Методическая статья

Количественное определение фторидов в сыворотке крови, костях и зубах мышиной модели с использованием диффузии, облегченной гексаметилдисилоксаном, и измерений ионоселективным электродом

20 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71488

⸱

28 августа 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Oral Science and Translational Research, College of Dental Medicine, Nova Southeastern University, 2Department of Biological Sciences, Bauru School of Dentistry, University of São Paulo, 3Department of Restorative Dentistry and Endodontology, Osaka University Graduate School of Dentistry, 4Unit of Dentistry, Osaka University Hospital, 5Department of Biomedical Sciences, Adams School of Dentistry, The University of North Carolina at Chapel Hill

В этой статье

Краткое содержание

В данном протоколе описывается подготовка чашек для диффузии с использованием гексаметилдисилоксана (HMDS), за которой следуют измерения с помощью ион-селективного электрода для количественного определения массы ионов фтора в сыворотке крови, костях и зубах мышей. Этот метод представляет собой чувствительный подход на основе калибровки для оценки накопления фтора в биологических образцах.

Аннотация

Количественное определение уровней фторида в биологических тканях необходимо для понимания механизмов воздействия, метаболизма и токсичности фторидов. В данном протоколе описан чувствительный и воспроизводимый метод измерения массы ионов фторида в сыворотке крови, костной ткани и зубах с использованием диффузии, облегченной гексаметилдисилоксаном (HMDS), с последующим анализом с помощью ион-селективного электрода (ISE). Биологические образцы, включая сыворотку крови, бедренную кость и нижние резцы, собираются у мышей, подвергшихся контролируемому воздействию фторидов. Образцы костей и зубов озоливают, измельчают и гидратируют, в то время как сыворотку крови обрабатывают непосредственно. Каждый образец переносят в диффузионную чашку, содержащую ультрачистую воду, и герметично закрывают крышкой с прокладкой из вазелина, на которой помещены капли гидроксида натрия, служащие ловушками для фторида. Введение насыщенной HMDS серной кислоты инициирует высвобождение и диффузию фторида, что позволяет количественно улавливать освобожденные ионы фторида в ловушках. После ночной диффузии капли из ловушек фторида объединяют в один образец, подкисляют до требуемого диапазона pH и доводят до определенного объема для измерения с помощью ISE. Диффузионные чашки для калибровки, подготовленные с известными массами фторида, используются для построения стандартной кривой количественного определения, а образцы контроля качества позволяют проверить стабильность электрода. Репрезентативные результаты, полученные от подростковых и взрослых мышей, подвергавшихся воздействию 0 или 125 ppm фторида, демонстрируют способность метода обнаруживать возрастные и дозозависимые различия в уровнях фторида в сыворотке крови, костях и зубах. Данный протокол представляет собой надежный калибровочный подход для количественного определения фторида в различных биологических матрицах и хорошо подходит для исследований воздействия фторидов, их отложения в тканях и токсикологических последствий на моделях мышей. Ключевым преимуществом этого метода является возможность точного количественного определения фторида в крайне малых образцах, включая 3–5 mg золы, полученной из отдельных резцов мыши, поскольку процесс диффузии концентрирует весь высвобожденный фторид в измеряемом объеме пробы менее 100 µL.

Введение

Фторид представляет собой природный анион, и его оптимальный уровень эффективен для предотвращения кариеса зубов1,2,3,4,5. В Соединенных Штатах (США) фторирование муниципальных вод до уровня 0.7 ppm было внедрено в качестве стратегии общественного здравоохранения для снижения заболеваемости кариесом и укрепления здоровья полости рта6. Однако длительное употребление избыточного количества фторида может оказать неблагоприятное воздействие на множество тканей. Высокая экспозиция фторида нарушает формирование эмали7,8,9, изменяет процесс образования костной ткани10 и нарушает целостность скелета11.

На клеточном уровне воздействие фторидов вызывает ряд метаболических нарушений, включая окислительный стресс12, стресс эндоплазматического ретикулума13, эпигенетические модификации, изменяющие экспрессию генов14, и апоптоз амелобластов15,16,17,18. В глобальном масштабе повышенные концентрации фторидов в грунтовых водах (>1.5 ppm) представляют серьезную угрозу для здоровья. Согласно недавнему исследованию с использованием прогностического моделирования, примерно 180 миллионов человек во всем мире потенциально подвержены воздействию избыточного количества фторидов, при этом наибольшая нагрузка приходится на Азию и Африку1. Помимо питьевой воды, воздействие фторидов также происходит через пищу (например, морепродукты; ~1.9 ppm), напитки (например, чай; 0.5–6 ppm19) и стоматологические средства, такие как зубная паста20 (1,000–1,500 ppm).

Таким образом, понимание механизмов воздействия, метаболизма и депонирования фторидов в тканях имеет важное значение для оценки как их терапевтического эффекта, так и потенциальных токсикологических последствий. Точное количественное определение фторидов в биологических образцах, включая мочу, сыворотку крови, костную ткань и зубы, является критически важным компонентом этой работы. Однако проведение таких измерений представляет собой сложную аналитическую задачу из-за химических свойств фторидов и их высокого сродства к матриксам, богатым кальцием. Примерно 99% фторидов в организме сосредоточено в минерализованных тканях, таких как кости и зубы21. Для решения этих проблем был разработан ряд аналитических методов, включая потенциометрию с использованием ион-селективных электродов (ISE), ионную хроматографию, колориметрический анализ, титриметрические процедуры, а также ядерные методы или методы активации22. Среди них метод диффузии, облегченной гексаметилдисилоксаном (HMDS), в сочетании с измерением с помощью ион-селективного электрода на фторид-ионы стал одним из наиболее надежных и широко используемых подходов для биологических матриксов благодаря своей чувствительности, воспроизводимости и совместимости с различными типами образцов23,24,25,26,27,28,29.

Несмотря на доступность множества аналитических методов, каждый подход имеет свои ограничения, которые могут затруднить его использование в экспериментальных или клинических исследованиях. Ионная хроматография обеспечивает высокую чувствительность и селективность, но требует специализированного оборудования и длительной подготовки проб30,31. Колориметрические методы, такие как метод с использованием SPADNS (натриевая соль 2-(парасульфофенилазо)-1,8-дигидроксинафталин-3,6-дисульфоната), просты и недороги, однако они подвержены влиянию мутности и эндогенных хромофоров, что ограничивает их надежность при анализе сложных биологических образцов22,32,33. Титриметрические методы экономичны и просты в исполнении, но им не хватает чувствительности, необходимой для определения следовых количеств фторидов в большинстве биологических объектов34. Ядерные методы или методы на основе активации обладают исключительной чувствительностью, но требуют доступа к реакторам или ускорительным источникам нейтронов, что делает их непрактичными для рутинного лабораторного использования35. Напротив, диффузия, облегчаемая HMDS, с последующим измерением с помощью ISE, обеспечивает практический баланс чувствительности, стоимости и доступности, гарантируя при этом полное высвобождение фторидов как из мягких, так и из минерализованных тканей. Это особенно выгодно для исследований с использованием мелких животных, где количество доступных тканей ограничено, а минерализованные структуры, такие как резцы мыши, дают всего 3–5 mg золы на один зуб.

Способность метода диффузии-ИОС концентрировать весь высвобожденный фторид в небольшом определенном объеме позволяет проводить точный количественный анализ даже в крайне малых образцах. Это делает данный метод подходящим для токсикокинетических исследований, экспериментов по изучению зависимости «доза — ответ» и изучения метаболизма фторида на разных стадиях развития. Малые грызуны, в частности мыши линии C57BL/6J, широко используются в качестве животных моделей для изучения воздействия фторида7,9,12,29,36.

В данном протоколе авторы применяют метод диффузии с использованием гексаметилдисилазана (HMDS) с последующим измерением с помощью ион-селективного электрода на фторид-ионы для количественного определения содержания фтора в сыворотке крови, костной ткани и зубах мышей, подвергавшихся воздействию высокой дозы фтора (125 ppm), в сравнении с необработанным контролем. Далее авторы сравнивают накопление фтора у подростковых (6 недель на момент начала лечения) и взрослых (18 недель на момент начала лечения) мышей для оценки возрастных различий в метаболизме фтора и его отложении в тканях. Нижние резцы были выбраны в качестве репрезентативной зубной ткани, так как резцы грызунов прорезываются непрерывно и достигают стационарного баланса между прорезыванием и окклюзионным износом примерно к 7 неделям жизни. Такой характер непрерывного роста обеспечивает стабильный и доступный градиент развития эмали, что делает резцы мышей широко используемой и хорошо валидированной моделью для исследования формирования эмали и развития зубного флюороза.

