Методическая статья

Микроинъекция интерлейкина-6 в кровоток личинок данио-религии TSC для изучения поведения, похожих на нейропсихиатрические расстройства

170 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71524

⸱

26 июня 2026 г.

 , 
1Laboratory of Developmental Neurobiology, International Institute of Molecular Mechanisms and Machines, IMol, Polish Academy of Sciences, 2Warsaw-4-PhD doctoral school, International Institute of Molecular and Cell Biology in Warsaw

В этой статье

Краткое содержание

Для моделирования влияния воспалительных сигналов на нейроразвитие у генетически восприимчивых организмов мы представляем протокол микроинъекции IL-6 в проток кювье (распространённую кардинальную вену) личинок данио-рерио, что позволяет контролировать индукцию воспаления и оценить его влияние на развитие в контексте туберозного склероза (ТСК).

Аннотация

Пациенты с комплексом туберозного склероза (мутации TSC1/TSC2) демонстрируют переменную экспрессивность расстройства аутистического спектра (РАС), а активация материнского иммунного препарата известна тем, что повышает риск РАС. Интерлейкин-6 (IL-6) — это плейотропный цитокин, обладающий хорошо зарекомендовавшей ролью в регуляции иммунитета, воспалении и нейровоспалительных процессах. Он вырабатывается несколькими типами иммунных клеток в ответ на инфекцию или повреждение тканей и обычно характеризуется как провоспалительный медиатор. В частности, IL-6 может проходить через гематоэнцефалический барьер и был связан с нейровоспалениями и нейропсихиатрическими состояниями, связанными с воспалением, включая расстройство аутистического спектра (РАС) и интеллектуальную отсталость (ID). Здесь мы описываем протокол для индуцирования системных воспалительных сигналов у данио путём доставки IL-6 в кровоток через инъекцию в проток Кювье. Этот подход позволяет контролировать и воспроизводить воспалительные реакции для изучения изменений, вызванных воспалением, в раннем развитии. Протокол подробно описывает основные этапы подготовки IL-6, микроинъекции и экспериментальных применений в моделях заболеваний и нейровоспаления у данио-рерио, включая исследования, направленные на изучение взаимодействия генов и среды. Обеспечивая контролируемую индукцию системных воспалительных сигналов, этот подход предоставляет универсальную платформу для изучения того, как генетическая восприимчивость и воспалительное воздействие пересекаются, формируя развитие результатов.

Введение

Понимание того, как воспалительные сигналы формируют раннее нейроразвитие, крайне важно для анализа механизмов, лежащих в основе нейроразвивающих расстройств, особенно в генетически восприимчивых контекстах. Основная цель этого протокола — предоставить точный, воспроизводимый подход для индуцирования системных воспалительных сигналов у личинок данио-религии посредством прямой микроинъекции интерлейкина-6 (IL-6) в проток Кювье (распространённую кардинальную вену).

Туберозный склерозный комплекс (ТСК) является примером таких взаимодействий генов и среды. TSC — это редкое генетическое заболевание, вызванное мутациями в TSC1 или TSC2, которые кодируют соответственно белки гамартина и туберин, образующие комплекс, обычно подавляющий сигнализацию mTORC1. Потеря этого ингибитора приводит к гиперактивации пути mTORC1, что приводит к аномальному росту клеток и широкому спектру клинических проявлений, включая расстройство аутистического спектра (РАС)1,2. По оценкам, РАС поражает ~1,5% людей со средним возрастом постановки диагноза ~3 года в развитыхстранах. РАС характеризуется повторяющимся поведением, нарушением социальных взаимодействий и снижением когнитивнойгибкости 4, при этом пациенты часто сталкиваются с дополнительными нейроповеденческими проблемами, такими как тревожность, депрессия или интеллектуальнаяотсталость 3. Примечательно, что 40%–60% людей с ТСК проявляют признаки, связанныес РАС 2, однако тяжесть симптомов сильно варьируется — даже среди пациентов с похожими мутациями — что говорит о влиянии факторов окружающей среды на генетически обусловленный риск.

Одним из таких факторов является воспаление. Хотя этиология РАС остаётся в значительной степени неизвестна, нейровоспаление в нескольких областях мозга давно связанос этим 5. Растущие доклинические и клинические данные свидетельствуют о том, что нейровоспаление плода, вызванное активацией иммунной системы матери (МИА) и соответствующим повышением цитокиновой сигнализации, может значительно способствовать патогенезуРАС-6. Таким образом, моделирование воздействия воспалительных цитокинов в генетически чувствительных системах, таких как TSC, предоставляет мощную основу для изучения того, как иммунные сигналы пересекаются с нарушенной регуляцией mTORC1, влияя на раннее развитие мозга.

