Методическая статья

Экспресс-диагностика патогенов инфекций нижних дыхательных путей в стационаре у пациентов отделений интенсивной терапии

54 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71534

⸱

19 сентября 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Infrastructures for Translational Medicine, State Key Laboratory of Complex, Severe, and Rare Diseases, Institute of Clinical Medicine, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 2Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd, 3Department of Critical Care Medicine, State Key Laboratory of Complex, Severe, and Rare Diseases, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College, 4Department of Medicine, Cape Cod Hospital, 5Harvard T.H. Chan School of Public Health, 6Department of Anesthesia, Critical Care and Pain Medicine, Center for Inflammation Research, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данном протоколе описывается полностью интегрированный метод LAMP на основе микрофлюидного чипа, позволяющий в течение одного часа проводить диагностику по месту оказания медицинской помощи 15 патогенов, вызывающих инфекции нижних дыхательных путей у пациентов в отделениях интенсивной терапии.

Аннотация

Инфекции нижних дыхательных путей (ИНДП) относятся к основным причинам клинического ухудшения состояния и летальности у пациентов в критическом состоянии. В отделении интенсивной терапии (ОИТ) своевременная идентификация возбудителя имеет решающее значение для назначения надлежащей антимикробной терапии; однако традиционные методы посева занимают от 3 до 5 дней и характеризуются субоптимальной частотой положительных результатов, особенно в случае грибковых инфекций. Молекулярные подходы, такие как ПЦР, сокращают время получения результата, но все же зависят от ручного выделения нуклеиновых кислот и термоциклирования, что ограничивает их применимость непосредственно у постели больного. В данном протоколе описывается рабочий процесс диагностики по месту оказания медицинской помощи (point-of-care), основанный на полностью интегрированном микрофлюидном чипе в форме диска (CD-чип), который сочетает в себе очистку нуклеиновых кислот с помощью магнитных частиц и петлевую изотермическую амплификацию (LAMP). После упрощенного этапа ручного разжижения и лизиса обработанный образец загружается на чип вместе с двумя предварительно упакованными флаконами с реагентами. Затем прибор автономно выполняет экстракцию, амплификацию при 65 °C и флуоресцентное считывание в реальном времени, выдавая качественные результаты по 15 мишеням (а именно 11 бактериям, 3 грибам и 1 атипичному патогену) в течение 45 min работы прибора (приблизительно 1 h для полного цикла от пробы до ответа, включая этап ручной предобработки). Мы представляем данные по детекции в 10 образцах из ОИТ, включая мокроту, бронхиальный аспират и жидкость для бронхоальвеолярного лаважа, охватывающие как однопатогенные, так и полимикробные ко-инфекции с участием до 7 организмов на одном чипе. Закрытая конструкция картриджа минимизирует риск аэрозольного загрязнения, а одноэтапная загрузка не требует специального обучения, что делает данную систему практичным инструментом прикроватной диагностики для бригад ОИТ.

Введение

Среди пациентов в критическом состоянии в отделениях интенсивной терапии (ОИТ) инфекции нижних дыхательных путей, главной из которых является вентилятор-ассоциированная пневмония (ВАП), остаются постоянным фактором заболеваемости, длительной искусственной вентиляцией легких и избыточной смертности1,2. Микробиологический профиль инфекций нижних дыхательных путей (ИНДП), приобретенных в ОИТ, заметно отличается от профиля заболеваний, приобретенных внебольнично. Преобладают многорезистентные грамотрицательные бактерии (Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii), часто в составе полимикробных ассоциаций, которые затрудняют подбор эмпирических схем лечения3,4. Оппортунистические грибы создают дополнительный уровень сложности. Инвазивный легочный аспергиллез, который ранее считался признаком глубокой иммуносупрессии, сейчас с возрастающей частотой выявляется у пациентов ОИТ без нейтропении, особенно после тяжелого гриппа и COVID-195. Существующие диагностические алгоритмы аспергиллеза сочетают малоэффективный посев с тестированием на антиген галактоманнан (ГМ), однако применение анализа на ГМ ограничено хорошо задокументированными диагностическими окнами и вариабельной чувствительностью у хозяев без нейтропении6. Каждый час задержки в начале соответствующей антимикробной терапии сепсиса связан с измеримым увеличением смертности7. В совокупности скорость развития и сложность инфекций в ОИТ требуют диагностических инструментов, соответствующих клинической срочности.

Стандартный микробиологический посев, будучи незаменимым для определения чувствительности к антибиотикам, имеет фундаментальное ограничение по времени: срок получения результата составляет от 3 до 5 дней, привередливые организмы остаются невыявленными, а частота положительных результатов грибковых культур остается низкой8. Метагеномное секвенирование следующего поколения (mNGS) представляет собой объективную альтернативу, однако его внедрение в клиническую практику сдерживается стоимостью, временем обработки от 24 до 48 часов, зависимостью от биоинформатических конвейеров и ограниченной возможностью применения непосредственно в месте оказания медицинской помощи9. Панели на основе ПЦР сократили временной разрыв, но они всё еще требуют многоэтапной экстракции нуклеиновых кислот, использования оборудования для термоциклирования и, в случае традиционных форматов, проведения электрофореза после амплификации10. Ни одна из этих платформ полностью не удовлетворяет совокупным требованиям отделений интенсивной терапии: скоростью менее одного часа, минимальным временем непосредственной работы оператора, мультиплексным охватом патогенов, включая грибы, и операционной простотой, достаточной для персонала, не являющегося сотрудником лаборатории.

