравнений. *p < 0,05, **p < 0,01 (N = 5/группа). (Рисунок 4B, Таблица 1). На Рисунке 5A показано кратное изменение содержания фторидов в бедренной кости при воздействии 0 ppm и 125 ppm для каждой возрастной группы. У подростков наблюдалось 14-кратное увеличение уровня фторидов при 125 ppm, тогда как у взрослых мышей увеличение составило 3 раза.

Концентрация фторидов в нижних резцах
В группах с 0 ppm концентрация фторидов в нижних резцах была значительно ниже у подростков (35 ± 4 ppm) по сравнению со взрослыми животными (123 ± 23 ppm) (p = 0,03). В группах, получавших 125 ppm, концентрация фторидов в резцах увеличилась до 5641 ± 955 ppm у подростков и 4392 ± 1694 ppm у взрослых животных. Сравнение групп подростков и взрослых животных проводили с помощью U-критерия Манна — Уитни с поправкой Бонферрони — Данна для множественных сравнений. *p < 0,05, **p < 0,01 (N = 5/группа). (Рисунок 4C, Таблица 1). Хотя абсолютные концентрации фторидов при 125 ppm существенно не различались между возрастными группами, кратность изменения при переходе от 0 ppm к 125 ppm была значительно выше у подростков (161-кратное увеличение), чем у взрослых мышей (36-кратное увеличение) (Рисунок 5B).

Влияние фторида на костную ткань: столбчатая диаграмма, показывающая кратность изменения содержания фторида в бедренной кости и резце у молодых и взрослых особей.
Рисунок 5: У молодых мышей наблюдается более выраженное увеличение кратности накопления фторида в костях и резцах, чем у взрослых мышей. Кратность изменения концентрации фторида при переходе от контроля (0 ppm) к воздействию фторида в концентрации 125 ppm у молодых (открытый столбец) и взрослых (закрашенный столбец) мышей. (A) Бедренная кость и (B) нижний резец из одних и тех же групп воздействия. Данные представлены как средние значения ± SD. Сравнения между группами молодых и взрослых животных проводились с использованием непарного t-критерия. * p < 0.05, (N = 5/группа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

ОбразецСыворотка кровиБедренная костьНижний резец
Возрастная группаПодростокЗрелыйПодростокЗрелыйПодростокЗрелый
Опытная группа0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm
< 0.020.2< 0.020.8324457693330813748241613229
< 0.020.1< 0.020.8229377892433263954511272654
< 0.020.7< 0.021.0300468387737133155441126997
< 0.020.4< 0.020.5323383280725193551141034169
< 0.020.3< 0.020.528336699372192Поскольку исходный текст не был предоставлен, пожалуйста, введите текст, который необходимо перевести.72711114909
Среднее значение< 0.020.3< 0.020.7292410889629663556411234392
СД (стандартное отклонение)Нет данных0.2Нет данных0.239482556123955231694

Таблица 1: Индивидуальные измерения содержания фторида в сыворотке крови, бедренной кости и нижних резцах. В Таблице 1 приведены индивидуальные концентрации фторида (ppm F⁻), измеренные в образцах сыворотки крови, бедренной кости и нижних резцов подростковых и взрослых мышей, подвергавшихся воздействию 0 ppm или 125 ppm фторида. Для каждого типа ткани данные представлены в столбцах, соответствующих четырем группам лечения: подростки 0 ppm, подростки 125 ppm, взрослые 0 ppm и взрослые 125 ppm. Каждый столбец содержит пять индивидуальных зарегистрированных значений (N = 5), за которыми следуют рассчитанное среднее значение и стандартное отклонение (SD). В группе сыворотки крови подростков 0 ppm все зарегистрированные значения были ниже предела обнаружения ион-селективного электрода (<0.02 ppm). В таблице представлены исходные числовые данные, лежащие в основе обобщающих значений и статистических сравнений, показанных на Рисунке 4.

