Принудительная гиперэкспрессия miR-486-3p подавляет связанную с пролиферацией активность, клоногенный рост, закрытие раны и миграцию через Matrigel в клетках аденокарциномы легкого линий A549 и H358. Эти эффекты сопровождаются снижением экспрессии WNT5B, DVL1, β-catenin и BCL-2, что указывает на связь in vitro с изменениями, связанными с путем Wnt, без установления прямого таргетинга или причинно-следственной связи в сигнальном пути.
Исследовательская статья
miR-486-3p подавляет злокачественные фенотипы и ассоциирован со снижением экспрессии WNT5B, DVL1 и β-catenin в клетках аденокарциномы легкого
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Аденокарцинома легкого (LUAD) является преобладающим гистологическим подтипом немелкоклеточного рака легкого и по-прежнему связана со значительными показателями заболеваемости и смертности. Предыдущие исследования выявили опухолесупрессивные функции miR-486-3p при LUAD, однако ее взаимосвязь с изменениями экспрессии WNT5B, DVL1 и β-катенина не была четко определена. В данной работе базовый уровень экспрессии miR-486-3p изучался в клетках LUAD линий A549 и H358 и сравнивался с уровнем в клетках бронхиального эпителия Beas-2b, которые содержались в соответствующих стандартных условиях. Модели со стабильной гиперэкспрессией miR-486-3p были созданы с помощью лентивирусной трансдукции. Активность, связанная с ростом клеток, клоногенный рост, закрытие раны и прохождение через мембраны, покрытые Matrigel, оценивали с помощью набора Cell Counting Kit-8, анализа формирования колоний, анализа заживления ран и анализа в системе Transwell. Содержание белков WNT5B, DVL1, β-катенина и BCL-2 оценивали методом вестерн-блоттинга, а уровни мРНК WNT5B, DVL1, CTNNB1 и BCL2 дополнительно исследовали с помощью RT-qPCR. В использованных условиях культивирования уровень экспрессии miR-486-3p в клетках A549 и H358 был ниже, чем в клетках Beas-2b, а лентивирусная трансдукция привела к стабильной гиперэкспрессии в обеих клеточных линиях LUAD. Принудительная гиперэкспрессия miR-486-3p снижала сигнал CCK-8, формирование колоний, закрытие раны и прохождение через мембраны, покрытые Matrigel, что сопровождалось снижением содержания белков WNT5B, DVL1, общего β-катенина и BCL-2. Данные RT-qPCR дополнительно показали снижение уровня транскриптов WNT5B, DVL1, CTNNB1 и BCL2 в обеих клеточных линиях LUAD после гиперэкспрессии miR-486-3p. Эти результаты подтверждают связь in vitro между принудительной экспрессией miR-486-3p, ослаблением нескольких показателей злокачественности клеток и изменением экспрессии белков, связанных с путем Wnt; однако они не устанавливают прямого связывания miRNA с мишенью, активность пути или причинно-следственный линейный механизм передачи сигнала.
Введение
Аденокарцинома легкого (LUAD) является наиболее распространенным гистологическим подтипом немелкоклеточного рака легкого (NSCLC) и вносит значительный вклад в показатели заболеваемости и смертности от рака легкого во всем мире1,2,3,4,5. Молекулярная классификация и таргетная терапия улучшили исходы для отдельных групп пациентов, однако распространенная LUAD остается трудноизлечимым заболеванием и характеризуется биологической гетерогенностью1,2,3,4,5. Таким образом, определение регуляторных процессов, которые способствуют злокачественному поведению клеток, остается актуальным для разработки проверяемых терапевтических гипотез.
Сигналинг Wnt включает β-catenin-зависимые и β-catenin-независимые ветви, которые регулируют пролиферацию, выживаемость, полярность и подвижность6,7,8,9. WNT5B чаще всего ассоциируют с неканоническим сигналингом, хотя его биологические эффекты варьируются в зависимости от рецептора и клеточного контекста10,11. DVL1 представляет собой цитоплазматический белок передачи сигнала, общий для нескольких ветвей Wnt, и был связан с β-catenin-зависимыми процессами при раке легкого12. Соответственно, одновременные изменения уровней WNT5B, DVL1 и β-catenin сами по себе не должны интерпретироваться как доказательство существования единого линейного пути.
МикроРНК (мРНК) представляют собой короткие некодирующие РНК, которые регулируют экспрессию генов посредством последовательно-зависимых взаимодействий с таргетными транскриптами13,14,15. Поскольку одна мРНК может воздействовать на несколько РНК, изменение содержания мРНК может влиять на различные опухолеассоциированные фенотипы13,14,15,16,17,18. Ряд мРНК был связан с ростом, подвижностью и сигнализацией клеток рака легкого, а перекрестное взаимодействие между мРНК и сетями, связанными с Wnt, было описано при различных видах рака16,17,18,19,20.