Петлевая изотермическая амплификация (LAMP) позволяет преодолеть ряд этих ограничений. Метод, впервые описанный Notomi et al., обеспечивает амплификацию целевой ДНК при постоянной температуре 65 °C с использованием набора из четырех-шести праймеров, распознающих шесть различных областей, при помощи полимеразы со способностью вытеснять цепь11. В ходе реакции образуются характерные шпилеобразные и «цветковидные» структуры ампликонов, которые можно обнаружить с помощью флуоресценции в реальном времени, что позволяет получить S-образные кривые через несколько минут после пересечения порога. Чувствительность при низких концентрациях матрицы высока, а использование нескольких праймеров обеспечивает селективность, которая ограничивает появление ложноположительных результатов12,13. В сочетании с микрофлюидными чип-платформами метод LAMP может быть распараллелен для анализа нескольких мишеней из одной пробы14. В предыдущих работах было показано, что системы на базе LAMP-чипов позволяют обнаруживать респираторные патогены с общим временем анализа значительно менее трех часов15. Однако основным ограничением таких систем является зависимость от отдельного ручного выделения ДНК, что увеличивает временные затраты, эксплуатационную сложность и риск контаминации.

Описанная здесь система устраняет это узкое место. Построенная на базе одноразового микрофлюидного чипа в форме диска (диаметром 86 mm), она объединяет загрузку образца, очистку нуклеиновых кислот с помощью магнитных частиц и 16-плексную амплификацию методом LAMP в одном герметичном картридже (Рисунок 1). Оператор выполняет лишь короткий этап ручного разжижения и лизиса с использованием специально разработанной пробирки, затем загружает лизат и два флакона с реагентами на чип (Рисунок 2). С этого момента прибор автономно осуществляет экстракцию, изотермическую амплификацию при 65 °C и регистрацию флуоресценции, выдавая качественные результаты по 15 клинически значимым мишеням, а именно: 11 бактериям, 3 грибам (Aspergillus spp., Candida albicans, Pneumocystis jirovecii) и 1 атипичному патогену (Mycoplasma pneumoniae) в течение 45 min. Ген семейства точек разрыва нейробластомы (NBPF), используемый в качестве внутреннего контроля, подтверждает адекватность образца и целостность реакции в каждом анализе. Данный протокол содержит пошаговые инструкции по всему рабочему процессу, от сбора образцов в отделении интенсивной терапии и их предварительной обработки до загрузки чипа, автоматического детектирования и интерпретации результатов, и предназначен как для персонала клинических лабораторий, так и для бригад интенсивной терапии у постели больного.

Протокол

Все образцы были собраны в соответствии с протоколом, утвержденным Комитетом по этике больницы Пекинского медицинского колледжа Китайской академии медицинских наук (номер одобрения I-24PJ1778). Перед сбором биоматериала от каждого участника или его законного представителя было получено письменное информированное согласие. Перечень целевых патогенов и распределение лунок для реакций приведены в Таблице 1, а расходные материалы, использованные при предварительной обработке образцов, перечислены в Таблице 2.

1. Сбор клинических образцов из нижних дыхательных путей в отделении интенсивной терапии

  1. Сбор мокроты
    1. Трижды прополощите ротовую полость чистой водой или стерильным физиологическим раствором, чтобы удалить остатки пищи и комменсальную микрофлору полости рта.
    2. Попросите пациента сделать два-три глубоких вдоха, затем с силой откашляться, чтобыB вытолкнуть мокроту из глубоких дыхательных путей непосредственно в стерильный контейнер для сбора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приемлемый образец представляет собой вязкий, гнойный или со следами крови материал из области ниже трахеи; прозрачная слюна или постназальный секрет не подходят и могут затруднить последующее обнаружение.
  2. Сбор бронхиального аспирата (БАС)
    1. Для пациентов без интубации введите стерильный аспирационный катетер (катетер 10–12 Fr, при установленном давлении источника аспирации −0.0267 MPa, что эквивалентно −200 mmHg) через носовой или ротовой путь на глубину примерно 30 cm.
    2. Включите аспирацию, вращая катетер, и медленно извлеките его. Соберите аспирированный секрет в стерильную ловушку для образцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если секреции скудны, перед аспирацией введите через катетер примерно 5 mL стерильного физраствора.
    3. Для пациентов на искусственной вентиляции легких выберите аспирационный катетер в соответствии с размером эндотрахеальной трубки: используйте катетер 10 Fr для трубки 7.0–7.5 mm и катетер 12 Fr для трубки 8.0 mm.
    4. Перед аспирацией проведите предварительную оксигенацию пациента 100% кислородом в течение 30–60 s. Отсоедините контур вентилятора и введите выбранный катетер через искусственные дыхательные пути до появления сопротивления.
    5. Создайте отрицательное давление −0.0267 MPa (эквивалентно −200 mmHg), ограничив каждый цикл аспирации (и, следовательно, время отключения вентилятора) не более чем 15 s, чтобы минимизировать дерекрутмент и гипоксемию; после аспирации снова проведите оксигенацию пациента 100% кислородом в течение 30–60 s.
    6. Введите 1–2 mL стерильного физраствора через катетер и подождите 3 s.
    7. Включите аспирацию и извлеките катетер. Соберите аспирированный секрет в стерильную ловушку для образцов. Сразу после сбора образца снова подключите контур вентилятора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всей процедуры необходимо строго соблюдать технику асептики, чтобы избежать нозокомиального загрязнения образца.
  3. Сбор жидкости для бронхоальвеолярного лаважа (БАЛЖ)
    1. Определите целевой сегмент по снимкам грудной клетки. Проведите бронхоскоп и зафиксируйте его в соответствующем сегментарном или субсегментарном бронхе.
    2. Быстро введите 3–5 порций стерильного физраствора по 20–50 mL (всего 60–120 mL). После каждой порции проведите осторожную аспирацию, затем соберите полученную жидкость в стерильный герметичный контейнер.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: При проведении БАЛ у пациентов в отделении интенсивной терапии обязателен непрерывный гемодинамический и вентиляционный мониторинг. При необходимости отрегулируйте настройки вентилятора для пациентов на искусственной вентиляции легких.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Типичный объем возврата составляет 40–60% от введенного объема. Низкий возврат может потребовать изменения положения наконечника бронхоскопа.

