Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Экспресс-диагностика патогенов инфекций нижних дыхательных путей в стационаре у пациентов отделений интенсивной терапии

649 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71534

⸱

19 сентября 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Infrastructures for Translational Medicine, State Key Laboratory of Complex, Severe, and Rare Diseases, Institute of Clinical Medicine, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 2Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd, 3Department of Critical Care Medicine, State Key Laboratory of Complex, Severe, and Rare Diseases, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College, 4Department of Medicine, Cape Cod Hospital, 5Harvard T.H. Chan School of Public Health, 6Department of Anesthesia, Critical Care and Pain Medicine, Center for Inflammation Research, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данном протоколе описывается полностью интегрированный метод LAMP на основе микрофлюидного чипа, позволяющий в течение одного часа проводить диагностику по месту оказания медицинской помощи 15 патогенов, вызывающих инфекции нижних дыхательных путей у пациентов в отделениях интенсивной терапии.

Аннотация

Инфекции нижних дыхательных путей (ИНДП) относятся к основным причинам клинического ухудшения состояния и летальности у пациентов в критическом состоянии. В отделении интенсивной терапии (ОИТ) своевременная идентификация возбудителя имеет решающее значение для назначения надлежащей антимикробной терапии; однако традиционные методы посева занимают от 3 до 5 дней и характеризуются субоптимальной частотой положительных результатов, особенно в случае грибковых инфекций. Молекулярные подходы, такие как ПЦР, сокращают время получения результата, но все же зависят от ручного выделения нуклеиновых кислот и термоциклирования, что ограничивает их применимость непосредственно у постели больного. В данном протоколе описывается рабочий процесс диагностики по месту оказания медицинской помощи (point-of-care), основанный на полностью интегрированном микрофлюидном чипе в форме диска (CD-чип), который сочетает в себе очистку нуклеиновых кислот с помощью магнитных частиц и петлевую изотермическую амплификацию (LAMP). После упрощенного этапа ручного разжижения и лизиса обработанный образец загружается на чип вместе с двумя предварительно упакованными флаконами с реагентами. Затем прибор автономно выполняет экстракцию, амплификацию при 65 °C и флуоресцентное считывание в реальном времени, выдавая качественные результаты по 15 мишеням (а именно 11 бактериям, 3 грибам и 1 атипичному патогену) в течение 45 min работы прибора (приблизительно 1 h для полного цикла от пробы до ответа, включая этап ручной предобработки). Мы представляем данные по детекции в 10 образцах из ОИТ, включая мокроту, бронхиальный аспират и жидкость для бронхоальвеолярного лаважа, охватывающие как однопатогенные, так и полимикробные ко-инфекции с участием до 7 организмов на одном чипе. Закрытая конструкция картриджа минимизирует риск аэрозольного загрязнения, а одноэтапная загрузка не требует специального обучения, что делает данную систему практичным инструментом прикроватной диагностики для бригад ОИТ.

Введение

Среди пациентов в критическом состоянии в отделениях интенсивной терапии (ОИТ) инфекции нижних дыхательных путей, главной из которых является вентилятор-ассоциированная пневмония (ВАП), остаются постоянным фактором заболеваемости, длительной искусственной вентиляцией легких и избыточной смертности1,2. Микробиологический профиль инфекций нижних дыхательных путей (ИНДП), приобретенных в ОИТ, заметно отличается от профиля заболеваний, приобретенных внебольнично. Преобладают многорезистентные грамотрицательные бактерии (Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii), часто в составе полимикробных ассоциаций, которые затрудняют подбор эмпирических схем лечения3,4. Оппортунистические грибы создают дополнительный уровень сложности. Инвазивный легочный аспергиллез, который ранее считался признаком глубокой иммуносупрессии, сейчас с возрастающей частотой выявляется у пациентов ОИТ без нейтропении, особенно после тяжелого гриппа и COVID-195. Существующие диагностические алгоритмы аспергиллеза сочетают малоэффективный посев с тестированием на антиген галактоманнан (ГМ), однако применение анализа на ГМ ограничено хорошо задокументированными диагностическими окнами и вариабельной чувствительностью у хозяев без нейтропении6. Каждый час задержки в начале соответствующей антимикробной терапии сепсиса связан с измеримым увеличением смертности7. В совокупности скорость развития и сложность инфекций в ОИТ требуют диагностических инструментов, соответствующих клинической срочности.