Протокол

Все процедуры, описанные в данном протоколе, были выполнены в соответствии с правилами и нормами использования позвоночных животных, утвержденными Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Университета Nova Southeastern (протокол № 2023.02.MSuz1), который аккредитован Международной ассоциацией по оценке и аккредитации ухода за лабораторными животными (AAALAC). Вся работа с животными соответствовала руководству по уходу и использованию лабораторных животных и рекомендациям Американской ветеринарно-медицинской ассоциации (AVMA) по эвтаназии животных. Все материалы, использованные в данном исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Животные, подготовка и введение фторида натрия в мышиной модели

  1. Животные: распределите самцов мышей C57BL/6J по двум возрастным категориям: подростковым (6 недель на момент начала лечения) и взрослым (18 недель на момент начала лечения).
    1. Обеспечьте каждую группу либо деионизированной водой без фтора (0 ppm F⁻), либо питьевой водой с добавлением фторида натрия (125 ppm F⁻) в течение 6-недельного периода воздействия.
    2. Включите по пять животных в каждое возрастное условие и группу лечения (N = 5/группа).
    3. По окончании периода воздействия соберите сыворотку крови, бедренные кости и нижние резцы, после чего подготовьте все собранные образцы для последующего анализа.
      ​ПРИМЕЧАНИЕ: Образец: обработанный материал, такой как озоленная кость, озоленный зуб и сыворотка.
  2. Содержание животных и диета: содержите мышей в стандартных лабораторных условиях со свободным доступом (ad libitum) к корму и воде.
    1. Обеспечьте безфтористый рацион, начиная за одну неделю до сбора зубов, костей и сыворотки, чтобы минимизировать фоновые уровни фтора.
  3. Питьевая вода с фторидом натрия
    1. Для приготовления питьевой воды с добавлением фтора растворите фторид натрия (NaF) в деионизированной воде до достижения желаемой концентрации фтора (например, 125 ppm F⁻).
    2. Профильтруйте раствор через вакуумный фильтр 0,2 µm в автоклавированный флакон. Готовьте свежий раствор каждые 2 дня.
      ОСТОРОЖНО: NaF токсичен при проглатывании и может вызвать раздражение кожи и глаз. Работайте в вытяжном шкафу, используя лабораторный халат, нитриловые перчатки и защитные очки.
  4. Для подготовки контрольной воды без фтора профильтруйте деионизированную воду через вакуумный фильтр 0,2 µm в автоклавированный флакон. Готовьте свежую воду каждые 2 дня.
  5. Обеспечьте свободный доступ (ad libitum) к питьевой воде с фтором или без него в течение необходимого периода лечения фторидами. Ежедневно контролируйте уровень воды и заменяйте флаконы каждые 2 дня.
  6. По окончании периода воздействия усыпите животных путем ингаляции диоксида углерода (CO₂), после чего проведите декапитацию. Процедуры эвтаназии проводились в соответствии с Руководством AVMA по эвтаназии животных и были утверждены в рамках институционального протокола IACUC.
    ОСТОРОЖНО: CO2 является асфиксикантом. Проводите процедуры в хорошо проветриваемом помещении и убедитесь в исправности камеры. Избегайте прямого вдыхания газа.

2. Подготовка образцов для измерения содержания фторидов

  1. Сбор крови
    1. Эвтаназируйте мышей путем вдыхания CO₂ и немедленно соберите кровь методом терминальной пункции сердца, используя туберкулиновый шприц объемом 1 mL. Перенесите кровь в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 mL. Утилизируйте все использованные иглы и шприцы в утвержденный учреждением контейнер для острых отходов.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Иглы шприцев острые и могут вызвать колотые раны; обращайтесь с ними осторожно.
    2. Выдержите кровь в течение 30 мин при комнатной температуре, затем центрифугируйте в течение 10 мин при 2,000 × g.
    3. Перенесите супернатант (сыворотку) в микроцентрифужную пробирку и храните при −80 °C.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Морозильники сверхнизких температур представляют опасность обморожения. При работе с пробирками используйте утепленные перчатки и избегайте длительного контакта кожи с холодными поверхностями.
  2. Кости
    1. Извлечение бедренных костей: После эвтаназии препарируйте задние конечности в области тазобедренных суставов.
    2. Осторожно удалите все мягкие ткани с бедренных костей. Промойте ткани трижды в деионизированной воде. Храните кости при -80 °C до дальнейшей обработки. Удаленные мягкие ткани и любые загрязненные материалы утилизируйте в поток биологических отходов учреждения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для длительного хранения в 70% этаноле ткани можно фиксировать в 4% параформальдегиде с 2% сахарозой в течение 12–16 ч. Данная процедура фиксации не влияет на точность последующего количественного определения фторидов.
    3. Тщательно промойте кости деионизированной водой. Удалите излишки влаги безворсовой бумажной салфеткой.
    4. Перенесите кости в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 mL с открытыми крышками для обеспечения испарения и поместите их в сушильный шкаф при 60 °C на 12–16 ч.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Сушильный шкаф может вызвать ожоги. При работе с образцами используйте термостойкие перчатки.
    5. Озоление костей: Перенесите высушенные кости в алюмооксидные тигли. Поместите тигли в муфельную печь и нагрейте до 600 °C со скоростью 150 °C/ч, затем выдержите в течение 6 ч. Дайте печи остыть до температуры ниже 200 °C перед извлечением тиглей. Остатки фрагментов костей или загрязненные расходные материалы утилизируйте в поток биологических отходов учреждения.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Муфельная печь и тигли разогреваются до экстремальных температур, что создает серьезную опасность ожогов. Всегда давайте печи остыть перед извлечением тиглей. При извлечении тиглей надевайте лабораторный халат, защитные очки и термостойкие перчатки, а также используйте длинный пинцет, чтобы избежать прямого контакта с горячими поверхностями.
      КРИТИЧЕСКИЙ ЭТАП: Неполное озоление нарушит последующие анализы. Прежде чем продолжить, убедитесь, что костный материал достиг полностью окисленного состояния; любое остаточное содержание углерода помешает последующим измерениям.
      ​ПРИМЕЧАНИЕ: Правильно озоленная кость должна иметь равномерный светло-серый или белый цвет. Более темные частицы, особенно черные или напоминающие древесный уголь остатки, указывают на неполное сгорание. При наличии обесцвечивания увеличьте продолжительность озоления для полного удаления органического материала.
    6. Хранение озоленных костей: Сразу после озоления перенесите кости в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 mL. Герметизируйте пробирки Parafilm и храните их в вакуумном эксикаторе до использования.
  3. Зубы
    1. Извлечение нижних резцов: Сделайте горизонтальный разрез на уровне височно-нижнечелюстного сустава, чтобы отделить нижнюю челюсть от верхней.
    2. Выполните срединно-сагиттальные разрезы, чтобы разделить верхнюю и нижнюю челюсти на левую и правую половины.
    3. Промойте ткани трижды в деионизированной воде и осторожно извлеките нижние резцы. Храните извлеченные резцы при -80 °C до дальнейшего использования. Удаленные мягкие ткани и любые загрязненные расходные материалы утилизируйте в поток биологических отходов учреждения.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Осторожно используйте острые инструменты для диссекции при выполнении разрезов в области височно-нижнечелюстного сустава и в срединно-сагиттальной плоскости во избежание травм. Используйте соответствующие СИЗ, включая перчатки, лабораторный халат и защитные очки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для длительного хранения в 70% этаноле ткани можно фиксировать в 4% параформальдегиде с 2% сахарозой в течение 12–16 ч. Данная процедура фиксации не влияет на точность последующего количественного определения фторидов.
    4. Подготовка зубов к озолению: Тщательно промойте зубы деионизированной водой и поместите их в 1% раствор перекиси водорода (H₂O₂) на 12–16 ч. Отработанные растворы перекиси водорода утилизируйте как опасные химические отходы.
    5. Снова промойте деионизированной водой, быстро промокните безворсовой салфеткой и перенесите в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 mL с открытыми крышками. Поместите пробирки в сушильный шкаф при 60 °C на 12–16 ч.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Перекись водорода является окислителем и может вызвать раздражение кожи и слизистой оболочки глаз. Работайте в вытяжном шкафу, используя лабораторный халат, нитриловые перчатки и защитные очки. Избегайте контакта с горючими материалами.
    6. Озоление зубов: Перенесите высушенные зубы в алюмооксидные тигли и озольте в муфельной печи при температуре выдержки 600 °C в течение 20 ч, используя скорость нагрева 150 °C/ч.
    7. Извлекайте тигли только после того, как печь остынет ниже 200 °C.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Муфельная печь и тигли разогреваются до экстремальных температур, что создает серьезную опасность ожогов. Дайте печи остыть ниже 200 °C перед извлечением тиглей. При извлечении тиглей надевайте лабораторный халат, защитные очки и термостойкие перчатки, а также используйте длинный пинцет, чтобы избежать прямого контакта с горячими поверхностями.
      КРИТИЧЕСКИЙ ЭТАП: Обеспечьте полное окисление; остаточный углерод помешает последующим анализам.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Озоленный зубной материал должен иметь равномерный светло-серый или белый цвет. Повторите озоление, если остались черные осадки.
    8. Хранение образцов озоленных зубов: Сразу после озоления перенесите зубы в микроцентрифужные пробирки объемом 2 mL с круглым дном.
    9. Герметизируйте пробирки Parafilm и храните их в вакуумном эксикаторе до использования.