Обоснование разработки этого протокола связано с растущим признанием того, что воспаление, опосредованное цитокином, включая сигнализацию IL-6, может взаимодействовать с генетическими уязвимостями, влияя на траектории нейроразвития. Цитокины — это гликопротеины низкомолекулярной массы, которые координируют коммуникацию внутри иммунной системы. При РАС несколько исследований постоянно фиксировали повышенный уровень провоспалительных цитокинов, включая IL-6 в периферическойкрови 7,8,9,10, что подтверждает гипотезу о том, что нарушение сигнализации IL-6 может способствовать нейроразвитию и поведенческим особенностям, характерным для этого заболевания. IL-6 является ключевым посредником иммунной активации, вырабатываемой различными типами иммунных клеток в ответ на инфекцию или повреждение тканей. Поскольку IL-6 может пересекать гематоэнцефалический барьер и напрямую влиять на нейроны, астроциты и микроглию, устойчивое повышение этого цитокина связано с изменением нейроразвивающихся путей, синаптической пластичности и нейроиммунного гомеостаза — механизмов, которые всё чаще исследуются в патофизиологии РАС11,12. Эти связи дополнительно укрепляются исследованиями MIA, где повышенный IL-6 у матери во время беременности нарушает развитие мозга плода и увеличивает риск, связанный сРАС 13. Однако существующие модели позвоночных часто опираются на системную иммунную стимуляцию с помощью молекул, ассоциированных с патогенами, или парадигм материнского воздействия, которые могут вводить вариабельность, одновременно активировать несколько иммунных путей и ограничивать возможность выделения специфического вклада IL-6. Прямая микроинъекция IL-6 у данио-рерио преодолевает эти ограничения, позволяя целенаправленно манипулировать одним цитокином внутри прозрачного, генетически управляемого организма.

Данио-рерио предлагает несколько преимуществ для изучения факторов развития, вызванного цитокином. Их оптическая прозрачность позволяет визуализировать иммунные и нейронные ответы в реальном времени; их быстрое развитие позволяет проводить эксперименты с высокой производительностью; а их консервативные цитокиновые сигнальные пути делают их мощной моделью позвоночных для вскрытия воспалительныхмеханизмов 14,15,16,17,18. В экспериментальных исследованиях необходимо доставлять экзогенные материалы (бактерии, раковые клетки, ДНК, наночастицы и др.) в личинки данио-рерио. Один из подходов предполагает подвержение личинок воздействию раствора с интересующим материалом, что позволяет пассивно поглощать их через кожу, жабры или желудочно-кишечный тракт. Второй, более прямой метод — микроинъекция, при которой внешние материалы вводятся в определённые эмбриональные или личиночные отсеки с помощью тонких стеклянных игл 19,20,21. Важно отметить, что микроинъекция в проток Кювье обеспечивает надёжный путь для системной доставки, обеспечивая быстрое распределение IL-6 по всему кровообращению без мешающих эффектов иммунной стимуляции всего организма.

В этом протоколе мы представляем пошаговую процедуру — от приготовления инъекционных шприцев до инъекций IL-6 в кровоток через проток Кювье личинок данио через 2 и 3 дня после оплодотворения (dpf). Этот метод особенно полезен для исследователей, изучающих, как специфические воспалительные сигналы влияют на ранние процессы развития, взаимодействие генов и среды в моделях нейроразвивающихся или иммунных расстройств, клеточные и молекулярные последствия воздействия цитокинов in vivo, а также взаимодействие генетических мутаций и воспалительных сигнальных путей. Предлагая контролируемый, цитокин-специфичный и точный с точки зрения развития подход, этот протокол предоставляет универсальную платформу для изучения механизмов, с помощью которых IL-6 и связанные с ним иммунные сигналы формируют ранние иммунные, нейронные и поведенческие результаты.

Протокол

Для описанной здесь процедуры использовалась линия tsc2vu242/+ данио-рерио, 22,23. Все проведённые эксперименты проводились в соответствии со всеми соответствующими нормативными актами, и дополнительное одобрение этического комитета не требуется, поскольку используемый этап развития (<5 dpf) не подпадает под обязательный этический обзор. На рисунке 1 представлена схема протокола.

1. Вытягивание микропипеток

  1. Подготовьте иглы для микроинъекций из боросиликатных стеклянных капилляров с помощью микропипеточного вытягивателя, следуя установленнымпроцедурам 24.
  2. Используйте боросиликатные стеклянные капилляры длиной 10 см (внешний диаметр 1,0 мм, тонкостенные) и загружайте их в микропипеточный вытягиватель.
  3. Аккуратно расположите капилляр внутри каретки для тяга, обеспечивая точное выравнивание в заведенной канавке, и надёжно закрепляйте его с помощью зажимов инструмента, чтобы предотвратить движение во время вытягивания.
  4. Отрегулируйте капилляр так, чтобы он был центрирован внутри нагревающей нити, обеспечивая равномерное нагревание вдоль области, которую нужно притягивать для равномерного образования иглы.
  5. Запускайте программу вытягивания с использованием оптимизированных параметров (например, для прибора Саттера используйте тепло: 533, натяжение: 50, скорость: 60, задержка: 90 и давление: 200) для получения микроинъекционных игл с мелким наконечником.
    ВНИМАНИЕ: Микроиголки, извлеченные из стеклянных капилляров, хрупкие и могут легко трескаться, забивать или приобретать неправильную форму кончиков, изменяющую объём инъекции. Осматривайте каждую иглу под стереомикроскопом перед использованием, избегайте прикосновения кончика к твёрдым поверхностям и немедленно заменяйте иглы при обнаружении сопротивления, протекания или неравномерного размера капель.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После процесса вытягивания на обоих концах капилляра образуются конечные иглы. Перед использованием наконечник следует аккуратно открыть, аккуратно разбивая его тонким щипцом под стереомикроскопом, чтобы достичь желаемого размера апертуры для микроинъекции.

