Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Исследовательская статья
* These authors contributed equally
Принудительная гиперэкспрессия miR-486-3p подавляет связанную с пролиферацией активность, клоногенный рост, закрытие раны и миграцию через Matrigel в клетках аденокарциномы легкого линий A549 и H358. Эти эффекты сопровождаются снижением экспрессии WNT5B, DVL1, β-catenin и BCL-2, что указывает на связь in vitro с изменениями, связанными с путем Wnt, без установления прямого таргетинга или причинно-следственной связи в сигнальном пути.
Аденокарцинома легкого (LUAD) является преобладающим гистологическим подтипом немелкоклеточного рака легкого и по-прежнему связана со значительными показателями заболеваемости и смертности. Предыдущие исследования выявили опухолесупрессивные функции miR-486-3p при LUAD, однако ее взаимосвязь с изменениями экспрессии WNT5B, DVL1 и β-катенина не была четко определена. В данной работе базовый уровень экспрессии miR-486-3p изучался в клетках LUAD линий A549 и H358 и сравнивался с уровнем в клетках бронхиального эпителия Beas-2b, которые содержались в соответствующих стандартных условиях. Модели со стабильной гиперэкспрессией miR-486-3p были созданы с помощью лентивирусной трансдукции. Активность, связанная с ростом клеток, клоногенный рост, закрытие раны и прохождение через мембраны, покрытые Matrigel, оценивали с помощью набора Cell Counting Kit-8, анализа формирования колоний, анализа заживления ран и анализа в системе Transwell. Содержание белков WNT5B, DVL1, β-катенина и BCL-2 оценивали методом вестерн-блоттинга, а уровни мРНК WNT5B, DVL1, CTNNB1 и BCL2 дополнительно исследовали с помощью RT-qPCR. В использованных условиях культивирования уровень экспрессии miR-486-3p в клетках A549 и H358 был ниже, чем в клетках Beas-2b, а лентивирусная трансдукция привела к стабильной гиперэкспрессии в обеих клеточных линиях LUAD. Принудительная гиперэкспрессия miR-486-3p снижала сигнал CCK-8, формирование колоний, закрытие раны и прохождение через мембраны, покрытые Matrigel, что сопровождалось снижением содержания белков WNT5B, DVL1, общего β-катенина и BCL-2. Данные RT-qPCR дополнительно показали снижение уровня транскриптов WNT5B, DVL1, CTNNB1 и BCL2 в обеих клеточных линиях LUAD после гиперэкспрессии miR-486-3p. Эти результаты подтверждают связь in vitro между принудительной экспрессией miR-486-3p, ослаблением нескольких показателей злокачественности клеток и изменением экспрессии белков, связанных с путем Wnt; однако они не устанавливают прямого связывания miRNA с мишенью, активность пути или причинно-следственный линейный механизм передачи сигнала.
Аденокарцинома легкого (LUAD) является наиболее распространенным гистологическим подтипом немелкоклеточного рака легкого (NSCLC) и вносит значительный вклад в показатели заболеваемости и смертности от рака легкого во всем мире1,2,3,4,5. Молекулярная классификация и таргетная терапия улучшили исходы для отдельных групп пациентов, однако распространенная LUAD остается трудноизлечимым заболеванием и характеризуется биологической гетерогенностью1,2,3,4,5. Таким образом, определение регуляторных процессов, которые способствуют злокачественному поведению клеток, остается актуальным для разработки проверяемых терапевтических гипотез.
Сигналинг Wnt включает β-catenin-зависимые и β-catenin-независимые ветви, которые регулируют пролиферацию, выживаемость, полярность и подвижность6,7,8,9. WNT5B чаще всего ассоциируют с неканоническим сигналингом, хотя его биологические эффекты варьируются в зависимости от рецептора и клеточного контекста10,11. DVL1 представляет собой цитоплазматический белок передачи сигнала, общий для нескольких ветвей Wnt, и был связан с β-catenin-зависимыми процессами при раке легкого12. Соответственно, одновременные изменения уровней WNT5B, DVL1 и β-catenin сами по себе не должны интерпретироваться как доказательство существования единого линейного пути.