3. Подготовка чашек для диффузии с использованием ГМДС

  1. Реагенты и материалы
    1. 6 н. серная кислота: как минимум за два дня до приготовления диффузионных чашек приготовьте стоковый раствор 6 N серной кислоты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диффузионная чашка: герметичный сосуд, предназначенный для создания контролируемой замкнутой среды, в которой компоненты, высвобождающиеся из обработанного биологического материала, могут быть уловлены химической ловушкой, закрепленной на крышке. Герметичная конструкция предотвращает обмен с наружным воздухом и гарантирует, что высвобождаемые аналиты направляются к ловушке для последующего измерения.
    2. Поместите 1 В пластиковый стакан объемом L с магнитным перемешивающим элементом на магнитной мешалке добавьте 416 мл ультрачистой воды.
    3. Используя 50 серологической пипеткой на ... мл медленно добавьте 84 мл 36% N H₂ОС₄ в воду при непрерывном перемешивании. Раствор нагреется; дайте ему остыть до комнатной температуры. Утилизируйте любые неиспользованные или отработанные растворы серной кислоты как опасные химические отходы в соответствии с правилами сбора химических отходов вашего учреждения.
      ОСТОРОЖНО: Серная кислота обладает высокой коррозионной активностью. Работать с ней следует в вытяжном шкафу, используя кислотостойкие перчатки, лабораторный халат и защитные очки. В случае контакта немедленно промыть пораженное место большим количеством воды.
    4. 6 н. серная кислота, насыщенная ГМДС: Перенесите 6 N серной кислоты к 2 в делительную воронку и добавьте 15 мл гексаметилдисилоксана (ГМДС).
    5. Убедитесь, что пробка и кран плотно закрыты, держите делительную воронку горизонтально и интенсивно встряхивайте ее до появления мелких капель ГМДС.
    6. Откройте пробку, чтобы выпустить выделившийся газ, и повторите эту процедуру еще дважды.
    7. Оставьте пробку приоткрытой на несколько часов. Храните делительную воронку с 6 Серную кислоту, насыщенную HMDS, поместите в штатив внутри вытяжного шкафа. Утилизируйте серную кислоту, содержащую HMDS, и загрязненные материалы как опасные химические отходы.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: HMDS огнеопасен и токсичен при вдыхании. Работайте с ним в вытяжном шкафу, используя лабораторный халат, перчатки и защитные очки. Храните вдали от источников возгорания.
    8. 0,05 N гидроксид натрия: растворите 1 г гранул NaOH в 25 мл сверхчистой воды для приготовления 1 N-стоковый раствор.
    9. Смесь 2 мл 1-го Стоковый раствор NaOH концентрацией N с 38 мл ультрачистой воды для получения 0,05 N раствор NaOH.
    10. Разделите 0,05 на аликвоты N NaOH в 1,5 мл микроцентрифужные пробирки для одноразового использования, плотно закройте крышки Parafilm и храните пробирки в вакуумном эксикаторе для минимизации CO₂ абсорбция. Неиспользованные или отработанные растворы гидроксида натрия утилизируйте как опасные химические отходы.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Гидроксид натрия обладает высокой едкостью и может вызвать серьезные ожоги. Используйте лабораторный халат, перчатки и защитные очки. Работайте с растворами осторожно, чтобы избежать разбрызгивания.
    11. 0,2 Н уксусная кислота: добавьте 575 µL ледяную уксусную кислоту к ультрачистой воде и доведите до конечного объема 50 мл для приготовления 0,2 N уксусной кислоты. Утилизируйте растворы уксусной кислоты как опасные химические отходы.
      ОСТОРОЖНО: Уксусная кислота обладает коррозионными свойствами и может вызвать раздражение кожи, глаз и дыхательных путей. Работать в вытяжном шкафу, используя лабораторный халат, перчатки и защитные очки.
    12. Вазелин: расплавить примерно 100 г вазелина при 60 °C в термостате. Отберите жидкий পেট্রлатум в 10 шприцы объемом мл, после чего следует дать смеси остыть и затвердеть. Шприцы, заполненные вазелином, могут храниться при комнатной температуре в течение нескольких недель.
    13. Чашка Петри: использовать 60 шт. × 15 мм необработанные чашки Петри для приготовления чашек для диффузии.
    14. С помощью разогретой иглы шприца 18G проплавьте небольшое отверстие в крышке чашки Петри.
    15. Нанесите непрерывный слой вазелина по внутреннему краю крышки с помощью 10 шприц объемом мл, оснащенный тупоконечной иглой 14 калибра игла G. Утилизируйте все использованные иглы в утвержденном учреждением контейнере для острых отходов.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Иглы шприцев острые и могут стать причиной колотых ран. Обращайтесь с ними осторожно и утилизируйте в утвержденные контейнеры для острых предметов. При нагревании игл используйте термостойкие перчатки и средства защиты глаз для предотвращения ожогов.
    16. Стоковые растворы NaF для калибровки диффузионных чашек. Растворите 4,19 г NaF в 1 сверхчистую воду для приготовления 100 сток-раствор с концентрацией 10 мМ. Приготовьте мМ, 100 µMи 10 µM рабочие растворы путем последовательных десятикратных разведений (1:10) исходного раствора с концентрацией 100 мМ раствор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: один моль NaF обеспечивает 19 г F⁻; следовательно, 1 µL из 10 µM NaF содержит 0,19 нг F⁻ и 1 µL из 10 190 мМ NaF содержит нг F⁻.
      ​ПРИМЕЧАНИЕ: Калибровочные чашки для диффузии: чашки для диффузии, используемые специально для калибровки с известной массой ионов фтора (F⁻)¯).
  2. Подготовка чашек для диффузии в зависимости от типа образца
    1. Чашка для диффузии сыворотки: пипеткой внесите 3 мл ультрачистой воды на дно чашки Петри и добавьте 75 µL сыворотка. Все материалы, загрязненные сывороткой, следует утилизировать в соответствии с правилами учреждения по обращению с биологическими отходами. Перейдите к шагу 3.4.
    2. Чашка для диффузии в костной ткани
      1. Измельчение костной золы: с помощью микрошпателя разотрите озоленные кости в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл до состояния мелкого порошка. Приступайте к обработке измельченной костной золы незамедлительно. Утилизируйте расходные материалы, загрязненные костной золой, в соответствии с правилами учреждения по утилизации химических отходов.
      2. Взвешивание и гидратация костного пепла
        1. Поместите пустое основание чашки Петри на чашу аналитических весов с дискретностью не менее 0,1. мг
        2. Перенесите измельченную костную золу из 2 мл микроцентрифужную пробирку в небольшую фарфоровую чашку, чтобы минимизировать статический заряд и предотвратить дисперсию порошка.
        3. С помощью микрошпателя добавьте примерно 5 мг костной золы в чашку и немедленно залейте порошок 3 мл ультрачистой воды перед снятием чашки с аналитических весов во избежание разлета золы.
        4. Зафиксируйте точный вес каждого образца костного пепла. Переходите к шагу 3.4.
    3. Чашка для диффузии зуба
      1. Фрезерование зольных остатков зубов
        1. Перенесите зольные остатки резцов в 2 мл микроцентрифужные пробирки с круглым дном и добавить 5 в каждую пробирку шарик из нержавеющей стали диаметром мм. Закройте пробирки и загерметизируйте крышки Parafilm.
        2. Измельчите озоленные резцы в гомогенизаторе с шариками при 2500 об/мин об/мин для 10 Приступайте к обработке измельченных зубов незамедлительно.
      2. Взвешивание и гидратация озоленных зубов
        1. Перелейте все содержимое пробирки, включая стальной шарик, на дно диффузионной чашки, помещенной на чашу аналитических весов. Утилизируйте загрязненные расходные материалы, содержащие золу зубов, в соответствии с правилами учреждения по утилизации химических отходов.
        2. Извлеките стальной шарик из чашки и зафиксируйте точный вес золы зуба (обычно 3–4 мг на один нижний резец).
        3. Немедленно добавьте 3 мл ультрачистой воды, чтобы покрыть золу зуба, прежде чем снимать чашку с весов, чтобы предотвратить дисперсию золы, вызванную статическим разрядом. Перейдите к шагу 3.4.
  3. Калибровка и контроль качества диффузионных чашек
    1. Параллельно с чашками для диффузии образцов подготовьте два набора калибровочных чашек для диффузии для проведения калибровки по 5–6 точкам и один идентичный набор контрольных чашек для диффузии, включая холостую пробу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диффузионные чашки для контроля качества: готовятся аналогично калибровочным диффузионным чашкам, но используются периодически для проверки стабильности электрода и обеспечения согласованности результатов измерений.
    2. Дозатор 3 мл ультрачистой воды в каждую из 11 или 13 чашек Петри и добавьте стоковый раствор NaF, чтобы охватить ожидаемый диапазон F¯ диапазон масс в образцах исследуемого материала. Переходите к шагу 3.4. Завершение сборки диффузионной чашки37.
  4. Завершение сборки диффузионной чашки
    1. Для создания фторидного ловушечного осадка 50 µl Три капли 0,05 N раствора NaOH наносят на внутреннюю поверхность крышки чашки Петри, на значительном удалении от ее края.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ловушка для фторидов (F¯ Ловушка): Компонент диффузионных чашек, который улавливает F¯, в частности гидроксид натрия (NaOH).
    2. Переверните крышку, не потревожив капли NaOH, и плотно прикрепите ее к основанию чашки с помощью вазелина.
    3. Для приготовления 3 N раствора серной кислоты, насыщенного HMDS, смешайте равные объемы 6 N раствора серной кислоты, насыщенного HMDS, и ультрачистой воды. Готовьте раствор непосредственно перед использованием, так как он не подлежит хранению.
    4. С помощью шприца объемом 10 мл с иглой 20 G введите 3 мл приготовленной 3 Н серной кислоты, насыщенной HMDS, через отверстие в крышке в воду в нижней части диффузионного сосуда. При введении и извлечении иглы шприца следите за тем, чтобы кислота не попала на внутреннюю поверхность крышки.
    5. Диффузия фторида, облегченная HMDS: немедленно запечатайте отверстие для инъекции каплей вазелина, полностью закрывающей отверстие, и поместите чашки для диффузии на встряхиватель-балансир, установленный на низкую скорость. Инкубируйте в течение ночи при комнатной температуре (Рисунок 1).