2. Подготовка буферов и раствора запаса

  1. Приготовьте 60× раствор эмбриональной среды E3 (см. таблицу 1). Стерилизуйте раствор с помощью автоклава и храните при 4 °C. Для использования разведите стандартный раствор в сверхчистой воде, чтобы получить рабочий раствор 1× E3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 60× запасного раствора эмбриональной среды E3 можно хранить при 4 °C для длительного хранения.
  2. Приготовьте 20-кратный раствор трикаина (MS-222), как описано в таблице 1. Храните раствор при 4 °C в темноте, чтобы предотвратить разрушение. Перед использованием разведите до рабочей концентрации 1× в среде E3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте pH раствора трикаина до 7,5 при 1 M Tris pH 9,0. Этот раствор можно использовать в аликвоте и хранить при -20 °C (замороженный) для длительного хранения или при 4 °C. Трикаин разлагается при RT и при освещении до токсичного соединения.
    ВНИМАНИЕ: При использовании трикаина (MS-222) для анестезии следует проявлять особую осторожность, так как как недостаточное и чрезмерное воздействие может негативно влиять на физиологию и поведение личинок. Чрезмерное воздействие может подавлять функцию сердца и изменять поведение в дальнейшем состоянии, а недостаток анестезии увеличивает риск травм во время посадки. Используйте только минимальную эффективную концентрацию и продолжительность, а затем обеспечьте полное восстановление в свежей эмбриональной среде перед проведением поведенческих анализов.
  3. Приготовьте агарозный раствор 1% (w/v) в среде E3, нагревая до полного растворения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если раствор подготовлен заранее, его можно хранить при 4 °C и повторно разогревать перед использованием. В день эксперимента агарозу поддерживайте в жидком состоянии при температуре 55–60 °C, чтобы предотвратить преждевременное затвердевание.
  4. Приготовьте раствор NaCl с содержанием 0,9% (w/v) и храните при комнатной температуре до 1 недели или при 4 °C для длительного хранения. Перед использованием уравновесьте раствор до комнатной температуры или инкубировать при 28,5 °C, чтобы соответствовать физиологическим условиям эмбрионов.
  5. Приготовьте раствор IL-6 с концентрацией 2 pg/nL в 0,9% NaCl. Используйте раствор, чтобы избежать повторяющихся циклов заморозки и оттаивания, и храните при -20 °C. Перед использованием разморозьте и доведите аликвот до комнатной температуры.
  6. Приготовьте рабочий раствор проназа с концентрацией 0,5 мг/мл в среде E3 из настоящего раствора 20 мг/мл, приготовленного в ультрачистой воде.

3. Получение и выращивание эмбрионов до 2 dpf

  1. Организуйте групповое нересто, поместив в нерест несколько взрослых данио-рерио-рероев TSC22vu242 /vu242.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Самцов и самок можно разлучить на ночь с помощью разделителя для предотвращения преждевременного нереста, а разделитель удаляется на следующее утро для синхронизации спаривания. В качестве альтернативы рыбу можно содержать без разделителя в условиях с контролируемым светом, где переход от темноты (ночь) к свету (утро) служит сигналом нереста.
  2. На следующий день уберите разделитель (если он используется) и дайте нересту примерно 1 час.
  3. Быстро собирайте оплодотворённые эмбрионы и переносите их в чашки Петри диаметром 100 мм, содержащие 40 мл эмбриональной среды E3, поддерживая плотность не более ~60 эмбрионов на блюдо для оптимального развития.
  4. Инкубировать эмбрионы при 28,5 °C при контролируемом дневном цикле: 14 часов света и 10 часов темноты.
  5. При 1 dpf и 2 dpf изучайте эмбрионы под стереомикроскопом и удаляйте мёртвые эмбрионы, неоплодотворённые яйца и мусоры для поддержания качества культуры.
  6. Замените среду E3 свежим раствором, чтобы минимизировать накопление отходов и поддерживать нормальное эмбриональное развитие.

4. Подготовка агарозных пластин для микроинъекций и дехорионации

  1. Приготовьте 1% (w/v) раствор агарозы в среде E3 и нагрейте его, пока агароза полностью не растворится и не станет прозрачным.
  2. Дайте раствору ненадолго остыть, затем залить примерно 30 мл в чашку Петри диаметром 100 мм, чтобы равномерный слой по поверхности был равномерен.
  3. Пока агароза ещё жидкая, но начинает затвердевать, аккуратно положите силиконовую форму на поверхность, чтобы создать однородные канавки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь силиконовые формы с пирамидальными узорами (рисунок 2) используются для получения скважин, способных удерживать избыток E3 при микроинъекции. Эти скважины спроектированы так, чтобы временно обеспечивать стабильность при обработке и инъекции за счёт поддержания достаточной влажности для предотвращения высыхания и обеспечения жизнеспособности эмбриона на несколько минут вне стандартных инкубационных условий.
  4. Подготовьте чашки Петри с агарозой для ферментативной дехорионизации (диаметром 50 мм), заливая примерно 5 мл расплавленного раствора агарозы 1% (w/v) и аккуратно перемешивая чашу для равномерного покрытия поверхности.
  5. Удалите лишние агарозы.
  6. Дайте агарозе затвердеть при комнатной температуре в течение 10–15 минут. После установки тарелки готовы к ферментативному дехорионированию эмбрионов.