2. Разжижение и лизис патогенов

  1. С помощью одноразовой пипетки №2 аспирируйте образец до отмеченной линии (приблизительно 1 mL) и перенесите его в пробирку для разжижения. Неоднократно сжимайте грушу пипетки, чтобы перенести весь вязкий материал, затем закройте пробирку крышкой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для БАЛЖ или жидкой мокроты возьмите два объема пипетки, чтобы обеспечить достаточное количество патогена.
  2. Интенсивно встряхивайте пробирку для разжижения вручную в течение 1 min. Визуально оцените образец и продолжайте встряхивание до тех пор, пока не исчезнут видимые комки слизи и образец будет свободно проходить через одноразовую пипетку №1 без сопротивления (однородная консистенция, напоминающая воду). Встряхивайте не менее 1 min, при необходимости увеличивая время для высоковязких образцов до достижения этих критериев.
  3. Откройте герметичную крышку пробирки для лизиса.
  4. Аспирируйте примерно 0.5 mL гомогенизированного образца с помощью одноразовой пипетки №1 и перенесите образец в пробирку для лизиса.
  5. Закройте герметичную крышку и убедитесь, что колпачок наконечника плотно затянут.
  6. Установите пробирку для лизиса в устройство для предварительной обработки образцов (устройство SP), нажимая вниз до полной фиксации. Нажмите Start.
  7. Дождитесь завершения устройством SP автоматического цикла разжижения-лизиса (параметры приведены в таблице 3), который длится примерно 15 min.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не открывайте и не вынимайте пробирку во время обработки.

3. Загрузка чипа и автоматизированное детектирование

  1. Загрузка реагентов и образца
    1. Извлеките CD-чип из хранения при 4 °C и выдержите его при комнатной температуре (приблизительно 25 °C) в течение 10 мин.
      ​ПРИМЕЧАНИЕ: Флаконы с реагентами O и B, а также предварительно обработанный лизат используются при комнатной температуре; амплификация LAMP на чипе проводится при 65 °C (см. пункт 3.2.3 и Таблицу 3).
    2. Откройте фольгированный пакет и поместите чип на плоскую поверхность.
    3. Поверните крышку против часовой стрелки, чтобы открыть чип.
    4. Встряхните флакон O, чтобы собрать жидкость на дне флакона.
    5. Снимите колпачок с флакона O, вставьте носик в порт O и введите всё содержимое во флакон.
    6. Утилизируйте флакон O. Повторите процедуру, используя флакон B и порт B.
    7. Извлеките пробирку с обработанным лизатом из устройства SP и снимите колпачок с наконечника.
    8. Совместите наконечник пробирки с портом S и введите весь объем лизата в чип.
    9. Утилизируйте использованную пробирку для лизиса.
    10. Поверните крышку чипа по часовой стрелке до тех пор, пока два слышимых щелчка не подтвердят полную герметизацию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Неполная загрузка любого из портов может привести к сбоям в отдельных каналах. Перед герметизацией убедитесь в полном введении содержимого. Чтобы избежать неполной герметизации и риска загрязнения, не используйте полиэтиленовые (PE) перчатки при закрытии крышки; вместо них рекомендуются латексные или нитриловые перчатки.
  2. Работа с прибором
    1. Включите автоматический анализатор нуклеиновых кислот. Нажмите Detect, отсканируйте штрих-код на фольгированном пакете чипа и введите демографические данные пациента и ID образца.
    2. Установите чип на вращающийся шпиндель и нажмите вниз до щелчка, подтверждающего фиксацию.
    3. Нажмите Start. Прибор автономно выполняет центрифужное распределение реагентов, экстракцию на магнитных частицах, амплификацию LAMP при 65 °C и регистрацию флуоресценции. Время анализа составляет примерно 45 мин (загрузка реагентов/образцов и рабочий процесс прибора обобщены на Рисунке 3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не открывайте крышку во время анализа.
  3. Интерпретация результатов
    1. Программное обеспечение определяет точку перегиба каждой S-образной кривой амплификации с помощью анализа максимума второй производной и сообщает соответствующее значение TP (время до появления положительного сигнала).
    2. Сравните каждое значение TP с соответствующим пороговым значением, указанным в Таблице 4. Классифицируйте каналы со значениями TP на уровне порога или ниже него как положительные, а каналы со значениями TP выше порога — как отрицательные.
    3. Убедитесь, что в канале внутреннего контроля (лунка 16) наблюдается S-образная кривая амплификации со значением TP менее 12 мин.
    4. Если внутренний контроль не сработал, результат анализа считается недостоверным. Повторите тестирование, используя новый чип, или заберите образец повторно.

Результаты

On completion of a valid run, the instrument displayed real-time fluorescence traces for all 16 channels. Positive channels exhibited the expected S-shaped amplification kinetics with automatically annotated TP values, whereas negative channels remained at baseline. The IC channel (well 16) yielded an S-shaped curve with TP < 12 min in all valid runs.

As a pilot, proof-of-concept demonstration of the protocol, 10 representative specimens were selected to illustrate the range of clinical scenarios encountered in ICU practice, including 6 bronchial aspirates (BAS), 2 bronchoalveolar lavage fluid (BALF) specimens, and 2 deep sputum (Spt) specimens. These specimens were deliberately chosen to span monomicrobial and complex polymicrobial cases rather than to estimate pathogen prevalence; 8 of the 10 were polymicrobial (2 to 7 targets each), and 2 were monomicrobial. Full TP data are presented in Table 5, and representative amplification curves are shown in Figure 4.

