Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оптимизированный протокол обратной трансфекции для доставки мРНК теломеразы в ранне-сенесцентные фибробласты человека

126 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71538

⸱

18 августа 2026 г.

 , 
1Center on the Biology of Aging, and Department of Molecular Biology, Cell Biology, and Biochemistry, Brown University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данной статье представлен оптимизированный протокол обратной трансфекции для эффективной доставки нуклеозидно-модифицированной мРНК обратной транскриптазы теломеразы человека (hTERT mRNA) в сенесцентные фибробласты человека. Предварительное нанесение комплексов hTERT mRNA-липидов на поверхности для культивирования улучшает поглощение, обеспечивая активацию теломеразы, удлинение теломер и частичное омоложение. В конечном итоге культуры снова входят в состояние сенесценции или криза без бессмертия.

Аннотация

Клеточное старение сопровождается глубокими изменениями физиологии клеток, включая снижение текучести мембран, нарушение эндосомального транспорта, снижение способности к эндоцитозу и повышение активности внеклеточных РНказ, что в совокупности препятствует эффективной доставке мРНК. Эти барьеры ограничивали применение подходов на основе РНК в стареющих клетках, особенно при доставке крупных терапевтических транскриптов. В данном протоколе описывается оптимизированный метод обратной трансфекции для эффективной доставки модифицированной матричной РНК (мРНК) в стареющие фибробласты человека. Хотя в качестве модельного транскрипта использовалась мРНК человеческой теломеразы обратной транскриптазы (hTERT), данный рабочий процесс в целом применим и к другим мРНК. В отличие от традиционных методов трансфекции, при которых РНК-липидные комплексы добавляются в культуральную среду после прикрепления клеток, обратная трансфекция предполагает нанесение комплексов на поверхность культуры до посева клеток, что обеспечивает прямое взаимодействие между прикрепляющимися клетками и трансфекционными комплексами. Для максимизации эффективности трансфекции в протоколе используются нуклеозидно-модифицированные мРНК, содержащие псевдоуридин и 5-метилцитидин, удлиненные поли(А)-хвосты, оптимизированное время формирования комплексов, ингибирование РНказ, кратковременное повышение pH эндосом с помощью хлорохина, повышенная плотность посева клеток и увеличенные периоды инкубации. С помощью этого подхода была достигнута эффективность трансфекции примерно 50%–80% в стареющих фибробластах после доставки транскрипта мРНК hTERT размером 5 kb. Пик активности теломеразы наблюдался через 24–48 h после трансфекции. Одиночный цикл трансфекции приводил к измеримому удлинению теломер, в то время как три последовательные трансфекции приводили к существенному, но ограниченному удлинению теломер. Частичное обращение фенотипов, связанных со старением, было заметно в течение 72–96 h, включая снижение активности β-галактозидазы, связанной со старением, снижение экспрессии p16 и p21, восстановление морфологии клеток и увеличение репликативного срока жизни. Доставленная мРНК hTERT деградировала в течение 72–96 h, и бессмертия клеток не наблюдалось. Данный протокол предлагает практический подход для транзиентной доставки мРНК в стареющие клетки и может быть адаптирован для широкого спектра типов клеток и видов.

Введение

Метод обратной трансфекции представляет собой критическую методологическую адаптацию для сенесцентных клеток, которая позволяет преодолеть фундаментальные барьеры, создаваемые этими клетками для стандартных методов трансфекции. В отличие от прямой трансфекции, при которой клетки предварительно высевают и дают им прикрепиться перед добавлением трансфекционных комплексов, обратная трансфекция предполагает добавление клеток в суспензии непосредственно на предварительно сформированные липидные комплексы с мРНК hTERT. Эта техника значительно повышает эффективность трансфекции сенесцентных клеток за счет максимизации воздействия трансфекционных комплексов в критической фазе адгезии, когда перестройка мембран наиболее активна.

Основной концептуальный сдвиг в данном протоколе заключается в том, чтобы рассматривать сенесцентные клетки как отдельную проблему доставки, а не просто как труднотрансфицируемые варианты молодых клеток. При сенесцентности глобальные изменения в составе липидов мембраны, включая фосфолипиды, сфинголипиды и холестерин, изменяют текучесть мембраны, ее кривизну и белково-липидные взаимодействия, одновременно способствуя развитию секреторного фенотипа, ассоциированного со старением1,2,3. Сенесцентные клетки также характеризуются снижением рецепторного эндоцитоза, опосредованного клатрином и кавеолами, а также изменением путей эндоцитоза, что частично обусловлено подавлением экспрессии amphiphysin-1 и компенсаторными изменениями экспрессии кавеолина, которые ослабляют рецепторно-опосредованный захват и передачу сигналов4,5,6. Параллельно с этим происходит дисрегуляция оси поздних эндосом и лизосом, регулируемой Rab7, а также более широкой эндосомально-автофагически-лизосомальной (EAL) сети, при этом Rab7 выступает в качестве главного контроллера созревания эндолизосом и слияния автофагосом с лизосомами, которые нарушаются при старении и нейродегенерации7.

