Методическая статья

Редактирование генома Mesorhizobium ciceri с помощью системы CRISPR-Cas9 путем нарушения гена nodC для изучения симбиоза с нутом

0 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71513

⸱

25 сентября 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Root Nodule Symbiosis Laboratory, National Institute of Plant Genome Research, 2Microbial Engineering Laboratory, International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данном протоколе описывается CRISPR-Cas9-опосредованное нарушение локуса nodC у Mesorhizobium ciceri с использованием гомологичной рекомбинации и скрининга на основе GFP для создания мутантов с дефектом симбиоза с целью проведения функциональных геномных исследований ризобий, ассоциированных с нутом.

Аннотация

Mesorhizobium ciceri, азотфиксирующий симбионт нута (Cicer arietinum), остается генетически труднодоступным для манипуляций с использованием традиционных методов гомологичной рекомбинации, которые трудозатратны и часто оставляют нежелательные селективные маркеры. В данном протоколе мы описываем упрощенную стратегию редактирования генома с использованием системы CRISPR (короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами) и ассоциированного белка 9 (Cas9) с широким спектром хозяев, адаптированной для M. ciceri. Мы демонстрируем эффективность этого метода, нацеливаясь на ген nodC, который кодирует N-ацетилглюкозаминилтрансферазу, необходимую для синтеза хитинового остова в Nod-факторах — основных сигнальных молекулах, участвующих в симбиотической молекулярной коммуникации. В этом протоколе подробно описано систематическое конструирование одноцепочечных направляющих РНК (sgRNA) и создание матрицы для гомологично-направленной репарации (HDR). Матрица HDR была разработана для облегчения сайт-специфической интеграции репортера зеленого флуоресцентного белка (GFP), фланкирующего сайт расщепления nodC. После доставки конструкции Cas9/sgRNA/HDR посредством бипарентального скрещивания предполагаемые мутанты были идентифицированы с помощью метода скрининга на основе флуоресценции. Успешная делеция локуса nodC размером 1,3 kb в кассете нодуляции (nod) первоначально проверялась путем визуализации экспрессии GFP в колониях мутантов с помощью флуоресцентной микроскопии. Нарушение последовательности было дополнительно подтверждено рестрикционным анализом, амплификацией интегрированной кассеты из геномной ДНК и секвенированием по Сэнгеру. Экспрессия GFP была дополнительно количественно определена с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией. Для подтверждения функционального воздействия мутации были проведены тесты на заражение нута, которые продемонстрировали нарушение нодуляции у растений, инокулированных штаммом ΔnodC M. ciceri, по сравнению со штаммом дикого типа. В целом, данный протокол предоставляет эффективную и воспроизводимую основу для точного нарушения работы генов и функциональных геномных исследований Mesorhizobium.

Введение

Система нуклеазы Cas9 (белок 9, ассоциированный с короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами — CRISPR), первоначально идентифицированная как механизм адаптивного иммунитета у прокариот, была адаптирована в эффективный и надежный инструмент для редактирования генома1,2. Система использует синтетическую направляющую РНК (sgRNA) для идентификации целевых последовательностей ДНК посредством комплементарного спаривания оснований по Уотсону-Крику. sgRNA состоит из 20 нуклеотидов, комплементарных геномному участку, примыкающему к последовательности мотива, прилегающего к протоспейсеру (PAM) NGG. Cas9 создает двухцепочечный разрыв (DSB) в определенном сайте внутри целевой последовательности, как правило, за 3 парами оснований (bp) выше сайта PAM1. Результирующие DSB могут быть восстановлены либо путем негомологичного соединения концов, либо посредством гомологичной репарации (HDR) с использованием донорского шаблона3,4. Эта стратегия широко применялась для нарушения работы генов, а также для методов нокаута и нок-ина у бактерий5,6,7,8. Основной целью данного протокола является разработка эффективного метода редактирования генома Mesorhizobium ciceri с использованием системы CRISPR-Cas9 с широким спектром хозяев.

M. ciceri — грамотрицательная почвенная бактерия, которая функционирует как важный азотфиксирующий эндосимбионт нута (Cicer arietinum)9. Один из штаммов, M. ciceri CC1192, обладает высокой эффективностью нодуляции, и его геном был секвенирован10. Несмотря на сельскохозяйственную значимость, генетические манипуляции с видами Mesorhizobium остаются ограниченными. Системы на основе CRISPR ранее внедрялись и в другие ризобии, включая CRISPR-интерференцию (CRISPRi) у Rhizobium etli11, редактирование генома у Sinorhizobium meliloti12 и редактирование оснований у S. meliloti13. Однако надежная платформа для редактирования генома M. ciceri до сих пор не была описана. Традиционные подходы опираются на гомологичную рекомбинацию с помощью суицидальных плазмид, что является трудоемким процессом, требует нескольких раундов селекции и часто оставляет маркеры устойчивости к антибиотикам в виде геномных «шрамов»14.

Для преодоления этих ограничений векторная система pCasPP, первоначально разработанная для Paenibacillus polymyxa, была адаптирована для использования в M. ciceri15. В основе системы pCasPP лежит Cas9 из Streptococcus pyogenes, кодонно-оптимизированная для актиномицетов с высоким содержанием ГЦ-пар; система также содержит кассету lacZ для сине-белого скрининга клонирования sgRNA под конститутивным промотором gapdh8. Для доставки вектора редактирования проводили бипарентальное скрещивание донорного штамма Escherichia coli и реципиентного штамма Mesorhizobium16. Чтобы повысить эффективность скрининга, в донорную матрицу для HDR был включен вариант зеленого флуоресцентного белка (GFP) bjGFP, первоначально кодонно-оптимизированный для Bradyrhizobium diazoefficiens16. Эта стратегия скрининга на основе флуоресценции была применена для таргетирования эссенциального локуса nodC, который необходим для ранних стадий симбиотической сигнализации между бактерией и нутом17,18.

Данный протокол представляет собой точную и эффективную альтернативу методам случайного химического или ультрафиолетового (УФ) мутагенеза. В ходе валидационных экспериментов более 80% выделенных колоний проявляли флуоресценцию GFP, а репрезентативные отредактированные колонии были дополнительно подтверждены с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенирования по Сэнгеру. Полученные мутанты ΔnodC M. ciceri являются полезным ресурсом для изучения симбиотической сигнализации и взаимодействий между хозяином и микробом. В целом, данная схема предлагает сообществу исследователей ризобий эффективный и масштабируемый подход для функциональных геномных исследований Mesorhizobium.

Протокол

Все экспериментальные протоколы, включающие рост растений, микробную инокуляцию и работу с генетически модифицированными бактериями, проводились в соответствии с институциональными руководствами и правилами. Культивирование растений и инокуляция бактериями осуществлялись в контролируемых условиях камеры роста. Штамм M. ciceri, использованный в данном исследовании, классифицируется как микроорганизм 1-го уровня биобезопасности (BSL-1). Поскольку все эксперименты проводились в закрытых лабораторных условиях без выпуска в открытую среду, официального одобрения институционального комитета по биобезопасности в соответствии с внутренними правилами биобезопасности не требовалось. Все биологические отходы, образовавшиеся в ходе исследования, подвергались автоклавированию перед утилизацией.

1. Подготовка компетентных клеток

Химически компетентные клетки E. coli DH5α и E. coli S17-1λpir были подготовлены и проверены в соответствии с процедурой, описанной в Дополнительном файле 1.

