Гибридная биоаналитическая платформа на основе 3D-культуры клеток для оптической визуализации с использованием шелковых фиброиновых губок

Краткое содержание

В статье описывается простая, доступная и воспроизводимая методология производства и культивирования шелковых каркасов 4T1-iRFP720 клеток рака молочной железы в условиях контролируемого потока для поддержки динамической культуры. Рост и миграция клеток оценивались как доказательство концепции с использованием оптического инструмента in vivo в качестве основного неинвазивного показания.

Аннотация

Мы представляем инновационную биоаналитическую гибридную платформу, предназначенную для доклинической оценки клеточных характеристик. Система сочетает в себе трёхмерную (3D) клеточную культуру, выращиваемую на искусственном внеклеточном матриксе, с конфигурацией, вдохновлённой хроматографией. Губки, изготовленные из структурного белка шелкового фиброина, служат как биомиметический внеклеточный матрикс, так и как стационарная фаза. Шелковые фиброиновые губки производились на собственном месте с использованием многоступенчатого процесса, включающего удаление природных белков серицина из сырых шелковых волокон, затем растворение и диализ для очистки раствора фиброина, растворение в органическом растворителе и последующее литье в соляном слое для получения шелковых губок с контролируемой пористостью/размером пор 500–800 мкм. Генетически модифицированные линии клеток рака молочной железы 4T1-iRFP720 и 4T1-wt (нефлуоресцентный контроль) культивировались в шелковых каркасах с использованием непрерывного потока среды через насос, а их рост и характеристики клеток анализировались неинвазивно с помощью оптических методов визуализации (in vivo оптический инструмент). Объединяя ключевые преимущества хроматографических систем (автоматизация, воспроизводимость) с биологической значимостью современных 3D-клеточных культур, платформа позволяет in vitro моделировать тканеподобную архитектуру и морфологию, одновременно облегчая мониторинг динамического клеточного поведения. Параллельно применение технологий медицинской визуализации позволяет осуществлять мониторинг миграции и роста клеток в реальном времени в реальном времени, среди прочих факторов. Этот подход открывает значительный потенциал для изучения клеточного поведения на макроскопическом уровне в ламинарной системе потоков. Повышая физиологическую значимость моделей in vitro , этот метод может помочь преодолеть трансляционный разрыв для исследований in vivo и соответствует концепции reduce, replace, refined (3R) для экспериментов на животных.

Введение

В живых тканях миграция и рост клеток происходят внутри трёхмерного, гетерогенного внеклеточного матрикса (ЭКМ), управляемого биофизическими и биохимическими сигналами, такими как межклеточный поток жидкости и взаимодействие между клетками. Эти факторы регулируют полярность клеток, механотрансдукцию и координированное движение, лежа в основе ключевых биологических процессов, включая восстановление тканей и инвазию рака 1,2,3,4.

Несмотря на их важность, большинство тестов in vitro миграции, таких как скретч и анализы Трансвелла, оценивают движение отдельных клеток на плоских, статичных субстратах. Хотя эти двумерные подходы просты и экономически эффективны, они плохо воспроизводят структурные и динамические особенности микросреды in vivo ^5,6. Это ограничение особенно критично в контексте метастазирования рака, когда опухолевые клетки мигрируют коллективно через механически и химически разнообразные тканевые^{матрицы 3,7,8}. Хотя 2D scratch тесты остаются популярными благодаря их простоте, они не отражают сложность ECM или влияние потока^{жидкости 6}. Подходы на основе Трансвелла обеспечивают количественные показания, но только на фиксированных конечных точках, что препятствует непрерывному наблюдению за^{миграцией 6,9}.

Недавние исследования показали, что интерстициальный поток усиливает метастатический потенциал, тогда как жёсткость и состав ECM способствуют эпителиально-мезенхимальному переходу и коллективной^{миграции 4,10}. Более продвинутые 3D-системы, такие как сфероиды и органоиды, лучше приближают нативные среды ЭБМ; однако их использование часто ограничено вариабельностью, ограниченной доступностью экспериментов и трудностями стандартизированного^{анализа 11,12}. Микрофлюидные платформы обеспечивают превосходный контроль над механическими и жидкостными условиями, но их зависимость от специализированных методов изготовления и оборудования ограничивает их широкое^{применение 13}. Таким образом, воссоздание этих интегрированных сигналов in vitro в контролируемом, доступном, неинвазивном и экономически эффективном виде остаётся серьёзной^{задачей 5,14}.