Сенесцентные клетки обычно активируют экспрессию множества компонентов системы лизосомальной переработки и адаптации (LYPAS), включая лизосомальный биогенез под управлением TFEB/TFE3 и шаперон-опосредованную аутофагию, что приводит к увеличению лизосомальной массы. Однако отдельные лизосомы часто характеризуются повышенным pH просвета, повреждением мембран и измененной протеолитической активностью, что способствует развитию лизосомальной дисфункции, несмотря на их повышенное количество8,9,10,11. В совокупности эти изменения могут более эффективно направлять интернализованный материал в деградативные эндолизосомальные компартменты, повышая вероятность того, что доставленная РНК или белок будут подвергнуты деградации до их продуктивного высвобождения в цитозоль9,10,11. Обратная трансфекция напрямую воздействует на самый ранний период ремоделирования мембран во время адгезии, обеспечивая устойчивый высокоаффинный контакт между клетками и комплексами мРНК-липид, что позволяет частично обойти нарушенный стационарный эндоцитоз в полностью адгезивных сенесцентных клетках4,5,6,12.

Что касается дизайна РНК, протокол предполагает, что в контексте старения простого базового уровня «кэп + хвост» недостаточно: полная модификация нуклеозидов (например, псевдоуридина или N1‑метилпсевдоуридина вместе с 5‑метилцитидином) считается обязательным условием, чтобы разделить процесс трансляции и распознавание эндосомальными Toll-подобными рецепторами с последующей индукцией интерферона I типа. Основополагающие работы показали, что включение модифицированных нуклеозидов в РНК подавляет активацию TLR3, TLR7 и TLR8 и заметно снижает продукцию цитокинов дендритными клетками, что обеспечивает механистическую основу снижения врожденной иммуногенности современных платформ на основе нуклеозид-модифицированной мРНК13. В более современных обзорах вакцин на основе мРНК-ЛНП и препаратов на основе мРНК подчеркивается необходимость скоординированного проектирования 5′-кэпа, нетранслируемых областей (UTR), кодирующей последовательности и поли(A)-хвоста для повышения стабильности и трансляции in vivo при одновременной минимизации активации врожденного иммунитета14. В частности, длина и архитектура поли(A)-хвоста оказались ключевыми детерминантами стабильности и трансляционного выхода мРНК, транскрибированной in vitro, что обосновывает использование удлиненных или модифицированных конструкций поли(A)-хвоста в терапевтической мРНК15.

Кроме того, протокол в явном виде предусматривает защиту от внеклеточных и эндосомальных РНКаз во время формирования комплекса и его поглощения, а также определенное окно выхода из эндосом с использованием транзиторного лизосомотропного агента, такого как хлорохин16,17. Хлорохин давно используется в качестве функционального зонда эндосомальных барьеров; он может значительно повысить эффективность взаимодействия с мишенью и сайленсинга с помощью siRNA или антисмысловых олигонуклеотидов, способствуя деструкции мембран эндосом и выходу нуклеиновых кислот в цитозоль18. В то же время визуализация mRNA, доставленных с помощью LNP, на живых клетках и с суперразрешением показала, что эффективная доставка жестко ограничена редкими событиями выхода из ранних/рециклирующих эндосом, а не самим начальным поглощением, что подчеркивает важность намеренного проектирования этапа выхода из эндосом для препаратов на основе mRNA19.

В совокупности эти связанные со старением изменения в динамике мембран, эндоцитозном транспорте, лизосомальной обработке и активации врожденного иммунитета создают значительные барьеры для эффективной доставки мРНК. Описанная здесь стратегия обратной трансфекции была разработана для преодоления этих ограничений путем сочетания оптимизированного инжиниринга мРНК, защиты от РНказ, усиленного выхода из эндосом и прямого воздействия на прикрепляющиеся клетки предварительно сформированных комплексов мРНК и липидов. Хотя в качестве модельного груза используется мРНК hTERT, данный рабочий процесс широко применим для доставки других крупных терапевтических транскриптов мРНК в стареющие и труднотрансфицируемые популяции клеток20,21,22.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Транскрипция мРНК hTERT in vitro