2. Дизайн гидовой РНК

  1. Дизайн гидовых РНК
    1. Откройте платформу Benchling (https://benchling.com/). Войдите в существующий аккаунт Benchling или создайте новый.
    2. Создайте новый проект и откройте инструмент для дизайна гидов CRISPR (CRISPR Guide Design Tool).
    3. Загрузите или вставьте полную последовательность целевой ДНК для дизайна гидовой РНК. Выберите вариант дизайна «Single Guide» и установите длину гида 20 bp.
    4. Выберите референсный геном из доступных вариантов. Для дизайна гидовой РНК, нацеленной на M. ciceri, выберите Bradyrhizobium diazoefficiens USDA 110 в качестве референсного генома. Используйте NGG в качестве последовательности мотива, прилегающего к протоспейсеру (PAM), необходимого для активности Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9).
    5. Используйте алгоритм Hsu et al.19 для расчета прогнозируемой частоты нецелевого расщепления. Поддерживайте пороговое значение ≥50, чтобы минимизировать неспецифическое расщепление на фоне референсного генома.
    6. Используйте алгоритм Doench-Root20 для расчета прогнозируемых показателей эффективности целевого расщепления. Установите порог отбора мишеней ≥60 для идентификации гидов с благоприятной прогнозируемой эффективностью расщепления Cas9 в целевом локусе.
    7. Нажмите «Finish», чтобы сформировать список потенциальных гидовых РНК.
  2. Отбор гидовых РНК
    1. Откройте панель результатов дизайна гидовых РНК.
    2. Отдайте приоритет потенциальным sgRNA, которые, по прогнозам, вызовут двухцепочечный разрыв в пределах 100 bp от старт-кодона трансляции (ATG), что повышает вероятность получения нефункционального белка.
    3. Оцените показатели нецелевой и целевой активности. Отдавайте приоритет более высокому показателю нецелевой активности перед несколько более высоким показателем целевой активности, чтобы снизить риск непреднамеренного нецелевого расщепления.
    4. Выберите одну или две потенциальные одноцепочечные гидовые РНК (sgRNA), которые удовлетворяют всем критериям отбора.
  3. Подготовка олигонуклеотидов gRNA
    1. Сгенерируйте обратно-комплементарную последовательность выбранной гидовой РНК.
    2. Добавьте последовательность 5′-ACGC к 5′-концу гидовой РНК и последовательность 5′-AAAC к 5′-концу обратно-комплементарной цепи.
    3. Закажите оба олигонуклеотида с 5′-фосфорилированием и очисткой с помощью ПААГ-электрофореза (PAGE) при масштабе синтеза 25 nmol.
  4. Отжиг олигонуклеотидов gRNA
    1. Приготовьте 30 mM HEPES-буфер, растворив 7,15 g HEPES-кислоты примерно в 800 mL дистиллированной воды. Доведите pH до 7,8 с помощью гидроксида натрия и доведите конечный объем до 1 L.
    2. Ресуспендируйте каждый фосфорилированный олигонуклеотид в воде, свободной от нуклеаз, до конечной концентрации 100 µM. Смешайте 5 µL каждого олигонуклеотида с 90 µL 30 mM HEPES-буфера в стерильной микроцентрифужной пробирке.
    3. Кратковременно перемешайте на вортексе и центрифугируйте для сбора жидкости. Проведите отжиг олигонуклеотидов в термоциклере, инкубируя при 95°C в течение 5 min и охлаждая до 4°C со скоростью 0,1°C/s.
    4. Разведите отожженные олигонуклеотиды в 10 раз, используя воду, свободную от нуклеаз.
  5. Сборка gRNA в вектор pCasPP
    1. Получите вектор pCasPP, описанный ранее Rütering et al.15.
    2. Последовательность плазмиды была предоставлена Йохеном Шмидом, а конструкция, использованная в данном исследовании, была получена через доктора Сайеда Шамса Яздани (ICGEB).  
    3. Подготовьте реакционную смесь для Golden Gate сборки, содержащую 100 ng вектора pCasPP, 0,3 µL отожженной олигонуклеотидной вставки, 2 µL 10× буфера для Т4 ДНК-лигазы, 1 µL Т4 ДНК-лигазы, 1 µL рестриктазы BbsI и воду, свободную от нуклеаз, до конечного объема 20 µL.
    4. Подготовьте реакцию отрицательного контроля, заменив вставку водой, свободной от нуклеаз.
    5. Осторожно перемешайте содержимое пробирок и кратковременно центрифугируйте.
  6. Условия циклирования при Golden Gate сборке
    1. Поместите пробирки с реакцией в термоциклер. Проведите девять циклов, состоящих из 37°C в течение 10 min, затем 16°C в течение 10 min.
    2. Инкубируйте смеси при 50°C в течение 5 min, а затем при 65°C в течение 20 min. Храните образцы при 4°C до использования.
  7. Трансформация продуктов сборки
    1. Разморозьте 50 µL компетентных клеток Escherichia coli DH5α на льду в течение 10–15 min.
    2. Добавьте по 3 µL каждой реакции Golden Gate сборки в компетентные клетки. Параллельно проведите трансформацию с отрицательным контролем. Инкубируйте смеси на льду в течение 30 min.
    3. Проведите тепловой шок клеток при 42°C в течение 45 s и немедленно верните пробирки на лед на 2 min. Добавьте 950 µL среды Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC).
    4. Приготовьте среду SOC, содержащую 0,5% дрожжевого экстракта, 2% триптона, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄ и 20 mM глюкозы. Стерилизуйте среду путем фильтрации через шприцевой фильтр 0,4 µm в асептических условиях.
    5. Инкубируйте культуры при 37°C и 180 rpm в течение 1 h.
  8. Отбор положительных трансформантов
    1. Приготовьте чашки с LB-агаром, дополненным 50 µg/mL неомицина, 0,2 mM изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом (IPTG) и 32 mg/L 5-бром-4-хлоро-3-индолил-β-D-галактопиранозидом (X-gal). Высейте по 100 µL культуры восстановления на селективные чашки. Инкубируйте чашки при 37°C в течение 12–16 h.
    2. Отоберите белые колонии и удалите синие. Убедитесь, что на чашке с отрицательным контролем выросло менее пяти колоний.
  9. Скрининг и экспансия положительных клонов
    1. Перенесите три или четыре независимые белые колонии на свежие селективные чашки с LB-агаром.
    2. Инкубируйте чашки при 37°C в течение 12–16 h. Инокулируйте отдельные колонии в 10 mL среды LB, дополненной 50 µg/mL неомицина.
    3. Обрабатывайте каждую конструкцию с гидовой РНК независимо на всех последующих этапах рабочего процесса.
  10. Валидация конструкций pCasPP-gRNA
    1. Соберите бактериальные культуры центрифугированием. Выделите плазмидную ДНК с помощью набора для очистки плазмид на силикатных колонках.
    2. Проведите рестрикцию выделенной плазмидной ДНК ферментами XbaI и EcoRI в соответствующем реакционном буфере в течение 1 h при 37°C.
    3. Разделите продукты рестрикции в 1% агарозном геле, приготовленном на 1× Tris-acetate-EDTA (TAE) буфере, содержащем бромистый этидий в конечной концентрации 0,5 µg/mL.
    4. Проводите электрофорез при 90–110 V до тех пор, пока фронт красителя не пройдет примерно 70–80% длины геля. Визуализируйте фрагменты ДНК с помощью УФ-трансиллюминатора.
    5. Подтвердите положительные клоны по наличию фрагмента 1 280 bp, а пустые векторы-контроли — по фрагменту 1 630 bp. Пустой вектор pCasPP имеет размер примерно 9 663 bp и содержит ген lacZ; вставка олигонуклеотида gRNA длиной 24 bp удаляет фрагмент lacZ, создавая более короткую конструкцию pCasPP, содержащую gRNA. Сайты рестрикции XbaI и EcoRI, фланкирующие область lacZ, используются для диагностического подтверждения клонирования gRNA.
  11. Приготовление глицериновых стоков
    1. Вырастите подтвержденный положительный клон в селективной среде LB.
    2. Приготовьте глицериновый сток, смешав 700 µL культуры в логарифмической фазе с 300 µL стерильного 50% глицерина. Перенесите смесь в стерильные криопробирки. Храните глицериновые стоки при −80°C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте повторных циклов замораживания-оттаивания. Приготовьте несколько аликвот для поддержания стабильности плазмид и жизнеспособности бактерий. Завершенную реакцию Golden Gate сборки можно хранить при 4°C в течение ночи или при −20°C в течение 1–2 недель перед трансформацией.