Чтобы решить эти задачи и преодолеть разрыв между традиционными двумерными анализами и сложными in vivo моделями, мы разработали простую 3D-сотовую платформу с поддержкой потока на основе губки из шелкового фиброина. Система использует шелковую губку с настраиваемыми механическими свойствами как каркас, похожий на ЭБМ. Шелк был выбран из-за своей пористой структуры, которая обеспечивает мягкую перфузию и поддерживает физиологически значимый интерстициальный^{поток 15}. Его биосовместимость и устоявшееся применение в биомедицине и тканевой инженерии делают его подходящим материалом для этого применения. Недавняя публикация дополнительно продемонстрировала экологическую устойчивость и потенциал переработки^{строительных лесов 16}. В другом исследовании мы дополнительно показали их адаптивность к различным методам визуализации, таким как позитронно-эмиссионная^{томография 17}. Эта предыдущая работа послужила основой для настоящего описания методологии, в которой мы развиваем одну и ту же концепцию платформы в упрощённой конфигурации на основе оптической визуализации in vivo . В совокупности эти исследования демонстрируют потенциал системы для мультимодальной визуализации инженерных тканевых конструкций и поддерживают её использование как универсальной экспериментальной платформы для интеграции in vitro культуры и релевантных in vivo показаний в различных моделях раковых клеток.

В качестве доказательства концепции мы культивировали клетки рака молочной железы с меткой iRFP720 4T1 с тройной отрицательной формой в каркасах в двух условиях низкосдвигового стрессового потока в течение пяти дней. Неинвазивный оптический мониторинг in vivo выявил выраженные паттерны роста, направленные на поток, и значительные изменения динамики популяции клеток по сравнению со статическими контролями. Делая акцент на инженерной простоте и воспроизводимости, эта модель обеспечивает практический мост между двумерными анализами и исследованиями in vivo , позволяя исследователям на макроскопическом и неинвазивном уровне клеточные характеристики в физиологически значимом, но доступном формате. В отличие от предыдущих методологий, которые часто опираются на разрушительный анализ конечных точек или не имеют стандартизированных критериев посева, этот протокол вводит систематическую структуру для оптимизации производства каркасов и, соответственно, клеточного посева и визуализации. Этот подход повышает экспериментальную устойчивость и предоставляет более всесторонний, продольный обзор динамики коллективных клеток внутри трёхмерных матриц, что представляет собой значительное усовершенствование по сравнению с существующими методами мониторинга роста и миграции.

Протокол

В первом разделе описывается подготовка каркасов из шелкового фиброина на основе ранее опубликованных работ¹⁶. В следующих разделах описываются оптимизация плотности засева клеток, интеграция потока и оптическая визуализация для мониторинга движения и роста клеток. В этом исследовании использовались исключительно устоявшиеся линии рака молочной железы у мышей (4T1-wt и 4T1-iRFP720) и не включали участников человека, образцы пациентов, первичные ткани или живые животные. В соответствии с институциональными и национальными рекомендациями этическое одобрение не требовалось. Схематический обзор рабочего процесса показан на рисунке 1.