5. Ферментативная дехорионация рыб с 2 dpf

  1. Переместить примерно 100 эмбрионов в хорионах при 2 dpf в небольшую (50 мм) чашку Петри, покрытую агарозой.
  2. Удалите как можно больше среды E3, чтобы минимизировать разбавление ферментативного раствора и обеспечить эффективную дехорионизацию.
  3. Добавьте в блюдо 4 мл свежеприготовленного раствора проназы (концентрация запаса: 20 мг/мл [приготовлено в ультрачистой воде], рабочая концентрация: 0,5 мг/мл [разбавленной в E3]), обеспечивая полное погружение эмбрионов.
    ВНИМАНИЕ: Лечение проназой должно тщательно контролироваться, так как чрезмерное переварение может повредить ткани личинок, что приводит к повышенной хрупкости при обращении и потенциально влияет на выживание или поведение. Используйте только минимальное эффективное время воздействия, а после этого тщательно промывайте эмбрионы, чтобы предотвратить продолжение ферментативной активности.
  4. Инкубировать при комнатной температуре в течение 3–5 минут, контролируя высвобождение хорионов под стереомикроскопом.
  5. Аккуратно поворачивайте или поворачивайте чашу с перерывами, чтобы облегчить ферментативное удаление хорионов. Продолжайте до тех пор, пока большинство эмбрионов не выйдут из хорионов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что обнажённые эмбрионы всегда погружены в раствор; в противном случае желточный мешок может разорваться, что приведёт к гибели эмбрионов.
  6. После достижения дехорионации тщательно промывайте эмбрионы, передавая их через 5–6 смен свежей среды E3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что обнажённые эмбрионы всегда погружены в раствор; в противном случае желточный мешок может разорваться, что приведёт к гибели эмбрионов.
  7. Убедитесь, что все хорионы и остатки проназа удалены, чтобы предотвратить повреждение личинок и поддерживать оптимальные условия для культуры.
  8. Переместите ~50 дехорионированных личинок в чашку Петри диаметром 100 мм, содержащую 40 мл среды E3, используя стеклянную пипетку Пастера.
  9. Поддерживайте личинок в этих условиях до микроинъекции.

6. Введение эмбрионов данио-рерио.

  1. Под стереомикроскопом (≥150× увеличение используйте тонкие щипцы, чтобы аккуратно сломать кончик вытянутого стеклянного капилляра (секция 1), создавая микропипетку с отверстием диаметром примерно 3 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подходящую микропипетку можно определить, убедившись, что кончик тонко открыт, без видимого уплощения или большой открытой поверхности на кончике. Если кончик слишком сильно сломан, он не проникнет в кожу рыбы эффективно и может привести к неудачным или непоследовательным инъекциям. Поэтому открытие кончика следует аккуратно выполнять под стереомикроскопом при сильном увеличении, обеспечивая минимальный, контролируемый разрыв на самом конце капилляра.
  2. Приготовьте инъекционные растворы с 0,9% (w/v) NaCl (контрольный) или IL-6 (2 pg/nL) в 0,9% NaCl и добавьте 1 мкл 0,1% трипан-синего на каждые 10 мкл раствора для облегчения визуализации во время инъекции.
  3. Заполните подготовленную микропипетку ~3 мкл раствора с помощью наконечника микрозагрузчика, чтобы избежать появления пузырьков воздуха.
  4. Закрепите загруженную микропипетку в держателе капилляра (рисунок 2), подключённом к системе микроинжекции.
  5. Нанесите небольшую каплю минерального масла на калибровочный затвор.
  6. Калибруйте объём впрыскивания, выбрасывая капли в минеральное масло и измеряя их диаметр с помощью калибровочного затвора (рисунок 2) с шкалой 0,01 мм. Отрегулировать давление впрыска (от 300 до 500 гПа) для достижения объёма капель ~1 nL.
  7. Добавьте трикаин (MS-222) в среду E3, содержащую личинки, до конечной концентрации 1× для анестезии. Чтобы минимизировать стресс и обеспечить стабильную седацию, используйте личинки небольшими партиями.
  8. Перенесите отдельные личинки 2 dpf на затвердевшую пластину для агарозы. Несколько личинок (например, до 10) могут быть размещены в каждой тарелке, в зависимости от ёмкости.
  9. Поставьте тарелку под стереомикроскоп. Используя стеклянную пипетку, аккуратно ориентируйте каждую личинку так, чтобы проток Кювье был хорошо виден и доступен.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с несколькими личинками убедитесь, что поверхность агарозы остаётся гидратированной, периодически добавляя капли среды E3, содержащей трикаин (1×), чтобы предотвратить высыхание.
  10. Разместить кончик микропипетки в точке входа в проток Кювье (как показано на рисунке 3), который можно определить, отслеживая движущиеся кровяные клетки к сердцу под стереомикроскопом.
  11. Введите две последовательные капли (~1 нл каждая) подготовленного раствора в канал Кювье с интервалом примерно 20 секунд между инъекциями для правильного распределения.
  12. После инъекции аккуратно переместите личинки с агарозной пластины в свежую чашку Петри диаметром 100 мм, содержащую 40 мл среды E3. Минимизировать механические нагрузки во время переноса.
  13. Верните личинок в инкубатор при температуре 28,5 °C для восстановления.
  14. На следующий день (3 dpf) повторите процедуру микроинъекции согласно пунктам 6.8–6.13.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Одна инъекция вызывает лишь кратковременные сигналы и не вызывает последовательной поведенческой реакции, тогда как вторая инъекция обеспечивает устойчивую активацию воспалительных путей через раннее личиночное окно развития, важные для нейроразвития, и вызывает поведенческие изменения, описанные в разделе «Репрезентативные результаты».
  15. При 5 dpf используйте личинки для последующих целей, включая поведенческие анализы, визуализацию мозга или иммунофлуоресцентный анализ.