figure-protocol-1
Рисунок 1: Схема диффузионной чашки для экстракции и улавливания фторидов из кости. На рисунке  1 представлена конструкция диффузионной чашки, собранной в необработанной чашке Петри размером 60 × 15 mm. В крышке имеется небольшое инъекционное отверстие, герметизированное капелькой вазелина. На внутренней поверхности крышки расположены три капли NaOH, служащие ловушками для ионов фтора (F⁻), которые остаются подвешенными к крышке во время диффузии. Крышка герметично прикреплена к основанию чашки с помощью вазелина. В нижней части чашки Петри находятся ультрачистая вода, серная кислота, насыщенная гексаметилдисилоксаном (HMDS), и костная зола, которые совместно создают реакционную среду для высвобождения и последующего улавливания фторидов. Данный рисунок был создан авторами с помощью Biorender и распространяется по лицензии CC BY. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

4. Измерение содержания фторидов с помощью ИСЭ

  1. Подготовка ИСЭ
    1. Заполните двухканальный фторид-селективный электрод соответствующим заполняющим раствором, подключите его к потенциометру и закрепите электрод в держателе.
    2. Поместите необработанную чашку Петри на ножничный домкрат под чувствительную поверхность электрода, убедившись, что поверхность электрода параллельна дну чашки Петри, и поднимите стол домкрата так, чтобы чашка Петри почти касалась электрода (Рисунок 2).
  2. Подготовка проб к измерению
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пробы: в данном протоколе под пробами понимаются только конечные продукты, измеряемые с помощью ион-селективного электрода (ИСЭ), которые представляют собой ловушку F¯ после диффузии, впоследствии смешанную с уксусной кислотой и водой. 
    1. Для доведения pH пробы до 5 снимите диффузионную чашку с качалки и после периода инкубации осторожно поднимите крышку, нарушив герметизацию вазелином. Переверните крышку на плоскую поверхность, следя за тем, чтобы три капли ловушки F¯ оставались неподвижными.
    2. Добавьте 15–20 µL 0,2 N уксусной кислоты в одну каплю с помощью дозатора P20, затем объедините все три капли в одну, не меняя наконечника дозатора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пробы с высокой концентрацией F¯, как правило, имеют более низкий исходный pH и поэтому требуют меньшего количества 0,2 N уксусной кислоты для доведения pH до 5 по сравнению с пробами с меньшим содержанием F¯. Поскольку объем пробы, остающийся после регистрации электродного потенциала (шаг 5.3), минимален, используйте любой имеющийся остаток пробы для проверки pH с помощью индикаторной бумаги.
    3. Для корректировки объема пробы установите дозатор P100 на 75 µL, аспирируйте весь объем ловушки F¯, не допуская попадания воздуха, и доведите объем пробы ровно до 75 µL с помощью ультрачистой воды.
    4. Выполняйте этот шаг осторожно, чтобы обеспечить точный объем для расчета концентрации фторида. Оставьте пробу в наконечнике дозатора и немедленно переходите к шагу 4.3.
  3. Измерение образцов, калибровка и контроль качества
    1. Для измерения электродного потенциала пробы поместите ее между чувствительной поверхностью фторид-селективного электрода и чашкой Петри. Убедитесь, что вся чувствительная поверхность электрода полностью погружена в жидкость, не касаясь напрямую чашки Петри. Дождитесь стабилизации потенциометра и запишите значение потенциала (mV), отображаемое ИСЭ.
    2. Постройте калибровочную кривую, последовательно измеряя первую серию калибровочных стандартов, начиная с самой низкой концентрации F¯ и переходя к самой высокой.
      1. Постройте график зависимости электродного потенциала (mV) от логарифма F¯ (ng) для получения калибровочной кривой (Рисунок 3). Примените экспоненциальную регрессию для получения уравнения стандартной кривой и коэффициента детерминации (R2). Принимайте калибровочные кривые только при R2 ≥ 0,99.
    3. Измерьте каждую пробу образца и запишите электродный потенциал (mV).
    4. Для мониторинга стабильности электрода и выявления возможного дрейфа анализа периодически измеряйте контрольные пробы на протяжении каждого аналитического цикла.
      1. Сравните значения контрольных проб непосредственно с соответствующими калибровочными пробами и подтвердите их соответствие в пределах примерно 5%, чтобы убедиться в стабильной работе электрода с течением времени.
      2. Периодически измеряйте «холостую» диффузионную чашку, чтобы подтвердить отсутствие загрязнения фторидами при обработке проб и диффузии.
  4. Для расчета массы F¯ (ng) в каждой пробе образца используйте уравнение стандартной кривой. Затем разделите эту массу на объем (µL) сыворотки или массу (mg) золы кости или зуба, добавленную в диффузионную чашку.
    1. Пример расчета концентрации F¯ в золе кости (ng/mg)
      1. Масса золы кости, добавленная в диффузионную чашку: 5,1 mg; электродный потенциал пробы образца объемом 75 µL: –31,6 mV
      2. Шаг 1: Расчет массы фторида с использованием калибровочного уравнения
        1. Масса F⁻ (ng) = 3505,4 x e(-0,043x-31,6)
        2. Масса F⁻ (ng) = 13 641 ng
      3. Шаг 2: Расчет концентрации фторида в золе кости
        1. Концентрация F⁻ =  13 641 ng  /  5,1  mg
        2. Концентрация F⁻ =  2 675 ng / mg (ppm)