3. Сборка матрицы для гомологично-направленной репарации

  1. Подготовка вставки зеленого флуоресцентного белка (GFP)
    1. Получите плазмиду pRJPaph-bjGFP, содержащую флуоресцентную репортерную кассету16 (Таблица 1)10,15,16,21,22,23. Плазмида была предоставлена проф. Хансом-Мартином Фишером (ETH Zurich, Швейцария) и доступна через Addgene (плазмида #67032).
    2. Вырежьте кассету gfp из pRJPaph-bjGFP с помощью рестрикции ферментами SacI и KpnI, как описано в Дополнительном файле 2 (шаг 3.1). Последовательность gfp в pRJPaph-bjGFP представляет собой синтетический ген bjGFP с кодонной оптимизацией для Bradyrhizobium diazoefficiens.
    3. Очистите ожидаемый фрагмент gfp размером 1081 bp.
  2. Конструирование pUC18-gfp
    1. Получите векторный остов pUC18 (плазмида Addgene #50004)21.
    2. Линеаризуйте pUC18 с помощью SacI и KpnI, как описано в Дополнительном файле 2 (шаг 3.2).
    3. Лигируйте очищенный фрагмент gfp в линеаризованный вектор pUC18, как описано в Дополнительном файле 2 (шаг 3.2).
    4. Трансформируйте компетентные клетки E. coli DH5α, используя процедуру трансформации, описанную в шаге 2.7, заменив реакционную смесь для сборки Golden Gate смесью лигирования, полученной в шаге 3.2.3.
    5. Отоберите положительные трансформанты и подтвердите вставку gfp с помощью ПЦР-скрининга колоний (colony PCR), как описано в Дополнительном файле 2 (шаг 3.2).
  3. Амплификация плеч гомологии
    1. Разработайте праймеры для амплификации вышележащего (UHA) и нижележащего (DHA) плеч гомологии длиной примерно 400–500 bp из геномной ДНК M. ciceri (Таблица 2).
    2. Внесите сайты рестрикции SacI/EcoRI в праймеры UHA и сайты рестрикции XbaI/KpnI в праймеры DHA. Используйте праймеры F_nodC_Up_EcoRI и R_nodC_Up_SacI для амплификации UHA, а также праймеры F_nodCdown_KpnI и R_nodCdown_XbaI для амплификации DHA (Таблица 2).
    3. Выделите геномную ДНК M. ciceri согласно методике Weerakkody et al.25.
    4. Амплифицируйте и очистите фрагменты UHA и DHA, как описано в Дополнительном файле 2 (шаг 3.3).
  4. Конструирование pUC18-UHA-gfp
    1. Клонируйте фрагмент UHA в pUC18-gfp с помощью EcoRI и SacI, как описано в Дополнительном файле 2 (шаг 3.4).
    2. Подтвердите правильность сборки плазмиды путем рестрикции с помощью XbaI и KpnI. При успешной сборке должны образоваться фрагменты размером примерно 500 и 3725 bp.
    3. Продолжите работу с одним проверенным клоном.
  5. Конструирование pUC18-UHA-gfp-DHA
    1. Клонируйте фрагмент DHA в pUC18-UHA-gfp с помощью KpnI и XbaI, как описано в Дополнительном файле 2 (шаг 3.5).
    2. Подтвердите правильность сборки путем рестрикции с помощью SacI и EcoRI. При успешной сборке должны образоваться фрагменты размером примерно 400 и 4271 bp.
    3. Проверьте 5–6 клонов-кандидатов методом секвенирования по Сэнгеру с использованием праймеров F_nodC_Up_EcoRI, BjGFP_BP_F1 и R_nodCdown_XbaI (Таблица 2), которые в совокупности охватывают большую часть последовательности кассеты для гомологично-направленной репарации (HDR).
  6. Амплификация и очистка окончательного шаблона HDR
    1. Амплифицируйте полную кассету HDR с помощью праймеров F_FL_nodCgfp_XbaI и R_nodCdown_XbaI (Таблица 2).
    2. Очистите ожидаемый HDR-фрагмент размером 2012 bp и проведите рестрикцию очищенного ПЦР-продукта ферментом XbaI, как описано в Дополнительном файле 2 (шаг 3.6).
  7. Подготовка векторов pCasPP-gRNA
    1. Возьмите плазмиды pCasPP-gRNA1 и pCasPP-gRNA2, полученные в шаге 2.
    2. Линеаризуйте плазмиды ферментом XbaI и дефосфорилируйте векторный остов, как описано в Дополнительном файле 2 (шаг 3.7).
  8. Клонирование шаблона HDR в векторы pCasPP-gRNA
    1. Лигируйте кассету HDR в линеаризованные по XbaI векторы pCasPP-gRNA1 или pCasPP-gRNA2, как описано в Дополнительном файле 2 (шаг 3.8).
    2. Трансформируйте компетентные клетки E. coli DH5α и отоберите трансформанты на LB-агаре, содержащем 50 µg/mL неомицина.
  9. Скрининг клонов, содержащих HDR
    1. Проведите скрининг трансформантов на флуоресценцию GFP с помощью флуоресцентного стереомикроскопа, оснащенного стандартным набором фильтров для GFP (возбуждение 470–488 nm; эмиссия 507–510 nm).
    2. Классифицируйте колонии как GFP-положительные при наличии четкой однородной зеленой флуоресценции, которая явно превышает слабую автофлуоресценцию, наблюдаемую в нередактированных колониях отрицательного контроля.
    3. Нарастите GFP-положительные клоны и выделите плазмидную ДНК.
  10. Валидация сборки HDR-вектора
    1. Подтвердите вставку HDR путем рестрикции ферментом XbaI.
    2. Подтвердите успешную сборку по высвобождению ожидаемого HDR-фрагмента размером 2012 bp вместе с векторным остовом pCasPP-gRNA размером примерно 9,300 bp.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После тепловой инактивации рестриктаз и фосфатазы реакционные смеси можно хранить при 4°C в течение ночи или при −20°C до 1 месяца. Храните подтвержденные плазмидные конструкции при −20°C для длительного сохранения.
Штамм или плазмидаОписаниеСписок литературы
Mesorhizobium ciceri CC1192Реципиентный штамм, используемый для редактирования генома с помощью системы CRISPR-Cas9 и анализов нодуляции нутаХаскетт и др.10
pCasPPВектор для редактирования генома CRISPR-Cas9, используемый для клонирования направляющей РНК и доставки матрицы для гомологично-направленной репарации (HDR)Рютеринг и др.15
pRJPaph-bjGFPРепортерная плазмида с GFP, используемая в качестве источника GFP-кассеты
(плазмида Addgene #67032)		Ледерманн и др.16
pUC18Универсальный клонирующий вектор, используемый для сборки матрицы HDR
(плазмида Addgene №50004)		Норрандер и др.21
Escherichia coli S17-1λПИР (пассивный инфракрасный датчик)Донорский штамм, используемый для бипарентальной конъюгацииSimon и др.22
Escherichia coli DH5αХост-штамм для клонирования, используемый для репликации плазмидHanahan и др.23

Таблица 1: Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные в данном исследовании. В этой таблице перечислены бактериальные штаммы и плазмиды, использованные для репликации плазмид, редактирования генома с помощью системы CRISPR-Cas9, сборки матриц для гомологичной репарации (HDR), бипарентального скрещивания и флуоресцентного маркирования Mesorhizobium ciceri CC1192.

КатегорияНазваниеПоследовательность (5′ figure-protocol-1 3′) или описание
Бактериальный штаммEscherichia coli DH5αШтамм-хозяин для клонирования
Бактериальный штаммEscherichia coli S17-1λpirДонорский штамм для бипарентального скрещивания
Вектор для клонированияpUC18Основной вектор для клонирования
CRISPR-векторpCasPPCRISPR-Cas9 вектор с широким кругом хозяев
Репортерная плазмидаpRJPaph-bjGFPРепортерная плазмида GFP
ПраймерF_guide1_BbsIpACGCTGTTTACAGAGGCATGCAAG
ПраймерR_guide1_BbsIpAAACCTTGCATGCCTCTGTAAACA
ПраймерF_guide2_BbsIpACGCGCTTGTTCGGATCCGACCGT
ПраймерR_guide2_BbsIpAAACACGGTCGGATCCGAACAAGC
ПраймерF_nodC_Up_EcoRIAAAGAATTCCTCATTGCAAGCCAGCAGT
ПраймерR_nodC_Up_SacIAAAGAGCTCCGGAAAGCTTGTTTCGGATCC
ПраймерF_nodCdown_KpnIAAAGGTACCTCGAGAGCACCGCATAAGAC
ПраймерR_nodCdown_XbaIAATTCTAGATGGTTCGGTACTTTCGTGCA
ПраймерF_FL_nodCgfp_XbaIAAATTCTAGACTCATTGCAAGCCAGCCAGT
ПраймерBjGFP_BP_F1GAAGTTCATCTGCACCACCG
ПраймерBjGFP_BP_R1GTCCTTGAACGAGATGGTGC
ПраймерBjGFP_BP_F2CCAACTTCAAGATCCGCCAC
ПраймерGFP_RCCAACTTCAAGATCCGCCAC
ПраймерBjGFP_BP_R2CTTGTACAGCTCGTCCATGC
Праймер16S_F1ATCCTGGCTCAGAACGAACG
Праймер16S_R1ATTCCCACGCGTTACTCACC
Праймер16S_F2AGTCCGAGAGGGTGAGTGG
Праймер16S_R2GTCAGTACCGAGCCAGTGAG
ПраймерF1_nodCCGATTTCCAGAACCGTCGTC
ПраймерnodC_RCGATTTCCAGAACCGTCGTC
ПраймерR1_nodCTCCCCTGCTACAATGAGGAC
ПраймерF2_nodCAGTGACTCCGCAATTCCAGA
ПраймерR2_nodCTGTCGGTAAAAGTGTTTCCC
ПраймерF1_nodBTGGTTCGGTACTTTCGTGCA
ПраймерR1_nodBAGTCGCGTGGATCAATGGAC
ПраймерF1_nodATGATCGTCGCTGAATTGGGC
ПраймерR1_nodACAACTGATGGAGCACTGGGT
ПраймерF1_nodDTGGCCTTAAGAGACGTGTCG
ПраймерR1_nodDAAATGCCTGACCAGCCGTAA

Таблица 2: Бактериальные штаммы, плазмиды и олигонуклеотидные праймеры, использованные в данном исследовании.В этой таблице перечислены бактериальные штаммы, плазмиды и олигонуклеотидные праймеры, использованные для конструирования единой направляющей РНК (sgRNA), сборки матрицы для гомологично-направленной репарации (HDR), диагностической полимеразной цепной реакции (ПЦР), секвенирования по Сэнгеру и количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-кПЦР). Последовательности праймеров представлены в ориентации 5′ figure-protocol-2 3′. Примечание: BjGFP_BP_F2 и GFP_R относятся к одной и той же олигонуклеотидной последовательности, но указаны под разными названиями праймеров, так как они использовались в разных экспериментальных анализах.