Обсуждение

Измерения содержания фторида проводили с помощью ион-селективного электрода (ISE), селективного к фториду, который содержит кристаллическую мембрану из фторида лантана (LaF₃)38,39. Эта мембрана образует высокостабильные связи La–F, что обеспечивает выраженное предпочтение ионов фторида перед другими галогенидами. Согласно общепринятой электрохимической литературе и спецификациям производителя, мембрана LaF₃ обладает очень низкими коэффициентами селективности по отношению к хлориду, что указывает на то, что ионы хлорида не создают измеримых помех в условиях, используемых в данном протоколе. Несмотря на естественное присутствие хлорида в зубах и костях, его активность не влияет на потенциал электрода, и регистрируемый сигнал отражает именно активность фторида. Нижний предел обнаружения 0,02 ppm соответствует подтвержденному производителем минимальному количественно определяемому пределу концентрации для фторид-селективного электрода Orion. Этот предел отражает самую низкую концентрацию фторида, при которой электрод сохраняет стабильный нернстовский отклик и линейную зависимость от калибровочной кривой. Поскольку предел обнаружения определяется характеристиками мембраны электрода и подтвержден производителем, дополнительного экспериментального определения для данного протокола не потребовалось; однако в отношении верхнего диапазона обнаружения авторы заметили, что массы фторида, превышающие примерно 38 000 ng в ловушке с 50 µL NaOH, приводили к нелинейному отклику электрода, что указывает на потерю достоверности калибровочной кривой при очень высоких нагрузках фторида. Эта нелинейность, вероятно, обусловлена превышением оптимальной ионной силы и диапазона активности для электрода в данных экспериментальных условиях, а не внутренним верхним пределом самого ISE. Для образцов, в которых ожидается содержание фторида выше этого порога, рекомендуется увеличить объем ловушки NaOH, чтобы измерения оставались в пределах линейного динамического диапазона электрода.

Данный фактор следует учитывать при применении протокола к образцам с необычно высоким содержанием фторидов. Поскольку этап диффузии расходует весь объем образца, выполнение повторных измерений и экспериментов по методу добавок с определением степени извлечения на биологических образцах было невозможно. Для обеспечения аналитической точности и прецизионности в каждую серию измерений включали стандарты контроля качества (КК) с известными концентрациями фторидов. Эти стандарты КК обрабатывали и измеряли идентично экспериментальным образцам. Во всех сериях измеренные концентрации фторидов в стандартах КК стабильно находились в пределах 5% от их ожидаемых значений. Для каждой серии из 10–20 исследуемых образцов параллельно готовили два независимых набора по 5–6 калибровочных образцов, а перед каждой сессией измерений регистрировали калибровочную кривую. Диапазон калибровки корректировали для каждого запуска таким образом, чтобы он соответствовал ожидаемой массе фторидов в исследуемых образцах, которая зависела от типа образца, массы материала, помещенного в диффузионную чашку, а также от группы лечения и возраста животного. Для измерений в сыворотке крови калибровочные стандарты соответствовали концентрациям фторидов в образце примерно 0.06–1.20 ppm. Для измерений в костной ткани и зубах калибровочные стандарты соответствовали концентрациям фторидов в образце примерно 19–7,600 ppm.

Данный протокол описывает чувствительный и воспроизводимый подход к количественному определению массы ионов фтора в сыворотке крови, костях и зубах с использованием диффузии, облегчаемой гексаметилдисилоксаном, с последующим анализом методом ионоселективного электрода (ISE). Метод надежно фиксирует фтор, высвобождаемый из различных биологических матриц, и позволяет количественно оценить накопление фтора после контролируемого воздействия. Репрезентативные результаты, полученные на подростковых и взрослых мышах, демонстрируют четкие возрастные и дозозависимые различия в отложении фтора в тканях, что подчеркивает полезность данного подхода для изучения метаболизма и токсикокинетики фтора in vivo.