figure-protocol-2
Рисунок 2: Схема установки для измерений с помощью ИСЭ.На рисунке  2 представлена конфигурация, используемая для измерения ионов фтора с помощью двухканального ион-селективного электрода (ИСЭ). Чашка Петри помещена на ножничный домкрат для точной регулировки ее высоты относительно электрода. ИСЭ подключен к потенциометру и ориентирован таким образом, чтобы его чувствительная поверхность была параллельна плоскости чашки Петри с соблюдением расстояния примерно 1–2 mm. После установки зазора в пространство между чувствительной поверхностью и чашкой Петри дозируют небольшой объем образца (75 µL), чтобы образец полностью покрывал чувствительную область электрода во время измерения. Данный рисунок был создан авторами с помощью BioRender и распространяется по лицензии CC BY. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-protocol-3
Рисунок 3: Калибровочная кривая и соответствующая калибровочная таблица для количественного определения массы ионов фторида в образцах тканей зуба. Верхняя панель: Пример калибровочной кривой, используемой для определения массы ионов фторида в образцах тканей зуба. По оси x отложен потенциал электрода (mV, линейная шкала), по оси y — соответствующая масса ионов фторида (ng F⁻, логарифмическая шкала). Измеренные калибровочные точки представлены сплошной линией, а аппроксимированная экспоненциальная регрессия — пунктирной линией. Вставленное окно содержит уравнение стандартной кривой и коэффициент детерминации (R2 = 0.99). Нижняя панель: Таблица с числовыми значениями, использованными для построения калибровочной кривой. В первой строке указаны пять значений потенциала электрода (mV), зарегистрированных для калибровочных образцов. Во второй строке приведены соответствующие массы ионов фторида (ng F⁻) для каждого калибровочного образца. В третьей строке указаны объемы (µL) стандартного раствора NaF 10 mM, добавленные в калибровочные диффузионные чашки; эта добавленная масса ионов фторида эквивалентна массе, захваченной в каждом калибровочном образце после диффузии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Результаты

Для демонстрации применения данного протокола при измерении концентраций фторида (F-) в биологических материалах были получены образцы сыворотки крови, кости и нижних резцов от мышей, подвергавшихся контролируемому воздействию фторидов. Самцов мышей линии C57BL/6J разделили на две возрастные группы: подростков (6 недель) и взрослых особей (18 недель); им предоставляли либо деионизированную воду без фтора (0 ppm F⁻), либо питьевую воду с добавлением фторида натрия (125 ppm F⁻) в течение 6-недельного периода воздействия. В каждой возрастной группе и при каждом варианте обработки было по пять животных. По окончании периода воздействия были отобраны пробы сыворотки крови, бедренные кости и нижние резцы, после чего образцы были подготовлены и проанализированы в соответствии с протоколом. Репрезентативные значения концентраций фторида, измеренные в сыворотке крови, костной ткани и зубах, приведены ниже.

figure-results-1
Рисунок 4Концентрации фторидов, измеренные в сыворотке крови, бедренной кости и нижних резцах. Мышей линии C57BL/6J мужского пола разделили на две возрастные группы: подростков (6 недель, пустой столбец) и взрослых особей (18 недель, закрашенный столбец); животным предоставляли либо деионизированную воду без содержания фтора (0 ppm F⁻) или питьевую воду с добавлением фторида натрия (125 ppm F⁻) в течение 6-недельного периода воздействия. По окончании периода воздействия измеряли уровни фторидов в (А) сыворотке крови, (Б) бедренной кости и (В) нижних резцах животных тех же групп лечения. Значения в сыворотке крови ниже предела обнаружения (<0,02 ppm) были нанесены на график для визуализации, но исключены из статистического анализа. Данные представлены в виде средних значений ± СО (стандартное отклонение). Сравнения между группами подростков и взрослых проводились с помощью U-критерия Манна — Уитни с поправкой Бонферрони — Данна для множественных сравнений. *p < 0.05, **p < 0,01 (N = 5 в группе). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Концентрация фторида в сыворотке крови
В обеих группах (подростковой и взрослой), получавших 0 ppm фторида, концентрации фторида в сыворотке крови были ниже предела обнаружения ион-селективного электрода (<0.02 ppm). В группах, получавших 125 ppm, концентрация фторида в сыворотке крови увеличилась до 0.3 ± 0.2 ppm в подростковой группе и до 0.7 ± 0.2 ppm во взрослой группе (p = 0.06). Сравнение между подростковой и взрослой группами, получавшими 125 ppm, проводилось с использованием U-критерия Манна–Уитни с поправкой Бонферрони–Данна для множественных сравнений. *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5/группа). Группы, получавшие 0 ppm, были исключены из статистического анализа. (Рисунок 4A, Таблица 1).

Концентрация фторида в бедренной кости
В группах с дозировкой 0 ppm концентрация фторида в бедренной кости была значительно ниже у подростков (292 ± 39 ppm) по сравнению со взрослыми животными (896 ± 55 ppm) (p < 0.01). Напротив, в группах с дозировкой 125 ppm концентрация фторида у подростков (4 108 ± 482 ppm) была значительно выше, чем у взрослых животных (2 966 ± 612 ppm) (p = 0.04). Сравнения между группами подростков и взрослых животных проводились с помощью U-критерия Манна — Уитни с поправкой Бонферрони — Данна для множественных сравнений. *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5/группа). (Рисунок 4B, Таблица 1). На Рисунке 5A показано кратное изменение содержания фторида в бедренной кости при переходе от дозировки 0 ppm к 125 ppm для каждой возрастной группы. У подростков наблюдалось 14-кратное увеличение уровня фторида при 125 ppm, тогда как у взрослых мышей увеличение было 3-кратным.

Концентрации фторидов в нижних резцах
В группах с 0 ppm концентрации фторидов в нижних резцах были значительно ниже у подростков (35 ± 4 ppm) по сравнению со взрослыми животными (123 ± 23 ppm) (p = 0.03). В группах, получавших 125 ppm, концентрации фторидов в резцах увеличились до 5641 ± 955 ppm у подростков и 4392 ± 1694 ppm у взрослых животных. Сравнение групп подростков и взрослых животных проводили с помощью U-критерия Манна–Уитни с поправкой Бонферрони–Данна для множественных сравнений. *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5/группа). (Рисунок 4C, Таблица 1). Хотя абсолютные концентрации фторидов при 125 ppm существенно не различались между возрастными группами, кратность изменения при переходе от 0 ppm к 125 ppm была значительно выше у мышей-подростков (увеличение в 161 раз), чем у взрослых мышей (увеличение в 36 раз) (Рисунок 5B).

figure-results-2
Рисунок 5: У подростков наблюдается более выраженное кратное увеличение накопления фтора в костях и резцах, чем у взрослых мышей. Кратность изменения концентрации фтора при переходе от 0 ppm к 125 ppm фтора у подростковых (пустой столбец) и взрослых (закрашенный столбец) мышей. (A) Бедренная кость и (B) нижний резц из одних и тех же групп обработки. Данные представлены как средние ± SD. Сравнение между группами подростков и взрослых животных проводилось с помощью непарного t-критерия. * p < 0.05, (N = 5/группа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