At one end of the complexity spectrum, sample S1 (BAS) produced a single positive signal for Aspergillus spp. (TP = 8 min), whereas all bacterial channels remained negative. This pattern was consistent with isolated invasive aspergillosis, a diagnosis that conventional culture frequently fails to detect promptly. Sample S10 (Spt) similarly yielded a single positive result for Streptococcus pneumoniae (TP = 5.5 min). These findings demonstrated the assay's ability to identify monomicrobial infections against a background of 15 pathogen targets.

Polymicrobial infections were observed in the remaining specimens, consistent with the epidemiology of respiratory infections in ICU patients. Samples S2–S5 each contained Aspergillus spp. together with one or more bacterial pathogens and, in two specimens, Candida albicans. The most complex specimen, S5 (BALF), generated seven simultaneous positive signals, including Aspergillus spp., Burkholderia cepacia, Corynebacterium striatum, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, and Stenotrophomonas maltophilia. These results demonstrated the 16-well microfluidic chip's multiplex detection capability under clinical testing conditions.

Samples S6–S9, which contained bacterial co-infections without fungal involvement, ranged from dual-pathogen detection (S6: B. cepacia and E. coli) to quadruple-pathogen detection (S8: Acinetobacter baumannii, B. cepacia, Klebsiella pneumoniae, and S. maltophilia). Across all 10 specimens, TP values for positive channels ranged from 3.5–9 min, and all internal control channels met the predefined validity criterion of TP < 12 min.

For this pilot set, the chip results were compared with two reference methods performed in parallel on the same 10 specimens: targeted metagenomic next-generation sequencing (tNGS) and conventional sputum culture. Per-target concordance for the 15 pathogen channels is summarized in Table 6. Relative to tNGS, the assay showed 100% positive percent agreement (PPA) and 100% negative percent agreement (NPA) across all targets in these specimens. Relative to sputum culture, PPA was 100% for every culture-positive target, whereas NPA ranged from 44.4% to 100%; the lower NPA values reflected targets detected by the chip (and by tNGS) but not recovered in culture, consistent with the higher analytical sensitivity of nucleic acid amplification relative to culture rather than with false positivity. Given the small, deliberately selected sample, these figures are descriptive concordance estimates for the pilot cohort and are not intended as formal diagnostic-accuracy measures. Because tNGS is itself a nucleic acid-based method, agreement with tNGS confirms concordance at the nucleic acid level rather than establishing the clinical status of each organism; neither method, on its own, distinguishes true infection from colonization.

Centrifugal microfluidic device diagram; sample purification, amplification, detection setup.
Figure 1: Microfluidic chip architecture and associated consumables. (A) Overview of the 86 mm disc chip, showing three concentric zones: a loading region, an intermediate magnetic-bead purification region, and an outer amplification and detection region. (B) Outer amplification ring housing the 16 reaction wells (positions 1, 4, 8, 12, and 16 indicated). (C) Lysis tube components (tip cap, sealing cap, and tube body). (D) Single-dose reagent vials "O" and "B." (E) Loading region showing sample well "S" and reagent wells "O" and "B." Abbreviations: O = reagent O; B = reagent B; S = sample. Please click here to view a larger version of this figure.

DNA extraction setup; diagram showing lysis, liquefaction tubes, pipettes, and thermocycler process.
Figure 2: Preprocessing kit and sample preprocessing workflow. (A) The specimen is transferred into the liquefaction tube and homogenized by manual shaking. (B) The homogenized specimen is transferred from the liquefaction tube into the lysis tube. (C) The lysis tube is seated in the sample preprocessing (SP) device for the automated liquefaction-lysis cycle. (D) Preprocessing consumables: the #1 and #2 disposable pipettes (red arrows indicate the sample-loading marks), the lysis tube, and the liquefaction tube. Abbreviation: SP = Sample preprocessing. Please click here to view a larger version of this figure.

PCR experiment setup; equipment includes spin rotor and digital assay device; DNA analysis process.
Figure 3: Chip loading and automated detection workflow. (A) Reagent vial O, reagent vial B, and the processed sample are loaded into the corresponding chip ports (O, B, and S). (B) The chip is assembled and sealed. (C) The chip is mounted on the automated nucleic acid analyzer, and the barcode is scanned. (D) The run is initiated from the touchscreen, after which nucleic acid extraction, amplification, and fluorescence detection proceed automatically. Please click here to view a larger version of this figure.

Real-time fluorescence curves diagram showing DNA amplification across 10 samples, PCR analysis.
Figure 4: Representative amplification curves obtained from 10 lower respiratory tract specimens collected from ICU patients. Each panel represents a single specimen (S1–S10). S-shaped amplification curves indicate positive targets with annotated TP values, whereas flat traces indicate negative targets. Specimen S1 contained only Aspergillus spp.; specimens S2–S5 contained Aspergillus spp. together with bacterial pathogens and/or Candida albicans; specimens S6–S9 contained polymicrobial bacterial infections; and specimen S10 contained only Streptococcus pneumoniae. Corresponding TP values are provided in Table 5. Abbreviations: Aba = Acinetobacter baumannii; Asp = Aspergillus spp.; Bcc = Burkholderia cepacia; Cal = Candida albicans; Cst = Corynebacterium striatum; Eco = Escherichia coli; Hin = Haemophilus influenzae; IC = internal control; Kpn = Klebsiella pneumoniae; Lpn = Legionella pneumophila; Mpn = Mycoplasma pneumoniae; Pae = Pseudomonas aeruginosa; Pji = Pneumocystis jirovecii; Sau = Staphylococcus aureus; Sma = Stenotrophomonas maltophilia; Spn = Streptococcus pneumoniae. Please click here to view a larger version of this figure.