Результаты

Для оценки влияния микроинъекции IL-6 на физиологию и поведение личинок мы сравнили личинки, введённые IL-6, с контролями, введёнными NaCl, по показателям выживаемости и два поведенческих показателя, часто используемых для оценки тревожного и повторяющегося поведения у данио. Микроинъекция IL-6 не повлияла на жизнеспособность личинок по сравнению с инъекциями NaCl (рисунок 4A). Показатели выживаемости при 5 dpf были неразличимы между группами, введёнными IL-6, и NaCl, что указывает на то, что режим дозирования хорошо переносится и не вызывает неспецифической токсичности. Сами микроинъекции немного снижали жизнеспособность по сравнению с неинъекционными «братьями» и сестрами, что свидетельствует о умеренном воздействии, связанном с обращением, независимо от воздействия IL-6. Это подтверждает, что протокол подходит для последующих поведенческих анализов.

Чтобы подтвердить, что парадигма микроинъекции IL-6 вызывает измеримый воспалительный ответ при 5 dpf, мы количественно определили простагландин E2 (PGE2), посредника цитокин-управляемых воспалительныхсигналов 25. Гомозиготные мутанты TSC2-/- демонстрировали повышенный базовый уровень PGE2 даже без инъекции IL-6, значительно выше, чем у их родственников дикого типа (WT) tsc2+/+ (рисунок 4B). Гетерозиготные мутанты TSC2+/- показали умеренное, незначительное увеличение исходного PGE2 по сравнению с личинками WT, но важно, что их уровень PGE2 резко вырос после микроинъекции IL-6. Этот паттерн соответствует нашей цели моделирования взаимодействия генов × окружающей среды: личинки WT остаются в значительной степени неизменными при лёгком временном воздействии IL-6, тогда как генетически восприимчивые мутанты tsc2+/- проявляют выраженный воспалительный ответ.

В соответствии с этими генотипно-зависимыми различиями в воспалительном тоне мы затем изучили, переводится ли сигнализация, вызванная IL-6, в измеримые поведенческие изменения в открытом поле. Тест на открытом поле при 5 dpf (как былоописано ранее, 22) показал, что личинки мутантов TSC2 демонстрируют более выраженное поведение, похожее на тревогу, по сравнению с WT (рисунок 4C); однако микроинъекции IL6 не повлияли на это поведение. В частности, личинки tsc2+/- и tsc2-/- проводили значительно больше времени во внешней зоне арены и демонстрировали снижение исследования центра по сравнению с tsc2+/+, что соответствует установленным фенотипам, связанным с тревогой у личинок данио-рерио.

Инъекции IL-6 увеличивали повторяющиеся, стереотипные модели плавания, особенно у личинок мутантов TSC2+/- (рисунок 4D–E), поведенческой особенности, часто используемой как показатель, релевантный для РАС, в моделяхданио-рерио. Детальная количественная оценка повторяющихся циклов, определяемых как три и более последовательных круговых плаваний, показала значительный рост доли мутантов TSC2+/-, инъекционируемых IL-6, проявляющих такое поведение по сравнению с контролями, инъекционированными NaCl. Это селективное усиление повторяющегося плавания у генетически восприимчивых личинок дополнительно поддерживает взаимодействие гена × окружающей среде, при котором лёгкая воспалительная стимуляция раскрывает или усиливает поведенческие тенденции, похожие на РАС, особенно в мутантном фоне tsc2+/.

figure-results-1
Рисунок 1: Схема протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой картины.