ОбразецСывороткаБедренная костьНижний резец
Возрастная группаПодростковаяЗрелаяПодростковаяЗрелаяПодростковаяЗрелая
Группа обработки0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm
< 0.020.2< 0.020.8324457693330813748241613229
< 0.020.1< 0.020.8229377892433263954511272654
< 0.020.7< 0.021.0300468387737133155441126997
< 0.020.4< 0.020.5323383280725193551141034169
< 0.020.3< 0.020.528336699372192н/д72711114909
Среднее значение< 0.020.3< 0.020.7292410889629663556411234392
СОн/д0.2н/д0.239482556123955231694

Таблица 1: Индивидуальные измерения содержания фторида в сыворотке крови, бедренной кости и нижних резцах. В таблице 1 приведены индивидуальные концентрации фторида (ppm F⁻), измеренные в образцах сыворотки крови, бедренной кости и нижних резцов подростковых и взрослых мышей, подвергавшихся воздействию 0 ppm или 125 ppm фторида. Для каждого типа ткани данные представлены в столбцах, соответствующих четырем группам обработки: подростки 0 ppm, подростки 125 ppm, взрослые 0 ppm и взрослые 125 ppm. Каждый столбец содержит пять индивидуальных зарегистрированных значений (N = 5), за которыми следуют рассчитанное среднее значение и стандартное отклонение (SD). В группе сыворотки крови подростков (0 ppm) все зарегистрированные значения были ниже предела обнаружения ион-селективного электрода (<0.02 ppm). В таблице приведены необработанные числовые данные, лежащие в основе сводных значений и статистических сравнений, показанных на рисунке 4.

Обсуждение

Измерения содержания фторида проводили с помощью ион-селективного электрода (ISE), селективного к фториду, который содержит кристаллическую мембрану из фторида лантана (LaF₃)38,39. Эта мембрана образует высокостабильные связи La–F, что обеспечивает выраженное предпочтение ионов фторида перед другими галогенидами. Согласно общепринятой электрохимической литературе и спецификациям производителя, мембрана LaF₃ обладает очень низкими коэффициентами селективности по отношению к хлориду, что указывает на то, что ионы хлорида не создают измеримых помех в условиях, используемых в данном протоколе. Несмотря на естественное присутствие хлорида в зубах и костях, его активность не влияет на потенциал электрода, и регистрируемый сигнал отражает именно активность фторида. Нижний предел обнаружения 0,02 ppm соответствует подтвержденному производителем минимальному количественно определяемому пределу концентрации для фторид-селективного электрода Orion. Этот предел отражает самую низкую концентрацию фторида, при которой электрод сохраняет стабильный нернстовский отклик и линейную зависимость от калибровочной кривой. Поскольку предел обнаружения определяется характеристиками мембраны электрода и подтвержден производителем, дополнительного экспериментального определения для данного протокола не потребовалось; однако в отношении верхнего диапазона обнаружения авторы заметили, что массы фторида, превышающие примерно 38 000 ng в ловушке с 50 µL NaOH, приводили к нелинейному отклику электрода, что указывает на потерю достоверности калибровочной кривой при очень высоких нагрузках фторида. Эта нелинейность, вероятно, обусловлена превышением оптимальной ионной силы и диапазона активности для электрода в данных экспериментальных условиях, а не внутренним верхним пределом самого ISE. Для образцов, в которых ожидается содержание фторида выше этого порога, рекомендуется увеличить объем ловушки NaOH, чтобы измерения оставались в пределах линейного динамического диапазона электрода.

Данный фактор следует учитывать при применении протокола к образцам с необычно высоким содержанием фторидов. Поскольку этап диффузии расходует весь объем образца, выполнение повторных измерений и экспериментов по методу добавок с определением степени извлечения на биологических образцах было невозможно. Для обеспечения аналитической точности и прецизионности в каждую серию измерений включали стандарты контроля качества (КК) с известными концентрациями фторидов. Эти стандарты КК обрабатывали и измеряли идентично экспериментальным образцам. Во всех сериях измеренные концентрации фторидов в стандартах КК стабильно находились в пределах 5% от их ожидаемых значений. Для каждой серии из 10–20 исследуемых образцов параллельно готовили два независимых набора по 5–6 калибровочных образцов, а перед каждой сессией измерений регистрировали калибровочную кривую. Диапазон калибровки корректировали для каждого запуска таким образом, чтобы он соответствовал ожидаемой массе фторидов в исследуемых образцах, которая зависела от типа образца, массы материала, помещенного в диффузионную чашку, а также от группы лечения и возраста животного. Для измерений в сыворотке крови калибровочные стандарты соответствовали концентрациям фторидов в образце примерно 0.06–1.20 ppm. Для измерений в костной ткани и зубах калибровочные стандарты соответствовали концентрациям фторидов в образце примерно 19–7,600 ppm.

Данный протокол описывает чувствительный и воспроизводимый подход к количественному определению массы ионов фтора в сыворотке крови, костях и зубах с использованием диффузии, облегчаемой гексаметилдисилоксаном, с последующим анализом методом ионоселективного электрода (ISE). Метод надежно фиксирует фтор, высвобождаемый из различных биологических матриц, и позволяет количественно оценить накопление фтора после контролируемого воздействия. Репрезентативные результаты, полученные на подростковых и взрослых мышах, демонстрируют четкие возрастные и дозозависимые различия в отложении фтора в тканях, что подчеркивает полезность данного подхода для изучения метаболизма и токсикокинетики фтора in vivo.

Ключевым преимуществом данного протокола является использование диффузионных чашек, которые физически отделяют реакцию высвобождения фторида от среды его улавливания. Конструкция с герметизацией вазелином минимизирует газообмен с атмосферой и обеспечивает эффективный захват высвобожденных ионов фторида каплями гидроксида натрия на крышке. Серная кислота, насыщенная HMDS, создает сильную и стабильную движущую силу для высвобождения фторида из минерализованных тканей, включая сильно кальцинированные структуры, такие как кости и зубы. Последующее измерение с помощью ион-селективного электрода (ISE), откалиброванного по соответствующим диффузионным стандартам, позволяет проводить точный количественный анализ в широком динамическом диапазоне. Еще одним преимуществом данного подхода является возможность количественного определения фторида в крайне малых биологических образцах. Минерализованные ткани мышей, в частности нижние резцы, дают всего 3–5 mg золы на один зуб. Традиционные аналитические методы часто требуют большей массы образца или более высокого содержания фторида для обеспечения надежного обнаружения. В отличие от них, конструкция на основе диффузии концентрирует весь фторид, высвобожденный из всего образца, в небольшом определенном объеме, что позволяет проводить точный количественный анализ даже в крошечных образцах с низкой абсолютной массой фторида. Эта особенность особенно ценна для исследований с использованием мелких животных, при ограниченном наличии тканей или при анализе микродиссецированных минерализованных структур.

Основным ограничением данного метода является предел обнаружения ион-селективного электрода (ISE), использованного в этом исследовании (0.02 ppm). Образцы сыворотки контрольных животных, не получавших фториды, часто оказывались ниже этого порога, что делало невозможным количественное определение крайне низких концентраций фторидов. При измерении следовых концентраций, близких к пределу обнаружения или ниже его, может потребоваться увеличение массы или объема образца, помещаемого в диффузионную чашку (при наличии возможности), или использование альтернативных аналитических методов. Кроме того, метод требует диффузии в течение ночи и осторожного обращения с коррозионно-активными реагентами, что может ограничить пропускную способность при проведении масштабных исследований. Хотя метод ISE обеспечивает чувствительное количественное определение общего содержания фторидов, он не позволяет оценить их пространственное распределение в тканях. Для визуализации и картирования распределения фторидов в микро- и макромасштабе могут быть применены дополнительные подходы, такие как сканирующая электронная микроскопия в сочетании с энергодисперсионной рентгеновской спектроскопией (SEM-EDX) или метод гамма-излучения, индуцированного частицами (PIGE). Эти методы визуализации позволяют оценить локальное накопление фторидов в минерализованных или мягких тканях, дополняя таким образом измерения методом ISE и обеспечивая более комплексную оценку содержания фторидов в тканях.