1. Приготовление шелковой фиброиновой губки

1. Чистка кокона и удаление резинки.
   1. Разрежьте коконы шелкопряда Bombyx mori L. с помощью защитного скальпеля.
   2. Удалите личинок и извлеките самый внутренний слой кокона (компактный слой, непосредственно окружающий полость личинки) с помощью стандартной игли для вскрытия.
   3. Наполните стакан 1,6 литром двойной дистиллляции воды (_{ddH 2}O).
   4. Добавьте магнитную перемешивательку и доведите воду до кипения во время помешивания; Накройте стакан алюминиевой фольгой, чтобы ускорить нагрев и уменьшить потери воды.
   5. Добавьте 3,4 г Na₂CO₃ , когда температура воды достигает примерно 70 °C.
   6. Когда смесь начнёт кипеть, положите в раствор 4 г подготовленных коконов и перемешайте стеклянным стержнем.
   7. Прокипятите коконы 30 минут, помешивая стеклянным стержнем каждые 10 минут, чтобы обеспечить правильную экспозицию.
   8. Удалите шёлк из раствора и несколько раз промывайте его водопроводной водой, чтобы удалить оставшийся серицин.
   9. Выжмите лишнюю воду и распределите шелковые волокна на подготовленной алюминиевой фольге.
   10. Сушите шелковые волокна в предварительно разогретой духовке при 50 °C до полного высыхания (примерно 18 часов).
2. Растворение и диализ
   1. Для следующих этапов используйте абсолютный этанол и безводный_CaCl2 . Матрица растворения состоит из 1 части_{CaCl 2}, 2 частей этанола и 8 частей_{ddH 2}O. Соотношение сухого дегумированного шелка к матрице растворения составляет 1:10 [ч/ж].
   2. Взвесьте высушенный шелк и соответственно рассчитайте правильное количество компонентов для матрицы растворения.
   3. Наполните соответствующее количество_CaCl2 в термос с круглым дном и помешивающей.
   4. Измерьте необходимое количество этанола и_{ddH 20}и комбинируйте их.
   5. Добавьте смесь этанола-ddH₂₀в_CaCl2 во время помешивания.
   6. Установите рефлюкс-аппарат и нагрейте смесь до 100 °C в масляной бане, чтобы_CaCl2 растворился и довёл смесь до кипения.
   7. Когда смесь начнёт кипеть, добавьте засохший шелк и нагрейте его под рефлюксом 45 минут.
   8. Подготовьте диализные трубки длиной 15 см объемом 3,5 кДа, промывая их несколько раз водой для восстановления воды, затем закрепите один конец вокруг стеклянного стержня с помощью зажима.
   9. После кипячения перелейте горячий шелковый раствор в трубку и запечатайте противоположный конец зажимом, оставив зазор 2–3 см между жидкостью и зажимом для уплотнения, без воздушных заслонов.
   10. Поместите заполненную диализную трубку в 2-литровый стакан с_{ddH 2O}и проведите диализ при комнатной температуре 72 часа, меняя воду дважды в день для эффективной очистки.
   11. Центрифугуйте раствор при 4500 × г в течение 10 минут при комнатной температуре.
   12. Аккуратно налейте супернатант в центрифугные трубки, не нарушая гранулу, и храните трубки при -20 °C.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Заполните трубки центрифуг не более чем на половину их вместимости и заморозьте их в горизонтальном положении.
3. Лиофилизация
   1. Предварительно нагрейте вакуумный насос на 20 минут и работайте с лиофилизатором согласно инструкции производителя.
   2. Поместите замороженные трубки центрифуг прямо из морозилки в колбу с круглым дном.
   3. Прикрепите флягу к лиофилизатору и лиофилизируйте 24 часа.
   4. До дальнейшего использования храните лиофилизированный шелковый фиброин в сухом месте при комнатной температуре.
4. Литье растворителем и выщелачивание частиц
   1. Добавьте необходимое количество лиофилизированного шёлка в 1,1,1,3,3,3,3-гексафторизопропанол (HFIP) в контейнере для проб мочи под вытяжкой для получения 16% [w/v] раствора с окончательным объёмом 30 мл и закройте контейнер крышкой.
      ВНИМАНИЕ: HFIP коррозионен и вреден при вдыхании, проглатывании или всасывании через кожу; Держите растворитель в вытяжной вытяжке, надевая соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ) и избегайте контакта с кожей, глазами и парами. В случае пролива соберите жидкость с помощью впитывающих материалов и очистите поражённые участки. Перемещать загрязнённые материалы в специальные контейнеры для опасных отходов.
   2. Плотно запечатайте контейнер и поставьте его на орбитальный шейкер при 70 об/мин на 18 часов, чтобы шёлк растворился.
   3. Сито NaCl с использованием разных мешей и отложить долю 500–800 мкм.
   4. Наполните чашку Петри (диаметром 9 см, диаметром дна 8,5 см) 100 г просеянной соли (фракция 500–800 мкм), получив высоту 1,2 см. Убедитесь, что поверхность равномерно выровнена.
   5. Аккуратно вылейте 25,5 мл приготовленного шелкового раствора на соляный слой (пороген для образования губчатых пор).
   6. Накройте чашку Петри крышкой и поставьте её на орбитальный шейкер на 10 минут при 70 об/мин для равномерного проникновения шелкового раствора в соляный слой.
   7. Инкубировать чашку Петри при 37 °C в течение 1 часа с закрытой крышкой; затем инкубировать чашку Петри, открытую при 37 °C, ещё 18 часов.
   8. Для индуцирования образования бета-листа погрузите шёлковый композит в стакан с метанолом на 20 минут, затем достаните и высушите в духовке при температуре 50 °C (примерно 1 час).
      ВНИМАНИЕ: Метанол крайне токсичен; Держать их в выхлопчике с соответствующей индивидуальной защитой, избегайте контакта с кожей и воздействия пара. В случае пролива соберите жидкость с помощью впитывающих материалов и очистите поражённые участки. Переместить загрязнённые материалы в специальные контейнеры для токсичных отходов.
   9. Удалите порогенный NaCl, погружая шёлковый композит в стакан с тёплой водопроводной водой не менее 3 часа, с водяным обменом каждые 20–30 минут, пока материал не приобретет мягкую и губчатую текстуру без твёрдых оставшихся частей.
   10. Храните шелковую губку в 70% этаноле для дезинфекции и краткосрочного хранения при 4 °C.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Растворы, содержащие HFIP, собирались как галогенированные отходы растворителей, а метаноловые отходы утилизировались отдельно как негалогенированные органические растворители в соответствии с институциональными рекомендациями по химической безопасности. Для послеупотреблённой дезактивации контейнеры и рабочие поверхности, подвергшиеся воздействию HFIP или метанола, промывались совместимым растворителем и очищались моющим раствором. Первоначальные промывания и загрязнённые расходники собирались как химически опасные отходы.