figure-results-2
Рисунок 2: Настройка рабочей станции с микроинъекцией. Схема микроинъекционной рабочей станции, используемой для инъекций личинок данио-рерио. (1) Стеклянная микропипетка, установленная на держателе форсунки; (2) чашка Петри с агарозой и формованными колодцами для размещения личинок; (3) минеральное масло для калибровки; (4) раствор трипана синего; (5) вытаскивали стеклянные иголки; (6) калибровочный затвор; (7) удлинённые наконечники пипетки; (8) Пипетка Пастера; (9) Силиконовая форма. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: Инъекция в проток Кювье. (A) Схематическое изображение протока места инъекции Кювье (обычной кардинальной вены) у личинок данио-религии и репрезентативных открытых локомоторных путей при 5 dpf. (B) Репрезентативные изображения контроля (без инъекций), а также инъекции NaCl и IL-6. Шкала масштаба: 250 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4: Репрезентативные результаты взаимодействия гена x с использованием мутантной линии TSC2. (A) Показатели выживаемости (%) личинок tsc2vu242 в ходе эксперимента в группах контрольных (без инъекций), NaCl и IL-6. Данные представлены как среднее ± SEM при 5 dpf (n = 4 независимых экспериментальных репликатов, каждый генотип × комбинация лечения содержит 60–70 рыб). Статистический анализ проводился с использованием ANOVA, а затем пост-хок тест Тьюки для парного сравнения. Наблюдались значимые различия между контрольными группами и группами, введёнными IL-6 (p = 0,00150), а также между контрольными и группами, введёнными NaCl (p = 0,00243). (B) Бокс-графики, отражающие уровни PGE2 у мутантов и сестёр TSC2, измеренные при 5 dpf с использованием ферментно-связанного иммуносорбентного анализа (ELISA) согласно протоколу производителя (двухсторонний ANOVA для генотипа: F = 7.4503; P = 0,01234). Каждый образец содержит 20 голов (хвосты использовались для генотипирования). Точки в бокс-плотах представляют биологические реплики. (C) Коробочные графики результатов теста в открытом поле для мутантных рыб TSC2, показывающие относительное время, проведённое рядом со стенками, для каждого генотипа после инъекций NaCl и IL-6, а также для неинъекционных контролей (двунаправленный ANOVA для генотипа: F = 7.021; P = 0,00106). Тест на открытом поле проводился с использованием автоматизированной аналитической камеры (Таблица материалов) согласно протоколу, ранеесообщенному 22. (D) Примерная фигура, показывающая случайное исследовательское поведение после инъекции NaCl и повторяющееся циклирование после инъекций IL-6. (E) Коробочные графики, показывающие количество животных, демонстрирующих нормальное и повторяющееся поведение петель для каждого генотипа TSC2 после инъекции NaCl или IL-6, а также для неинъекционных контрольных рыб (двунаправленный ANOVA для генотипа: F = 5.7615; P = 0,005849). Для этого использовались три независимых экспериментальных реплики, каждый генотип × комбинация лечения, содержащий 60–70 рыб. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

60 x E3 стандартное решение
РеагентИтоговая концентрацияСумма
NaCl297 мМ17,4 г
KCl10,7 мМ0,8 г
CaCl219,6 мМ2,18 г
MgCl2·6H2O24 мМ4,89 г
Ультрачистый H2OН/ДЗаправьте до 1 литра
TotalН/Д1 L
Трикаиновый раствор
РеагентИтоговая концентрацияСумма
Трикаин15,3 мМ1 г
1 M Tris-HCl pH 921 мМ5,25 мл
Ультрачистый H2OН/Д244,75 мл
TotalН/Д250 мл

Таблица 1: Состав растворов E3 и трикаина.

Обсуждение

Как и ожидалось, гомозиготные мутанты TSC2 демонстрировали высокий базовый уровень тревожности, что соответствует ранее зарегистрированнымфенотипам 22,27. Поскольку эти личинки уже проявляют серьёзные поведенческие аномалии, инъекция IL-6 не усугубила их фенотип. В отличие от этого, гетерозиготы TSC2 показали явные изменения, вызванные IL-6. Эта селективная чувствительность подчёркивает полезность этого протокола для изучения взаимодействий генов × окружающей среды, где мягкая, но продолжительная воспалительная сигнализация взаимодействует с основной генетической уязвимостью, формируя нейроповеденческие исходы.

Воздействие ЛПС остаётся самой широко используемой парадигмой, вызывающей воспаление у данио-рерио, и надёжно вызывает широкий и устойчивый иммунный ответ, характеризующийся сильной индукцией провоспалительных цитокинов, набором врождённых иммунных клеток и дозозависимойсмертностью 28. Хотя LPS мощный, он одновременно активирует несколько рецепторных путей, похожих на Toll(28, 29, 30), что затрудняет выделение вклада отдельных цитокинов в последующие нейроразвивающие эффекты. В отличие от этого, описанный здесь протокол микроинъекции IL-6 предлагает целенаправленный и контролируемый подход, повышая уровень одного цитокина, который является центральным фактором активации иммунитета у матери. Важно, что инъекции IL-6 не увеличивают смертность по сравнению с контролями, введёнными NaCl, что позволяет исследовать поведенческие и молекулярные фенотипы без замешательства токсичности. Кроме того, микроинъекция IL-6 вызывает специфические воспалительные сигналы ниже по течению, что подтверждается повышенным уровнем PGE2, и вызывает измеримые изменения в поведении — особенно увеличение повторяющегося плавания у гетерозиготных личинок TSC2, где генетическая восприимчивость взаимодействует с воздействием цитокинов. В совокупности эти различия подчёркивают, что, хотя LPS моделирует глобальную иммунную активацию, микроинъекция IL-6 позволяет точно рассекать цитокин-специфические механизмы, связанные с нейроразвитием рисков.

Представленные здесь репрезентативные результаты иллюстрируют эффекты IL-6 на фоне мутантов TSC2, но сам протокол широко применим. Метод можно легко реализовать в личинках дикого типа или других генетических моделях для изучения того, как определённые воспалительные сигналы пересекаются с различными генетическими контекстами на раннем нейроразвитии. Для применений, выходящих за рамки модели tsc2, мы рекомендуем эмпирически определить оптимальную дозу IL-6, поскольку чувствительность к цитокинам и пороги воспалительных веществ могут различаться в зависимости от генотипов и экспериментальных целей.