4. Бипарентальное скрещивание для переноса плазмиды в M. ciceri CC1192

  1. Трансформация донорских клеток E. coli
    1. Трансформируйте клетки E. coli S17-1λpir конструктами pCasPP-gRNA1-HDR или pCasPP-gRNA2-HDR в соответствии с процедурой, описанной в Дополнительном файле 3 (этап 4.1).
    2. Отберите трансформанты на агаре LB, содержащем 50 µg/mL неомицина.
    3. Проведите скрининг трансформантов на наличие флуоресценции GFP, используя возбуждение при длине волны примерно 488 nm и детектирование эмиссии при примерно 510–520 nm.
    4. Классифицируйте колонии как GFP-положительные, если они проявляют равномерную, отчетливую зеленую флуоресценцию, которая отсутствует у контрольных нетрансформированных колоний E. coli S17-1λpir при исследовании с идентичными настройками микроскопа.
    5. Приготовьте глицериновые стоки из подтвержденных GFP-положительных донорных клонов.
  2. Приготовление посевных и стартовых культур
    1. Приготовьте стартовые культуры донорной E. coli S17-1λpir и реципиентной M. ciceri в соответствии с Дополнительным файлом 3 (этап 4.2).
    2. Вырастите стартовые культуры до OD₆₀₀ 0,3–0,4, что соответствует расчетной плотности клеток примерно 1 × 108 CFU/mL.
  3. Приготовление субкультур для бипарентального скрещивания
    1. Приготовьте субкультуры донора и реципиента и вырастите их до требуемой экспоненциальной фазы роста в соответствии с Дополнительным файлом 3 (этап 4.3).
    2. Измерьте оптическую плотность при 600 nm (OD600) с помощью УФ-видимого спектрофотометра согласно процедуре измерения оптической плотности, описанной в Дополнительном файле 1 (этап 1.2.3).
  4. Процедура бипарентального скрещивания
    1. Проведите бипарентальное скрещивание на мембранном фильтре в соответствии с Дополнительным файлом 3 (этап 4.4).
    2. Нанесите четыре аликвоты суспензии для скрещивания на стерильный мембранный фильтр из поливинилиденфторида (PVDF) с порами 0,22 µm (диаметром 47 mm), обеспечив достаточное расстояние между каплями для предотвращения их смешивания.
  5. Восстановление и селекция трансконъюгантов
    1. Восстановите трансконъюганты и проведите двойную антибиотиковую селекцию в соответствии с Дополнительным файлом 3 (этап 4.5).
    2. Проведите повторные пассажи трансконъюгантов на среде, содержащей только карбенициллин, для элиминации остаточных плазмид.
    3. Подтвердите очистку от плазмид по отсутствию роста колоний на среде с неомицином и с помощью диагностической ПЦР, демонстрирующей отсутствие остова pCasPP при сохранении интегрированной в хромосому HDR-кассеты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для проверки стабильности интегрированной модификации и удаления остаточных эписомальных плазмид требуется последовательное пассирование.
  6. Скрининг GFP-положительных колоний
    1. Проведите скрининг очищенных трансконъюгантов на флуоресценцию GFP и сравните их с контролем дикого типа M. ciceri в соответствии с Дополнительным файлом 3 (этап 4.6).
    2. Отберите флуоресцирующие колонии в качестве предполагаемых HDR-положительных штаммов.
    3. Классифицируйте колонии как GFP-положительные, если они проявляют равномерную, отчетливую зеленую флуоресценцию, которая отсутствует у колоний M. ciceri дикого типа при идентичных настройках микроскопа и условиях экспозиции.
    4. Подтвердите GFP-положительные колонии с помощью диагностической ПЦР перед переходом к последующей валидации.
    5. Храните подтвержденные колонии на дрожжево-маннитном (YM) агаре при 4°C для краткосрочного поддержания или в виде глицериновых стоков с содержанием 20%–25% глицерина при −80°C для длительного сохранения.

5. Валидация мутантов nodC

  1. Валидация интеграции GFP в локус nodC
    1. Инокулируйте одну колонию M. ciceri, экспрессирующую GFP, в 10 мл дрожжевого маннитного бульона (YMB), дополненного карбенициллином в концентрации 100 µg/mL24. Инкубируйте культуру при 28°C с перемешиванием при 180 об/мин в течение 20–24 ч.
    2. Соберите бактериальные клетки путем центрифугирования при 8,000 × g в течение 10 мин при 25°C. Осадите клетки и изолируйте геномную ДНК согласно методу Weerakkody et al.25.
    3. Проведите диагностическую ПЦР, используя геномную ДНК в качестве матрицы (Таблица 2). Подготовьте ПЦР-реакцию объемом 10 µL, содержащую 5 µL 2× PCR Master Mix, 0.2 µM праймеров F1_nodB и nodC_R или праймеров F1_nodB и gfp_R, а также 50 ng геномной ДНК.
    4. Запрограммируйте термоциклер на начальную денатурацию при 95°C в течение 5 мин, затем 35 циклов: 95°C в течение 1 мин, 62°C в течение 30 с и 72°C в течение 45 с, с финальной элонгацией при 72°C в течение 5 мин.
    5. Проведите разделение продуктов ПЦР в 1% (мас./об.) агарозном геле, как было описано ранее. Подтвердите интеграцию GFP путем обнаружения продукта размером около 430 bp у дикого типа (WT) и продукта размером около 1500 bp у мутанта с нарушенной функцией при использовании F1_nodB/nodC_R, а также продукта размером около 1000 bp у мутанта (отсутствие продукта у WT) при использовании F1_nodB/gfp_R.
    6. Включите соответствующие контроли при валидации ПЦР. В качестве положительного контроля используйте плазмидную ДНК, содержащую целевую последовательность, а в качестве отрицательного контроля — контроль без матрицы (NTC), содержащий воду, свободную от нуклеаз.
  2. Количественное определение экспрессии GFP методом количественной ПЦР с обратной транскрипцией (RT-qPCR)
    1. Изолируйте общую РНК из культур WT и мутантного штамма M. ciceri с использованием реагента TRIzol согласно инструкциям производителя.
    2. Обработайте РНК ДНКазой I согласно инструкциям производителя для удаления contaminating геномной ДНК. Проверьте полное удаление ДНК с помощью контроля без обратной транскриптазы (−RT) во время qPCR.
    3. Синтезируйте первую цепь кДНК из 1 µg общей РНК, используя коммерчески доступный набор для синтеза первой цепи кДНК согласно инструкциям производителя. Подготовьте реакцию объемом 20 µL, содержащую РНК, олиго(dT)-праймеры, dNTP, реакционный буфер, ингибитор РНКазы и обратную транскриптазу.
    4. Инкубируйте реакцию синтеза кДНК при 42°C в течение 60 мин с последующей тепловой инактивацией при 70°C в течение 5 мин. Храните кДНК при −20°C до использования.
    5. Подготовьте реакции RT-qPCR в технических трипликатах. Соберите реакции объемом 10 µL, содержащие 5 µL 2× SYBR Green Master Mix, 0.2 µM праймеров BjGFP_BP_F1 и BjGFP_BP_R1 для амплификации GFP или праймеров 16S_F1 и 16S_R1 для амплификации референсного гена (Таблица 2), 2 µL матрицы кДНК (приблизительно 20 ng) и воду, свободную от нуклеаз.
    6. Проведите RT-qPCR с использованием следующих условий циклирования: начальная денатурация при 95°C в течение 2 мин, затем 40 циклов: 95°C в течение 15 с и 58°C в течение 45 с, с последующим анализом кривых плавления в диапазоне от 65°C до 95°C.
    7. Проведите qRT-PCR с использованием системы детекции Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR. Проанализируйте графики амплификации, значения Ct и кривые плавления с помощью программного обеспечения Bio-Rad CFX Manager.
    8. Рассчитайте относительную экспрессию генов методом 2−ΔΔCt. Нормализуйте экспрессию по референсному гену 16S rRNA и используйте штамм M. ciceri дикого типа в качестве калибратора. Проанализируйте три биологических повторности, каждая из которых измерена в технических трипликатах.
  3. Оценка нодуляционного потенциала
    1. Подготовка бактериального инокулята
      1. Инокулируйте отдельные колонии штаммов WT и мутантного штамма в селективный YMB, содержащий 100 µg/mL карбенициллина. Инкубируйте культуры при 28°C с перемешиванием при 180 об/мин в течение 30–36 ч.
      2. Разбавьте культуры 1:100 в свежем селективном YMB и контролируйте рост, измеряя OD600 с помощью УФ-видимого спектрофотометра. Обнулите прибор по неинокулированному YMB и продолжайте инкубацию до достижения культурами OD600 от 0.3 до 0.4, что соответствует примерно 1 × 108 КОЕ/мл.
      3. Используйте 3 мл стандартизированной бактериальной суспензии для инокуляции каждого растения.
    2. Анализ инфицирования растений нута
      1. Получите семена C. arietinum сорта BDG25618,24 из ICAR–Indian Agricultural Research Institute (IARI), Нью-Дели, Индия.
      2. Тщательно промойте семена под проточной водопроводной водой, затем очищенной водой Milli-Q. Стерилизуйте поверхность семян в 1% растворе гипохлорита натрия в течение 5 мин при перемешивании и промойте пять раз стерильной очищенной водой.
      3. Обработайте семена 0.1% раствором фунгицида Бавистин (50% смачиваемый порошок карбендазима) в течение 2–3 ч при комнатной температуре. Промойте обработанные семена дважды стерильной очищенной водой.
      4. Поместите семена на влажную стерильную фильтровальную бумагу в стерильные чашки Петри (110 мм × 40 мм), запечатайте Parafilm и инкубируйте в темноте при 28°C ± 2°C в течение 3 дней.
      5. Перенесите проросшие просеянцы по отдельности в стерильный песок. Стерилизуйте песок при 121°C и 15 psi в течение 20 мин перед использованием.
      6. Приготовьте беззотную питательную среду МакНайта, растворив 6.0 g CaSO₄, 1.0 g MgSO₄·7H₂O, 1.0 g KH₂PO₄, 1.5 g KCl, 14.3 mg H₃BO₃, 0.4 mg CuSO₄·5H₂O, 0.08 mg MnSO₄·4H₂O, 0.45 mg H₂MoO₄ и 1.1 mg ZnSO₄·7H₂O в стерильной дистиллированной воде до конечного объема 5 L.
      7. Выращивайте просеянцы в горшках диаметром 10 см со стерильным песком, поддерживая по четыре растения в горшке. Поливайте каждый горшок дважды в неделю 20 мл беззотного раствора МакНайта.
      8. Содержите растения в контролируемых условиях: 22°C ± 2°C (день), 18°C ± 2°C (ночь), относительная влажность 55%–60%, фотопериод 16 ч свет/8 ч темнота и интенсивность света 200 µmol фотонов m⁻2 s⁻1. Выращивайте просеянцы в течение 6–7 дней перед инокуляцией.
      9. Внесите 3 мл бактериальной суспензии непосредственно к каждому просеянцу. Создайте ложнообработанный контроль, внеся 3 мл стерильного YMB. Используйте 16 биологических повторностей растений на каждую группу обработки.
      10. Соберите корни и побеги через 20 дней после инокуляции. Подсчитайте количество клубеньков вручную и зафиксируйте сырую биомассу сразу после сбора.
      11. Высушите ткани при 65°C до достижения постоянной массы. Определяйте постоянную массу как два последовательных измерения, полученных с интервалом сушки 24 ч, разница между которыми составляет <0.01 g, затем зафиксируйте сухую биомассу.
      12. Представьте результаты как среднее значение ± стандартную ошибку (SE). Проведите однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим множественным сравнительным тестом Тьюки с использованием GraphPad Prism версии 10.0, принимая P < 0.05 за статистически значимое.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте стерильность на протяжении всего процесса стерилизации семян, проращивания, инокуляции и роста растений.
        ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: При работе с растворами гипохлорита натрия и фунгицидов используйте соответствующие средства индивидуальной защиты, включая перчатки и средства защиты глаз.

Результаты

В данном протоколе метод редактирования генома CRISPR-Cas9 был адаптирован для M. ciceri CC1192 путем нацеливания на локус nodC. Для обеспечения потери функции sgRNA были сконструированы таким образом, чтобы нацеливаться на 5′-проксимальную область кодирующей последовательности nodC, вводя тем самым двухцепочечный разрыв (DSB) в начальной кодирующей области для нарушения трансляции кодируемого белка (Рисунок 1A).

figure-results-1
Рисунок 1. Дизайн одноцепочечных направляющих РНК (sgRNA), нацеленных на локус nodC у Mesorhizobium ciceri. (A) Схематическое изображение локуса M. ciceri nodC, показывающее положения двух 20-п.н. sgRNA, разработанных для таргетинга с помощью системы CRISPR-Cas9. Сайты-мишени sgRNA выделены синим цветом. (B) Нуклеотидные последовательности sgRNA1 и sgRNA2, нацеленных на локус nodC. Мотив, прилегающий к протоспейсеру (PAM; 5′-NGG-3′), отмечен красным, а старт-кодон трансляции nodC (ATG) выделен желтым цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Две целевые последовательности длиной 20 bp были идентифицированы непосредственно перед последовательностью PAM 5′-NGG-3′ (Рисунок 1B). In silico анализ этих кандидатных sgRNA с использованием алгоритма Hsu и др.19 дал показатели специфичности, равные 100, что указывает на высокую прогнозируемую специфичность таргетирования и отсутствие значимой комплементарности вне целевого участка в геноме M. ciceri. Были отмечены незначительные различия в прогнозируемых показателях эффективности воздействия выбранных sgRNA (Таблица 3), что послужило основанием для выбора гидов для последующей экспериментальной оценки.

Целевая позиция
(п. н.)		Цепьпоследовательность sgRNA (5’′ figure-results-2 3′)PAMПоказатель специфичностиПоказатель эффективности
77+TGTTTACAGAGGCATGCAAGCGG10043.58
139+GCTTGTTCGGATCCGACCGTTGG99.747.63

Таблица 3: Кандидаты в одноцепочечные гидовые РНК (sgRNA), разработанные для редактирования гена nodC у Mesorhizobium ciceri с помощью системы CRISPR-Cas9. Кандидаты sgRNA были разработаны с использованием инструмента Benchling CRISPR Guide Design Tool с использованием генома Bradyrhizobium diazoefficiens USDA 110 в качестве референсного. Гиды ранжировали по прогнозируемой специфичности и показателям эффективности попадания в цель; были отобраны те, которые нацелены на последовательности, расположенные рядом с трансляционным старт-кодоном nodC и содержащие необходимый мотив прилежащего протоспейсера (PAM) NGG для Cas9 из Streptococcus pyogenes (SpCas9).

Для облегчения HDR и флуоресцентного скрининга предполагаемых мутантов была собрана HDR-кассета с использованием клонирующего вектора pUC18 (Рисунок 2). Репортерная кассета gfp была вырезана из pRJPaph-bjGFP путем рестрикционного расщепления ферментами SacI и KpnI и лигирована в линеаризованный остов pUC18 (Рисунок 2A). После трансформации в E. coli предполагаемые положительные клоны были идентифицированы с помощью сине-белого скрининга. Интеграция вставки gfp в остов pUC18 была дополнительно подтверждена ПЦР-амплификацией с использованием ген-специфических праймеров, в результате которой в положительных клонах был получен ожидаемый ампликон размером 500 bp (Рисунок 2A).

figure-results-3
Рисунок 2. Конструирование системы CRISPR-Cas9 для гомологично-направленной репарации (HDR) с целью инактивации nodC. (A) Конструирование и валидация промежуточной плазмиды pUC18-gfp. Верхняя панель представляет карту плазмиды pUC18-gfp, созданной путем вставки кассеты зеленого флуоресцентного белка (gfp) в остов pUC18. Средняя панель демонстрирует репрезентативные колонии после сине-белого скрининга. Нижняя панель показывает валидацию колоний с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием пары праймеров BjGFP_BP_F1 и BjGFP_BP_R2. (B) Последовательная сборка матрицы HDR в остове pUC18. Карты плазмид и анализ рестрикции подтверждают вставку upstream-плеча гомологии (UHA), downstream-плеча гомологии (DHA) и полной HDR-кассеты UHA-gfp-DHA. (C) Клонирование и валидация HDR-кассеты UHA-gfp-DHA в вектор CRISPR-Cas9 pCasPP. Верхняя панель показывает итоговую карту плазмиды pCasPP-HDR, а нижняя панель — рестрикционный анализ, подтверждающий вставку HDR-кассеты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Затем была собрана конструкция для HDR путем введения плеч гомологии nodC, фланкирующих кассету gfp. UHA длиной 500 bp и DHA длиной 400 bp, расположенные рядом с предполагаемым сайтом расщепления Cas9, последовательно клонировали в конструкцию pUC18-gfp с помощью рестрикции и лигирования (Рисунок 2B). Сборку кассеты UHA-gfp-DHA подтвердили анализом рестрикции, в результате которого был получен ожидаемый фрагмент размером 2012 bp (Рисунок 2B). Затем полную кассету HDR субклонировали в CRISPR-вектор широкого спектра хозяев pCasPP (Рисунок 2C). Анализ рестрикции подтвердил целостность итоговой конструкции и успешную сборку вектора доставки для редактирования генома M. ciceri (Рисунок 2C).

Было проведено бипарентальное спаривание между донором E. coli S17-1λПИР (протеоингибиторы) и реципиент M. ciceri штамм, в который вводится конструкция pCasPP-gRNA-HDR M. ciceri (Рисунок 3A). Рисунок 3B иллюстрирует кивок организация оперона и предполагаемая замена nodC локус по GFP (зеленый флуоресцентный белок) кассету посредством гомологичной рекомбинации с использованием матрицы HDR. Колонии трансконъюгантов первоначально идентифицировали путем скрининга по флуоресценции GFP после бипарентального скрещивания (Рисунок 3B и 3C). Более 80 % восстановленных колоний проявляли флуоресценцию GFP при использовании gRNA2, и более 65 % колоний проявляли флуоресценцию после введения gRNA1 (Рисунок 3C). Поскольку один только флуоресцентный скрининг не позволяет отличить экспрессию GFP из плазмиды от успешной геномной интеграции, для подтверждения локус-специфической вставки репортерной кассеты была проведена последующая молекулярная валидация.

figure-results-4
Рисунок 3. Нарушение локуса nodC в Mesorhizobium ciceri с помощью системы CRISPR-Cas9. (A) Схематическое изображение бипарентального скрещивания, использованного для переноса конструкции pCasPP-gRNA-HDR из донорских клеток Escherichia coli S17-1λpir в реципиентные клетки M. ciceri. (B) Схема, иллюстрирующая замену локуса nodC кассетой gfp посредством гомологичной рекомбинации (HDR) после расщепления системой CRISPR-Cas9. Шаблон HDR содержит плечи гомологии длиной примерно 500 bp выше и 400 bp ниже по течению, фланкирующие кассету gfp. (C) Скрининг колоний трансконъюгантов M. ciceri на основе флуоресценции. Представлены репрезентативные изображения GFP-положительных колоний, полученные с помощью флуоресцентной и светлопольной стереомикроскопии, а также процент полученных флуоресцентных трансконъюгантов после бипарентального скрещивания с использованием конструкций, содержащих sgRNA1 или sgRNA2. Планки погрешностей соответствуют стандартному отклонению. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Для подтверждения интеграции кассеты gfp в локус nodC репрезентативные GFP-положительные колонии были подвергнуты ПЦР-анализу. Амплификация участка генома, охватывающего nodB и nodC, привела к образованию фрагмента размером 1511 bp в отредактированных клонах, что соответствует интеграции репортерной кассеты, тогда как штамм дикого типа (WT) дал ампликон размером 430 bp (Рисунок 4A). ПЦР-амплификация с использованием специфичных для gfp и фланкирующих nodC праймеров позволила получить четкий фрагмент размером 997 bp в отредактированных клонах, в то время как в контроле WT амплификация не была обнаружена, что подтверждает локус-специфичную вставку. Ориентация репортерной кассеты была подтверждена с помощью секвенирования по Сенгеру. Кроме того, экспрессия GFP в отредактированных штаммах была оценена с помощью RT-qPCR, которая показала повышенное накопление транскриптов GFP по сравнению со штаммом WT (Рисунок 4B). Значения экспрессии рассчитывали методом 2−ΔΔCt с нормализацией по референсному гену 16s, используя штамм WT в качестве контроля. Данные представлены как среднее ± SD трех биологических повторов (n = 3). Статистическую значимость определяли с помощью однофакторного ANOVA с последующим тестом Даннетта относительно контроля WT.

Текущим ограничением данного исследования является отсутствие контрольного вектора, такого как пустой-gRNA pCasPP-HDR, для установления базового коэффициента рекомбинации. Будущие исследования должны включать такой контроль.

figure-results-5
Рисунок 4. Молекулярная валидация мутантов ΔnodC Mesorhizobium ciceri. (A) Подтверждение делеции nodC с помощью ПЦР. На левой панели показана амплификация с использованием пары праймеров F1_nodB и nodC_R. Дорожка M — маркер длин ДНК; дорожки 1–4 — мутанты ΔnodC M. ciceri; дорожка WT — дикий тип M. ciceri. На правой панели показана амплификация с использованием пары праймеров F1_nodB и gfp_R. Дорожка M — маркер длин ДНК; дорожки 1–4 — мутанты ΔnodC M. ciceri; дорожка WT — дикий тип M. ciceri. Указаны ожидаемые размеры ампликонов. (B) Относительная экспрессия зеленого флуоресцентного белка (GFP) у мутантов ΔnodC M. ciceri, определенная методом количественной ПЦР с обратной транскрипцией (RT-qPCR). Экспрессия генов была нормализована по референсному гену 16S рибосомальной РНК (16S rRNA) M. ciceri и выражена относительно контроля дикого типа (WT) с использованием метода 2^−ΔΔCt. Планки погрешностей соответствуют стандартному отклонению. Статистическая значимость определялась относительно контроля WT. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Биологический эффект инактивации nodC оценивали с помощью тестов на инфицирование нута. Растения, инокулированные WT M. ciceri, образовали видимые корневые клубеньки, тогда как растения, инокулированные ΔnodC M. ciceri, характеризовались выраженным снижением или отсутствием клубенькообразования (Рисунок 5A). Неинокулированные контрольные растения оставались без клубеньков, что подтверждает соблюдение стерильных условий эксперимента (Рисунок 5A). Количественный анализ параметров роста растений дополнительно продемонстрировал различия между растениями, инокулированными WT- и ΔnodC M. ciceri, включая длину корня, сырую массу корня, сухую массу корня, длину побега, сырую массу побега, сухую массу побега и количество клубеньков (Рисунок 5B). Растения, инокулированные WT, демонстрировали большее количество клубеньков и более высокие показатели роста по сравнению с растениями, инокулированными ΔnodC M. ciceri, и неинокулированным контролем. Эти результаты согласуются с нарушением функции клубенькообразования, связанной с nodC, и подтверждают применимость данного рабочего процесса на основе CRISPR-Cas9 для исследований в области функциональной геномики M. ciceri. Количественные данные о фенотипе растений анализировали для сравнения различий между группами обработки. В анализ было включено в общей сложности 90 биологических повторностей (n = 30 растений на группу обработки). Данные представлены как среднее ± SD. Статистическую значимость оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Тьюки для множественных сравнений. Различия считались статистически значимыми при P < 0.05.

figure-results-6
Рисунок 5. Функциональная валидация мутантов ΔnodC Mesorhizobium ciceri с использованием анализа инфекции нута. (A) Репрезентативные растения нута (Cicer arietinum) через 20 дней после инокуляции диким типом M. ciceri, ΔnodC M. ciceri или неинокулированного контроля. (B) Количественный анализ параметров роста растений и нодуляции, включая длину корня, сырую массу корня, сухую массу корня, длину побега, сырую массу побега, сухую массу побега и количество клубеньков. Данные представлены для растений, инокулированных диким типом M. ciceri, ΔnodC M. ciceri или неинокулированного контроля. Планки погрешностей соответствуют стандартному отклонению. Статистическая значимость определялась с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим множественным сравнением по тесту Тьюки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот рисунок в большем размере.

Дополнительный файл 1. Подробный протокол подготовки и валидации химически компетентных клеток Escherichia coli.В данном дополнительном файле приведено полное описание процедуры подготовки и валидации химически компетентных клеток Escherichia coli DH5α и E. coli S17-1λpir, включая подготовку бактериальной культуры, индуцирование компетентности, сбор клеток, промывку буфером CaCl₂–глицерол, разделение на аликвоты, криоконсервацию и валидацию путем тестирования эффективности трансформации. Также включены критические меры контроля качества, рекомендации по хранению и критерии приемлемости компетентности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 2. Подробный протокол конструирования матриц для гомологично-направленной репарации (HDR) и сборки векторов для редактирования генома CRISPR-Cas9.В данном дополнительном файле представлены подробные процедуры по вырезанию кассеты зеленого флуоресцентного белка (GFP), конструированию промежуточной плазмиды pUC18-gfp, амплификации и клонированию выше- и нижележащих плеч гомологии, сборке полной матрицы для гомологично-направленной репарации (HDR), подготовке векторов pCasPP-направляющей РНК (gRNA), вставке матриц HDR в плазмиды CRISPR-Cas9, скринингу клонов по флуоресценции, а также валидации рекомбинантных плазмид с помощью рестрикционного анализа и секвенирования по Сэнгеру. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 3. Подробный протокол бипарентального скрещивания и получения трансконъюгантов Mesorhizobium ciceri с GFP-меткой.В данном дополнительном файле описываются подготовка донорного и реципиентного штаммов, бипарентальное скрещивание на мембранном фильтре, восстановление и антибиотический отбор трансконъюгантов, процедуры избавления от плазмид (плазмид-кьюринг), скрининг рекомбинантных колоний на основе флуоресценции, молекулярное подтверждение штаммов с отредактированным геномом, а также краткосрочное и долгосрочное хранение подтвержденных GFP-положительных трансконъюгантов M. ciceri. Приведены подробные условия культивирования, параметры скрещивания и процедуры отбора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Создание системы редактирования генома CRISPR-Cas9 у M. ciceri устраняет серьезное техническое ограничение в генетических манипуляциях с этим важным для сельского хозяйства азотфиксирующим симбионтом. Путем нарушения локуса nodC с использованием репортера gfp и гомологичной рекомбинации (HDR), данный рабочий процесс обеспечивает основу с применением флуоресценции для направленной модификации генома M. ciceri.

Традиционные подходы к генетическим манипуляциям с ризобиями основывались преимущественно на случайном мутагенезе с использованием Tn5 или аллельном обмене, опосредованном sacB19,26,27. Несмотря на то, что эти методы остаются ценными, они трудоемки, часто требуют нескольких раундов контрселекции и могут оставлять в геноме маркеры устойчивости к антибиотикам, что осложняет последующие этапы редактирования. В отличие от них, редактирование генома с помощью системы CRISPR-Cas9 представляет собой более направленную и оптимизированную альтернативу для геномной инженерии. В последних исследованиях сообщалось о применении CRISPR-опосредованного редактирования оснований и систем на базе Cas12e у S. meliloti для снижения токсичности, связанной с Cas912,13, в то время как транскрипционная репрессия с помощью dCas9 изучалась у R. etli11. Насколько нам известно, данная работа представляет собой одно из первых применений CRISPR-Cas9-опосредованной хромосомной дизрупции у M. ciceri. Протокол включает таргетирование с помощью sgRNA, бипарентальную доставку плазмид и HDR-опосредованную рекомбинацию для локус-специфического редактирования. Интеграция репортера gfp в HDR-кассету также облегчает быстрый флуоресцентный скрининг предполагаемых отредактированных колоний, тем самым сокращая количество колоний, требующих последующей молекулярной валидации.

Для успешной реализации данного рабочего процесса важную роль сыграл ряд факторов. Выбор sgРНК с высокой прогнозируемой специфичностью позволил минимизировать потенциальные нецелевые эффекты в пределах M. ciceri генома, в то время как сохранение целостности плеч гомологии способствовало эффективности рекомбинации, опосредованной HDR. Кроме того, оптимизация условий роста донора и реципиента во время бипарентального скрещивания улучшила выход трансконъюгантов. Скрининг на основе флуоресценции позволил быстро идентифицировать предполагаемые мутанты, однако для подтверждения локус-специфической интеграции репортерной кассеты по-прежнему требовалась молекулярная валидация с помощью ПЦР и секвенирования по Сэнгеру. В будущих исследованиях можно использовать контрольный вектор pCasPP-HDR с пустой gRNA для количественной оценки базового коэффициента рекомбинации.

Помимо методологического прогресса, эта платформа может быть использована в будущих исследованиях симбиотической сигнализации и функциональной геномики ризобий, ассоциированных с нутом28. Нут (Cicer arietinum L.) является глобально значимой бобовой культурой и важным компонентом устойчивых сельскохозяйственных систем29,30. Штамм ΔnodC M. ciceri, созданный в данном исследовании, представляет собой потенциально полезный генетический фон для изучения совместимости хозяина и микроба, а также сигнальных путей, связанных с нодуляцией. Предыдущие исследования показали, что малые РНК (sRNA) функционируют как регуляторные эффекторы на ранних стадиях симбиоза в корневых клубеньках31. Следовательно, описанный здесь дефектный по нодуляции штамм ΔnodC M. ciceri может способствовать проведению будущих исследований, сосредоточенных на молекулярных механизмах, лежащих в основе коммуникации в ризосфере и азотфиксирующего симбиоза.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов или конфликтов интересов.

Благодарности

Данная работа была поддержана грантом HRD-16016/15/2023-AFS-DBT от Департамента биотехнологий (DBT)-MK Bhan для доктора Nandita Pasari. Эта работа также была поддержана основным грантом, предоставленным доктору Senjuti Sinharoy Национальным институтом исследования генома растений, Нью-Дели, Индия.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
АгарозаGenetixPG-40005Гель-электрофорез
Алюминиевая фольгаРолия’sGF83048115Общие лабораторные цели
Бактериологический агарHiMediaGRM026Приготовление сред
Платформа Benchling для дизайна гидовых РНК CRISPRBenchlingПоскольку исходный текст не был предоставлен, пожалуйста, введите текст, который необходимо перевести.Дизайн гидовой РНК
Борная кислотаHiMediaPCT0102Макнайт’приготовление раствора
Коническая колба из боросиликатного стеклаSigmaCLS5100500Подготовка культуры
Боросиликатные стеклянные трубкиSigmaDWK73500-1075Подготовка культуры
Дигидрат хлорида кальцияHiMediaMB034Приготовление компетентных клеток
Дигидрат сульфата кальцияHiMediaGRM328Макнайт’приготовление раствора
Карбенициллин динатрийDuchefa BiochemieDUC-C0109.005-18Используется при 100 µg/mL
набор для синтеза кДНКThermo Fisher ScientificAB1543Aсинтез кДНК
Пищевая пленкаОА10954049Общее лабораторное применение
Набор для клонирования/Т4-ДНК-лигазаThermo Fisher ScientificK1422Реакции лигирования
Конго красныйHiMedia573-58-0Работа с микробными культурами
Пятиводный сульфат меди(II)HiMediaPCT0104Макнайт’приготовление раствора
Пробирка для культивированияBorosil9800U08Культивирование первичной бактериальной культуры; 15 см × 2,5 см
Цифровой pH-метрEutech InstrumentsEC PH TUTOR DSРегулировка pH
ДикалийфосфатHiMediaTC596MПриготовление среды YMB
Маркер молекулярного веса ДНКBIO-HELIXDM015-R500Гель-электрофорез
Набор для удаления ДНКазыInvitrogenAM1907Удаление ДНК из выделенной РНК
смесь дНТФThermo ScientificR0181ПЦР-амплификация
ЭтанолSigma-Aldrich1.00983.0511Использовать в концентрации 75%
Бромистый этидийSigma-AldrichE1510Окрашивание ДНК в геле
Термочувствительная щелочная фосфатаза FastAPThermo Fisher ScientificEF0651Дефосфорилирование вектора при клонировании
Буфер FastDigestThermo Fisher ScientificB64Рестрикционное расщепление
Безводный хлорид железа(III)HiMediaTC583Макнайт’приготовление растворов
Флуоресцентный стереомикроскопNikonSMZ25Скрининг GFP
Фунгицид, BavistinЗащита сельскохозяйственных культур CrystalBavistin Карбендазим 50% WPОбработка семян
Набор для экстракции из геляQIAGEN28704Очистка ДНК
ГлицеринThermo Fisher ScientificQ24505Компетентные клетки/глицериновые стоки
Инкубатор для выращивания с орбитальным шейкеромМРЦLOM-150Бактериальная культура
ПерчаткиKimtech97612Средства индивидуальной защиты
HEPESHiMediaMB016Отжиг олигонуклеотидов
ИПТГG BiosciencesRC1113DСине-белый скрининг
Ламинарный шкафBiolinkBL-H1300Стерильные методы работы
LB-агарHiMediaM1151Чашки с бактериальными культурами
Бульон LBHiMediaG1245Бактериальная культура
Сульфат магнияHiMediaGRM1281-500GПриготовление среды YMB
Сульфат магния гептагидратHiMediaPCT0008Макнайт’приготовление раствора
Сульфат марганца(II) тетрагидратSigma-AldrichM3634Макнайт’приготовление раствора
МаннитолHiMediaMB198Приготовление среды YMB
Макнайт’растворПриготовленный в лабораторных условияхПоскольку исходный текст не был предоставлен, пожалуйста, введите текст для перевода.Питательный раствор для растений
Микронаконечники, 0,2–10 µLTarsons521000Работа с жидкостями
Микронаконечники, 2–200 µLTarsons521010Работа с жидкостями
Микронаконечники, 200 мкл–1000 µLTarsons521020XРабота с жидкостями
Микроцентрифужная пробирка, 0,5 млTarsons500000Работа с образцами
Микроцентрифужная пробирка, 1,5 млTarsons500010Обработка образцов
Микроцентрифужная пробирка, 2,0 млTarsons500020Обработка образцов
Молибденовая кислотаSigma-Aldrich232084Макнайт’приготовление растворов
спектрофотометр NanoDropThermo Fisher Scientific13-400-519Количественное определение ДНК/РНК
НеомицинDuchefa BiochemieM0135Используется при 50 µg/mL
Вода, свободная от нуклеазHiMediaML064-100MLПрименение в молекулярной биологии
мастер-микс для ПЦРThermo Fisher ScientificK01712× мастер-микс
Стрипы с ПЦР-пробирками, 0,2 млTarsons610040Подготовка к ПЦР
Чашки Петри, 90 ммПКСК (плюрипотентные стволовые клетки)2041Чашки с агаром
Дозатор, 0,1–2.5 µLEppendorfN10178MРабота с жидкостями
Дозатор, 0,5–10 µLEppendorfH40069LРабота с жидкостями
Пипетка, 2–20 µLEppendorfH30046MРабота с жидкостями
Дозатор, 10–100 µLEppendorfI00395MРабота с жидкостями
Дозатор, 20 мкл–200 µLEppendorfM38186MРабота с жидкостями
Пипетка, 100–1000 µLEppendorfN20610MРабота с жидкостями
Набор для экстракции плазмидной ДНКQIAGEN12143Выделение плазмид
Хлорид калияHiMediaTC010Макнайт’приготовление раствора
Дигидрофосфат калия безводныйHiMediaTC011MМакнайт’приготовление раствора
мембранный фильтр из ПВДФ, 0.22 µm, 47 ммMilliporeSigmaGVWP04700Бипарентальное спаривание
Система для количественной ПЦР в реальном времениBio-RadCFX96ОТ-ПЦР в реальном времени
Настольная центрифуга с охлаждениемEppendorf04-987-373Сбор клеток
Рестриктаза BbsIThermo Fisher ScientificER1011Клонирование гРНК
Рестриктаза, EcoRIThermo Fisher ScientificFD0274Клонирование
Рестриктаза KpnIThermo Fisher ScientificFD0524Клонирование
Рестриктаза SacIThermo Fisher ScientificFD1133Клонирование
Рестриктаза XbaIThermo Fisher ScientificFD0684Клонирование
ДНКаза, не содержащая РНКазыQIAGEN79254Очистка РНК
ПесокРам СуратПесокСубстрат для роста растений
СеквенаторApplied BiosystemsГенетический анализатор ABI3730xlСеквенирование по Сэнгеру
среда SOCПриготовленный в лабораторных условияхПоскольку исходный текст не был предоставлен, пожалуйста, отправьте контент, который необходимо перевести. Я готов приступить к профессиональному переводу ваших материалов JoVE на русский язык, строго соблюдая все указанные требования к академическому стилю, научной терминологии и точности протоколов.Восстановление после трансформации
Хлорид натрияHiMediaTC046Приготовление сред
Гидроксид натрияHiMediaPCT1325Корректировка pH HEPES
Стерильный хирургический скальпельMedicare Surgical16020Вырезание полос из геля / работа с тканями
Стерильный шприцHMD Dispovanшприц объемом 10 мл без иглыСтерилизующая фильтрация
Стерильный шприцевой фильтр, 0.22 µmMerck Millex Durapore12766842Стерилизация фильтрованием
мастер-микс SYBR GreenNew England BiolabsM3003EОТ-ПЦР в реальном времени
ТетрациклинDuchefa BiochemieT01050Используется при 5 µg/mL
АмплификаторApplied BiosystemsA24811ПЦР-амплификация
Рулон салфетокРолия’s07AAECR4885K1ZTОбщее лабораторное использование
реагент TRIzolInvitrogen15596026Выделение РНК
УФ-трансиллюминаторAnalytik JenaTW-43Визуализация геля
УФ-видимый спектрофотометрEppendorfD30Измерение OD600
Кюветы для видимого диапазона спектраEppendorf30079345Измерение OD600
Вортекс-смесительНейтрализацияiSWIX-VTСмешивание образцов
X-galG BiosciencesRC1233Сине-белый скрининг
Дрожжевой экстрактHiMediaRM668-500GПриготовление сред
Гептагидрат сульфата цинкаSigma-AldrichZ0251Макнайт’приготовление раствора