2. Подготовка и уравновесение шелковых строительных лесов

1. Вырезали шелковые фиброиновые губки с помощью биопсийного пунона диаметром 6 мм для получения цилиндрических каркасов диаметром 6 мм и высотой 12 мм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовленные шелковые фиброиновые губки могут храниться в 70 % этаноле при 4 °C до 4 месяцев; Для длительного хранения рекомендуется периодическая замена на свежий этанол. Уравновешенные каркасы могут храниться в среде для клеточной культуры при 4 °C до 1 месяца.
2. Поместите образцы в пробирки с 70% этанолом для дезинфекции.
3. Выполните последующие шаги в сертифицированном биологическом шкафу безопасности, чтобы предотвратить загрязнение.
4. Аспирируйте этанол пипеткой, прижимая губку пинцетом.
5. Поместите губки в чашку Петри, содержащую 10–20 мл, дополненную средой Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640, чтобы полностью погрузить их.
6. Обменивайтесь носителями три раза, с небольшим встряхиванием между каждым обменом.
7. После третьей стирки добавьте свежий материал, плотно закройте крышку и обмотайте её керофиновой пленкой.
8. Храните губки не менее одной недели в холодильнике при 4 °C перед использованием для клеточной культуры. За это время обменивайтесь медиа 4–5 раз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте полное удаление этанола, так как остаточный этанол является цитотоксичным и ухудшает прикрепление клеток и жизнеспособность.

3. Фоновое измерение и оптимизация визуализации

1. Транспортировать пустые оптически прозрачные фильтрационные трубки и оптически прозрачные фильтрационные трубки с незасеянными шелковыми каркасами на оптическую визуализацию in vivo .
   ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация проводилась с использованием оптической визуализации in vivo в режиме 2D эпифлуоресценции.
2. Проводите съёмку в различных парах фильтров (возбуждение: 675 нм, 745 нм; излучение: 720 нм, 800 нм), времени экспозиции (4–60 с), значения диафрагми (1–8), поле обзора (13,5–22,5 см) и различные уровни лампы (низкий и высокий).
3. Оцените автофлуоресценцию, визуализируя обе платформы при одинаковых условиях перед использованием клеточных каркасов.
4. Замените мужской вход Luer-lock на отсечённый женский Luer-lock разъём для устройств только с изображением, чтобы устранить высокоинтенсивный автофлуоресцентный артефакт от мужского разъёма Luer-lock. Если материалы одинаковы для всех экспериментов, этот шаг требуется только один раз.
    

4. Подготовка клеточных суспензий и посева на каркасах из шелкового фиброина

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все последующие шаги в биологическом шкафу безопасности в стерильных условиях, так как эти процедуры включают обращение с живыми клетками и образцами, содержащими клетки.