МикроРНК (мРНК) представляют собой короткие некодирующие РНК, которые регулируют экспрессию генов посредством последовательно-зависимых взаимодействий с таргетными транскриптами13,14,15. Поскольку одна мРНК может воздействовать на несколько РНК, изменение содержания мРНК может влиять на различные опухолеассоциированные фенотипы13,14,15,16,17,18. Ряд мРНК был связан с ростом, подвижностью и сигнализацией клеток рака легкого, а перекрестное взаимодействие между мРНК и сетями, связанными с Wnt, было описано при различных видах рака16,17,18,19,20.
Локус MIR486 дает начало зрелым цепям miR-486-3p и miR-486-5p. miR-486-3p проявила опухолесупрессорную активность при раке полости рта и глиобластоме, тогда как при плоскоклеточном раке кожи сообщалось об эффекте, способствующем развитию опухоли21,22,23,24,25. miR-486-3p была выбрана для настоящего исследования на основе гипотезы, опирающейся на ее пониженное содержание в общедоступных данных по LUAD, ранее описанную опухолесупрессорную активность при LUAD и биоинформатические прогнозы, связывающие ее с кандидатными транскриптами, относящимися к WNT. Tomioka и др. продемонстрировали опухолесупрессорные эффекты обеих цепей miR-486 при LUAD и идентифицировали GINS4 с помощью полногеномного скрининга мишеней26. Таким образом, в настоящем исследовании не заявляется о первой демонстрации противоопухолевого фенотипа. Вместо этого оценивается, сопровождается ли форсированная экспрессия miR-486-3p изменениями содержания WNT5B, DVL1 и β-catenin, а также воспроизводимыми фенотипическими изменениями в двух клеточных линиях LUAD. Эти анализы оценивают взаимосвязи и не устанавливают прямое воздействие на мишени, активность пути или линейный механизм WNT5B/DVL1/β-catenin.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Используемые реагенты и оборудование перечислены в таблице материалов.
Культивирование клеток
Использовались клеточные линии аденокарциномы легкого человека (LUAD) A549 и H358, а также иммортализованная линия бронхиального эпителия Beas-2b. Линии A549 (KRAS G12S) и H358 (KRAS G12C; дефицитные по STK11) были выбраны в качестве общепринятых моделей LUAD с различными вариантами мутаций KRAS, в то время как Beas-2b использовалась в качестве незлокачественного бронхиального эпителиального контроля. Клетки A549 и H358 культивировали в среде RPMI-1640, а клетки Beas-2b — в среде DMEM; каждая среда содержала 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина-стрептомицина. Клетки культивировали при 37 °C в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO₂. Поскольку опухолевые линии и линия эпителиального контроля содержались в разных стандартных средах, сравнения базового уровня экспрессии между различными клеточными линиями интерпретировали с осторожностью.
Лентивирусная трансдукция и селекция стабильных клеточных линий
Для реализации стратегии стабильного усиления функции использовали лентивирусные векторы, несущие предшественник hsa-miR-486-3p (LV-miR-486-3p) или скрамблированную последовательность отрицательного контроля (LV-NC). Клетки A549 и H358 высевали в 6-луночные планшеты с плотностью 5 × 104 клеток/лунку и культивировали в течение ночи. На следующий день клетки подвергали воздействию лентивируса с множественностью заражения (MOI) 10 в присутствии 8 µg/mL полибрен. Через 24 ч вирусный инокулят заменяли свежей полной средой. Трансдуцированные клетки селектировали пуромицином в концентрации 2 µg/mL в течение 7 дней. После селекции выжившим клеткам давали восстановиться, затем их наращивали для последующих молекулярных и функциональных анализов. Группу с ингибитором miR-486-3p не включали, так как данное исследование было специально разработано для оценки эффектов стабильной принудительной гиперэкспрессии.
ПРИМЕЧАНИЕ: MOI, время воздействия полибренa и условия селекции пуромицином должны быть идентичными для групп LV-NC и LV-miR-486-3p, чтобы минимизировать различия в жизнеспособности клеток, связанные с процедурой обработки.
ОТ-КПЦР
Для определения уровней экспрессии miR-486-3p и подтверждения эффективности лентивирусной оверэкспрессии в клетках A549 и H358 была проведена RT-qPCR. Общую РНК выделяли с использованием реагента TRIzol в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию и чистоту РНК оценивали спектрофотометрически; приемлемым считалось соотношение A260/A280 в диапазоне 1,8–2,1. Для анализа мРНК 1 µg общей РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК с помощью коммерческого набора для синтеза кДНК согласно протоколу производителя. Для анализа микроРНК синтез кДНК проводили с использованием специфического для микроРНК стем-петлевого праймера для обратной транскрипции. Количественную ПЦР проводили в общем объеме реакции 20 µL, содержащем 10 µL 2× SYBR Green Master Mix, по 0,4 µM каждого праймера и 2 µL матрицы кДНК. Протокол амплификации состоял из этапа начальной денатурации при 95 °C в течение 5 min, после чего следовали 40 циклов денатурации при 95 °C в течение 10 s и отжига/элонгации при 60 °C в течение 30 s. Затем проводили анализ кривых плавления для проверки специфичности амплификации. В качестве внутреннего контроля для количественного определения микроРНК использовали малую ядерную РНК U6, а в качестве референсного гена для нормализации мРНК — GAPDH. Относительные уровни экспрессии определяли методом 2−ΔΔCq.
Последовательности праймеров для miRNA были следующими: праймер для обратной транскрипции с «шпилькой» (stem-loop), 5′-GTCGTATCGACTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAGTCGATACGAC
ATCCTG-3′; прямой праймер для miR-486-3p, 5′-CGCGGGGCAGCTCAGTA-3′; универсальный обратный праймер, 5′-ACTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′; прямой праймер для U6, 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′ и обратный праймер для U6, 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′. Последовательности праймеров для WNT5B, DVL1, CTNNB1, BCL2 и GAPDH, а также длина ампликонов и эффективность амплификации приведены в Таблице 1. Экспрессия мРНК была нормализована по GAPDH, в то время как экспрессия miR-486-3p — по U6. Каждый эксперимент включал три независимых биологических повторности, с тремя техническими повторностями для каждой биологической повторности.
Вестерн-блоттинг
После завершения 7-дневной селекции пуромицином и периода восстановления клетки лизировали в буфере RIPA, содержащем ингибиторы протеаз. Концентрацию белка определяли с помощью BCA-анализа. Равные количества белка (20 µg на лунку) разделяли в 10% SDS-PAGE гелях и переносили на ПВДФ-мембраны методом влажного переноса при 300 mA в течение 120 мин. Мембраны блокировали 5% раствором обезжиренного молока, приготовленным на трис-солевом буфере с добавлением 0,1% Tween-20 (TBST), в течение 1 ч при комнатной температуре. Мембраны инкубировали в течение ночи при 4 °C с первичными антителами к WNT5B (1:1,000), DVL1 (1:1,000), β-catenin (1:1,000), BCL-2 (0.5 µg/mL) или β-actin (1:5,000). Производители и номера каталогов всех антител указаны в таблице материалов. После трех 10-минутных промывок TBST мембраны инкубировали с козьими вторичными антителами против IgG кролика, конъюгированными с HRP, в разведении 1:5,000 в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем мембраны трижды промывали TBST, и полосы белков визуализировали с помощью хемилюминесцентного субстрата и системы гель-документации и визуализации. Интенсивность полос количественно оценивали с помощью ImageJ. Содержание каждого целевого белка нормировали по соответствующему сигналу β-actin из того же биологического образца. Для денситометрического анализа использовали только экспозиции в линейном, ненасыщенном диапазоне детектирования. Было проведено три независимых биологических эксперимента.
Анализ с использованием набора для подсчета клеток Cell Counting Kit-8
Клетки A549 и H358, стабильно трансдуцированные LV-NC или LV-miR-486-3p, высевали в 96-луночные планшеты в количестве 1,5 × 104 клеток/лунку в 100 µL полной среды. После ночной адгезии среду заменяли, и значение абсорбции в момент 0 ч измеряли сразу после добавления реагента Cell Counting Kit-8. В моменты 0 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч и 96 ч в каждую лунку добавляли 10 µL реагента и инкубировали в течение 1 ч при 37 °C, после чего измеряли абсорбцию при 450 nm. Для уточненного анализа временного хода значения каждой группы нормировали по соответствующему значению в момент 0 ч перед построением графиков. Было проведено три независимых биологических эксперимента, и значения технических повторности внутри каждого эксперимента усреднялись перед статистическим анализом.