WellTargetAbbreviationCategoryType
1Acinetobacter baumanniiAbaBacteriaBacterium
2Aspergillus spp.AspFungiFungus
3Burkholderia cepaciaBccBacteriaBacterium
4Candida albicansCalFungiFungus
5Corynebacterium striatumCstBacteriaBacterium
6Escherichia coliEcoBacteriaBacterium
7Haemophilus influenzaeHinBacteriaBacterium
8Klebsiella pneumoniaeKpnBacteriaBacterium
9Legionella pneumophilaLpnBacteriaBacterium
10Mycoplasma pneumoniaeMpnAtypicalAtypical bacterium
11Pseudomonas aeruginosaPaeBacteriaBacterium
12Pneumocystis jiroveciiPjiFungiFungus
13Staphylococcus aureusSauBacteriaBacterium
14Stenotrophomonas maltophiliaSmaBacteriaBacterium
15Streptococcus pneumoniaeSpnBacteriaBacterium
16NBPF (internal control)ICinternal controlInternal control

Table 1: Target pathogen panel and reaction well assignments.

ConsumableSpecification / volumeFunction
Liquefaction tube2 mL/tubeReceives specimen; manual homogenization
Lysis tube0.5 mL/tubeCompressible silicone body with 200 µm filter membrane; preloaded lysis reagents
#1 disposable pipette0.5 mLTransfers homogenized specimen into lysis tube
#2 disposable pipette2 mLAspirates specimen to marked line into liquefaction tube

Table 2: Specifications of consumables used during sample preprocessing.

StepTemperatureDuration
Liquefaction50 °C10 min
Pathogen lysis95 °C5 min
Total cycle—~15 min

Table 3: Operating parameters of the sample preprocessing (SP) device cycle.

TargetTP threshold (min)Classification rule
Acinetobacter baumannii13TP ≤ threshold = positive
Aspergillus spp.15.5TP ≤ threshold = positive
Burkholderia cepacia12.5TP ≤ threshold = positive
Candida albicans13.5TP ≤ threshold = positive
Corynebacterium striatum13TP ≤ threshold = positive
Escherichia coli12TP ≤ threshold = positive
Haemophilus influenzae13.5TP ≤ threshold = positive
Klebsiella pneumoniae15.5TP ≤ threshold = positive
Legionella pneumophila14.5TP ≤ threshold = positive
Mycoplasma pneumoniae14TP ≤ threshold = positive
Pseudomonas aeruginosa12TP ≤ threshold = positive
Pneumocystis jirovecii14.5TP ≤ threshold = positive
Staphylococcus aureus15.5TP ≤ threshold = positive
Stenotrophomonas maltophilia12TP ≤ threshold = positive
Streptococcus pneumoniae14.5TP ≤ threshold = positive
NBPF (internal control)12Run valid if TP < 12 min

Table 4: TP threshold values used for target classification.

SpecimenTypeDetected targetTP (min)Culture / tNGS (reads)
S1BASAspergillus spp.8+ / 1,253
S2BASAspergillus spp.7.5– / 3,877
Pseudomonas aeruginosa4+ / 55,039
Stenotrophomonas maltophilia6.5– / 3,087
S3BASAspergillus spp.5.5+ / 6,145
Burkholderia cepacia6– / 3,221
Candida albicans7.5– / 3,280
Stenotrophomonas maltophilia6+ / 13,189
S4BALFAcinetobacter baumannii6.5+ / 10,485
Aspergillus spp.7.5– / 4,432
Burkholderia cepacia5.5– / 1,676
Candida albicans8.5– / 576
S5BALFAspergillus spp.7.5+ / 2,869
Burkholderia cepacia4– / 6,532
Corynebacterium striatum5.5– / 71,839
Escherichia coli7– / 1,891
Pseudomonas aeruginosa4+ / 31,386
Staphylococcus aureus6.5– / 26,683
Stenotrophomonas maltophilia4+ / 21,467
S6BASBurkholderia cepacia5.5– / 1,984
Escherichia coli5.5+ / 8,005
S7BASAcinetobacter baumannii5.5+ / 28,007
Burkholderia cepacia4+ / 3,585
Haemophilus influenzae6.5– / 8,912
Stenotrophomonas maltophilia6– / 8,865
S8BASAcinetobacter baumannii5.5– / 43,721
Burkholderia cepacia4– / 53,796
Klebsiella pneumoniae3.5+ / 23,757
Stenotrophomonas maltophilia4– / 26,898
S9SptHaemophilus influenzae9– / 3,636
Staphylococcus aureus8.5+ / 1,918
Stenotrophomonas maltophilia8.5– / 872
S10SptStreptococcus pneumoniae5.5– / 29,893

Table 5: Detection results and TP values for 10 representative lower respiratory tract specimens collected from ICU patients.

TargettNGS +POCT +tNGS −POCT −PPANPA(SC) PPA/NPA
Acinetobacter baumannii3377100%100%100% / 87.5%
Aspergillus spp.5555100%100%100% / 71.4%
Burkholderia cepacia6644100%100%100% / 44.4%
Candida albicans2288100%100%– / 80.0%
Corynebacterium striatum1199100%100%100% / 100%
Escherichia coli2288100%100%100% / 88.9%
Haemophilus influenzae2288100%100%– / 80.0%
Klebsiella pneumoniae1199100%100%100% / 100%
Legionella pneumophila001010–100%– / 100%
Mycoplasma pneumoniae001010–100%– / 100%
Pseudomonas aeruginosa2288100%100%100% / 100%
Pneumocystis jirovecii001010–100%– / 100%
Staphylococcus aureus2288100%100%100% / 88.9%
Stenotrophomonas maltophilia6644100%100%100% / 50.0%
Streptococcus pneumoniae1199100%100%– / 90.0%

Table 6: Per-target concordance of the assay with targeted metagenomic next-generation sequencing (tNGS) and conventional sputum culture for the 10 representative specimens. For each of the 15 pathogen targets, the number of positive and negative results by each method and the resulting positive percent agreement (PPA) and negative percent agreement (NPA) are shown. Abbreviations: PPA = positive percent agreement; NPA = negative percent agreement; tNGS = targeted metagenomic next-generation sequencing; PPA/NPA shown as "/" where no positive (or negative) reference results were available.

No.PathogenLoD (copies/mL)
1Acinetobacter baumannii1,000
2Aspergillus spp.2,000
3Burkholderia cepacia2,000
4Candida albicans1,000
5Corynebacterium striatum1,000
6Escherichia coli4,000
7Haemophilus influenzae2,000
8Klebsiella pneumoniae4,000
9Legionella pneumophila2,000
10Mycoplasma pneumoniae1,000
11Pseudomonas aeruginosa2,000
12Pneumocystis jirovecii1,000
13Staphylococcus aureus2,000
14Stenotrophomonas maltophilia2,000
15Streptococcus pneumoniae4,000
16Internal control (NBPF)Not applicable (internal control)

Table 7: Analytical limit of detection (LoD) for each panel target. LoD was determined using digital-PCR-quantified genomic nucleic acid spiked into a negative bronchoalveolar lavage fluid matrix, serially diluted and tested in triplicate, and defined as the lowest concentration detected in at least 95% of replicates. Values are expressed in copies/mL. Abbreviation: LoD = limit of detection.

DimensionPOCT (this assay)Sputum cultureConventional PCRmNGS
Turnaround time~1 h2–5 days4–8 h> 24 h
Operator skill requiredLowHighHighHigh
Laboratory requirementLow; bedsideHigh; bacteriology labHigh; PCR labHigh; specialized facility
Equipment investmentLow–moderateLowModerateHigh
Per-test costModerateLowModerateHigh
Analytical sensitivityHighLowHighHigh
Principal advantageFully integrated, sample-in/result-out, no specialized operationReference standard; provides susceptibilityHigh sensitivity; quantitativeUnbiased; detects rare/unexpected pathogens; resolves difficult cases

Table 8: Qualitative comparison of the present point-of-care assay with sputum culture, conventional PCR, and metagenomic sequencing. Methods are compared across turnaround time, operator skill requirement, laboratory infrastructure requirement, equipment investment, per-test cost, analytical sensitivity, and principal advantages. Abbreviations: POCT = point-of-care testing; PCR = polymerase chain reaction; mNGS = metagenomic next-generation sequencing.

Обсуждение

Быстрая идентификация патогенов имеет решающее значение при лечении инфекций в отделениях интенсивной терапии. Описанная здесь система сокращает время идентификации патогена с 3–5 дней, обычно требуемых для культивирования, до менее чем 1 часа — временного интервала, в течение которого часто принимаются решения о назначении антимикробных препаратов первой линии7. Благодаря интеграции экстракции нуклеиновых кислот, очистки и 16-плексной амплификации LAMP в одном герметичном чипе, данный рабочий процесс исключает этап ручного выделения ДНК, который был основным эксплуатационным «узким местом» в предыдущих платформах на базе LAMP-чипов15. В результате процедура загрузки становится единичной и может выполняться персоналом, не имеющим специальной подготовки в области молекулярной биологии.

Несколько процедурных аспектов заслуживают особого внимания. Качество образца имеет решающее значение. Глубокие респираторные образцы, такие как бронхиальный аспират или жидкость для бронхоальвеолярного лаважа, предпочтительнее мокроты при кашле у пациентов на искусственной вентиляции легких, так как в последних загрязнение из ротоглотки может маскировать истинный сигнал патогена. Неполное разжижение является наиболее частой причиной субоптимального лизиса, поэтому ручное встряхивание следует продолжать до тех пор, пока образец явно не приобретет водянистую консистенцию. При загрузке чипа неполное опорожнение флакона с реагентом или пробирки для лизиса может привести к недостатку исходного материала в последующих лунках, что вызовет сбои в конкретных каналах, которые могут быть ошибочно интерпретированы как отрицательные результаты. Кроме того, закрытие крышки чипа с двумя щелчками является не просто механической особенностью; это необходимо для поддержания герметичного пространства, требуемого для изотермической амплификации, и предотвращения потерь из-за испарения.

Устранение неисправностей осуществляется достаточно просто. Высоковязкая мокрота пациентов ОИТ может потребовать ручного встряхивания в течение более длительного времени, чем рекомендованная 1 min. Разбавленные образцы, в частности жидкость при бронхоальвеолярном лаваже, могут потребовать загрузки в двукратном стандартном объеме пипетирования для компенсации более низкой плотности патогенов. Отказ внутреннего контроля, определяемый как отсутствие S-образной кривой амплификации или значение TP более 12 min, указывает либо на недостаточную клеточность образца, либо на сбой гидродинамики внутри чипа. В таких случаях надлежит взять новый образец или повторить тестирование с использованием нового чипа, а не проводить переинтерпретацию данных по отдельным каналам.

Данный метод также имеет важные ограничения. Панель ограничена 15 предопределенными мишенями, и организмы, не входящие в этот список, включая многие детерминанты антимикробной резистентности, не могут быть обнаружены. Каждый набор праймеров нацелен на консервативный видоспецифический участок соответствующего организма, за исключением анализа рода Aspergillus; следовательно, виды или штаммы, не представленные в панели, не обнаруживаются, и панель не фиксирует внутривидовую вариабельность на уровне штаммов. Поскольку каждая из 16 лунок содержит специальный набор лиофилизированных праймеров, панель является модульной и может быть переконфигурирована в будущих версиях для добавления новых мишеней.

Результат анализа является качественным. Хотя значения TP могут иметь определенную корреляцию с бактериальной нагрузкой патогена, они не могут заменить результаты количественного культивирования или оценки на основе ПЦР, полученные из значений порогового цикла. Как и любой тест по амплификации нуклеиновых кислот, проводимый с респираторными образцами, данный анализ сам по себе не позволяет отличить колонизацию от истинной инфекции. Следовательно, клиническая интерпретация должна интегрировать результаты анализа на чипе с данными о маркерах воспаления, таких как C-реактивный белок и прокальцитонин, результатами визуализации, грибковыми биомаркерами, включая галактоманнан и (1,3)-β-D-глюкан, а также общим клиническим течением заболевания. Кроме того, система не предоставляет данные о чувствительности к антимикробным препаратам, и для этой цели по-прежнему необходим традиционный посев.

Наконец, все образцы, включенные в данное исследование, были получены из одного отделения интенсивной терапии третичного уровня, и распространенность патогенов, а также характер коинфекций могут различаться в зависимости от медицинского учреждения и популяции пациентов. Таким образом, настоящую работу следует рассматривать как пилотную демонстрацию принципа работы протокола на небольшой, намеренно отобранной группе репрезентативных образцов; она не была предназначена для оценки диагностической точности. Клиническая чувствительность и специфичность по каждой мишени, а также систематическое соответствие результатам традиционного культурального метода и метагеномного секвенирования следующего поколения (mNGS) будут установлены в ходе планируемого проспективного многоцентрового исследования с последовательным набором участников.

В качестве первичной оценки аналитических характеристик предел обнаружения (LoD) для каждой мишени оценивали с использованием геномной нуклеиновой кислоты, количество которой было определено методом цифровой ПЦР и которая была добавлена в матрицу отрицательного бронхоальвеолярного лаважа. Образцы подвергали серийному разведению и тестировали в трех повторностях. LoD определяли как самую низкую концентрацию, обнаруженную как минимум в 95% повторностей. Полученные значения LoD для всей панели варьировались от 1 000 до 4 000 копий/mL (Таблица 7). Поскольку в данном пилотном исследовании количественное определение каждого организма методом подсчета колоний было недоступно, эти оценки LoD будут уточнены в будущих работах с использованием официально пересчитанных референсных штаммов.

Сравнение с существующими диагностическими подходами позволяет дополнительно уточнить позицию данной платформы. Традиционный посев, несмотря на медлительность, остается золотым стандартом и предоставляет информацию о чувствительности к препаратам. Метагеномное секвенирование нового поколения обеспечивает гораздо более широкий охват организмов, но при существенно более высокой стоимости, более длительных сроках выполнения анализа (обычно 24–48 h) и требованиях к биоинформатике, которые многие отделения интенсивной терапии не могут обеспечить на месте9. Стандартные мультиплексные панели ПЦР сокращают время получения результата, но они по-прежнему обычно требуют отдельной экстракции нуклеиновых кислот и, в зависимости от платформы, серийной обработки, что может привести к дополнительным задержкам10.

С точки зрения затрат, хотя формальный анализ экономической эффективности выходил за рамки данного пилотного исследования, платформа решает основные проблемы факторов стоимости в условиях ОИТ, включая как посев, так и традиционную или мультиплексную ПЦР (качественное сравнение методов приведено в Таблице 8). Она выдает результаты примерно за 1 ч, по сравнению с 2–5 сутками для посева мокроты, 4–8 ч для традиционной ПЦР (которая обычно требует серийной обработки) и >24 ч для метагеномного секвенирования. Поскольку рабочий процесс полностью интегрирован (от образца до результата), он требует only одного этапа ручной загрузки без отдельного выделения нуклеиновых кислот, может выполняться непосредственно у постели больного без специализированной бактериологической или молекулярной лаборатории и профильного персонала по молекулярной биологии, а также использует закрытый одноразовый картридж, что снижает количество повторных тестов из-за контаминации. Затраты на оборудование также умеренны, что позволяет избежать необходимости в приборе для количественной ПЦР в реальном времени или платформе для секвенирования. Для тяжелобольных пациентов в ОИТ такое быстрое получение результата может сократить продолжительность ненадлежащей эмпирической терапии и уменьшить сроки пребывания в стационаре, обеспечивая косвенный, но потенциально значительный экономический эффект.

Данная система занимает особую нишу, определяемую высокой скоростью анализа, простотой эксплуатации и биобезопасностью за счет использования закрытых картриджей — характеристиками, которые в совокупности делают возможным внедрение метода непосредственно у постели больного. Важной особенностью является включение трех мишеней для грибков. Aspergillus spp. был обнаружен в 5 из 10 образцов (диапазон Tp: 5,5–8 мин). Учитывая известные ограничения культуральных методов и ограниченное диагностическое окно при тестировании на галактоманнан для Aspergillus5,6, наличие молекулярного сигнала в течение 45 мин может позволить раньше рассмотреть возможность применения таргетной антифунгальной терапии, хотя клиническая значимость такого раннего сигнала должна быть подтверждена в проспективных исследованиях.