Ключевым техническим аспектом в этом протоколе является стабильность объёма инъекций, поскольку биологические эффекты IL-6 зависят от точной подачи примерно 1 нл на одну инъекцию. Вариабельность размера капель часто связана с различиями в отверстии иглы или давлении впрыскивания. Если капли слишком малы, постепенное увеличение давления или небольшое расширение кончика иглы при сильном увеличении обычно восстанавливает правильный поток. С другой стороны, капли, превышающие предполагаемый объём, обычно указывают на слишком широкое отверстие иглы, поэтому необходимо снизить давление или подготовить новую иглу с более узким концем. Поддержание точных объёмов инъекций крайне важно, так как отклонения могут изменять воспалительную нагрузку и снижать воспроизводимость. Иногда пользователи могут столкнуться с ситуациями, когда раствор не выводится из иглы. Чаще всего это происходит из-за пузырьков воздуха, мусора или закупорок на кончике иглы. Осмотр иглы под стереомикроскопом и проверка инжекторной системы на наличие протечек или ослабленных соединений обычно решают проблему. Обеспечение чистого и незапятнанного кончика иглы крайне важно для равномерной подачи и предотвращения накопления давления, которое может повредить личинку.

Ещё одним важным фактором является физиологическая толерантность введённого объёма. Личинки обычно хорошо переносят ~1 нл, но большие объёмы могут увеличить смертность, особенно при многократных инъекциях в течение нескольких дней подряд. Для экспериментов, требующих повторного дозирования, крайне важно минимизировать механическое напряжение, обеспечить достаточное время восстановления между инъекциями и корректировать концентрацию IL-6 вместо объёма для достижения желаемой дозы. Эти соображения помогают гарантировать, что наблюдаемые фенотипы отражают воздействие цитокинов, а не повреждения, связанные с инъекцией.

Наконец, смертность, связанная с инъекцией, может сильно варьироваться в зависимости от пользовательского опыта. Хотя квалифицированные пользователи обычно достигают уровня смертности около 5%, неопытные пользователи могут наблюдать показатели до 50%. Большинство потерь связано с механическими повреждениями при установке, неправильным размещением иглы или случайным проколом желткового мешка или окружающих тканей. Практика процедуры на личинках дикого типа перед началом экспериментальных инъекций значительно повышает консистентность и снижает смертность. Правильное положение личинок для чёткого визуализации протока Кювье, в сочетании с аккуратным обращением при установке и восстановлении, дополнительно минимизирует процедурный вред.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Благодарим Кевина Эсса и Лилианну Солника-Крезель (Университет Вандербильта) за рыбу tsc2vu242/+ и IIMCB ZCF за помощь со взрослой рыбой. Эта работа была поддержана грантом SONATA BIS No 2023/50/E/NZ3/00252, грантом JZ от Национального научного центра Польши.

Материалы

```html
Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Стеклокапиллярные боросиликатные (наружный диаметр 1,0 мм/внутренний диаметр 0,75 мм)Sutter InstrumentBF150-75-10
CaCl2 (хлорид кальция)Chempur118748703
Калибровочная скоба (1/100 мм)Bresser5916710
Держатель капилляра (набор зажимов 4 размера 0)Fertilart Sp. z o.o5196082001
Пламя/Браун микропипеттовый вытягивательSutter InstrumentP-1000
HClChempur115752837
Human IL6Thermo Fischer Scientific200-06-20UGНачальная концентрация: 10 µг/мл, Рабочая концентрация: 2 пг/нл (разбавленный в 0,9% NaCl)
Инжекторный насос FemtoJet 4iEppendorfE5252000021
KCl (хлорид калия)Chempur117397402
MgCl2·6H2O (хлорид магния гексагидрат)Chempur116120500
Кончики микрозагрузчика Femtotips для микроинжектора FemtojetEppendorfEPE 5242956003
Микроскоп Leica M165 FC 1983 увеличениеLeica Microsysytemshttps://www.leica-microsystems.com/products/
light-microscopes/stereo-microscopes/p/leica-m165-fc/
Минеральное маслоSigma-AldrichM5904
NaCl (хлорид натрия)Chempur117941206
ПроназаSigma-AldrichP5147-1GНачальная концентрация: 20 мг/мл (приготовленный в ультрачистой воде), Рабочая концентрация: 0,5 мг/мл (разбавленный в E3)
ТрикаинSigma-Aldrich/MerckA-5040
Трис базаCarl Roth4855.3
Трипановый синийThermo Fischer Scientific15250061
UltraPure низкотемпературное агарозаThermo Fischer Scientific16520050
Расширение ZebraBox - Photo Motor Response EZBPMRAnimalabhttps://animalab.eu/zebrabox-high-throughput-monitoring-system
ZebraboxViewPointhttps://www.viewpoint.fr/product/zebrafish/fish-behavior-monitoring/zebraboxАвтоматизированная камера анализа
```