  1. In vitro транскрипция (IVT) с использованием ARCA и ΨUTP
    1. Подготовьте реакционную смесь для IVT объемом 20 µL согласно Таблице 1. При необходимости большего выхода увеличьте объем компонентов реакции линейно.
    2. Смешайте все компоненты реакции, кроме РНК-полимеразы T7, в пробирке, свободной от РНказ. Добавьте РНК-полимеразу T7 в последнюю очередь, осторожно перемешайте и кратковременно центрифугируйте пробирку.
    3. Инкубируйте реакционную смесь при 37 °C в течение 0,5–4 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте время инкубации в зависимости от длины матрицы. Реакции с короткими матрицами (приблизительно 500 bp) инкубируйте около 30 мин, а с более длинными матрицами (приблизительно 4 kb) — в течение 3–4 ч.
  2. Обработка ДНКазой
    1. Добавьте 1 µL DNase I, свободной от РНказ, непосредственно в реакционную смесь IVT.
    2. Инкубируйте реакционную смесь при 37 °C в течение 15 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обработку ДНКазой следует проводить непосредственно в смеси для IVT без предварительной очистки синтезированной мРНК.
  3. Очистка мРНК
    1. Добавьте 115 µL воды, свободной от нуклеаз, чтобы разбавить реакционную смесь.
    2. Очистите мРНК с помощью набора для очистки РНК согласно инструкциям производителя.
    3. Элюируйте очищенную мРНК в 20–30 µL воды, свободной от нуклеаз.
    4. Измерьте чистоту мРНК спектрофотометрически и проверьте целостность РНК методом электрофореза в 1,0–1,5% денатурирующем агарозном геле или в низкопроцентном полиакриламидном геле.
  4. Полиаденилирование (добавление poly(A)-хвоста)
    1. Подготовьте реакционную смесь для полиаденилирования объемом 50 µL согласно Таблице 2. Осторожно перемешайте компоненты реакции и инкубируйте при 37 °C в течение 30–60 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте время инкубации в зависимости от количества исходной РНК.
    2. Остановите реакцию, добавив 2 µL 0,5 M EDTA (pH 8,0).
  5. Финальная очистка и контроль качества
    1. Очистите полиаденилированную мРНК с помощью набора для очистки РНК согласно инструкциям производителя.
    2. Элюируйте очищенную мРНК в 20–30 µL воды, свободной от нуклеаз.
    3. Оцените качество мРНК перед переходом к трансфекции
      1. Измерьте концентрацию мРНК при 260 nm и определите чистоту, используя соотношения A260/A280 и A260/A230. Используйте препараты мРНК со значениями A260/A280 приблизительно 2,0 и значениями A260/A230 более 2,0.
      2. Оцените целостность мРНК с помощью гель-электрофореза или системы анализа РНК согласно инструкциям производителя.
      3. Подтвердите длину poly(A)-хвоста методом ОТ-ПЦР или с помощью анализатора Bioanalyzer. Убедитесь, что длина poly(A)-хвоста составляет от 120 до 200 нуклеотидов.
      4. Разделите очищенную мРНК на аликвоты и храните их при −80 °C, чтобы минимизировать количество циклов замораживания-оттаивания.