Анализ колониеобразования
Стабильно селектированные клетки A549 и H358 готовили в виде суспензий из отдельных клеток с концентрацией 5 × 102 cells/mL. В каждую лунку 6-луночного планшета высевали по 1 мл клеточной суспензии, после чего добавляли 3 mL полной среды. Клетки культивировали в течение 14 дней, заменяя среду каждые 5 дней. Колонии промывали PBS, фиксировали 4% параформальдегидом в течение 20 min, окрашивали кристаллическим фиолетовым в течение 20 min, промывали и высушивали на воздухе. В программе ImageJ подсчитывали количество колоний, содержащих не менее 50 клеток. Было проведено три независимых биологических эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения искусственной агрегации клеток необходимо обеспечить получение однородной суспензии одиночных клеток и минимальное воздействие на планшет при формировании колоний.
Анализ миграции клеток
Стабильно трансдуцированные клетки A549 и H358 высевали в 6-луночные планшеты и культивировали до образования сплошного монослоя. С помощью стерильного наконечника дозатора объемом 10 µL создавали прямую царапину, затем удаляли отслоившиеся клетки и проводили визуализацию одних и тех же отмеченных полей через 0 h, 24 h, 48 h и 72 h. Площадь раны измеряли в программе ImageJ, а степень закрытия раны рассчитывали по формуле: (площадь в 0 h − площадь в указанный момент времени) / площадь в 0 h × 100%. Было проведено три независимых биологических эксперимента. Фармакологические блокаторы пролиферации не использовались, поэтому данный анализ интерпретировали как измерение закрытия раны, а не как специфический показатель миграции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Царапины должны быть нанесены с одинаковой шириной и силой нажатия; на протяжении всего временного интервала необходимо наблюдать за одними и теми же участками.
Анализ инвазии клеток
Тесты на инвазию в системе Transwell проводили с использованием поликарбонатных мембранных вставок для 24-луночных планшетов с размером пор 8 µm. Верхнюю поверхность каждой вставки покрывали 100 µL матрикса базальной мембраны Matrigel, разведенного в безсывороточной среде DMEM в соотношении 1:8 до приблизительной конечной концентрации белка 1 mg/mL, и инкубировали при 37 °C в течение 4 h. Клетки A549 и H358 ресуспендировали в безсывороточной среде RPMI-1640 с плотностью 8 × 105 клеток/mL и 4 × 105 клеток/mL соответственно. В верхнюю камеру добавляли аликвоту клеточной суспензии объемом 200 µL, что соответствовало 1.6 × 105 клеток A549 или 8 × 104 клеток H358 на одну вставку. Нижнюю камеру заполняли 500 µL среды RPMI-1640, содержащей 20% эмбриональной бычьей сыворотки в качестве хемоаттрактанта. После инкубации при 37 °C в увлажненной атмосфере с 5% CO₂ в течение 48 h неинвазивные клетки, оставшиеся на верхней поверхности мембраны, осторожно удаляли ватным тампоном. Клетки, прошедшие через мембрану, фиксировали 4% параформальдегидом в течение 20 min и окрашивали 0.1% кристаллическим фиолетовым в течение 20 min при комнатной температуре. Для каждой вставки получали изображения пяти случайно выбранных микроскопических полей, а количество инвазивных клеток подсчитывали с помощью ImageJ. Среднее количество клеток в пяти полях принимали за одно значение для каждой вставки; при этом в качестве экспериментальной единицы рассматривали вставку, а не отдельное микроскопическое поле. Проводили три независимых биологических эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно и равномерно удалите клетки, не проникшие через мембрану, чтобы избежать ее повреждения или смещения клеток, мигрировавших на ее нижнюю поверхность.
Статистический анализ
Данные представлены в виде среднего значения ± SD — стандартное отклонение; n обозначает количество независимых биологических экспериментов, если не указано иное. Технические повторности или данные из нескольких микроскопических полей одного и того же экспериментального объекта усреднялись перед проведением статистического анализа. Для сравнения трех клеточных линий использовался однофакторный дисперсионный анализ с последующим попарным сравнением с поправкой Тьюки. Для анализа временных кривых CCK-8 и времени закрытия раны использовался двухфакторный дисперсионный анализ с повторными измерениями для оценки эффектов воздействия, времени и взаимодействия воздействия и времени с последующим сравнением в отдельные моменты времени с поправкой Шидака. Сравнение двух групп проводилось с помощью двустороннего непарного t-критерия Стьюдента t-критерииСтатистический анализ и визуализация данных проводились с использованием программного обеспечения для статистического анализа и построения графиков. Точный pЗначения p указаны на панелях рисунков или в таблицах с исходными данными. Статистическая значимость определялась как p < 0.05; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0,001 и ****p < 0.0001.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Анализ данных TCGA/starBase показывает снижение содержания miR-486-3p при LUAD, а TargetScan позволяет определить потенциальные сайты связывания
Данные об экспрессии из базы TCGA, полученные с помощью starBase v3.0, показали, что уровень miR-486-3p был значительно ниже в 512 образцах аденокарциномы легкого (LUAD), чем в 20 образцах непухолевой ткани легкого (критерий суммы рангов Уилкоксона, p = 3.2 × 10⁻5; Рисунок 1)....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
В настоящем исследовании по увеличению функции оценивалось влияние стабильной принудительной экспрессии miR-486-3p в клетках аденокарциномы легкого (LUAD) линий A549 и H358. В обеих моделях гиперэкспрессия miR-486-3p сопровождалась снижением сигналов CCK-8, связанных с ростом, уменьшением клоногенного роста, замедлением закрытия раны и меньшим количеством клеток, прошедших через мембраны Transwell с покрытием из Matrigel. Эти фенотипические изменения сопровождались снижением содержания белков WNT5B, DVL1, общего β-cateni...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Данное исследование получило финансовую поддержку в рамках Плана медицинской и санитарной науки и техники провинции Чжэцзян (2025KY349) и программы ключевых поддерживаемых дисциплин города Цзясин (2023-zc-014).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1 M Tris-HCl (pH 6.8) | Solarbio | T1020 | Приготовление концентрирующего геля для SDS-PAGE |
| 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) | Solarbio | T1010 | Приготовление разделяющего геля для SDS-PAGE |
| 20× TBS буфер | Solarbio | 71080 | Стоковый буфер для промывки при вестерн-блоттинге и разведения антител |
| 30% раствор акриламида/бис-акриламида (29:1) | Solarbio | A1010 | Приготовление гелей для SDS-PAGE |
| 4% параформальдегидный фиксатор | Servicebio | G1101 | Фиксация для тестов на колониеобразование и в камерах Transwell |
| 5× буфер для нанесения белков | Beyotime | P0015 | Подготовка белковых образцов для SDS-PAGE |
| Персульфат аммония | Solarbio | 427A038 | Инициатор полимеризации геля для SDS-PAGE |
| Набор для определения концентрации белка BCA | Beyotime | P0009-1 | Определение концентрации белка |
| Антитело к BCL-2 | Boster Biological Technology | A00040-2 | Кроличьи поликлональные антитела; вестерн-блоттинг в разведении 1:5,000 |
| Набор для подсчета клеток-8 (CCK-8) | TargetMol | C0005 | Анализ метаболической активности, связанной с ростом клеток; 10 μL на 100 μL культуральной среды |
| Система хемилюминесцентной визуализации | Bio-Rad | ChemiDoc MP | Визуализация результатов вестерн-блоттинга |
| Хлороформ | Servicebio | G3005 | Разделение фаз при экстракции РНК с помощью TRIzol |
| Раствор для окрашивания кристаллическим фиолетовым | Servicebio | G1014 | Окрашивание колоний и мембран Transwell |
| DMEM | Servicebio | G4511 | Стандартная культуральная среда для клеток Beas-2b |
| Антитело к DVL1 | Signalway Antibody | 53180 | Кроличьи первичные антитела; вестерн-блоттинг в разведении 1:5,000 |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Biosharp | BL203B | Добавка 10% (v/v) для стандартного культивирования клеток; 20% (v/v) в нижней камере Transwell |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | Version 8 | Построение графиков и статистический анализ |
| Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) | Yeasen Biotechnology | 11201ES08 | Количественная ПЦР с использованием SYBR Green |
| Hifair III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix для qPCR (gDNA digester plus) | Yeasen Biotechnology | 11141ES60 | Обратная транскрипция для RT-qPCR мРНК |
| IBM SPSS Statistics | IBM | Version 22.0 | Статистический анализ |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.53 | Денситометрия вестерн-блоттов, измерение площади раны, подсчет колоний и клеток в камерах Transwell |
| Инвертированный микроскоп | Olympus | CKX53 | Визуализация тестов на заживление ран и в камерах Transwell |
| Изопропанол | Servicebio | G3006 | Осаждение РНК при экстракции с помощью TRIzol |
| Лентивирусные препараты LV-miR-486-3p и LV-NC | GenePharma | Custom synthesis | Вектор для стабильной сверхэкспрессии miR-486-3p и вектор отрицательного контроля со скремблированной последовательностью |
| Матрикс базальной мембраны Matrigel | Corning | 354234 | Разведен 1:8 в среде DMEM без сыворотки; конечная концентрация белка приблизительно 1 mg/mL |
| Метанол | Xilong Scientific | GB/T 683-2006 | Активация ПВДФ-мембран |
| Микропланшетный ридер | BioTek | ELx800 | Измерение абсорбции при 450 nm |
| Микрообъемный УФ-Вид спектрофотометр | Allsheng | Nano-600 | Определение концентрации РНК и оценка чистоты по соотношению A260/A280 |
| Пенициллин-стрептомицин | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Добавка 1% (v/v) для стандартного культивирования клеток |
| Фосфатно-солевой буфер (PBS) | Servicebio | G0002 | Промывка клеток и мембран |
| Коктейль ингибиторов протеаз | APExBIO | K1007 | Добавляется в лизирующий буфер RIPA |
| Маркер молекулярной массы белков | Biosharp | BL712A | Эталон молекулярной массы для вестерн-блоттинга |
| ПВДФ-мембрана | Millipore | K2MA8350E | Мембрана для переноса белков при вестерн-блоттинге |
| Система ПЦР в реальном времени QuantStudio 5 | Thermo Fisher Scientific | QuantStudio 5 | Сбор данных RT-qPCR |
| Лизирующий буфер RIPA | Beyotime | P0013B | Экстракция общего клеточного белка |
| Реагент для экстракции РНК (типа TRIzol) | Servicebio | G3013 | Экстракция общей РНК |
| Среда RPMI 1640 | Servicebio | G4510 | Стандартная культуральная среда для клеток A549 и H358, а также безсывороточная суспензия клеток для Transwell |
| SDS | Solarbio | S8010 | Реагент для SDS-PAGE |
| Обезжиренное молоко в порошке | BD | 2271470 | 5% блокирующий раствор для вестерн-блоттинга |
| StarBase v3.0 | Sun Yat-sen University | https://rnasysu.com/encori/ | Анализ экспрессии miR-486-3p на основе данных TCGA |
| TargetScanHuman | Whitehead Institute for Biomedical Research | https://www.targetscan.org/vert_80/ | Предсказание потенциальных сайтов связывания miR-486-3p |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T8090 | Катализатор полимеризации геля для SDS-PAGE |
| Вставки Transwell, 24-луночные, размер пор 8 μm | Corning | 3428 | Анализ прохождения через мембрану, покрытую Matrigel |
| Трипсин | Servicebio | G4000 | Открепление клеток |
| Tween-20 | Solarbio | 815A043 | Приготовление промывочного буфера для вестерн-блоттинга |
| Система вертикального электрофореза | Liuyi Biotechnology | DYCZ-24DN | Разделение белков методом SDS-PAGE |
| Люминольный реагент-субстрат HRP для вестерн-блоттинга | Affinity Biosciences | KF001 | Хемилюминесцентная детекция при вестерн-блоттинге |
| Система «мокрого» переноса | Bio-Rad | 1703930 | Перенос белков на ПВДФ-мембрану |
| Антитело к WNT5B | Signalway Antibody | 56808 | Кроличьи первичные антитела; вестерн-блоттинг в разведении 1:5,000 |
| Антитело к β-актину | Abcam | ab8227 | Контроль нагрузки; вестерн-блоттинг в разведении 1:5,000 |
| Антитело к β-катенину | Signalway Antibody | 21725 | Кроличьи первичные антитела; вестерн-блоттинг в разведении 1:5,000 |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.