Ключевым преимуществом данного протокола является использование диффузионных чашек, которые физически отделяют реакцию высвобождения фторида от среды его улавливания. Конструкция с герметизацией вазелином минимизирует газообмен с атмосферой и обеспечивает эффективный захват высвобожденных ионов фторида каплями гидроксида натрия на крышке. Серная кислота, насыщенная HMDS, создает сильную и стабильную движущую силу для высвобождения фторида из минерализованных тканей, включая сильно кальцинированные структуры, такие как кости и зубы. Последующее измерение с помощью ион-селективного электрода (ISE), откалиброванного по соответствующим диффузионным стандартам, позволяет проводить точный количественный анализ в широком динамическом диапазоне. Еще одним преимуществом данного подхода является возможность количественного определения фторида в крайне малых биологических образцах. Минерализованные ткани мышей, в частности нижние резцы, дают всего 3–5 mg золы на один зуб. Традиционные аналитические методы часто требуют большей массы образца или более высокого содержания фторида для обеспечения надежного обнаружения. В отличие от них, конструкция на основе диффузии концентрирует весь фторид, высвобожденный из всего образца, в небольшом определенном объеме, что позволяет проводить точный количественный анализ даже в крошечных образцах с низкой абсолютной массой фторида. Эта особенность особенно ценна для исследований с использованием мелких животных, при ограниченном наличии тканей или при анализе микродиссецированных минерализованных структур.

Основным ограничением данного метода является предел обнаружения ион-селективного электрода (ISE), использованного в этом исследовании (0.02 ppm). Образцы сыворотки контрольных животных, не получавших фториды, часто оказывались ниже этого порога, что делало невозможным количественное определение крайне низких концентраций фторидов. При измерении следовых концентраций, близких к пределу обнаружения или ниже его, может потребоваться увеличение массы или объема образца, помещаемого в диффузионную чашку (при наличии возможности), или использование альтернативных аналитических методов. Кроме того, метод требует диффузии в течение ночи и осторожного обращения с коррозионно-активными реагентами, что может ограничить пропускную способность при проведении масштабных исследований. Хотя метод ISE обеспечивает чувствительное количественное определение общего содержания фторидов, он не позволяет оценить их пространственное распределение в тканях. Для визуализации и картирования распределения фторидов в микро- и макромасштабе могут быть применены дополнительные подходы, такие как сканирующая электронная микроскопия в сочетании с энергодисперсионной рентгеновской спектроскопией (SEM-EDX) или метод гамма-излучения, индуцированного частицами (PIGE). Эти методы визуализации позволяют оценить локальное накопление фторидов в минерализованных или мягких тканях, дополняя таким образом измерения методом ISE и обеспечивая более комплексную оценку содержания фторидов в тканях.

На точность и достоверность диффузии и измерения фторида в данном протоколе могут влиять несколько повторяющихся технических факторов; наши наблюдения показывают, что подготовка калибровки, герметизация диффузионной чашки, контроль pH, работа электрода и обращение с образцами в совокупности определяют качество данных. Возможными причинами нелинейности калибровочной кривой (R2 < 0,99) или получения значений для образцов тканей вне ожидаемого диапазона являются ошибки в расчете объема стокового раствора NaF, добавляемого в диффузионную чашку, или ошибки пипетирования при приготовлении калибровочных стандартов. Рекомендуемое действие: готовьте не менее двух независимых наборов калибровочных образцов для каждого цикла, чтобы в случае выхода одной калибровочной кривой за пределы ожидаемого диапазона был доступен резервный набор. Неполная герметизация диффузионной чашки также может привести к потере фторида в процессе диффузии, что вызовет искусственно заниженные показания. Обычно это происходит при недостаточном нанесении вазелина на ободок крышки диффузионной чашки. Рекомендуемое действие: нанесите достаточное количество вазелинового желе на ободок крышки диффузионной чашки и плотно прижмите ее для обеспечения полной герметичности. Ошибки пипетирования при добавлении раствора уксусной кислоты в ловушку с NaOH могут сместить pH образца за пределы оптимального диапазона pH 5,0, что приведет к неточному определению степени извлечения фторида. Рекомендуемое действие: проверяйте pH каждого образца с помощью pH-бумаги и утилизируйте любой образец, значение pH которого выходит за пределы pH 5. Калибровочные образцы также могут выходить за пределы допустимых диапазонов регистрации фторид-селективного электрода. Концентрации ниже 0,02 ppm находятся ниже предела обнаружения электрода. Рекомендуемое действие: не используйте калибровочные образцы с содержанием фторида менее 0,02 ppm. И наоборот, калибровочные образцы с чрезмерно высокими концентрациями фторида могут изменить ионную силу раствора и вызвать нелинейный отклик электрода. Рекомендуемое действие: в начале проекта приготовьте калибровочные растворы в широком диапазоне концентраций фторида, чтобы определить линейный рабочий диапазон используемого электрода. Если значения для образцов тканей превышают этот линейный диапазон, уменьшите массу ткани или увеличьте объем ловушки с NaOH, соответственно скорректировав объем уксусной кислоты для поддержания pH 5. Трудности с получением линейных калибровочных кривых в диапазоне 0,02–1 ppm: распространенной причиной является старение электрода. Старые фторид-селективные электроды теряют чувствительность при очень низких концентрациях фторида. Рекомендуемое действие: замените фторид-селективный электрод. Нестабильные показания потенциометра (дрейф или скачки сигнала) обычно возникают, когда чувствительная поверхность электрода не полностью погружена в раствор образца. Рекомендуемое действие: опустите электрод так, чтобы чувствительная поверхность была полностью покрыта жидким образцом.

В целом, данный протокол представляет собой надежный метод количественного определения фторидов в различных биологических матрицах на основе калибровки и хорошо подходит для исследований воздействия фторидов, их отложения в тканях и токсикологических последствий на моделях мышей.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Исследование, представленное в данной публикации, было поддержано Японским обществом содействия науке; зарубежные исследовательские стипендии JSPS 202560528 (S.Y.), Фондом поддержки исследований штата Сан-Паулу (FAPESP); 2024/07452-9 (J.S.T.), а также Национальным институтом стоматологических и краниофациальных исследований Национальных институтов здравоохранения; R01DE027648 (M.S.) и K02DE029531 (M.S.).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Уксусная кислота, ледянаяSigma-AldrichSupelco, GR ACSAX0073-6
Корундовые тиглиAdvalue Technologyвн. диам. 12 мм × 25 мм В, AL-6212AL-6212
Аналитические весыVWRVWR 124B2, d = 0,1 мг—
Гомогенизатор с шарикамиКонтрольный показательBeadBug 6—
Шприцевая игла с тупым кончикомAmazonПромышленная игла с тупым кончиком, 14 G × 0,5 дюймаX001TT8KX1
Диоксид углеродаAirGas——
Химический вытяжной шкафMott ManufacturingМодель 7421040—
D(+)-сахарозаThermo Scientific99,7% для биохимии177142500
Раствор для заполнения электродаThermo ScientificРаствор для заполнения Orion IonPlus900061
Раствор этилового спиртаKoptec140 пруф2401
Морозильник, −80 °CThermo ScientificСерия Revco RDE—
Термостойкие перчаткиFisher ScientificАвтоклавные перчатки для работы с биоопасными материалами Bel-Art ClaviesH13201
Гексаметилдисилоксан (ГМДС)Fisher ScientificTCI H0091, >98%H0091
Перекись водородаVWRJ.T. Baker, 30%2204-01
Ион-селективный электродThermo ScientificИон-селективный электрод Orion на фторид-ионы, двухканальный9609BNWP
Магнитная мешалкаVWRМагнитная мешалка 360—
МикрошпательAmazonШпатель для моделирования из воска №7A, нержавеющая сталь—
МикроцентрифугаEppendorf5427R5404000131
Муфельная печьThermo ScientificКомпактная настольная муфельная печь Thermolyne, 1,3 л, FB1315MFB1315M
Сушильный шкафBoekel ScientificBoekel RapidFISH240200
Раствор параформальдегида в PBSThermo Scientific4% параформальдегид в PBSJ19943-K2
Чашка ПетриVWR60 × 15 мм, без обработки25384-092
ВазелинThermo ScientificВазелин белый очищенный417090010
Индикаторная бумага для определения pHFisher ScientificpH-Fix 4,5–10.092120.3
Фарфоровая чашкаFisher ScientificТигель Fisherbrand, 5 мл, высота 20 мм, высокая формаFB-965-B
ПотенциометрThermo ScientificpH/ИОМ-метр Orion Dual Star2115102
Лабораторный штатив с зажимомVWRКольцевой зажим, 15 см470104-526
Корм для грызуновBio-ServF1515, AIN-76A, ½ ОсадкиF1515
Ножничный домкратAmazonЛабораторный ножничный подъемник—
Делительная воронкаFisher ScientificEisco, боросиликатное стекло, 2 лS89285
Хлорид натрияFisher ScientificСертифицированный ACS, кристаллическийS271-1
Фторид натрияFisher ScientificСертифицированный реагент ACS, порошокS299-100
Гидроксид натрияFisher ScientificБелые гранулыBP359-500
Шарики из нержавеющей сталиFisher ScientificScientific Industries, 5 мм, 100 шт.SI-CS05
Серная кислотаFisher Scientificчистоты ACSA300-500
TISAB IIThermo ScientificПрименяемый раствор Orion IonPlus940909
Вакуумный эксикаторFisher ScientificВакуумный эксикатор Bel-Art Space Saver, 10 дюймовF42010-0000
Вакуумный фильтрFisher ScientificБутылочный фильтр Flow, ПЭС, 90 мм, 0.2 µm597-4520
Шейкер-качалка с регулируемой амплитудойMidSciLabDoctor / Benchmark Scientific—