На точность и достоверность диффузии и измерения фторида в данном протоколе могут влиять несколько повторяющихся технических факторов; наши наблюдения показывают, что подготовка калибровки, герметизация диффузионной чашки, контроль pH, работа электрода и обращение с образцами в совокупности определяют качество данных. Возможными причинами нелинейности калибровочной кривой (R2 < 0,99) или получения значений для образцов тканей вне ожидаемого диапазона являются ошибки в расчете объема стокового раствора NaF, добавляемого в диффузионную чашку, или ошибки пипетирования при приготовлении калибровочных стандартов. Рекомендуемое действие: готовьте не менее двух независимых наборов калибровочных образцов для каждого цикла, чтобы в случае выхода одной калибровочной кривой за пределы ожидаемого диапазона был доступен резервный набор. Неполная герметизация диффузионной чашки также может привести к потере фторида в процессе диффузии, что вызовет искусственно заниженные показания. Обычно это происходит при недостаточном нанесении вазелина на ободок крышки диффузионной чашки. Рекомендуемое действие: нанесите достаточное количество вазелинового желе на ободок крышки диффузионной чашки и плотно прижмите ее для обеспечения полной герметичности. Ошибки пипетирования при добавлении раствора уксусной кислоты в ловушку с NaOH могут сместить pH образца за пределы оптимального диапазона pH 5,0, что приведет к неточному определению степени извлечения фторида. Рекомендуемое действие: проверяйте pH каждого образца с помощью pH-бумаги и утилизируйте любой образец, значение pH которого выходит за пределы pH 5. Калибровочные образцы также могут выходить за пределы допустимых диапазонов регистрации фторид-селективного электрода. Концентрации ниже 0,02 ppm находятся ниже предела обнаружения электрода. Рекомендуемое действие: не используйте калибровочные образцы с содержанием фторида менее 0,02 ppm. И наоборот, калибровочные образцы с чрезмерно высокими концентрациями фторида могут изменить ионную силу раствора и вызвать нелинейный отклик электрода. Рекомендуемое действие: в начале проекта приготовьте калибровочные растворы в широком диапазоне концентраций фторида, чтобы определить линейный рабочий диапазон используемого электрода. Если значения для образцов тканей превышают этот линейный диапазон, уменьшите массу ткани или увеличьте объем ловушки с NaOH, соответственно скорректировав объем уксусной кислоты для поддержания pH 5. Трудности с получением линейных калибровочных кривых в диапазоне 0,02–1 ppm: распространенной причиной является старение электрода. Старые фторид-селективные электроды теряют чувствительность при очень низких концентрациях фторида. Рекомендуемое действие: замените фторид-селективный электрод. Нестабильные показания потенциометра (дрейф или скачки сигнала) обычно возникают, когда чувствительная поверхность электрода не полностью погружена в раствор образца. Рекомендуемое действие: опустите электрод так, чтобы чувствительная поверхность была полностью покрыта жидким образцом.

В целом, данный протокол представляет собой надежный метод количественного определения фторидов в различных биологических матрицах на основе калибровки и хорошо подходит для исследований воздействия фторидов, их отложения в тканях и токсикологических последствий на моделях мышей.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Исследование, представленное в данной публикации, было поддержано Японским обществом содействия науке; зарубежные исследовательские стипендии JSPS 202560528 (S.Y.), Фондом поддержки исследований штата Сан-Паулу (FAPESP); 2024/07452-9 (J.S.T.), а также Национальным институтом стоматологических и краниофациальных исследований Национальных институтов здравоохранения; R01DE027648 (M.S.) и K02DE029531 (M.S.).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Уксусная кислота, ледянаяSigma-AldrichSupelco, GR ACSAX0073-6
Корундовые тиглиAdvalue Technologyвн. диам. 12 мм × 25 мм В, AL-6212AL-6212
Аналитические весыVWRVWR 124B2, d = 0,1 мг—
Гомогенизатор с шарикамиКонтрольный показательBeadBug 6—
Шприцевая игла с тупым кончикомAmazonПромышленная игла с тупым кончиком, 14 G × 0,5 дюймаX001TT8KX1
Диоксид углеродаAirGas——
Химический вытяжной шкафMott ManufacturingМодель 7421040—
D(+)-сахарозаThermo Scientific99,7% для биохимии177142500
Раствор для заполнения электродаThermo ScientificРаствор для заполнения Orion IonPlus900061
Раствор этилового спиртаKoptec140 пруф2401
Морозильник, −80 °CThermo ScientificСерия Revco RDE—
Термостойкие перчаткиFisher ScientificАвтоклавные перчатки для работы с биоопасными материалами Bel-Art ClaviesH13201
Гексаметилдисилоксан (ГМДС)Fisher ScientificTCI H0091, >98%H0091
Перекись водородаVWRJ.T. Baker, 30%2204-01
Ион-селективный электродThermo ScientificИон-селективный электрод Orion на фторид-ионы, двухканальный9609BNWP
Магнитная мешалкаVWRМагнитная мешалка 360—
МикрошпательAmazonШпатель для моделирования из воска №7A, нержавеющая сталь—
МикроцентрифугаEppendorf5427R5404000131
Муфельная печьThermo ScientificКомпактная настольная муфельная печь Thermolyne, 1,3 л, FB1315MFB1315M
Сушильный шкафBoekel ScientificBoekel RapidFISH240200
Раствор параформальдегида в PBSThermo Scientific4% параформальдегид в PBSJ19943-K2
Чашка ПетриVWR60 × 15 мм, без обработки25384-092
ВазелинThermo ScientificВазелин белый очищенный417090010
Индикаторная бумага для определения pHFisher ScientificpH-Fix 4,5–10.092120.3
Фарфоровая чашкаFisher ScientificТигель Fisherbrand, 5 мл, высота 20 мм, высокая формаFB-965-B
ПотенциометрThermo ScientificpH/ИОМ-метр Orion Dual Star2115102
Лабораторный штатив с зажимомVWRКольцевой зажим, 15 см470104-526
Корм для грызуновBio-ServF1515, AIN-76A, ½ ОсадкиF1515
Ножничный домкратAmazonЛабораторный ножничный подъемник—
Делительная воронкаFisher ScientificEisco, боросиликатное стекло, 2 лS89285
Хлорид натрияFisher ScientificСертифицированный ACS, кристаллическийS271-1
Фторид натрияFisher ScientificСертифицированный реагент ACS, порошокS299-100
Гидроксид натрияFisher ScientificБелые гранулыBP359-500
Шарики из нержавеющей сталиFisher ScientificScientific Industries, 5 мм, 100 шт.SI-CS05
Серная кислотаFisher Scientificчистоты ACSA300-500
TISAB IIThermo ScientificПрименяемый раствор Orion IonPlus940909
Вакуумный эксикаторFisher ScientificВакуумный эксикатор Bel-Art Space Saver, 10 дюймовF42010-0000
Вакуумный фильтрFisher ScientificБутылочный фильтр Flow, ПЭС, 90 мм, 0.2 µm597-4520
Шейкер-качалка с регулируемой амплитудойMidSciLabDoctor / Benchmark Scientific—