2. Обратная трансфекция

  1. День −1: Подготовка к трансфекции
    1. Проверка сенесцентного фенотипа
      1. Провести окрашивание репрезентативного образца клеток на активность ассоциированной со старением β-галактозидазы (SA-β-gal). Убедиться, что более 70% клеток являются положительными.
      2. Подтвердить экспрессию маркеров старения (p16 и p21) с помощью qRT-PCR или иммунофлуоресценции.
      3. Определить жизнеспособность клеток и убедиться, что она превышает 90%.
    2. Подготовка реагентов
      1. Предварительно прогреть полную культуральную среду до 37 °C.
      2. Предварительно прогреть фосфатно-солевой буфер (PBS) до 37 °C.
      3. Приготовить свежую среду Opti-MEM I.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Не добавлять ингибитор РНказы в Opti-MEM I перед использованием.
  2. День 0: День трансфекции
    ПРИМЕЧАНИЕ: Интервал от подготовки реагентов до инкубации трансфецированных клеток должен составлять примерно 3 ч.
    1. Подготовка мРНК hTERT
      1. Разморозить мРНК hTERT на льду. Измерить концентрацию мРНК и использовать препараты с концентрацией от 0,5 до 1,0 µg/µL.
      2. Развести необходимое количество мРНК hTERT в Opti-MEM I в соответствии с используемым форматом культуры (Таблица 3). Добавить ингибитор РНказы до конечной концентрации 0,5–1,0 U/µL и аккуратно перемешать.
      3. Хранить разведенную мРНК на льду до момента формирования комплексов.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Добавлять ингибитор РНказы непосредственно перед использованием. Не хранить мРНК с ингибитором РНказы, так как его активность снижается после замораживания.
    2. Подготовка реагента для трансфекции
      1. Смешать 6,0 µL реагента для трансфекции с 100 µL Opti-MEM I в стерильной пробирке, не содержащей РНказ. Аккуратно перемешать путем пипетирования.
      2. Инкубировать смесь при комнатной температуре в течение 5 мин.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для крупных конструкций мРНК hTERT (~5 kb) оптимизировать соотношение реагента к мРНК в диапазоне от 0,4 до 0,6 µL реагента на 100 ng мРНК.
    3. Формирование мРНК-липидных комплексов
      1. Добавить разведенный раствор мРНК hTERT (100 µL) к разведенному раствору реагента для трансфекции (106 µL). Аккуратно перемешать, произведя пипетирование 5–6 раз.
      2. Инкубировать смесь при комнатной температуре в течение 15–20 мин.
      3. Время комплексообразования не должно превышать 30 мин.
      4. Убедиться в успешном формировании комплексов по появлению слегка мутного раствора.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовку клеток проводить во время процесса комплексообразования.
    4. Подготовка клеток для обратной трансфекции
      1. Аспирировать культуральную среду из культур сенесцентных клеток.
      2. Однократно промыть клетки предварительно прогретым PBS (2 mL на лунку планшета на 6 лунок).
      3. Добавить 500 µL 0,05% раствора трипсина-ЭДТА в каждую лунку.
      4. Инкубировать клетки при 37 °C в течение 3–5 мин.
      5. Нейтрализовать трипсин, добавив 3 mL полной среды, содержащей сыворотку.
      6. Аккуратно тритурировать клетки до получения суспензии из единичных клеток.
      7. Определить количество клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток.
      8. Приготовить суспензию в полной среде, содержащую 2,0–2,5 × 105 клеток на лунку.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Избегать длительной трипсинизации, так как сенесцентные клетки крайне чувствительны к механическому стрессу. Содержать клетки в суспензии; не высевать их на подложку перед обратной трансфекцией.
    5. Обратная трансфекция
      1. Подготовка культурального планшета
        1. Добавить 500 µL 0,01% поли-L-лизина в каждую лунку планшета на 6 лунок и инкубировать 30 мин при комнатной температуре.
        2. Аспирировать раствор для покрытия непосредственно перед использованием.
        3. Добавить 200 µL мРНК-липидного комплекса hTERT в центр каждой лунки.
        4. Инкубировать планшет при 37 °C и 5% CO₂ в течение 30 мин.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Покрытие планшета следует проводить параллельно с формированием комплексов и подготовкой клеток.
      2. Подготовка клеточной суспензии
        1. Суспендировать 2,0–2,5 × 105 клеток в 1800 µL полной среды без антибиотиков.
        2. Аккуратно ресуспендировать клетки для получения однородной суспензии единичных клеток.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Во время трансфекции использовать среду без антибиотиков.
      3. Посев клеток на комплексы
        1. Добавить 1800 µL клеточной суспензии непосредственно на предварительно сформированные мРНК-липидные комплексы hTERT.
        2. Осторожно наклонить планшет 2–3 раза в каждом направлении для равномерного распределения клеток.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Не перемешивать суспензию пипетой после добавления клеток, так как это может разрушить мРНК-липидные комплексы.
      4. Инкубация клеток
        1. Инкубировать клетки при 37 °C в увлажненном инкубаторе с содержанием 5% CO₂ в течение 6–8 ч.
        2. Контролировать прикрепление клеток с помощью световой микроскопии через 2–3 ч после трансфекции.
        3. Убедиться, что клетки равномерно распределены и начинают прикрепляться к поверхности культуры.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Избыточное количество плавающих клеток или клеточного детрита может указывать на цитотоксичность, связанную с трансфекцией.

3. Снижение цитотоксичности

  1. Сократите время экспозиции при трансфекции до 48 h, если гибель клеток превышает 20%.
  2. Для повышения выживаемости клеток в течение периода трансфекции дополните среды 10 µM ингибитора ROCK Y-27632.
  3. Через 6–8 h после трансфекции аккуратно аспирируйте среду для трансфекции, стараясь не потревожить частично прикрепившиеся клетки. Оставьте в каждой лунке примерно 100 µL остаточной среды.
  4. Добавьте в каждую лунку 1 mL свежей предварительно нагретой полной ростовой среды, дополненной 15% FBS.
  5. Сразу после замены среды добавьте хлорохин до конечной концентрации 10–20 µM.
  6. Инкубируйте культуры еще в течение 2 h при 37 °C в увлажненном инкубаторе с содержанием 5% CO₂.
  7. Замените среду, содержащую хлорохин, свежей полной ростовой средой.
  8. Верните культуры в инкубатор для дальнейшего роста.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Контролируйте морфологию и жизнеспособность клеток на протяжении всего периода восстановления. Чрезмерная отслойка клеток или появление клеточного детрита могут указывать на цитотоксичность, связанную с трансфекцией.

4. Анализ после трансфекции

  1. Оцените экспрессию белка TERT через 24–48 ч после трансфекции.
  2. Измерьте уровни белка TERT методом вестерн-блоттинга или иммунофлуоресцентного окрашивания в соответствии со стандартными лабораторными процедурами.
  3. Измерьте активность теломеразы в тот же интервал времени, используя подходящий анализ активности теломеразы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Активность теломеразы обычно снижается через 48 ч из-за деградации транзиторно доставленной мРНК hTERT.
  4. Оцените длину теломер через 48–72 ч после трансфекции с помощью монохромной мультиплексной количественной ПЦР (MMqPCR) или эквивалентного метода анализа длины теломер.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После успешной доставки мРНК hTERT может наблюдаться детектируемое удлинение теломер.
  5. Оцените фенотипы, связанные со старением и омоложением, через 7 дней после трансфекции
    1. Измерьте активность ассоциированной со старением β-галактозидазы (SA-β-gal).
    2. Измерьте уровни экспрессии p16 и p21.
    3. Оцените экспрессию Ki67.
    4. Изучите морфологию клеток с помощью световой микроскопии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сравните обработанные культуры с необработанными или имитированными (mock) трансфектированными стареющими контролями для оценки изменений в фенотипах, связанных со старением, и пролиферативных характеристиках.

5. Протокол повторного введения доз (опционально)

  1. Выполните первичную трансфекцию, как описано в разделах 2–4.
  2. Повторяйте трансфекции согласно следующему графику: день 0: первая трансфекция; день 5: вторая трансфекция; дни 10–12: третья трансфекция.
  3. Поддерживайте клетки в виде адгезивных культур и не используйте трипсинизацию перед последующими трансфекциями.
  4. Приготовьте свежие липидные комплексы с мРНК hTERT, как описано в разделах 2.2.1–2.2.3.
  5. Аспирируйте культуральную среду из каждой лунки.
  6. Добавьте по 200 µL липидных комплексов с мРНК hTERT непосредственно в каждую лунку.
  7. Сразу после добавления комплексов добавьте 800 µL свежей полной среды F-10.
  8. Инкубируйте клетки в течение 4–6 h при 37 °C в увлажненном инкубаторе с содержанием 5% CO₂.
  9. Замените среду для трансфекции свежей полной средой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ограничьте обработку максимум тремя циклами трансфекции, чтобы минимизировать кумулятивную цитотоксичность, связанную с трансфекцией.

6. Протокол прямой трансфекции (2 µg/mL, формат 6-луночного планшета)

  1. День −1: Посев клеток
    1. Отделите сенильные или ранние сенильные фибробласты, используя 0,05% раствор трипсин-ЭДТА.
    2. Нейтрализуйте трипсин полной культуральной средой.
    3. Определите количество и жизнеспособность клеток.
    4. Рассейте клетки по 6-луночным планшетам с плотностью 2,0–2,5 × 105 клеток на лунку.
    5. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 °C в увлажненном инкубаторе с содержанием 5% CO₂ до достижения конфлюэнтности примерно 60–80%.
  2. День 0: Приготовление комплексов мРНК hTERT с реагентом
    1. Разморозьте аликвоту нуклеозид-модифицированной мРНК hTERT на льду.
    2. Разведите мРНК hTERT в среде Opti-MEM до конечной концентрации 2 µg/mL в стерильной пробирке, свободной от РНказ (Пробирка А).
    3. Добавьте в Пробирку А ингибитор РНказы до конечной концентрации 0,5–1,0 U/µL и осторожно перемешайте.
    4. Разведите реагент для трансфекции в среде Opti-MEM во второй пробирке, свободной от РНказ (Пробирка B), используя 0,4–0,6 µL реагента на 100 ng мРНК.
    5. Покапельно добавьте содержимое Пробирки B в Пробирку A, осторожно перемешивая.
    6. Инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение 15–20 мин.
  3. День 0: Прямая трансфекция
    1. Убедитесь, что конфлюэнтность клеток составляет 60–80% и они имеют здоровую морфологию.
    2. Аспирируйте культуральную среду.
    3. Однократно промойте клетки 1–2 mL предварительно подогретого PBS.
    4. Добавьте в каждую лунку 0,5 mL предварительно подогретой полной или среды с пониженным содержанием сыворотки.
    5. При необходимости добавьте хлорохин до конечной концентрации 10–20 µM.
    6. Добавьте в каждую лунку 0,5 mL комплексов мРНК hTERT с реагентом, приготовленных на этапе 6.2.6.
    7. Осторожно покачайте планшет для равномерного распределения комплексов.
    8. Инкубируйте клетки в течение 4–6 ч при 37 °C в увлажненном инкубаторе с содержанием 5% CO₂.
      ​ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости увеличьте период инкубации для сенильных клеток до 6–8 ч.
    9. Аспирируйте среду для трансфекции.
    10. Добавьте в каждую лунку 2,0 mL свежей полной среды.
    11. Проведите посттрансфекционный анализ, как описано в Разделе 4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При сравнении условий прямой и обратной трансфекции используйте одну и ту же серию мРНК hTERT, один и тот же реагент для трансфекции и номинальную дозу.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

modРНК d2EGFP-T2A-hTERT была сконструирована как гибридная открытая рамка считывания, в которой репортер дестабилизированного EGFP (d2EGFP) был соединен с hTERT человека посредством саморасщепляющегося пептида T2A. Полные нуклеотидные и белковые последовательности всех конструктов представлены в Дополнительном файле 1. Кодирующая последовательность была фланкирована синтетической 5′-нетранслируемой областью (UTR) и 3′-UTR β-глобина человека для повышения эффективности трансляции и стабильности мРНК (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В данном исследовании клеточное старение рассматривается не как незначительное отклонение физиологии пролиферации, а как специфическая проблема доставки, в связи с чем разрабатывается стратегия трансфекции мРНК теломеразы, адаптированная к биофизическим и иммунологическим ограничениям сенильного состояния. Сенесцентные клетки характеризуются ригидностью мембран, обогащенных холестерином, и сниженной эндоцитарной активностью, что создает значительный барьер для эффективной доставки нуклеиновых кислот. Используя метод обра...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

J.M.S. является сооснователем и председателем научно-консультативного совета компании Transposon Therapeutics.

Благодарности

Данная работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения (NIH) P01 AG051449, R01 AG016694 и R01 AG078925, предоставленными JS.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Питательная смесь Ham's F-10Thermo Fisher11550043Среда для культивирования клеток.
Аналог структуры кэпа РНК 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')GNew England BiolabS1411LДля большинства РНК структура кэпа повышает стабильность, снижает подверженность деградации экзонуклеазами и способствует формированию инициаторных комплексов мРНК.
5-метилцитидин-5´-трифосфат (5-метил-CTP)New England BiolabN0432SМодифицированные NTP обычно используются для снижения иммуногенности РНК, полученной путем транскрипции in vitro.
6-луночный планшетCorning351146Для выращивания и обработки средних и больших объемов адгезивных клеток или клеток в суспензии в независимых экспериментальных условиях.
Антитело к Ki67 (SP6)abcamab16667Ki67 экспрессируется преимущественно в пролиферирующих клетках.
Набор для анализа клеточного старения (окрашивание на SA-бета-гал) cellbiolabsCBA-230 Идентификация стареющих клеток с помощью анализа окрашивания на SA-β-гал
Пробирки DNA LoBind 0,5 млEppendorf 022431005Для эффективного восстановления ДНК и РНК без потерь
Пробирки DNA LoBind 1,5 млEppendorf22431021Для эффективного восстановления ДНК и РНК без потерь
ДНКаза I, без РНКаз (1 U/μL)Thermo FisherEN0521ДНКаза I без РНКаз представляет собой эндонуклеазу, которая расщепляет одно- и двухцепочечную ДНК. 
Поли(А)-полимераза E. coliNew England BiolabM0276SУ Escherichia coli поли(А)-полимераза I (PAP I) функционирует преимущественно как катализатор независимого от матрицы присоединения остатков аденозинмонофосфата (AMP) к 3'-концу молекул РНК.
Фетальная бычья сывороткаThermo FisherA5256701Добавка сыворотки для культивирования клеток 
Набор HiScribe T7 ARCA mRNANew England BiolabE2065SНабор HiScribe T7 ARCA mRNA (с достройкой хвоста) предназначен для быстрого получения мРНК с ARCA-кэпом и поли(А)-хвостом in vitro. Кэпированные мРНК синтезируются путем ко-транскрипционного включения антиреверсивного аналога кэпа (ARCA) с использованием Т7 РНК-полимеразы.
Набор HiScribe T7 mRNA с реагентом CleanCap AGNew England BiolabE2080SНаборы HiScribe T7 mRNA с реагентом CleanCap AG позволяют быстро и эффективно производить один или несколько транскриптов с типичным выходом ≥90 μg на реакцию,
ДНК-полимераза LongAmp Hot Start TaqNew England BiolabM0534SДНК-полимераза LongAmp Hot Start Taq обеспечивает исключительные результаты при работе с длинными ампликонами.
Обратная транскриптаза M-MuLVNew England BiolabM0253LОбратная транскриптаза M-MuLV синтезирует комплементарную цепь ДНК, начиная с праймера, используя в качестве матрицы либо РНК (синтез кДНК), либо одноцепочечную ДНК.
Набор для очистки РНК Monarch Spin (50 μg)New England BiolabT2040LОсновная функция набора Monarch® Spin RNA Cleanup Kit (50 μg) заключается в очистке и концентрировании до 50 μg высококачественной РНК из ферментативных реакций или экстракционных смесей.
Мастер-микс для сборки ДНК NEBuilder HiFiNew England BiolabE2621LМастер-микс для сборки ДНК NEBuilder HiFi позволяет осуществлять бесшовную сборку нескольких фрагментов ДНК независимо от длины фрагментов или совместимости концов. Он полезен для специалистов по синтетической биологии, а также для одностадийного клонирования нескольких фрагментов благодаря простоте использования, гибкости и удобному формату мастер-микса. 
Среда Opti-MEM с пониженным содержанием сывороткиThermo Fisher31985070Для максимального повышения эффективности трансфекции клеток при формировании комплексов липид-груз. Она служит оптимизированной, химически определенной средой, которая поддерживает высокую жизнеспособность клеток млекопитающих, снижая необходимость в стандартном добавлении сыворотки
PBS, pH 7,4Thermo Fisher10010023Основное функциональное назначение фосфатно-солевого буфера (PBS) при pH 7,4 — поддержание стабильного pH и осмотического баланса для клеток млекопитающих и биологических молекул.
ПЦР-полоскиThermo FisherAB0776Основное функциональное назначение ПЦР-полосок (обычно в формате 8 или 12 пробирок) — удержание жидкостей в малых объемах во время высокопроизводительного термального циклирования.
Гидробромид поли-L-лизинаMillipore SigmaP4707-50MLОсновное функциональное назначение гидробромида поли-L-лизина (PLL) для адгезии клеток заключается в покрытии отрицательно заряженных твердых поверхностей (таких как стекло или пластик) для создания высокоадгезивного положительно заряженного субстрата.
Псевдоуридин-5´-трифосфат (Pseudo-UTP- ΨUTP)New England BiolabN0433SПсевдоуридин-5´-трифосфат (Pseudo-UTP) обычно используется для снижения иммуногенности РНК, полученной путем транскрипции in vitro.
Набор растворов рибонуклеотидовNew England BiolabN0450LЧетыре отдельных раствора ATP, GTP, CTP и UTP
Ингибитор ROCK Y-27632 (дигидрохлорид)Stem cell technologies72302Y-27632 является проникающим в клетку, высокоэффективным и селективным ингибитором Rho-ассоциированной протеинкиназы с закрученным доменом (ROCK). Y-27632 ингибирует как ROCK1 (Ki = 220 nM), так и ROCK2 (Ki = 300 nM), конкурируя с ATP за связывание с каталитическим центром 
Вода для RT-PCRThermo FisherAM9935Основное функциональное назначение воды для RT-PCR (часто маркируемой как вода без нуклеаз) — служить сверхчистым растворителем для чувствительных ферментативных анализов, где любое загрязнение может привести к деградации образца или ингибированию амплификации.
Ингибитор РНКаз SUPERase·In Thermo FisherAM2694Ингибитор РНКаз SUPERase In — это белковый ингибитор нечеловеческого происхождения, который нековалентно связывает и ингибирует наиболее распространенные и проблемные РНКазы, включая РНКазы A, B, C, 1 и T1.
Краситель для нуклеиновых кислот в гелях SYBR Green IThermo FisherS7563Основное функциональное назначение красителя для нуклеиновых кислот SYBR™ Green I — визуализация и количественное определение двухцепочечной ДНК (дцДНК) в агарозных или полиакриламидных гелях.
Набор для трансфекции TransIT-mRNAMirusbio/ Millipore SigmaMIR 2250Высокоэффективный реагент с низкой токсичностью для трансфекции крупных молекул РНК
Набор для определения теломеразы TRAPezeMillipore Sigma S7700 Анализ TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol) является широко используемым и чувствительным методом на основе ПЦР для обнаружения и измерения активности теломеразы в клетках млекопитающих и образцах тканей. Он включает три основных этапа: удлинение теломерных повторов теломеразой, амплификацию этих продуктов с помощью ПЦР и последующее детектирование.
Трипсин-ЭДТА (0,05%), феноловый красныйThermo Fisher25300054Для открепления адгезивных клеток млекопитающих от сосудов для культивирования при рутинном пассировании (субкультивировании) и сборе клеток.

Ссылки

  1. Millner A, Atilla-Gokcumen GE. Lipid players of cellular senescence. Metabolites. 2020;10(9):339.
  2. Hamsanathan S, Gurkar AU. Lipids as regulators of cellular senescence. Front Physiol. 2022;13:796850.
  3. Das UN. Cell membrane theory of senescence and the role of bioactive lipids in aging and aging-associated diseases and their therapeutic implications. Biomolecules. 2021;11(2):241.
  4. Shin EY, Soung NK, Schwartz MA, Kim EG. Altered endocytosis in cellular senescence. Ageing Res Rev. 2021;68:101332.
  5. Park JS, et al. Down-regulation of amphiphysin-1 is responsible for reduced receptor-mediated endocytosis in senescent cells. FASEB J. 2001;15(9):1625-1627.
  6. Park SC. Functional recovery of senescent cells through restoration of receptor-mediated endocytosis. Mech Ageing Dev. 2002;123(8):917-926.
  7. Stroupe C. This is the end: regulation of Rab7 nucleotide binding in endolysosomal trafficking and autophagy. Front Cell Dev Biol. 2018;6:129.
  8. Curnock R, et al. TFEB-dependent lysosome biogenesis is required for senescence. EMBO J. 2023;42(9):e111241.
  9. Guerrero-Navarro L, Jansen-Durr P, Cavinato M. Age-related lysosomal dysfunctions. Cells. 2022;11(12):1977.
  10. Tan JX, Finkel T. Lysosomes in senescence and aging. EMBO Rep. 2023;24(11):e57265.
  11. Rovira M, et al. The lysosomal proteome of senescent cells contributes to the senescence secretome. Aging Cell. 2022;21(10):e13707.
  12. Kilroy G, Burk DH, Floyd ZE. High-efficiency lipid-based siRNA transfection of adipocytes in suspension. PLoS One. 2009;4(9):e6940.
  13. Kariko K, Buckstein M, Ni H, Weissman D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 2005;23(2):165-175.
  14. Freund I, Eigenbrod T, Helm M, Dalpke AH. RNA modifications modulate activation of innate Toll-like receptors. Genes (Basel). 2019;10(2):92.
  15. Chen H, et al. Branched chemically modified poly(A) tails enhance the translation capacity of mRNA. Nat Biotechnol. 2025;43(2):194-203.
  16. Alshehri A, Grabowska A, Stolnik S. Pathways of cellular internalisation of liposome-delivered siRNA and effects on siRNA engagement with target mRNA and silencing in cancer cells. Sci Rep. 2018;8(1):3748.
  17. Paramasivam P, et al. Endosomal escape of delivered mRNA from endosomal recycling tubules visualized at the nanoscale. J Cell Biol. 2022;221(2):e202110137.
  18. Pandey E, Harris EN. Chloroquine and cytosolic galectins affect endosomal escape of antisense oligonucleotides after Stabilin-mediated endocytosis. Mol Ther Nucleic Acids. 2023;33:430-443.
  19. Bettinger T, et al. Peptide-mediated RNA delivery: a novel approach for enhanced transfection of primary and post-mitotic cells. Nucleic Acids Res. 2001;29(18):3882-3891.
  20. Granados-Riveron JT, Aquino-Jarquin G. Engineering of the current nucleoside-modified mRNA-LNP vaccines against SARS-CoV-2. Biomed Pharmacother. 2021;142:111953.
  21. Hou X, Shi J, Xiao Y. mRNA medicine: recent progresses in chemical modification, design, and engineering. Nano Res. 2024;17(10):9015-9030.
  22. Ramunas J, et al. Transient delivery of modified mRNA encoding TERT rapidly extends telomeres in human cells. FASEB J. 2015;29(5):1930-1939.
  23. Majewska J, Krizhanovsky V. Immune surveillance of senescent cells in aging and disease. Nat Aging. 2025;5(8):1415-1424.
  24. Ajoolabady A, et al. Hallmarks and mechanisms of cellular senescence in aging and disease. Cell Death Discov. 2025;11(1):364.
  25. Lin J, et al. RNA and protein degradation in the aging process. Cell Signal. 2025;136:112166.
  26. Anderson BR, et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic Acids Res. 2010;38(17):5884-5892.
  27. Sugawara S, et al. RNaseH2A downregulation drives inflammatory gene expression via genomic DNA fragmentation in senescent and cancer cells. Commun Biol. 2022;5(1):1420.
  28. Chatterjee S, Kon E, Sharma P, Peer D. Endosomal escape: a bottleneck for LNP-mediated therapeutics. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024;121(11):e2307800120.
  29. Li YY, Tay FR. The epigenetic rejuvenation promise: partial reprogramming as a therapeutic strategy for aging and disease. Ageing Res Rev. 2026;115:103009.
  30. Zhang W, Qu J, Liu GH, Belmonte JCI. The ageing epigenome and its rejuvenation. Nat Rev Mol Cell Biol. 2020;21(3):137-150.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

сенильные фибробластымРНК hTERTнуклеозидно-модифицированная мРНКингибирование РНКазымодуляция pH эндосомудлинение теломеррепликативный потенциал
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.