Ссылки

  1. Podgorski J, Berg M. Global analysis and prediction of fluoride in groundwater. Nat Commun. 2022;13(1):4232. doi:10.1038/s41467-022-31940-x
  2. Iheozor-Ejiofor Z, Worthington HV, Walsh T, O'Malley L, Clarkson JE, Macey R, et al. Water fluoridation for the prevention of dental caries. Cochrane Database Syst Rev. 2015;2015(6):Cd010856. doi:10.1002/14651858.CD010856.pub2
  3. Manchanda S, Sardana D, Liu P, Lee GH, Li KY, Lo EC, et al. Topical fluoride to prevent early childhood caries: Systematic review with network meta-analysis. J Dent. 2022;116:103885. doi:10.1016/j.jdent.2021.103885
  4. Chan AKY, Tamrakar M, Jiang CM, Tsang YC, Leung KCM, Chu CH. Clinical evidence for professionally applied fluoride therapy to prevent and arrest dental caries in older adults: A systematic review. J Dent. 2022;125:104273. doi:10.1016/j.jdent.2022.104273
  5. Zamperini CA, Bedran-Russo AK. Immediate and Sustained Root Caries Prevention of Fluoride Varnish Combined with Toothpastes. Caries Res. 2023;57(5-6):592-601. doi:10.1159/000533279
  6. Melough MM, Sathyanarayana S, Zohoori FV, Gustafsson HC, Sullivan EL, Chi DL, et al. Impact of Fluoride on Associations between Free Sugars Intake and Dental Caries in US Children. JDR Clin Trans Res. 2023;8(3):215-23. doi:10.1177/23800844221093038
  7. Suzuki M, Everett ET, Whitford GM, Bartlett JD. 4-phenylbutyrate Mitigates Fluoride-Induced Cytotoxicity in ALC Cells. Front Physiol. 2017;8:302. doi:10.3389/fphys.2017.00302
  8. Suzuki M, Shin M, Simmer JP, Bartlett JD. Fluoride affects enamel protein content via TGF-beta1-mediated KLK4 inhibition. J Dent Res. 2014;93(10):1022-7. doi:10.1177/0022034514545629
  9. Everett ET, McHenry MA, Reynolds N, Eggertsson H, Sullivan J, Kantmann C, et al. Dental fluorosis: variability among different inbred mouse strains. J Dent Res. 2002;81(11):794-8.
  10. Kong H, He Z, Li H, Xing D, Lin J. The association between fluoride and bone mineral density in US children and adolescents: a pilot study. Nutrients. 2024. doi:10.3390/nu16172948
  11. Mazzoli R, Filippini T, Iamandii I, De Pasquale L, Veneri F, Birnbaum LS, et al. The association of fluoride exposure with bone density and fracture risk: a dose-response meta-analysis. Environ Health. 2025;24(1):73.
  12. Suzuki M, Bandoski C, Bartlett JD. Fluoride induces oxidative damage and SIRT1/autophagy through ROS-mediated JNK signaling. Free Radic Biol Med. 2015;89:369-78.
  13. Kubota K, Lee DH, Tsuchiya M, Young CS, Everett ET, Martinez-Mier EA, et al. Fluoride induces endoplasmic reticulum stress in ameloblasts responsible for dental enamel formation. J Biol Chem. 2005;280(24):23194-202. doi:10.1074/jbc.M503288200
  14. Yamashita S, Okamoto M, Mendonca M. Fluoride alters gene expression via histone H3K27 acetylation in ameloblast-like LS8 cells. Int J Mol Sci. 2024. doi:10.3390/ijms25179600
  15. Deng H, Fujiwara N, Cui H, Whitford GM, Bartlett JD, Suzuki M. Histone acetyltransferase promotes fluoride toxicity in LS8 cells. Chemosphere. 2020;247:125825.
  16. Deng H, Ikeda A, Cui H, Bartlett JD, Suzuki M. MDM2-Mediated p21 Proteasomal Degradation Promotes Fluoride Toxicity in Ameloblasts. Cells. 2019;8(5). doi:10.3390/cells8050436
  17. Fujiwara N, Whitford GM, Bartlett JD, Suzuki M. Curcumin suppresses cell growth and attenuates fluoride-mediated Caspase-3 activation in ameloblast-like LS8 cells. Environ Pollut. 2021;273:116495. doi:10.1016/j.envpol.2021.116495
  18. Suzuki M, Ikeda A, Bartlett JD. Sirt1 overexpression suppresses fluoride-induced p53 acetylation to alleviate fluoride toxicity in ameloblasts responsible for enamel formation. Arch Toxicol. 2018;92(3):1283-93. doi:10.1007/s00204-017-2135-2
  19. Regelson S, Dehghan M, Tantbirojn D, Almoazen H. Evaluation of fluoride levels in commercially available tea in the United States. 2020/12/23 ed2021 Jan-Feb. 17-20 p.
  20. Cantoral A, Luna-Villa LC, Mantilla-Rodriguez AA, Mercado A, Lippert F, Liu Y, et al. Fluoride Content in Foods and Beverages From Mexico City Markets and Supermarkets. Food Nutr Bull. 2019;40(4):514-31. doi:10.1177/0379572119858486
  21. Institute of Medicine SCotSEoDRI. Dietary Reference Intakes for Calcium, Phosphorus, Magnesium, Vitamin D, and Fluoride. Washington, DC: National Academy Press; 1997.
  22. Otal E.H. KML, Kimura M. Fluoride Detection and Quantification, an Overview from Traditional to Innovative Material-Based Methods. In: Wambu E.W. LGJ, Kiplagat A., editor. Fluoride. London: IntechOpen; 2022.
  23. Whitford GM. Absorption and Plasma Concentrations of Fluoride, 1996.
  24. Taves DR. Determination of submicromolar concentrations of fluoride in biological samples. Talanta. 1968;15(10):1015-23. doi:10.1016/0039-9140(68)80109-2
  25. Buzalaf MA, Caroselli EE, de Carvalho JG, de Oliveira RC, da Silva Cardoso VE, Whitford GM. Bone surface and whole bone as biomarkers for acute fluoride exposure. J Anal Toxicol. 2005;29(8):810-3.
  26. Zohoori FV, Maguire A, Martinez-Mier EA, Buzalaf MAR, Sanderson R, Eckert GJ. A Comparison of Simple Analytical Methods for Determination of Fluoride in Microlitre-Volume Plasma Samples. Caries Res. 2019;53(3):275-83. doi:10.1159/000492339
  27. Martínez-Mier EA, Cury JA, Heilman JR, Katz BP, Levy SM, Li Y, et al. Development of gold standard ion-selective electrode-based methods for fluoride analysis. Caries Res. 2011;45(1):3-12. doi:10.1159/000321657
  28. Boivin G, Chapuy MC, Baud CA, Meunier PJ. Fluoride content in human iliac bone: results in controls, patients with fluorosis, and osteoporotic patients treated with fluoride. J Bone Miner Res. 1988;3(5):497-502.
  29. Yamashita S, Okamoto M, Fujiwara N, Achong-Bowe R, Brueckner S, Mendonca M, et al. Developmental vulnerability to fluoride toxicity: enamel and clearance differences in adolescent versus mature mice. Arch Toxicol. 2025.
  30. Chiba K, Hisamatsu, S., Takizawa, Y, Katsura, K. Determination of fluoride in biological materials by ion chromatography. Journal of Chromatography. 1982;245:8.
  31. Ikenishi K, Chiba, K., Hisamatsu, S, Takizawa, Y. Determination of fluoride in biological samples by ion chromatography. Journal of Chromatography. 1988;437:8.
  32. Venkateswarlu P, Reddy, D.S., Reddy, T.S. Spectrophotometric determination of fluoride using the SPADNS method. Analyst 1971;96:5.
  33. Kakabadse G. KN, Davies C.W. The Spectrophotometric Determination of Fluoride with SPDNS-Zirkonium Lake. Analyst. 1971;96:8.
  34. Mendham J, Denney RC, Barnes JD, Thomas MJK. Vogel's Textbook of Quantitative Chemical Analysis. 6th ed. Harlow, England: Prentice Hall; 2000.
  35. Kučera J, Štefánik, M. & Veselka, P. Fluorine determination in biological and environmental samples with INAA using fast neutrons from a p(19 MeV)+Be neutron generator. Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry 2019;322:7.
  36. Okamoto M, Yamashita S, Memida T, Mendonca M, Brueckner S, Nakamura S, et al. Microhardness Measurements on Tooth and Alveolar Bone in Rodent Oral Disease Models. J Vis Exp. 2024(206). doi:10.3791/66583
  37. Okamoto M, Yamashita S, Mendonca M, Brueckner S, Achong-Bowe R, Thompson J, et al. Ultrastructural evaluation of adverse effects on dentine formation from systemic fluoride application in an experimental mouse model. Int Endod J. 2025;58(1):128-40.
  38. Frant MS, Ross JW, Jr. Electrode for sensing fluoride ion activity in solution. Science. 1966;154(3756):1553-5.
  39. Umezawa Y, Umezawa, K and Sato, H. Selectivity coefficients for ion-selective electrodes: recommended methods for reporting KRB values, 1995.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Количественное определение фторидадиффузия с помощью HMDSфторид в сыворотке кровифторид в костной тканифторид в зубной тканибиологические образцыстандартная криваядепонирование в тканях
Количественное определение фторидов в сыворотке крови, костях и зубах мышиной модели с использованием диффузии, облегченной гексаметилдисилоксаном, и измерений ионоселективным электродом
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.