1. Регулярно контролировать клетки рака молочной железы 4T1 дикого типа (4T1-wt) и 4T1-iRFP720 у мышей тройной отрицательной инфекции на предмет загрязнения и стабильности экспрессии iRFP720.
2. Поддерживайте клетки рака молочной железы 4T1-wt и 4T1-iRFP720 у мышей тройной отрицательной раковой железы в среде RPMI-1640 с добавлением сыворотки 10% плода телячной сыворотки, 1% L-глутамина и 1% пенициллина/стрептомицина при 37 °C в увлажнённом инкубаторе с 5%_CO2.
3. Проходные клетки примерно на 80% слияния с использованием 0,25% трипсина-ЭДТА, следуя стандартным процедурам асептической культуры.
4. Используйте одинаковые номера проходов и условия культуры для клеток 4T1-wt и 4T1-iRFP720 для всех сравнительных экспериментов.
5. Подготовьте плотность посева клеток от 5 × 10⁴ до 5 × 10⁷ клеток/мл (соответствует диапазону от 1 ×^{10 4} до 1 × 10⁷ клеток на 200 мкл). Подготовьте следующие концентрации для анализа визуализации, чтобы оценить интенсивность сигнала при различных плотностях клеток и определить оптимальную концентрацию: 5 × 10⁴, 3,38 × 10⁵, 6,25 × 10⁵, 1,25 × 10⁶, 2,5 × 10⁶, 3,75 × 10⁶, 5 × 10⁶, 1,25 × 10⁷, 2,5 × 10⁷ и 5 × 10⁷ клеток/мл.
6. Подготовьте соответствующие суспензии 4T1-wt клеток в том же диапазоне концентраций, что и 4T1-iRFP720, чтобы использовать их в качестве нефлуоресцентных контролей.
7. Поместите отдельные каркасы (подготовленные в разделе 2) в стерильные, необработанные чаши Петри.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте необработанные чашки Петри, чтобы минимизировать прикрепление клеток к пластиковой поверхности и способствовать её прикреплению к шелковому каркасу.
8. Удалите лишнюю среду вокруг каждого каркаса и с лесов с помощью пипетки, стараясь не деформировать конструкцию.
9. Пипетта 200 мкл соответствующей ячейки непосредственно на верхней поверхности каждого каркаса, обеспечивая поглощение всего объёма каркасами.
10. Инкубировать каркасы в течение 4 часов при 37 °C в увлажнённом инкубаторе с 5%_CO2 , не нарушая тарелки для присоединения клеток.
11. Через 4 часа аккуратно переместите каждое каркас с клеточными семенами в колодец с 24-колодной пластиной, содержащей 1 мл предварительно подогретой полной среды.
12. Инкубировать каркасы за ночь (16–24 часа) при 37 °C в увлажнённом инкубаторе с 5%_CO2.

5. Сборка калибровочных платформ с использованием фритов

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все этапы сборки в биологическом защитном шкафу с использованием стерильных перчаток, стерильных пинцетов и стерильных инструментов.

1. Удалите шелковые каркасы с 24-колодцевыми пластинами стерильным пинцетом, аккуратно поддерживая каждое каркасное лесо, чтобы избежать сжатия.
2. Вставьте один каркас с клеточными семенами в нижнюю часть оптически прозрачной трубки для извлекания в цельной фазе с помощью стержня стерильной колонны.
3. Положите один стерильный полиэтиленовый фрит прямо над каркасом с помощью толкающего стержня.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Полиэтиленовые фриты используйте только при оптимизации сигнала, так как их поровый размер меньше диаметра клетки и предотвращает миграцию клетки или любой другой контакт клетки. Это также обеспечивает чёткое разделение сигнала, позволяя определить точную концентрацию клетки, соответствующую каждому сигналу.
4. Повторяйте последовательность укладки: один каркас за другим фритом, пока не будут вставлены пять каркасов с клеточными семенами и пять фритов.
5. Закройте нижнюю часть фильтрационной трубки стерильным женским разъёмом Luer-lock.
6. Закройте верхнюю часть трубки для экстракции стерильным мужским разъёмом Luer-lock.

6. Оптимизация сигнала с помощью оптического инструмента для визуализации in vivo с использованием калибровочных платформ с фритами (только один раз для валидации системы)

1. Транспортировать клетки для калибровки в комнату оптической визуализации in vivo внутри светонепроницаемого тёмного ящика для защиты флуоресцентных ячеек от фотоотбеливания.
2. Подготовьте оптическую съёмку in vivo в соответствии с требованиями институциональной безопасности и операционных процедур.
3. Разместите собранные платформы с посеянными клетками на стадии визуализации.
4. Получить двухмерные изображения эпифлуоресценции с помощью возбуждения при 675 нм и излучения на 720 нм, а также оптимизировать параметры изображения, включая время экспозиции, коэффициент биннинга и число f, чтобы достичь максимальной интенсивности сигнала в пределах линейного диапазона обнаружения (см. дополнительный рисунок 1 и дополнительный рисунок 2).
5. Включить как минимум одну оптически прозрачную экстракционную трубку с каркасами, засеянными клетками 4T1-wt с соответствующей плотностью клеток в качестве нефлуоресцентного эталонного контроля.
6. Получите изображения для всех образцов с одинаковыми настройками сбора для количественного сравнения интенсивности флуоресценции (см. Дополнительный рисунок 3 и Дополнительный рисунок 4).
7. Количественно определить флуоресцентные сигналы с помощью программного обеспечения для анализа оптической визуализации in vivo и определить оптимальную плотность засева клеток (то есть 5 ×^{10 6} ячеек на каркас), которая обеспечивает максимальный сигнал без насыщения (см. дополнительный рисунок 5).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательные настройки оптической системы in vivo были выбраны на основе оптимизационных экспериментов для обеспечения приёма сигнала в линейном динамическом диапазоне системы, избегая насыщения каркасов и поддержании стабильного соотношения сигнал/фон в экспериментальных и контрольных условиях. Исходя из оптимизированных настроек, засевайте все экспериментальные биореакторы 5 × 10⁶ ячеек/каркас. Проводите визуализацию в режиме 2D эпифлуоресценции при следующих настройках: возбуждение: 675 нм (полоса пропускания 30 нм); Излучение: 720 нм (полоса пропускания 20 нм), время экспозиции: 10 с, коэффициент биннинга: 8, число f: 8.