Ссылки

  1. Podgorski J, Berg M. Global analysis and prediction of fluoride in groundwater. Nat Commun. 2022;13(1):4232. doi:10.1038/s41467-022-31940-x
  2. Iheozor-Ejiofor Z, Worthington HV, Walsh T, O'Malley L, Clarkson JE, Macey R, et al. Water fluoridation for the prevention of dental caries. Cochrane Database Syst Rev. 2015;2015(6):Cd010856. doi:10.1002/14651858.CD010856.pub2
  3. Manchanda S, Sardana D, Liu P, Lee GH, Li KY, Lo EC, et al. Topical fluoride to prevent early childhood caries: Systematic review with network meta-analysis. J Dent. 2022;116:103885. doi:10.1016/j.jdent.2021.103885
  4. Chan AKY, Tamrakar M, Jiang CM, Tsang YC, Leung KCM, Chu CH. Clinical evidence for professionally applied fluoride therapy to prevent and arrest dental caries in older adults: A systematic review. J Dent. 2022;125:104273. doi:10.1016/j.jdent.2022.104273
  5. Zamperini CA, Bedran-Russo AK. Immediate and Sustained Root Caries Prevention of Fluoride Varnish Combined with Toothpastes. Caries Res. 2023;57(5-6):592-601. doi:10.1159/000533279
  6. Melough MM, Sathyanarayana S, Zohoori FV, Gustafsson HC, Sullivan EL, Chi DL, et al. Impact of Fluoride on Associations between Free Sugars Intake and Dental Caries in US Children. JDR Clin Trans Res. 2023;8(3):215-23. doi:10.1177/23800844221093038
  7. Suzuki M, Everett ET, Whitford GM, Bartlett JD. 4-phenylbutyrate Mitigates Fluoride-Induced Cytotoxicity in ALC Cells. Front Physiol. 2017;8:302. doi:10.3389/fphys.2017.00302
  8. Suzuki M, Shin M, Simmer JP, Bartlett JD. Fluoride affects enamel protein content via TGF-beta1-mediated KLK4 inhibition. J Dent Res. 2014;93(10):1022-7. doi:10.1177/0022034514545629
  9. Everett ET, McHenry MA, Reynolds N, Eggertsson H, Sullivan J, Kantmann C, et al. Dental fluorosis: variability among different inbred mouse strains. J Dent Res. 2002;81(11):794-8.
  10. Kong H, He Z, Li H, Xing D, Lin J. The association between fluoride and bone mineral density in US children and adolescents: a pilot study. Nutrients. 2024. doi:10.3390/nu16172948
  11. Mazzoli R, Filippini T, Iamandii I, De Pasquale L, Veneri F, Birnbaum LS, et al. The association of fluoride exposure with bone density and fracture risk: a dose-response meta-analysis. Environ Health. 2025;24(1):73.
  12. Suzuki M, Bandoski C, Bartlett JD. Fluoride induces oxidative damage and SIRT1/autophagy through ROS-mediated JNK signaling. Free Radic Biol Med. 2015;89:369-78.
  13. Kubota K, Lee DH, Tsuchiya M, Young CS, Everett ET, Martinez-Mier EA, et al. Fluoride induces endoplasmic reticulum stress in ameloblasts responsible for dental enamel formation. J Biol Chem. 2005;280(24):23194-202. doi:10.1074/jbc.M503288200
  14. Yamashita S, Okamoto M, Mendonca M. Fluoride alters gene expression via histone H3K27 acetylation in ameloblast-like LS8 cells. Int J Mol Sci. 2024. doi:10.3390/ijms25179600
  15. Deng H, Fujiwara N, Cui H, Whitford GM, Bartlett JD, Suzuki M. Histone acetyltransferase promotes fluoride toxicity in LS8 cells. Chemosphere. 2020;247:125825.
  16. Deng H, Ikeda A, Cui H, Bartlett JD, Suzuki M. MDM2-Mediated p21 Proteasomal Degradation Promotes Fluoride Toxicity in Ameloblasts. Cells. 2019;8(5). doi:10.3390/cells8050436
  17. Fujiwara N, Whitford GM, Bartlett JD, Suzuki M. Curcumin suppresses cell growth and attenuates fluoride-mediated Caspase-3 activation in ameloblast-like LS8 cells. Environ Pollut. 2021;273:116495. doi:10.1016/j.envpol.2021.116495
  18. Suzuki M, Ikeda A, Bartlett JD. Sirt1 overexpression suppresses fluoride-induced p53 acetylation to alleviate fluoride toxicity in ameloblasts responsible for enamel formation. Arch Toxicol. 2018;92(3):1283-93. doi:10.1007/s00204-017-2135-2
  19. Regelson S, Dehghan M, Tantbirojn D, Almoazen H. Evaluation of fluoride levels in commercially available tea in the United States. 2020/12/23 ed2021 Jan-Feb. 17-20 p.
  20. Cantoral A, Luna-Villa LC, Mantilla-Rodriguez AA, Mercado A, Lippert F, Liu Y, et al. Fluoride Content in Foods and Beverages From Mexico City Markets and Supermarkets. Food Nutr Bull. 2019;40(4):514-31. doi:10.1177/0379572119858486
  21. Institute of Medicine SCotSEoDRI. Dietary Reference Intakes for Calcium, Phosphorus, Magnesium, Vitamin D, and Fluoride. Washington, DC: National Academy Press; 1997.
  22. Otal E.H. KML, Kimura M. Fluoride Detection and Quantification, an Overview from Traditional to Innovative Material-Based Methods. In: Wambu E.W. LGJ, Kiplagat A., editor. Fluoride. London: IntechOpen; 2022.
  23. Whitford GM. Absorption and Plasma Concentrations of Fluoride, 1996.
  24. Taves DR. Determination of submicromolar concentrations of fluoride in biological samples. Talanta. 1968;15(10):1015-23. doi:10.1016/0039-9140(68)80109-2
  25. Buzalaf MA, Caroselli EE, de Carvalho JG, de Oliveira RC, da Silva Cardoso VE, Whitford GM. Bone surface and whole bone as biomarkers for acute fluoride exposure. J Anal Toxicol. 2005;29(8):810-3.
  26. Zohoori FV, Maguire A, Martinez-Mier EA, Buzalaf MAR, Sanderson R, Eckert GJ. A Comparison of Simple Analytical Methods for Determination of Fluoride in Microlitre-Volume Plasma Samples. Caries Res. 2019;53(3):275-83. doi:10.1159/000492339
  27. Martínez-Mier EA, Cury JA, Heilman JR, Katz BP, Levy SM, Li Y, et al. Development of gold standard ion-selective electrode-based methods for fluoride analysis. Caries Res. 2011;45(1):3-12. doi:10.1159/000321657
  28. Boivin G, Chapuy MC, Baud CA, Meunier PJ. Fluoride content in human iliac bone: results in controls, patients with fluorosis, and osteoporotic patients treated with fluoride. J Bone Miner Res. 1988;3(5):497-502.
  29. Yamashita S, Okamoto M, Fujiwara N, Achong-Bowe R, Brueckner S, Mendonca M, et al. Developmental vulnerability to fluoride toxicity: enamel and clearance differences in adolescent versus mature mice. Arch Toxicol. 2025.
  30. Chiba K, Hisamatsu, S., Takizawa, Y, Katsura, K. Determination of fluoride in biological materials by ion chromatography. Journal of Chromatography. 1982;245:8.
  31. Ikenishi K, Chiba, K., Hisamatsu, S, Takizawa, Y. Determination of fluoride in biological samples by ion chromatography. Journal of Chromatography. 1988;437:8.
  32. Venkateswarlu P, Reddy, D.S., Reddy, T.S. Spectrophotometric determination of fluoride using the SPADNS method. Analyst 1971;96:5.
  33. Kakabadse G. KN, Davies C.W. The Spectrophotometric Determination of Fluoride with SPDNS-Zirkonium Lake. Analyst. 1971;96:8.
  34. Mendham J, Denney RC, Barnes JD, Thomas MJK. Vogel's Textbook of Quantitative Chemical Analysis. 6th ed. Harlow, England: Prentice Hall; 2000.
  35. Kučera J, Štefánik, M. & Veselka, P. Fluorine determination in biological and environmental samples with INAA using fast neutrons from a p(19 MeV)+Be neutron generator. Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry 2019;322:7.
  36. Okamoto M, Yamashita S, Memida T, Mendonca M, Brueckner S, Nakamura S, et al. Microhardness Measurements on Tooth and Alveolar Bone in Rodent Oral Disease Models. J Vis Exp. 2024(206). doi:10.3791/66583
  37. Okamoto M, Yamashita S, Mendonca M, Brueckner S, Achong-Bowe R, Thompson J, et al. Ultrastructural evaluation of adverse effects on dentine formation from systemic fluoride application in an experimental mouse model. Int Endod J. 2025;58(1):128-40.
  38. Frant MS, Ross JW, Jr. Electrode for sensing fluoride ion activity in solution. Science. 1966;154(3756):1553-5.
  39. Umezawa Y, Umezawa, K and Sato, H. Selectivity coefficients for ion-selective electrodes: recommended methods for reporting KRB values, 1995.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

BiologyFluorideHexamethyldisiloxane HMDS facilitated diffusionion selective electrodeserumboneteeth
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи