Исследовательская статья

Временно-зависимое ухудшение подвижности сперматозоидов и целостности ДНК при длительном воздействии спермы

DOI:

10.3791/71515

⸱

7 августа 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University Hospitals Fertility Center

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Фрагментация ДНК сперматозоидов увеличилась, а подвижность значительно снизилась при длительном воздействии спермы после эякуляции. В 14 нормальных образцах фрагментация ДНК увеличилась на 5,5%, 11,5% и 16,1% за 1, 2 и 4 часа соответственно, при этом подвижность снизилась. Эти результаты помогают минимизировать задержки при сборе и обработке спермы вне площадки.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Известно, что фрагментация ДНК сперматозоидов негативно влияет на качество сперматозоидов, что может негативно влиять на циклы вспомогательных репродуктивных технологий (ART). Изучение фрагментации ДНК сперматозоидов (SDF) в семенной жидкости со временем может дать представление о влиянии длительного воздействия спермы на целостность сперматозоида. В этом предварительном исследовании был проведён анализ SDF в разные моменты времени для моделирования условий сбора спермы вне участка с использованием дисперсионного анализа хроматина сперматозоидов на 14 нормальных образцах спермы. Статистический анализ процентов фрагментации ДНК за время анализа показал, что длительное застояване семенной жидкости от эякуляции до анализа спермы значительно увеличивало фрагментацию ДНК. Средняя подвижность сперматозоидов значительно снизилась на 7,4% через 1 час, на 14,5% через 2 часа и на 18,7% через 4 часа, а средняя СДФ значительно увеличилась на 5,5% через 1 час, на 11,5% через 2 часа и на 16,1% через 4 часа после сбора спермы. Это снижение качества спермы со временем может влиять на протоколы клиник фертильности при рассмотрении подготовки спермы к циклам АРТ, особенно когда сбор спермы происходит вне лаборатории андрологии. Лаборатории могут рассмотреть возможность установления приемлемого порога времени для получения спермы из внелабораторного сбора.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) определяет, что один из шести человек, или 17,5% населения мира, испытывающий бесплодие в какой-либо момент своейжизни1. Около 20% случаев бесплодия имеют единственный диагноз мужского фактора бесплодия, а дополнительные 30–40% случаев имеют мужской фактор как вторичныйдиагноз 2. Даже у здоровых мужчин семенные параметры могут сильно различаться у разных людей, включая колебания концентрации, подвижности, морфологии ижизнеспособности 3. Поэтому важно понимать конкретные факторы, которые снижают мужскую фертильность, чтобы обеспечить надлежащее лечение в клинических условиях.

Развивающейся областью исследований является влияние целостности ДНК сперматозоидов на циклы вспомогательной репродуктивной технологии (ART)4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13. В лабораторном руководстве ВОЗ по исследованию и обработке человеческой спермы, 5-е издание, говорится, что фрагментация ДНК сперматозоидов (СДФ) (через одноцепочечные или двухцепочечные разрывы) может влиять на развитие эмбриона, имплантацию и исходыбеременности 14. Мюриэль и соавт. провели анализ SDF и обнаружили, что увеличение SDF приводит к снижению уровня оплодотворения, качества эмбрионов и скорости имплантации в циклахАРТ 10. Однако необходимо более глубокое понимание причин фрагментации ДНК.

Предыдущие исследования сообщают, что окислительный стресс может привести к снижению подвижности сперматозоидов, снижению выработки и функции ферментов, а также, что самое важное, к повреждениюДНК 8. Такое повреждение ДНК может включать, но не ограничиваться, удалением генов, неправильными переводами и SDF. В настоящее время анализы SDF используются для оценки целостности ДНК сперматозоидов. Хотя исследования коррелировали криоконсервацию, обработку среды и окислительный стресс с SDF, о SDF известно мало за период от эякуляции до анализа 4,5. Это критический период в продолжительности жизни сперматозоидов, учитывая рост распространённости домашних сборов спермы для подготовки сперматозоидов вциклах АРТ 15. Домашние сборы стали всё более популярны во время пандемии COVID-19, поскольку они ограничивают прямой контакт с пациентом и повышают комфорт и удобство. Однако нет конкретных рекомендаций, которые бы указывали оптимальное время от эякуляции до анализа для домашних коллекций. Таким образом, основной целью нашего исследования было понять, меняется ли SDF со временем в застойной семенной жидкости и могут ли эти изменения быть релевантны для обработки образцов ART.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследование было проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией и одобрено Институциональным обзорным советом университетских больниц (STUDY20201371). Было получено информированное согласие от всех участников исследования. Четырнадцать образцов спермы были отобраны у пациентов в одном академическом центре фертильности на северо-востоке Огайо. Все образцы, проанализированные в этом эксперименте, были собраны на месте нашего объекта. Тестирование на дисперсию хроматина спермы проводилось на образцах спермы полностью обученным андрологом в соответствии с инструкциями производителя для минимизации межличностных вариаций. С этим набором целые, неисправленные, свежие сперматозоиды погружались в инертный агарозный микрогель на предварительно обработанном стекле, а затем охлаждались при 4 °C в течение 5 минут для затвердевания микрогеля. Первоначальная кислотная обработка была использована для денатурации ДНК сперматозоидов с фрагментированной ДНК, а также применялся раствор лизисного буфера для удаления ядерных белков. После промывания дистиллированной водой горки обезвоживались в сортированных этаноловых растворах и сушили на воздухе. При визуализации под световой микроскопией после окрашивания растворами, предоставленными набором, сперматозоиды без фрагментации демонстрировали нуклеоиды с большим дисперсионным ореолом (больше 1/3 диаметра ядра), тогда как сперматозоиды с фрагментацией демонстрировали небольшой гало (менее 1/3 диаметра ядра) или отсутствие нимба. Процент сперматозоидов с фрагментацией ДНК рассчитывался как количество фрагментированных и деградированных сперматозоидов и экспрессировался в процентах. Всего на слайде было насчитано 300 сперматозоидов и классифицированы как обладающие большой или средней дисперсионной гало, либо как отсутствие дисперсионного гало. Этот подсчет был повторён дважды для оценки технической вариабельности, и оба подсчёта были усреднены. Диагностическая чувствительность и специфичность комплекта составляют 93%, и в каждом эксперименте были включены как положительные, так и отрицательные контрольные результаты. Образцы спермы оценивались за 0, 1, 2 и 4 часа (0 часа определялось как 15 минут после периода жидкости при 37 °C) и поддерживались при комнатной температуре (22–25 °C).

Дополнительный анализ подвижности проводился на каждом образце через 0, 1, 2 и 4 часа. Оценка подвижности проводилась опытным андрологом с помощью протокола подсчёта с использованием одноразовой камеры для подсчёта. В сетку было подсчитано триста подвижных сперматозоидов, и этот счёт повторялся дважды. Средняя концентрация подвижных сперматозоидов была рассчитана на основе двух воспроизведенных подсчётов.

Статистический анализ проводился с использованием повторяющихся измерений ANOVA для сравнения каждой временной группы. Когда был обнаружен значимый общий эффект, тест Тьюки на действительно значимую разницу (HSD) применялся для пост-хок парных сравнений. p-значение < 0,05 считалось статистически значимым. Подробная информация о материалах приведена в Таблице материалов.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для оценки влияния длительного воздействия спермы на подвижность сперматозоидов и фрагментацию ДНК было проанализировано в общей сложности 14 образцов нормозооспермических пациентов в четырёх точках сбора времени. Анализируемые образцы считались «нормальными» по параметрам анализа спермы согласно5-му изданию 14 ВОЗ. Все образцы были собраны на месте в нашем Центре фертильности для оптимизации точности параметров анализа в каждый момент времени. Средний возраст пациентов составлял 35,4 года (24–45 лет). Исходные результаты параметров спермы группы показали средний объём спермы 3,7 мл, среднюю концентрацию 42,2 миллиона/мл, среднюю подвижность 46,9%, среднюю нормальную морфологию 4% и отрицательные лейкоциты по всем образцам по качественным тестам (Таблица 1).

Со временем наблюдалось постепенное снижение подвижности сперматозоидов. По сравнению с исходным уровнем (0 ч) средняя подвижность сперматозоидов снизилась на 7,4% (в диапазоне 3–16%) за 1 час, на 14,5% (диапазон 4–31%) за 2 часа и на 18,7% (диапазон 8–37%) за 4 часа. Подвижность сперматозоидов со временем постепенно снижалась — с 58,6% на исходном уровне до 42,5% после 4 часов воздействия (рисунок 1). В целом снижение подвижности между временными точками было статистически значимым (p = 0,0001585). Одновременно SDF значительно увеличивался при длительной инкубации в семенной плазме. Средний уровень SDF увеличился с 15,6% на исходном уровне до 21,1% за 1 час, 27,1% за 2 часа и 31,7% в 4 часа. По сравнению с базовым уровнем SDF увеличилась на 5,5 процентных пункта (диапазон 4–8 процентных пунктов) за 1 час, на 11,5 процентных пункта (в диапазоне 8–16 процентных пунктов) во 2 часа и на 16,1 процентных пункта (диапазон 13–22 процентных пункта) в 4 часа. Статистически значимые увеличения SDF были обнаружены во всех последующих временных точках по сравнению с исходным, включая 1 ч (p = 0,021129), 2 часа (p < 0,00001) и 4 часа (p = 0,000018) (Таблица 2).

ДОСТУПНОСТЬ ДАННЫХ
Данные о подвижности пациента и SDF, используемые для анализа, приведены в дополнительной таблице S1.

figure-results-1
Рисунок 1. Изменение подвижности сперматозоидов со временем после эякуляции. Подвижность сперматозоидов оценивалась на начальном уровне и после 1, 2 и 4 часа контакта с спермой. Подвижность постепенно снижалась с увеличением времени воздействия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

ПараметрСредний показательСтандартное отклонение
Возраст пациентов35,4 (диапазон, 24–45 лет)6.22
Объем спермы3,7 мл2.18
Концентрация42,2 миллиона/мл33.45
Подвижность46.9%18.77
Белые кровяные клеткиОтрицательно (все)—
Морфология4.0%0.77

Таблица 1: Исходные характеристики семенной жидкости в исследуемых образцах. Параметры спермы фиксировались после жидкости и до временно-зависимой оценки фрагментации и подвижности сперматозоидов.

Время0 h1 час2 часа4 часа
Среднее снижение подвижности сперматозоидов с 0 h*—-7.4%-14.5%-18.7%
Средний SDF15.6%21.1%27.1%31.7%
Стандартное отклонение5.28%5.27%5.31%4.80%
P-значение против 0 h—p = 0.021129p < 0.00001p = 0,000018
*Повторные измерения ANOVA с Tukey HSD posthoc сравнения.

Таблица 2: Временно-зависимые изменения фрагментации и подвижности ДНК сперматозоидов. Фрагментация и подвижность сперматозоидов оценивались на начальном этапе и после 1, 2 и 4 часов воздействия спермы. Значения представлены в соответствии с данными авторами, при этом статистические сравнения проводятся по исходному уровню.

Дополнительная таблица S1. Различия в подвижности сперматозоидов на уровне пациента и значения индекса фрагментации ДНК сперматозоидов . Значения выражаются в пропорциях; Умножьте на 100, чтобы преобразовать в проценты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В образцах, включённых в этот эксперимент, SDF увеличилась со временем, а подвижность снизилась за тот же период. Это говорит о том, что целостность ДНК сперматозоидов может снижаться, когда семенной жидкости остаётся в состоянии длительного времени между эякуляцией и анализом или обработкой. Увеличение времени застоя образцов перед анализом могло увеличить воздействие условий, связанных с окислительным стрессом. Как уже обсуждалось, окислительный стресс может негативно сказываться на качестве ДНК сперматозоидов, приводя к высокому уровню фрагментацииДНК 6,8,13. Результаты этого исследования могут повлиять на обработку спермы в циклах АРТ.

Во-первых, клиникам может быть полезно добавить этот тест в традиционные параметры анализа спермы, чтобы убедиться в качестве ДНК сперматозоидов перед использованием сперматозоидов в циклах АРТ. Оптимизация качества сперматозоидов может быть связана с улучшением результатов, таких как увеличение количества замороженных эмбрионов, увеличение уровня эуплоидии и более высокий уровень положительных беременностей и живорождений, как было сообщено в предыдущихисследованиях 16.

Во-вторых, эти результаты дают представление о влиянии домашнего сбора спермы на результаты АРТ. Во время пандемии COVID-19 многие клиники начали использовать сбор спермы дома как более безопасный вариант дляпациентов 15 и 17 лет. По мере того как практики начали делать этот переход, пациенты получили возможность не только снизить уровень заражения COVID, но и проводить сбор в уединении собственного дома. Однако наши результаты показывают, что эти изменения в практике могут включать компромиссы, связанные с качеством спермы и потенциальными результатами АРТ.

Предыдущие исследования на наборах для домашнего сбора показывали значительные колебания результатов анализа спермы у мужчин с разными диагнозами мужских факторов и у мужчин, которые обычно производят «нормальные» образцыспермы 18. Эти колебания могут быть вызваны застоем спермы во время транспортировки из дома в клинику, особенно при отправке образцов спермы за ночь в некоторых случаях. Другие исследования подтверждают наш результат, что SDF быстро увеличивается в первые 3–4 часа инкубации при 5% CO2 при 37 °C после подготовки сперматозоидов либо в замороженной/размораженнойсперматозоиде 19 , либо всвежей сперматозоиде 20, что свидетельствует о том, что сперматозоиды следует использовать как можно скорее после подготовки спермы для АРТ.

Кердтави и др. провели метаанализ влияния расположения спермы на параметры спермы и результаты фертильности. Хотя они не выявили значимых различий между образцами, собранными на дому и в клинике, были отмечены значительная гетерогенность во всех анализируемых исследованиях, большинство из которых былинаблюдательными 16. Важно, что в этих исследованиях не было ограниченного срока, когда образцы, собранные дома, должны быть возвращены в клиники и проанализированы. Однако анализируемые в этом исследовании данные позволили провести контролируемый анализ фрагментации ДНК в нескольких временных точках, обеспечив большую точность и согласованность экспериментальных результатов.

Хотя для некоторых пациентов может быть вариантом для домашних сборов, понимание частоты SDF может помочь разработать рекомендации для выявления пациентов, у которых домашний сбор может быть вреден для результатов АРТ. Систематический обзор и мета-анализ Христофораки и др. показали, что потенциал окисления в семенной жидкости негативно влияет на мужскоебесплодие 21. Анализируемые параметры включают концентрацию сперматозоидов, их численность, подвижность и морфологию, все из которых неблагоприятно страдали из-за более высокого потенциала окисления восстановления, что демонстрирует, что качество сперматозоидов может зависеть от окислительного стресса.

Сильные стороны этого исследования включают его новизну, поскольку немногие исследования оценивали временно-зависимые изменения SDF при длительном воздействии семенной жидкости. Это исследование также проводилось в контролируемых условиях с относительно однородной группой мужчин без основной семинальной патологии. Однако это исследование ограничивалось небольшой выборкой из 14 пациентов. Необходимо провести дополнительные эксперименты для максимизации уверенности в собранных данных и окончательных замечаниях.

Дальнейшие исследования также должны рассмотреть переменные, которые могут влиять на уровень SDF, в частности, чтобы лучше понять факторы, способствующие поддержанию качества спермы. Некоторые факторы, которые следует учитывать, включают, но не ограничиваются, обращением с материалами, используемыми при приготовлении спермы, температурой транспортировки из дома в клинику, методами криоконсервации и сопутствующими состояниями у мужчин-пациентов. Получение всестороннего понимания факторов, влияющих на SDF, в конечном итоге позволит клиникам оптимизировать свои рекомендации и лучше принимать решения при разработке протоколов лечения пациентов, получающих АРТ.

Наблюдаемое ухудшение качества сперматозоидов продемонстрировало явный временно-зависимый паттерн, характеризующийся снижением подвижности и увеличением фрагментации ДНК при длительном воздействии семенной жидкости. Примечательно, что наиболее выраженное ухудшение произошло после 2–4 часов хранения, когда SDF превысил 30%, а подвижность снизилась почти на пятую от исходного уровня. Эти данные свидетельствуют о том, что задержки между эякуляцией и обработкой спермы могут негативно влиять на функциональную целостность сперматозоидов и подтверждают необходимость минимизации времени транспортировки и обработки образцов, собранных вне площадки для вспомогательных репродуктивных технологий. Андрологические лаборатории могут рассмотреть возможность установления и информирования пациентов о приемлемом временном пороге для получения спермы из внелабораторного сбора, особенно в условиях подготовки к ВМИ или ЭКО. Время от эякуляции до анализа и/или подготовки спермы следует учитывать относительно SDF, особенно если сбор АРТ происходит вне лаборатории андрологии.

Из-за ограничений небольшого размера выборки этого исследования будущие исследования должны оценивать влияние длительного воздействия спермы на SDF в более широком диапазоне категорий качества спермы, включая образцы мужчин с аномальными параметрами спермы. Кроме того, необходимы перспективные рандомизированные контролируемые исследования для определения, приведёт ли зависящее от времени увеличение SDF к клинически значимым различиям в результатах АРТ, включая оплодотворение, развитие эмбрионов, имплантацию, беременность, выкидыша и показатели живых рождений.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Калькулятор ANOVAStatistics KingdomСтатистический анализ
https://www.statskingdom.com/anova_manova.html
Halosperm G2HalotechHT-HSG2Набор для in vitro диагностики для измерения фрагментации ДНК сперматозоидов
https://halotechdna.com/en/producto/halosperm-g2/
MicrocellVitrolife15423Одноразовая камера подсчета для анализа спермы
https://www.vitrolife.com/products/sperm-processing/microcell--accessories/
Контроль качества для полосок-тест на WBC/pHMedical Electronic SystemsA-CA-01752-00Положительный и отрицательный контроль для полосок-тест QwikCheck WBC
https://mes-global.com/products/semen-analysis-validation-kits/qwikcheck-test-kits/qwikcheck-wbc-ph-test-strips-quality-control/
Полоски-тест QwikCheck WBC/pHMedical Electronic Systems0700Определение лейкоцитов (WBC) в сперме
https://mes-global.com/products/semen-analysis-validation-kits/qwikcheck-test-kits/