Локус MIR486 дает начало зрелым цепям miR-486-3p и miR-486-5p. miR-486-3p проявила опухолесупрессорную активность при раке полости рта и глиобластоме, тогда как при плоскоклеточном раке кожи сообщалось об эффекте, способствующем развитию опухоли21,22,23,24,25. miR-486-3p была выбрана для настоящего исследования на основе гипотезы, опирающейся на ее пониженное содержание в общедоступных данных по LUAD, ранее описанную опухолесупрессорную активность при LUAD и биоинформатические прогнозы, связывающие ее с кандидатными транскриптами, относящимися к WNT. Tomioka и др. продемонстрировали опухолесупрессорные эффекты обеих цепей miR-486 при LUAD и идентифицировали GINS4 с помощью полногеномного скрининга мишеней26. Таким образом, в настоящем исследовании не заявляется о первой демонстрации противоопухолевого фенотипа. Вместо этого оценивается, сопровождается ли форсированная экспрессия miR-486-3p изменениями содержания WNT5B, DVL1 и β-catenin, а также воспроизводимыми фенотипическими изменениями в двух клеточных линиях LUAD. Эти анализы оценивают взаимосвязи и не устанавливают прямое воздействие на мишени, активность пути или линейный механизм WNT5B/DVL1/β-catenin.
Протокол
Используемые реагенты и оборудование перечислены в таблице материалов.
Культивирование клеток
Использовались клеточные линии аденокарциномы легкого человека (LUAD) A549 и H358, а также иммортализованная линия бронхиального эпителия Beas-2b. Линии A549 (KRAS G12S) и H358 (KRAS G12C; дефицитные по STK11) были выбраны в качестве общепринятых моделей LUAD с различными вариантами мутаций KRAS, в то время как Beas-2b использовалась в качестве незлокачественного бронхиального эпителиального контроля. Клетки A549 и H358 культивировали в среде RPMI-1640, а клетки Beas-2b — в среде DMEM; каждая среда содержала 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина-стрептомицина. Клетки культивировали при 37 °C в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO₂. Поскольку опухолевые линии и линия эпителиального контроля содержались в разных стандартных средах, сравнения базового уровня экспрессии между различными клеточными линиями интерпретировали с осторожностью.
Лентивирусная трансдукция и селекция стабильных клеточных линий
Для реализации стратегии стабильного усиления функции использовали лентивирусные векторы, несущие предшественник hsa-miR-486-3p (LV-miR-486-3p) или скрамблированную последовательность отрицательного контроля (LV-NC). Клетки A549 и H358 высевали в 6-луночные планшеты с плотностью 5 × 104 клеток/лунку и культивировали в течение ночи. На следующий день клетки подвергали воздействию лентивируса с множественностью заражения (MOI) 10 в присутствии 8 µg/mL полибрен. Через 24 ч вирусный инокулят заменяли свежей полной средой. Трансдуцированные клетки селектировали пуромицином в концентрации 2 µg/mL в течение 7 дней. После селекции выжившим клеткам давали восстановиться, затем их наращивали для последующих молекулярных и функциональных анализов. Группу с ингибитором miR-486-3p не включали, так как данное исследование было специально разработано для оценки эффектов стабильной принудительной гиперэкспрессии.
ПРИМЕЧАНИЕ: MOI, время воздействия полибренa и условия селекции пуромицином должны быть идентичными для групп LV-NC и LV-miR-486-3p, чтобы минимизировать различия в жизнеспособности клеток, связанные с процедурой обработки.
ОТ-КПЦР
Для определения уровней экспрессии miR-486-3p и подтверждения эффективности лентивирусной оверэкспрессии в клетках A549 и H358 была проведена RT-qPCR. Общую РНК выделяли с использованием реагента TRIzol в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию и чистоту РНК оценивали спектрофотометрически; приемлемым считалось соотношение A260/A280 в диапазоне 1,8–2,1. Для анализа мРНК 1 µg общей РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК с помощью коммерческого набора для синтеза кДНК согласно протоколу производителя. Для анализа микроРНК синтез кДНК проводили с использованием специфического для микроРНК стем-петлевого праймера для обратной транскрипции. Количественную ПЦР проводили в общем объеме реакции 20 µL, содержащем 10 µL 2× SYBR Green Master Mix, по 0,4 µM каждого праймера и 2 µL матрицы кДНК. Протокол амплификации состоял из этапа начальной денатурации при 95 °C в течение 5 min, после чего следовали 40 циклов денатурации при 95 °C в течение 10 s и отжига/элонгации при 60 °C в течение 30 s. Затем проводили анализ кривых плавления для проверки специфичности амплификации. В качестве внутреннего контроля для количественного определения микроРНК использовали малую ядерную РНК U6, а в качестве референсного гена для нормализации мРНК — GAPDH. Относительные уровни экспрессии определяли методом 2−ΔΔCq.