Стандартный микробиологический посев, будучи незаменимым для определения чувствительности к антибиотикам, имеет фундаментальное ограничение по времени: срок получения результата составляет от 3 до 5 дней, привередливые организмы остаются невыявленными, а частота положительных результатов грибковых культур остается низкой8. Метагеномное секвенирование следующего поколения (mNGS) представляет собой объективную альтернативу, однако его внедрение в клиническую практику сдерживается стоимостью, временем обработки от 24 до 48 часов, зависимостью от биоинформатических конвейеров и ограниченной возможностью применения непосредственно в месте оказания медицинской помощи9. Панели на основе ПЦР сократили временной разрыв, но они всё еще требуют многоэтапной экстракции нуклеиновых кислот, использования оборудования для термоциклирования и, в случае традиционных форматов, проведения электрофореза после амплификации10. Ни одна из этих платформ полностью не удовлетворяет совокупным требованиям отделений интенсивной терапии: скоростью менее одного часа, минимальным временем непосредственной работы оператора, мультиплексным охватом патогенов, включая грибы, и операционной простотой, достаточной для персонала, не являющегося сотрудником лаборатории.

Петлевая изотермическая амплификация (LAMP) позволяет преодолеть ряд этих ограничений. Метод, впервые описанный Notomi et al., обеспечивает амплификацию целевой ДНК при постоянной температуре 65 °C с использованием набора из четырех-шести праймеров, распознающих шесть различных областей, при помощи полимеразы со способностью вытеснять цепь11. В ходе реакции образуются характерные шпилеобразные и «цветковидные» структуры ампликонов, которые можно обнаружить с помощью флуоресценции в реальном времени, что позволяет получить S-образные кривые через несколько минут после пересечения порога. Чувствительность при низких концентрациях матрицы высока, а использование нескольких праймеров обеспечивает селективность, которая ограничивает появление ложноположительных результатов12,13. В сочетании с микрофлюидными чип-платформами метод LAMP может быть распараллелен для анализа нескольких мишеней из одной пробы14. В предыдущих работах было показано, что системы на базе LAMP-чипов позволяют обнаруживать респираторные патогены с общим временем анализа значительно менее трех часов15. Однако основным ограничением таких систем является зависимость от отдельного ручного выделения ДНК, что увеличивает временные затраты, эксплуатационную сложность и риск контаминации.

Описанная здесь система устраняет это узкое место. Построенная на базе одноразового микрофлюидного чипа в форме диска (диаметром 86 mm), она объединяет загрузку образца, очистку нуклеиновых кислот с помощью магнитных частиц и 16-плексную амплификацию методом LAMP в одном герметичном картридже (Рисунок 1). Оператор выполняет лишь короткий этап ручного разжижения и лизиса с использованием специально разработанной пробирки, затем загружает лизат и два флакона с реагентами на чип (Рисунок 2). С этого момента прибор автономно осуществляет экстракцию, изотермическую амплификацию при 65 °C и регистрацию флуоресценции, выдавая качественные результаты по 15 клинически значимым мишеням, а именно: 11 бактериям, 3 грибам (Aspergillus spp., Candida albicans, Pneumocystis jirovecii) и 1 атипичному патогену (Mycoplasma pneumoniae) в течение 45 min. Ген семейства точек разрыва нейробластомы (NBPF), используемый в качестве внутреннего контроля, подтверждает адекватность образца и целостность реакции в каждом анализе. Данный протокол содержит пошаговые инструкции по всему рабочему процессу, от сбора образцов в отделении интенсивной терапии и их предварительной обработки до загрузки чипа, автоматического детектирования и интерпретации результатов, и предназначен как для персонала клинических лабораторий, так и для бригад интенсивной терапии у постели больного.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все образцы были собраны в соответствии с протоколом, утвержденным Комитетом по этике больницы Пекинского медицинского колледжа Китайской академии медицинских наук (номер одобрения I-24PJ1778). Перед сбором биоматериала от каждого участника или его законного представителя было получено письменное информированное согласие. Перечень целевых патогенов и распределение лунок для реакций приведены в Таблице 1, а расходные материалы, использованные при предварительной обработке образцов, перечислены в Таблице 2.

1. Сбор клинических образцов из нижних дыхательных путей в отделении интенсивной терапии