Ссылки

  1. Winden, K., et al. Tuberous sclerosis complex. Nat Rev Dis Primers. 12, 11(2026).
  2. Ramani, R., et al. The clinical interface of tuberous sclerosis complex and autism spectrum disorder: insights and future directions. Neurol Sci. 46 (6), 2571-2580 (2025).
  3. Lyall, K., et al. The changing epidemiology of autism spectrum disorders. Annu Rev Public Health. 38, 81-102 (2017).
  4. Nazeer, A., Ghaziuddin, M. Autism spectrum disorders: clinical features and diagnosis. Pediatr Clin North Am. 59, 19-25 (2012).
  5. Kern, J. K., Geier, D. A., Sykes, L. K., Geier, M. R. Relevance of neuroinflammation and encephalitis in autism. Front Cell Neurosci. 9, 519(2016).
  6. Careaga, M., Murai, T., Bauman, M. D. Maternal immune activation and autism spectrum disorder: from rodents to nonhuman and human primates. Biol Psychiatry. 81 (5), 391-401 (2017).
  7. Croonenberghs, J., Bosmans, E., Deboutte, D., Kenis, G., Maes, M. Activation of the inflammatory response system in autism. Neuropsychobiology. 45, 1-6 (2002).
  8. Girgis, R. R., Kumar, S. S., Brown, A. S. The cytokine model of schizophrenia: emerging therapeutic strategies. Biol Psychiatry. 75 (4), 292-299 (2014).
  9. Heuer, L. S., et al. An exploratory examination of neonatal cytokines and chemokines as predictors of autism risk: the early markers for autism study. Biol Psychiatry. 86 (4), 255-264 (2019).
  10. Sasayama, D., et al. Negative correlation between serum cytokine levels and cognitive abilities in children with autism spectrum disorder. J Intell. 5 (2), 19(2017).
  11. Banks, W. A., Kastin, A. J., Gutierrez, E. G. Penetration of interleukin-6 across the murine blood-brain barrier. Neurosci Lett. 179 (1-2), 53-56 (1994).
  12. Otkıran, G., Erdoğan, M. A., Uyanıkgil, Y., Erbaş, O. Prenatal interferon-alpha exposure induces autism-like neurobehavioral and neurochemical alterations in male offspring. J Neuroimmune Pharmacol. 21, 4(2026).
  13. Smith, S. E. P., Li, J., Garbett, K., Mirnics, K., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters fetal brain development through interleukin-6. J Neurosci. 27 (40), 10695-10702 (2007).
  14. Bedell, V. M., Meng, Q. C., Pack, M. A., Eckenhoff, R. G. A vertebrate model to reveal neural substrates underlying the transitions between conscious and unconscious states. Sci Rep. 10, 15789(2020).
  15. Belo, M. A. A., et al. Zebrafish as a model to study inflammation: a tool for drug discovery. Biomed Pharmacother. 144, 112310(2021).
  16. Ka, J., Pak, B., Han, O., Lee, S., Jin, S. -W. Comparison of transcriptomic changes between zebrafish and mice upon high fat diet reveals evolutionary convergence in lipid metabolism. Biochem Biophys Res Commun. 530 (4), 638-643 (2020).
  17. Li, Y., Hu, B. Establishment of multi-site infection model in zebrafish larvae for studying Staphylococcus aureus infectious disease. J Genet Genomics. 39 (9), 521-534 (2012).
  18. Nicoli, S., Ribatti, D., Cotelli, F., Presta, M. Mammalian tumor xenografts induce neovascularization in zebrafish embryos. Cancer Res. 67 (7), 2927-2931 (2007).
  19. Cao, Z., et al. Carboxyl graphene oxide nanoparticles induce neurodevelopmental defects and locomotor disorders in zebrafish larvae. Chemosphere. 270, 128611(2021).
  20. Martini, D., Pucci, C., Gabellini, C., Pellegrino, M., Andreazzoli, M. Exposure to the natural alkaloid berberine affects cardiovascular system morphogenesis and functionality during zebrafish development. Sci Rep. 10, 17358(2020).
  21. Sun, M., et al. Robotic cardinal vein microinjection of zebrafish larvae based on 3D positioning. 2021 IEEE International Conference on Robotics and Automation (ICRA), Xi'an, China, , (2021).
  22. Kedra, M., et al. TrkB hyperactivity contributes to brain dysconnectivity, epileptogenesis, and anxiety in zebrafish model of tuberous sclerosis complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (4), 2170-2179 (2020).
  23. Kim, S. -H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin. Dis Model Mech. 4 (2), 255-267 (2011).
  24. Konadu, B., Cox, C. K., Gibert, Y. Protocol for the microinjection of free fatty acids and triacylglycerol in zebrafish embryos. STAR Protoc. 5 (2), 103086(2024).
  25. Evans, S. S., Repasky, E. A., Fisher, D. T. Fever and the thermal regulation of immunity: the immune system feels the heat. Nat Rev Immunol. 15 (6), 335-349 (2015).
  26. Zabegalov, K. N., et al. Abnormal repetitive behaviors in zebrafish and their relevance to human brain disorders. Behav Brain Res. 367, 101-110 (2019).
  27. Scheldeman, C., et al. mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebrafish: phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis. Neurobiol Dis. 108, 225-237 (2017).
  28. Ilyin, N. P., et al. Effects of intracerebroventricular lipopolysaccharide administration on behavioral, neurochemical, and neurogenomic responses in adult zebrafish. Behav Brain Res. 493, 115676(2025).
  29. Luo, R., Yao, Y., Chen, Z., Sun, X. An examination of the LPS-TLR4 immune response through the analysis of molecular structures and protein-protein interactions. Cell Commun Signal. 23, 142(2025).
  30. Grebennikova, D. V., Shandilya, U. K., Karrow, N. A. Beyond TLR4 and its alternative lipopolysaccharide (LPS) sensing pathways in zebrafish. Genes. 16 (9), 1014(2025).

Перепечатки и разрешения

Теги

232232JoVETSCTSC TANDs6 IL 6MIA
Микроинъекция интерлейкина-6 в кровоток личинок данио-религии TSC для изучения поведения, похожих на нейропсихиатрические расстройства
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.