Очевидны несколько направлений для дальнейших исследований. Расширение панели за счет включения ключевых детерминант резистентности, как минимум генов карбапенемаз и mecA, помогло бы сократить разрыв между идентификацией патогена и эмпирическим подбором противомикробных препаратов. Кроме того, по мере роста наборов данных TP, модели машинного обучения, обученные на парных профилях амплификации и клинических метаданных, со временем могут помочь отличить колонизацию от истинной инфекции, хотя такие приложения потребуют тщательной проспективной валидации. В более широком смысле потребуется многоцентровая оценка в географически разнообразных популяциях пациентов ОИТ, прежде чем диагностическая эффективность данной платформы сможет считаться универсальной.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Национальный крупный научно-технический проект по неинфекционным хроническим заболеваниям (№ 2023ZD0516500), Национальное финансирование клинических исследований для госпиталей высокого уровня (2026-PUMCH-A-103), программа открытых конкурсов CMB (24-561) и программа подготовки талантов Больницы Пекинского медицинского колледжа (№ UGG11571).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Автоматический анализатор нуклеиновых кислотBeijing Taihao Biotechnology Co., LtdTHE-T80-01TurboFlow T; осуществляет центрифужное распределение реагентов, экстракцию на магнитных частицах, LAMP при 65 °C и флуоресцентную детекцию в реальном времени (время анализа ~45 мин)
Одноразовая пипетка Пастера №1Zhongtai Experimental Equipment Factory (Haimen)Custom-madeОдноразовый расходный материал; 0.5 mL; для переноса гомогенизированного образца в пробирку для лизиса
Одноразовая пипетка Пастера №2Zhongtai Experimental Equipment Factory (Haimen)Custom-madeОдноразовый расходный материал; 2 mL; для аспирации образца до отметки в пробирку для разжижения
CD-чипBeijing Hongyang Chensheng Technology Co., LtdCustom-madeОдноразовый расходный материал; диск диаметром 86 mm с центральной зоной загрузки (порты O, B, S), зоной очистки на магнитных частицах и внешним кольцом с 16 реакционными лунками (15 мишеней патогенов + внутренний контроль NBPF)
Реагенты для LAMP-реакцииYeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd16730ES80Реагенты для LAMP-реакции, предварительно помещенные в CD-чип в виде лиофилизированных гранул
Пробирка для разжиженияBeijing Taihao Biotechnology Co., LtdCustom-madeОдноразовый расходный материал; 2 mL/пробирка; используется для ручной гомогенизации образца
Пробирка для лизисаBeijing Taihao Biotechnology Co., LtdCustom-madeОдноразовый расходный материал; 0.5 mL/пробирка; сжимаемый силиконовый корпус с фильтрующей мембраной 200 µm; предварительно заполнена реагентами для лизиса
ПраймерыSangon Biotech (Shanghai) Co., LtdCustom-madeСмесь праймеров, встроенная в реакционную камеру CD-чипа
Устройство для предварительной обработки образцовBeijing Taihao Biotechnology Co., LtdTHE-R10-02TS-2000; автоматизированный цикл разжижение–лизис (~15 мин)
Однодозовый флакон “B”Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., LtdCustom-madeОдноразовый расходный материал; предварительно упакованный реагент для чипа; один на тест; хранить при 4 °C и довести до комнатной температуры (~25 °C) перед загрузкой
Однодозовый флакон “O”Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., LtdCustom-madeОдноразовый расходный материал; предварительно упакованный реагент для чипа; один на тест; хранить при 4 °C и довести до комнатной температуры (~25 °C) перед загрузкой

Ссылки

  1. GBD 2016 Lower Respiratory Infections Collaborators. Estimates of the global, regional, and national morbidity, mortality, and aetiologies of lower respiratory infections in 195 countries, 1990–2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Infect Dis. 2018;18(11):1191-1210.
  2. Niederman MS, Torres A. Respiratory infections. Eur Respir Rev. 2022;31(166):220150.
  3. Weiser JN, Ferreira DM, Paton JC. Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion. Nat Rev Microbiol. 2018;16(6):355-367.
  4. Reynolds D et al. The threat of multidrug-resistant/extensively drug-resistant gram-negative respiratory infections: another pandemic. Eur Respir Rev. 2022;31(166):220068.
  5. Schauwvlieghe AFAD et al. Invasive aspergillosis in patients admitted to the intensive care unit with severe influenza: a retrospective cohort study. Lancet Respir Med. 2018;6(10):782-792.
  6. Meersseman W et al. Galactomannan in bronchoalveolar lavage fluid: a tool for diagnosing aspergillosis in intensive care unit patients. Am J Respir Crit Care Med. 2008;177(1):27-34.
  7. Seymour CW et al. Time to treatment and mortality during mandated emergency care for sepsis. N Engl J Med. 2017;376(23):2235-2244.
  8. Noviello S, Huang DB. The basics and the advancements in diagnosis of bacterial lower respiratory tract infections. Diagnostics (Basel). 2019;9(2):37.
  9. Chiu CY, Miller SA. Clinical metagenomics. Nat Rev Genet. 2019;20(6):341-355.
  10. Hanson KE et al. Molecular testing for acute respiratory tract infections: clinical and diagnostic recommendations from the IDSA's diagnostics committee. Clin Infect Dis. 2020;71(10):2744-2751.
  11. Notomi T et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000;28(12):E63.
  12. Soroka M, Wasowicz B, Rymaszewska A. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): the better sibling of PCR? Cells. 2021;10(8):1931.
  13. Parida M et al. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a new generation of innovative gene amplification technique; perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases. Rev Med Virol. 2008;18(6):407-421.
  14. Ou H et al. Rapid detection of multiple pathogens by the combined loop-mediated isothermal amplification technology and microfluidic chip technology. Ann Palliat Med. 2021;10(10):11053-11066.
  15. Lai JX et al. Rapid detection of bacterial pathogens causing lower respiratory tract infections via microfluidic-chip-based loop-mediated isothermal amplification. J Vis Exp. 2024;(205):e66677.

Перепечатки и разрешения

Теги

Инфекции нижних дыхательных путейидентификация патогеновмикрофлюидный чипочистка нуклеиновых кислотизотермическая амплификацияэкстракция с помощью магнитных частицприкроватная диагностикареспираторные патогены

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.