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. World Health Organization. Infertility prevalence estimates, 1990-2021. 1st ed. World Health Organization; Geneva; 2023. xiv, 79 p.
  2. Leslie SW, Soon-Sutton TL, Khan MA. Male infertility. In: StatPearls [Internet]. StatPearls Publishing; Treasure Island (FL); 2025 [cited 2025 Feb 7]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK562258/
  3. Alvarez C et al. Biological variation of seminal parameters in healthy subjects. Hum Reprod. 2003;18(10):2082-8.
  4. Schulte RT, Ohl DA, Sigman M, Smith GD. Sperm DNA damage in male infertility: etiologies, assays, and outcomes. J Assist Reprod Genet. 2010;27(1):3-12.
  5. Le MT et al. Does conventional freezing affect sperm DNA fragmentation? Clin Exp Reprod Med. 2019;46(2):67-75.
  6. Zini A, Bielecki R, Phang D, Zenzes MT. Correlations between two markers of sperm DNA integrity, DNA denaturation and DNA fragmentation, in fertile and infertile men. Fertil Steril. 2001;75(4):674-7.
  7. Zini A et al. Potential adverse effect of sperm DNA damage on embryo quality after ICSI. Hum Reprod. 2005;20(12):3476-80.
  8. Aitken RJ, Krausz C. Oxidative stress, DNA damage and the Y chromosome. Reproduction. 2001;122(4):497-506.
  9. Benchaib M et al. Sperm DNA fragmentation decreases the pregnancy rate in an assisted reproductive technique. Hum Reprod. 2003;18(5):1023-8.
  10. Muriel L et al. Value of the sperm deoxyribonucleic acid fragmentation level, as measured by the sperm chromatin dispersion test, in the outcome of in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection. Fertil Steril. 2006;85(2):371-83.
  11. Tandara M et al. Sperm DNA integrity testing: big halo is a good predictor of embryo quality and pregnancy after conventional IVF. Andrology. 2014;2(5):678-86.
  12. Agarwal A et al. Clinical utility of sperm DNA fragmentation testing: practice recommendations based on clinical scenarios. Transl Androl Urol. 2016;5(6):935-50.
  13. Panner Selvam MK, Agarwal A. A systematic review on sperm DNA fragmentation in male factor infertility: laboratory assessment. Arab J Urol. 2018;16(1):65-76.
  14. World Health Organization. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. 5th ed. World Health Organization; Geneva; 2010. 271 p.
  15. Sacha CR et al. The effect of semen collection location and time to processing on sperm parameters and early IVF/ICSI outcomes. J Assist Reprod Genet. 2021;38(6):1449-57.
  16. Kerdtawee P, Salang L, Sothornwit J. Effect of semen collection location on semen parameters and fertility outcomes and implications for practice in the COVID-19 era: a systematic review and meta-analysis of randomized and observational studies. Am J Obstet Gynecol. 2023;228(2):150-60.
  17. Stimpfel M, Jancar N, Vrtacnik-Bokal E. Collecting semen samples at home for IVF/ICSI does not negatively affect the outcome of the fresh cycle. Reprod Biomed Online. 2021;42(2):391-9.
  18. Aznavour Y et al. Semen parameter variability among users of at-home sperm testing kits. BMC Urol. 2022;22(1):184.
  19. Gosálvez J et al. Sperm deoxyribonucleic acid fragmentation dynamics in fertile donors. Fertil Steril. 2009;92(1):170-3.
  20. Nabi A, Khalili MA, Halvaei I, Roodbari F. Prolonged incubation of processed human spermatozoa will increase DNA fragmentation. Andrologia. 2014;46(4):374-9.
  21. Christoforaki V et al. The role of seminal oxidation-reduction potential in male infertility: systematic review and meta-analysis. Reprod Biomed Online. 2026;52(2):104858.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

234234234

Похожие статьи