7. Сборка экспериментальной платформы (без фритов)

1. После оптимизации сигнала засеяны экспериментальные каркасы с определённой оптимальной плотностью ячейки (то есть 5 ×^{10 6} ячеек/200 мкл, см. раздел 4).
2. Собрать экспериментальную платформу с использованием всего пяти шелковых губок: одного каркаса с клеточными семенами и четырёх пустых каркасов без полиэтиленовых фритов для обеспечения клеточной коммуникации.
3. Запечатайте верхнюю часть фильтрационной трубки стерильным мужским разъёмом Luer-lock.
4. Настройте систему культуры для статических или динамических условий культуры
   1. Статическая культура: Запечатайте нижний порт стерильным женским разъёмом Luer-lock. Затем система помещается в центрифугную трубку с небрежно закреплённой крышкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку мужской люер-замок имеет отверстие, такая конфигурация обеспечивает газообмен при минимизации риска загрязнения. В такой схеме медиа обменивается вручную в капоте один раз в день.
   2. Динамическая культура: подключите нижний порт к стерильной трубке и подключите впускную трубу к мужскому Luer-lock в верхнем порте для проведения перфузионной культуры. Непрерывно подачи и удаления среды с помощью перистальтической насосной системы (дополнительный рисунок 6).

8. Динамичная культура на платформе

1. Начните дезинфекцию насоса и сопутствующих трубок, промыв 70% этанола при максимальном расходе в течение 10 минут.
2. Промыйте насос и трубку стерильным полным средом минимум 10 минут, чтобы удалить остатки этанола. Замените на свежую среду и продолжайте перфузию ещё 10 минут, чтобы обеспечить полное уравновесение системы перед использованием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все компоненты полностью заполнены средой и свободны от воздушных пузырьков перед посевом клеток.
3. Соедините мужской Luer-lock вход (верх) собранного реактора с выходной линией насоса с помощью стерильной трубы и люэр-лок-соединителей.
4. Подключите вход насоса к стерильному резервуару с полным материалом.
5. Соедините выход реактора (снизу) с резервуаром среды для создания контура рециркуляционной перфузии. Такая конфигурация позволяет непрерывно проникать среды через каркасы при сохранении системы замкнутого контура.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе перфузия выполняется с использованием рециркулирующей конфигурации, при которой среда непрерывно циркулируется между резервуаром и реактором. Такой подход минимизирует умеренное потребление при сохранении непрерывного потока.
6. Установите желаемый расход насоса на целевую номинальную сдвиговую нагрузку стенки (например, 1 дин/^см² и 4 дина/см^²), используя внутренний радиус канала ( = 3 мм) на основе предположения потока Пуазёя¹⁹:
   
   где τ — напряжение сдвига стенки (dyn/^{cm 2}), а Q — объемная скорость потока (^{см 3}/с), — вязкость жидкости среды RPMI-1640 (0,958 × 10-3 N·s/^{m 2} при 37 °C)²⁰. Хотя сама система содержит пористый шелковый каркас и поэтому отклоняется от этой идеализированной геометрии, рассчитанные значения использовались как стандартизированные операционные ориентиры для воспроизводимых сравнений условий потока. Соответствующие расходы составляли 0,133 мл/мин и 0,531 мл/мин и использовались в качестве условий перфузии для культуры.
7. Начните перфузию и контролируйте систему на наличие утечек, образования пузырьков и стабильного потока.
8. Начинайте перфузию с ингибитором миграции или тестовым соединением (например, Cucurbitacin E (CuE) при 0,05 мкмоль/л в полной среде) или без него (контрольно) и поддерживайте всю установку при 37 °C в увлажнённом инкубаторе с 5%_CO2 до пяти дней. Поэтому подключите вход насоса к стерильному резервуару с полным материалом, включая соответствующее испытательное соединение, и запустите насос с аналогичными настройками, что и раньше.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте полное удаление этанола из насоса и трубок, выполнив определённые этапы промывки среды. После промывания перед подключением к реакторам с ячеточным засеянием сбросьте первоначальную часть среды и убедитесь, что система полностью заполнена свежей средой и свободна от пузырьков воздуха.

9. Флуоресцентная визуализация экспериментальной платформы

1. Остановите насос, отсоедините все трубки, сохраняя стерильные условия.
2. Запечатайте нижнюю часть трубки SPE с помощью женского разъёма Luer-lock, поместите всю систему в стерильную трубку центрифугы на 50 мл и надёжно закройте трубку.
3. Перенесите систему в шкаф биобезопасности для продолжения всех последующих этапов. Внутри капота замените мужской разъём Luer-lock на отсечённый женский разъём Luer-lock, чтобы полностью закрыть систему.
4. Поместите герметичную систему обратно в стерильную центрифугную трубку объёмом 50 мл и надёжно закройте трубку для транспортировки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от лабораторных условий, поток не нужно останавливать для проведения визуализации, когда система напряжена. Однако в данных экспериментальных условиях это было невозможно.
5. Транспортируйте герметичные реакторы в помещение оптической системы in vivo внутри светонепроницаемого тёмного ящика для защиты люминесцентных элементов от фотоотбеливания.
6. Разместите реакторы на ступени оптической системы in vivo в соответствующем держателе.
7. Получите 2D эпифлуоресцентные изображения с использованием ранее оптимизированных параметров (например, возбуждение 675 нм, излучение 720 нм, время экспозиции 10 с, биннинг 8, число диафрагмы 8).
8. Включайте 4T1-wt с посевом, незасеянные каркасы и пустые органы управления реакторами для каждой сессии визуализации.
9. Количественная оценка флуоресцентных сигналов с помощью оптического анализа in vivo визуализации.
10. Постройте количественные результаты для контрольной и лечебной групп и создайте сравнительные графики для визуализации влияния тестового соединения на измеренный результат.

10. Анализ изображений экспериментальной платформы

1. Получайте флуоресцентные изображения на 0, 3 и 5 день и анализируйте с помощью программного обеспечения для анализа изображений.
2. Для каждого изображения проводите пространственную калибровку перед анализом. Измерьте известную физическую длину экспериментальной платформы в пикселях с помощью инструмента Line и введите соответствующее реальное расстояние (85 мм) с помощью Analyze > Set Scale , чтобы определить преобразование пикселя в длину.
3. После калибровки количественно оцените область флуоресцентной площади, вручную обведя интересующую область (ROI) с помощью инструмента свободного выбора.
4. Чтобы минимизировать предвзятость пользователя, определите ROI по согласованным визуальным критериям, основанным на интенсивности флуоресцентного сигнала относительно фона. Проводите все анализы в одинаковых условиях и, по возможности, назначайте один обученный оператор.
5. Определите флуоресцентный сигнал как яркие области, чётко отличающиеся от темного фона на изображениях программного обеспечения для оптического анализа in vivo и используйте эти сигналы для согласованной ручной сегментации.
6. Измеряйте выбранные области с помощью Analyze > Measure и записывайте значения площади для каждой временной точки. Повторите эту процедуру для всех изображений во всех экспериментальных группах.
7. Нормализуйте измерения площади до соответствующего значения Дня 0 для каждого выборки с помощью программного обеспечения для создания таблиц, чтобы учесть различия в начальном размере, и выразить результаты как изменение сгибания относительно исходной линии (день 0 = 1).

11. Статистический анализ

1. Проводите все эксперименты хотя бы в тройном экземпляре.
2. Повторить все эксперименты не менее трёх раз (n = 3), определить средние значения, а также стандартные отклонения (SD).
3. Определить статистическую значимость с помощью двухстороннего ANOVA, затем провести тест множественного сравнения Тьюки с α = 0,05.

Результаты

Этот протокол описывает удобную и недорогую платформу для макроскопического наблюдения за ростом и движением клеток в физиологически значимой 3D-среде. Метод использует шелковые фиброиновые губки в качестве имитации ЭКМ и включает контролируемый интерстициальный поток для моделирования динамических состояний тканей. Схематический обзор пошаговых процедур — от изготовления шелковых губок и строительных лесов до засева ячеек и экспериментальной сборки платформы — показан