  1. Сбор мокроты
    1. Трижды прополощите ротовую полость чистой водой или стерильным физиологическим раствором, чтобы удалить остатки пищи и комменсальную микрофлору полости рта.
    2. Попросите пациента сделать два-три глубоких вдоха, затем с силой откашляться, чтобыB вытолкнуть мокроту из глубоких дыхательных путей непосредственно в стерильный контейнер для сбора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приемлемый образец представляет собой вязкий, гнойный или со следами крови материал из области ниже трахеи; прозрачная слюна или постназальный секрет не подходят и могут затруднить последующее обнаружение.
  2. Сбор бронхиального аспирата (БАС)
    1. Для пациентов без интубации введите стерильный аспирационный катетер (катетер 10–12 Fr, при установленном давлении источника аспирации −0.0267 MPa, что эквивалентно −200 mmHg) через носовой или ротовой путь на глубину примерно 30 cm.
    2. Включите аспирацию, вращая катетер, и медленно извлеките его. Соберите аспирированный секрет в стерильную ловушку для образцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если секреции скудны, перед аспирацией введите через катетер примерно 5 mL стерильного физраствора.
    3. Для пациентов на искусственной вентиляции легких выберите аспирационный катетер в соответствии с размером эндотрахеальной трубки: используйте катетер 10 Fr для трубки 7.0–7.5 mm и катетер 12 Fr для трубки 8.0 mm.
    4. Перед аспирацией проведите предварительную оксигенацию пациента 100% кислородом в течение 30–60 s. Отсоедините контур вентилятора и введите выбранный катетер через искусственные дыхательные пути до появления сопротивления.
    5. Создайте отрицательное давление −0.0267 MPa (эквивалентно −200 mmHg), ограничив каждый цикл аспирации (и, следовательно, время отключения вентилятора) не более чем 15 s, чтобы минимизировать дерекрутмент и гипоксемию; после аспирации снова проведите оксигенацию пациента 100% кислородом в течение 30–60 s.
    6. Введите 1–2 mL стерильного физраствора через катетер и подождите 3 s.
    7. Включите аспирацию и извлеките катетер. Соберите аспирированный секрет в стерильную ловушку для образцов. Сразу после сбора образца снова подключите контур вентилятора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всей процедуры необходимо строго соблюдать технику асептики, чтобы избежать нозокомиального загрязнения образца.
  3. Сбор жидкости для бронхоальвеолярного лаважа (БАЛЖ)
    1. Определите целевой сегмент по снимкам грудной клетки. Проведите бронхоскоп и зафиксируйте его в соответствующем сегментарном или субсегментарном бронхе.
    2. Быстро введите 3–5 порций стерильного физраствора по 20–50 mL (всего 60–120 mL). После каждой порции проведите осторожную аспирацию, затем соберите полученную жидкость в стерильный герметичный контейнер.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: При проведении БАЛ у пациентов в отделении интенсивной терапии обязателен непрерывный гемодинамический и вентиляционный мониторинг. При необходимости отрегулируйте настройки вентилятора для пациентов на искусственной вентиляции легких.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Типичный объем возврата составляет 40–60% от введенного объема. Низкий возврат может потребовать изменения положения наконечника бронхоскопа.

2. Разжижение и лизис патогенов

  1. С помощью одноразовой пипетки №2 аспирируйте образец до отмеченной линии (приблизительно 1 mL) и перенесите его в пробирку для разжижения. Неоднократно сжимайте грушу пипетки, чтобы перенести весь вязкий материал, затем закройте пробирку крышкой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для БАЛЖ или жидкой мокроты возьмите два объема пипетки, чтобы обеспечить достаточное количество патогена.
  2. Интенсивно встряхивайте пробирку для разжижения вручную в течение 1 min. Визуально оцените образец и продолжайте встряхивание до тех пор, пока не исчезнут видимые комки слизи и образец будет свободно проходить через одноразовую пипетку №1 без сопротивления (однородная консистенция, напоминающая воду). Встряхивайте не менее 1 min, при необходимости увеличивая время для высоковязких образцов до достижения этих критериев.
  3. Откройте герметичную крышку пробирки для лизиса.
  4. Аспирируйте примерно 0.5 mL гомогенизированного образца с помощью одноразовой пипетки №1 и перенесите образец в пробирку для лизиса.
  5. Закройте герметичную крышку и убедитесь, что колпачок наконечника плотно затянут.
  6. Установите пробирку для лизиса в устройство для предварительной обработки образцов (устройство SP), нажимая вниз до полной фиксации. Нажмите Start.
  7. Дождитесь завершения устройством SP автоматического цикла разжижения-лизиса (параметры приведены в таблице 3), который длится примерно 15 min.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не открывайте и не вынимайте пробирку во время обработки.

3. Загрузка чипа и автоматизированное детектирование

  1. Загрузка реагентов и образца
    1. Извлеките CD-чип из хранения при 4 °C и выдержите его при комнатной температуре (приблизительно 25 °C) в течение 10 мин.
      ​ПРИМЕЧАНИЕ: Флаконы с реагентами O и B, а также предварительно обработанный лизат используются при комнатной температуре; амплификация LAMP на чипе проводится при 65 °C (см. пункт 3.2.3 и Таблицу 3).
    2. Откройте фольгированный пакет и поместите чип на плоскую поверхность.
    3. Поверните крышку против часовой стрелки, чтобы открыть чип.
    4. Встряхните флакон O, чтобы собрать жидкость на дне флакона.
    5. Снимите колпачок с флакона O, вставьте носик в порт O и введите всё содержимое во флакон.
    6. Утилизируйте флакон O. Повторите процедуру, используя флакон B и порт B.
    7. Извлеките пробирку с обработанным лизатом из устройства SP и снимите колпачок с наконечника.
    8. Совместите наконечник пробирки с портом S и введите весь объем лизата в чип.
    9. Утилизируйте использованную пробирку для лизиса.
    10. Поверните крышку чипа по часовой стрелке до тех пор, пока два слышимых щелчка не подтвердят полную герметизацию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Неполная загрузка любого из портов может привести к сбоям в отдельных каналах. Перед герметизацией убедитесь в полном введении содержимого. Чтобы избежать неполной герметизации и риска загрязнения, не используйте полиэтиленовые (PE) перчатки при закрытии крышки; вместо них рекомендуются латексные или нитриловые перчатки.
  2. Работа с прибором
    1. Включите автоматический анализатор нуклеиновых кислот. Нажмите Detect, отсканируйте штрих-код на фольгированном пакете чипа и введите демографические данные пациента и ID образца.
    2. Установите чип на вращающийся шпиндель и нажмите вниз до щелчка, подтверждающего фиксацию.
    3. Нажмите Start. Прибор автономно выполняет центрифужное распределение реагентов, экстракцию на магнитных частицах, амплификацию LAMP при 65 °C и регистрацию флуоресценции. Время анализа составляет примерно 45 мин (загрузка реагентов/образцов и рабочий процесс прибора обобщены на Рисунке 3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не открывайте крышку во время анализа.
  3. Интерпретация результатов
    1. Программное обеспечение определяет точку перегиба каждой S-образной кривой амплификации с помощью анализа максимума второй производной и сообщает соответствующее значение TP (время до появления положительного сигнала).
    2. Сравните каждое значение TP с соответствующим пороговым значением, указанным в Таблице 4. Классифицируйте каналы со значениями TP на уровне порога или ниже него как положительные, а каналы со значениями TP выше порога — как отрицательные.
    3. Убедитесь, что в канале внутреннего контроля (лунка 16) наблюдается S-образная кривая амплификации со значением TP менее 12 мин.
    4. Если внутренний контроль не сработал, результат анализа считается недостоверным. Повторите тестирование, используя новый чип, или заберите образец повторно.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

On completion of a valid run, the instrument displayed real-time fluorescence traces for all 16 channels. Positive channels exhibited the expected S-shaped amplification kinetics with automatically annotated TP values, whereas negative channels remained at baseline. The IC channel (well 16) yielded an S-shaped curve with TP < 12 min in all valid runs.

As a pilot, proof-of-concept demonstration of the protocol, 10 representative specimens were selected to illustrate the range of clinical sce...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Быстрая идентификация патогенов имеет решающее значение при лечении инфекций в отделениях интенсивной терапии. Описанная здесь система сокращает время идентификации патогена с 3–5 дней, обычно требуемых для культивирования, до менее чем 1 часа — временного интервала, в течение которого часто принимаются решения о назначении антимикробных препаратов первой линии7. Благодаря интеграции экстракции нуклеиновых кислот, очистки и 16-плексной амплификации LAMP в одном герметичном чипе, данный рабочий про...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Национальный крупный научно-технический проект по неинфекционным хроническим заболеваниям (№ 2023ZD0516500), Национальное финансирование клинических исследований для госпиталей высокого уровня (2026-PUMCH-A-103), программа открытых конкурсов CMB (24-561) и программа подготовки талантов Больницы Пекинского медицинского колледжа (№ UGG11571).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Автоматический анализатор нуклеиновых кислотBeijing Taihao Biotechnology Co., LtdTHE-T80-01TurboFlow T; осуществляет центрифужное распределение реагентов, экстракцию на магнитных частицах, LAMP при 65 °C и флуоресцентную детекцию в реальном времени (время анализа ~45 мин)
Одноразовая пипетка Пастера №1Zhongtai Experimental Equipment Factory (Haimen)Custom-madeОдноразовый расходный материал; 0.5 mL; для переноса гомогенизированного образца в пробирку для лизиса
Одноразовая пипетка Пастера №2Zhongtai Experimental Equipment Factory (Haimen)Custom-madeОдноразовый расходный материал; 2 mL; для аспирации образца до отметки в пробирку для разжижения
CD-чипBeijing Hongyang Chensheng Technology Co., LtdCustom-madeОдноразовый расходный материал; диск диаметром 86 mm с центральной зоной загрузки (порты O, B, S), зоной очистки на магнитных частицах и внешним кольцом с 16 реакционными лунками (15 мишеней патогенов + внутренний контроль NBPF)
Реагенты для LAMP-реакцииYeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd16730ES80Реагенты для LAMP-реакции, предварительно помещенные в CD-чип в виде лиофилизированных гранул
Пробирка для разжиженияBeijing Taihao Biotechnology Co., LtdCustom-madeОдноразовый расходный материал; 2 mL/пробирка; используется для ручной гомогенизации образца
Пробирка для лизисаBeijing Taihao Biotechnology Co., LtdCustom-madeОдноразовый расходный материал; 0.5 mL/пробирка; сжимаемый силиконовый корпус с фильтрующей мембраной 200 µm; предварительно заполнена реагентами для лизиса
ПраймерыSangon Biotech (Shanghai) Co., LtdCustom-madeСмесь праймеров, встроенная в реакционную камеру CD-чипа
Устройство для предварительной обработки образцовBeijing Taihao Biotechnology Co., LtdTHE-R10-02TS-2000; автоматизированный цикл разжижение–лизис (~15 мин)
Однодозовый флакон “B”Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., LtdCustom-madeОдноразовый расходный материал; предварительно упакованный реагент для чипа; один на тест; хранить при 4 °C и довести до комнатной температуры (~25 °C) перед загрузкой
Однодозовый флакон “O”Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., LtdCustom-madeОдноразовый расходный материал; предварительно упакованный реагент для чипа; один на тест; хранить при 4 °C и довести до комнатной температуры (~25 °C) перед загрузкой

Ссылки

  1. GBD 2016 Lower Respiratory Infections Collaborators. Estimates of the global, regional, and national morbidity, mortality, and aetiologies of lower respiratory infections in 195 countries, 1990–2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Infect Dis. 2018;18(11):1191-1210.
  2. Niederman MS, Torres A. Respiratory infections. Eur Respir Rev. 2022;31(166):220150.
  3. Weiser JN, Ferreira DM, Paton JC. Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion. Nat Rev Microbiol. 2018;16(6):355-367.
  4. Reynolds D et al. The threat of multidrug-resistant/extensively drug-resistant gram-negative respiratory infections: another pandemic. Eur Respir Rev. 2022;31(166):220068.
  5. Schauwvlieghe AFAD et al. Invasive aspergillosis in patients admitted to the intensive care unit with severe influenza: a retrospective cohort study. Lancet Respir Med. 2018;6(10):782-792.
  6. Meersseman W et al. Galactomannan in bronchoalveolar lavage fluid: a tool for diagnosing aspergillosis in intensive care unit patients. Am J Respir Crit Care Med. 2008;177(1):27-34.
  7. Seymour CW et al. Time to treatment and mortality during mandated emergency care for sepsis. N Engl J Med. 2017;376(23):2235-2244.
  8. Noviello S, Huang DB. The basics and the advancements in diagnosis of bacterial lower respiratory tract infections. Diagnostics (Basel). 2019;9(2):37.
  9. Chiu CY, Miller SA. Clinical metagenomics. Nat Rev Genet. 2019;20(6):341-355.
  10. Hanson KE et al. Molecular testing for acute respiratory tract infections: clinical and diagnostic recommendations from the IDSA's diagnostics committee. Clin Infect Dis. 2020;71(10):2744-2751.
  11. Notomi T et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000;28(12):E63.
  12. Soroka M, Wasowicz B, Rymaszewska A. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): the better sibling of PCR? Cells. 2021;10(8):1931.
  13. Parida M et al. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a new generation of innovative gene amplification technique; perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases. Rev Med Virol. 2008;18(6):407-421.
  14. Ou H et al. Rapid detection of multiple pathogens by the combined loop-mediated isothermal amplification technology and microfluidic chip technology. Ann Palliat Med. 2021;10(10):11053-11066.
  15. Lai JX et al. Rapid detection of bacterial pathogens causing lower respiratory tract infections via microfluidic-chip-based loop-mediated isothermal amplification. J Vis Exp. 2024;(205):e66677.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Инфекции нижних дыхательных путейидентификация патогеновмикрофлюидный чипочистка нуклеиновых кислотизотермическая амплификацияэкстракция с помощью магнитных частицприкроватная диагностикареспираторные патогены
Экспресс-диагностика патогенов инфекций нижних дыхательных путей в стационаре у пациентов отделений интенсивной терапии
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.