Ссылки

  1. Doudna JA, Charpentier E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 2014;346(6213):1258096.
  2. Jiang W, Bikard D, Cox D, Zhang F, Marraffini LA. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature biotechnology. 2013;31(3):233-9.
  3. Bertrand C, Thibessard A, Bruand C, Lecointe F, Leblond P. Bacterial NHEJ: a never ending story. Molecular microbiology. 2019;111(5):1139-51.
  4. Loureiro A, da Silva GJ. Crispr-cas: Converting a bacterial defence mechanism into a state-of-the-art genetic manipulation tool. Antibiotics. 2019;8(1):18.
  5. Altenbuchner J. Editing of the Bacillus subtilis genome by the CRISPR-Cas9 system. Applied and environmental microbiology. 2016;82(17):5421-7.
  6. Wang Y, et al. Bacterial genome editing with CRISPR-Cas9: deletion, integration, single nucleotide modification, and desirable “clean” mutant selection in Clostridium beijerinckii as an example. ACS synthetic biology. 2016;5(7):721-32.
  7. Oh J-H, van Pijkeren J-P. CRISPR–Cas9-assisted recombineering in Lactobacillus reuteri. Nucleic acids research. 2014;42(17):e131-e.
  8. Cobb RE, Wang Y, Zhao H. High-efficiency multiplex genome editing of Streptomyces species using an engineered CRISPR/Cas system. ACS synthetic biology. 2015;4(6):723-8.
  9. Wanjofu EI, et al. Nodulation and growth promotion of chickpea by Mesorhizobium isolates from diverse sources. Microorganisms. 2022;10(12):2467.
  10. Haskett T, et al. Complete genome sequence of Mesorhizobium ciceri strain CC1192, an efficient nitrogen-fixing microsymbiont of Cicer arietinum. Genome Announcements. 2016;4(3):10.1128/genomea. 00516-16.
  11. Bellahsen O, Díaz-Méndez R, Romero D. Genomic engineering in Rhizobium etli: implementation and evaluation of systems based on dCas9. Frontiers in Microbiology. 2025;16:1604430.
  12. Liu G, et al. An efficient CRISPR/Cas12e system for genome editing in Sinorhizobium meliloti. ACS Synthetic Biology. 2023;12(3):898-903.
  13. Wang L, Xiao Y, Wei X, Pan J, Duanmu D. Highly efficient CRISPR-mediated base editing in Sinorhizobium meliloti. Frontiers in Microbiology. 2021;12:686008.
  14. Schäfer A, et al. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum. Gene. 1994;145(1):69-73.
  15. Rütering M, et al. Tailor-made exopolysaccharides—CRISPR-Cas9 mediated genome editing in Paenibacillus polymyxa. Synthetic Biology. 2017;2(1):ysx007.
  16. Ledermann R, Bartsch I, Remus-Emsermann MN, Vorholt JA, Fischer H-M. Stable fluorescent and enzymatic tagging of Bradyrhizobium diazoefficiens to analyze host-plant infection and colonization. Molecular Plant-Microbe Interactions. 2015;28(9):959-67.
  17. Göttfert M. Regulation and function of rhizobial nodulation genes. FEMS microbiology reviews. 1993;10(1-2):39-63.
  18. Kant C, Pradhan S, Bhatia S. Dissecting the root nodule transcriptome of chickpea (Cicer arietinum L.). PLoS One. 2016;11(6):e0157908.
  19. Hsu PD, et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature biotechnology. 2013;31(9):827-32.
  20. Doench JG, et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature biotechnology. 2016;34(2):184-91.
  21. Norrander J, Kempe T, Messing J. Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis. Gene. 1983;26(1):101-6.
  22. Simon R, Priefer U, Pühler A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram negative bacteria. Bio/technology. 1983;1(9):784-91.
  23. Hanahan D, Jessee J, Bloom FR. [4] Plasmid transformation of Escherichia coli and other bacteria. Methods in enzymology. 1991;204:63-113.
  24. Alexandre A, et al. Natural populations of chickpea rhizobia evaluated by antibiotic resistance profiles and molecular methods. Microbial Ecology. 2006:128-36.
  25. Weerakkody LR, et al. A rapid, inexpensive and effective method for the efficient isolation of genomic DNA from Gram-negative bacteria. Molecular Genetics and Genomics. 2024;299(1):26.
  26. Selbitschka W, Niemann S, Pühler A. Construction of gene replacement vectors for Gram− bacteria using a genetically modified sacRB gene as a positve selection marker. Applied microbiology and biotechnology. 1993;38(5):615-8.
  27. Yadav A, Singh RP, Singh AL, Singh M. Identification of genes involved in phosphate solubilization and drought stress tolerance in chickpea symbiont Mesorhizobium ciceri Ca181. Archives of microbiology. 2021;203(3):1167-74.
  28. Dicenzo GC, et al. Multidisciplinary approaches for studying rhizobium–legume symbioses. Canadian Journal of Microbiology. 2019;65(1):1-33.
  29. Calia C, et al. A bibliometric analysis of chickpea agronomic practices in the world during 45 years of scientific research. Legume Science. 2024;6(1):e219.
  30. Sandhu J, Tripathi S, Chaturvedi S. Chickpea nutritional status and value chain for sustainable development.  Sustainable food value chain development: Perspectives from developing and emerging economies: Springer; 2023. p. 175-83.
  31. Ren B, Wang X, Duan J, Ma J. Rhizobial tRNA-derived small RNAs are signal molecules regulating plant nodulation. Science. 2019;365(6456):919-22.

Перепечатки и разрешения

Теги

Редактирование CRISPR-Cas9гомологично-направленная репарацияGFP-репортерфлуоресцентная микроскопиясеквенирование по Сэнгеруанализ инфицирования нутафункциональная геномика

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.