Обсуждение

Процесс производства шелковой губки, описанный в этом протоколе, стандартизирован, что гарантирует воспроизводимую изготовление строительных лесов, как сообщалось в предыдущем^{исследовании 16}. Производство губок при полностью стандартизированных условиях, таких как высота/количество соляного слоя, объём шелкового раствора и инкубация метанола, имеет решающее значение для получения однородных, сопоставимых губок. Изготовленные губки должны соответствовать критериям ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1,1,1,3,3,3-Гексафторизопропанол (HFIP)	Sigma-Aldrich	8.04515	Внимание: Опасен. Используется для растворения лиофилизованной шелковицы
24-лунная пластинка	Cellstar, Greiner Bio-One	662102	Хранение осеянных клетками каркасов во время инкубации
4T1-iRFP720 мышьи тройне отрицательные раковые клетки груди	Макромолекулярная лаборатория онкологических терапевтических средств (MMCT), Университет Вены	N/A	Опыты с культурой клеток; 4T1-iRFP720 было получено внутри лаборатории от родительской 4T1 (ATCC: CRL-2539)
4T1-wt мышьи тройне отрицательные раковые клетки груди	Макромолекулярная лаборатория онкологических терапевтических средств (MMCT), Университет Вены	ATCC: CRL-2539	Опыты с культурой клеток
Bruker Alpha Compact FTIR с платиновым модулем ATR образцов	Bruker	A220/D-01	FT-IR анализ
Хлорид кальция, безводный, ≥93% лабораторный градус	Sigma-Aldrich	902179	Для приготовления растворительной матрицы
Флакон для культуры клеток, T25	Cellstar, Greiner Bio-One	690175	Потребматериалы; для культивирования клеток
Флакон для культуры клеток, T75	Cellstar, Greiner Bio-One	658175	Потребматериалы; для культивирования клеток
Центрифуга 5804 R	Eppendorf	5805000010	Используется для разделения образцов центрифугированием
Комби-стоппер (женский соединитель Luer-lock)	Braun Melsungen AG	4495101	Используется для сборки платформы
Кукунбитацин E	Sigma-Aldrich	SML0577	Ингибитор миграции клеток
Дермальный кусач для биопсии, ø 6 мм	Dahlhausen	1190001006	Используется для получения цилиндрических губчатых каркасов
Диализные трубки (3.5 кДа, целлюлоза)	Spectra/Por by Spectrum Labs	SPEC132724	Для диализа раствора шелковицы
Раствор Дульбекко с фосфатным буфером	Sigma-Aldrich	D8537	Для поддержания клеток
Этанол, абсолютный	Merck	1.07017	Для приготовления растворительной матрицы
Excel	Microsoft	v2604	Организация данных, базовые вычисления и построение графиков
Фетальная сыворотка телят (FCS) теплоинактивированная	Biowest	S181H-500	Добавка для среды культивирования клеток
Fiji (бывший ImageJ)	Open source (https://imagej.net/software/fiji/)	N/A	Обработка и анализ изображений
GraphPad Prism	GraphPad Software	v8.2.1	Статистический анализ и создание графиков
Насос HPLC Hitachi L-7120 LaChrom	Merck	K-5244	Для динамических условий культивирования в собранной платформе
Система IVIS 200 Spectrum CT	PerkinElmer	128201	Оптическая имAGING система с возможностью КТ
Программное обеспечение IVIS Living Image	PerkinElmer	v4.5.2	Программное обеспечение для получения, визуализации и количественного анализа данных имAGING IVIS
Сканируюший электронный микроскоп JEOL JSM-6510	JEOL GmbH	JSM-6510	Изображения СЭМ
L-глутамин, раствор 200 мМ, пригодный для культуры клеток (L-Glu)	Sigma-Aldrich	G7513	Добавка для среды культивирования клеток
Лиофилизатор Alpha 2-4 LD Plus	Martin Christ	101542	Для лиофилизации шелковицы
Мужской соединитель Luer-lock	Supelco (Sigma-Aldrich)	57020-U	Адаптер для резервуаров образцов
Метанол, ≥99.9 %, градиент HPLC	Carl Roth	7342.1	Внимание: Токсичен. Индукция формирования бета-листов в шелковых композитах
Оптически прозрачные трубы для твердофазной экстракции (SPE) без фильтров	Sigma Aldrich	57240-U	Используется для сборки платформы
Спектроскопическое программное обеспечение OPUS	Bruker	v7.5	FT-IR анализ
Орбитальный и линейный шакерователь MI0103002	Four E'S Scientific	MI0103002	Равномерное распределение/смешивание
Parafilm PM996	Sigma-Aldrich	P7793	Для герметизации/завертывания пластинок и контейнеров для хранения (например, охлаждения)
Пенициллин-стрептомицин, жидкий, пригодный для культуры клеток (P/S)	Sigma-Aldrich	P0781	Добавка для среды культивирования клеток
Петри чаша, 9 см	VWR	391-0598	Для формирования солевого ложа губчатых структур; для посева на шелковых каркасах
Полиэтиленовы фильтры