Последовательности праймеров для miRNA были следующими: праймер для обратной транскрипции с «шпилькой» (stem-loop), 5′-GTCGTATCGACTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAGTCGATACGAC
ATCCTG-3′; прямой праймер для miR-486-3p, 5′-CGCGGGGCAGCTCAGTA-3′; универсальный обратный праймер, 5′-ACTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′; прямой праймер для U6, 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′ и обратный праймер для U6, 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′. Последовательности праймеров для WNT5B, DVL1, CTNNB1, BCL2 и GAPDH, а также длина ампликонов и эффективность амплификации приведены в Таблице 1. Экспрессия мРНК была нормализована по GAPDH, в то время как экспрессия miR-486-3p — по U6. Каждый эксперимент включал три независимых биологических повторности, с тремя техническими повторностями для каждой биологической повторности.
Вестерн-блоттинг
После завершения 7-дневной селекции пуромицином и периода восстановления клетки лизировали в буфере RIPA, содержащем ингибиторы протеаз. Концентрацию белка определяли с помощью BCA-анализа. Равные количества белка (20 µg на лунку) разделяли в 10% SDS-PAGE гелях и переносили на ПВДФ-мембраны методом влажного переноса при 300 mA в течение 120 мин. Мембраны блокировали 5% раствором обезжиренного молока, приготовленным на трис-солевом буфере с добавлением 0,1% Tween-20 (TBST), в течение 1 ч при комнатной температуре. Мембраны инкубировали в течение ночи при 4 °C с первичными антителами к WNT5B (1:1,000), DVL1 (1:1,000), β-catenin (1:1,000), BCL-2 (0.5 µg/mL) или β-actin (1:5,000). Производители и номера каталогов всех антител указаны в таблице материалов. После трех 10-минутных промывок TBST мембраны инкубировали с козьими вторичными антителами против IgG кролика, конъюгированными с HRP, в разведении 1:5,000 в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем мембраны трижды промывали TBST, и полосы белков визуализировали с помощью хемилюминесцентного субстрата и системы гель-документации и визуализации. Интенсивность полос количественно оценивали с помощью ImageJ. Содержание каждого целевого белка нормировали по соответствующему сигналу β-actin из того же биологического образца. Для денситометрического анализа использовали только экспозиции в линейном, ненасыщенном диапазоне детектирования. Было проведено три независимых биологических эксперимента.
Анализ с использованием набора для подсчета клеток Cell Counting Kit-8
Клетки A549 и H358, стабильно трансдуцированные LV-NC или LV-miR-486-3p, высевали в 96-луночные планшеты в количестве 1,5 × 104 клеток/лунку в 100 µL полной среды. После ночной адгезии среду заменяли, и значение абсорбции в момент 0 ч измеряли сразу после добавления реагента Cell Counting Kit-8. В моменты 0 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч и 96 ч в каждую лунку добавляли 10 µL реагента и инкубировали в течение 1 ч при 37 °C, после чего измеряли абсорбцию при 450 nm. Для уточненного анализа временного хода значения каждой группы нормировали по соответствующему значению в момент 0 ч перед построением графиков. Было проведено три независимых биологических эксперимента, и значения технических повторности внутри каждого эксперимента усреднялись перед статистическим анализом.
Анализ колониеобразования
Стабильно селектированные клетки A549 и H358 готовили в виде суспензий из отдельных клеток с концентрацией 5 × 102 cells/mL. В каждую лунку 6-луночного планшета высевали по 1 мл клеточной суспензии, после чего добавляли 3 mL полной среды. Клетки культивировали в течение 14 дней, заменяя среду каждые 5 дней. Колонии промывали PBS, фиксировали 4% параформальдегидом в течение 20 min, окрашивали кристаллическим фиолетовым в течение 20 min, промывали и высушивали на воздухе. В программе ImageJ подсчитывали количество колоний, содержащих не менее 50 клеток. Было проведено три независимых биологических эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения искусственной агрегации клеток необходимо обеспечить получение однородной суспензии одиночных клеток и минимальное воздействие на планшет при формировании колоний.
Анализ миграции клеток
Стабильно трансдуцированные клетки A549 и H358 высевали в 6-луночные планшеты и культивировали до образования сплошного монослоя. С помощью стерильного наконечника дозатора объемом 10 µL создавали прямую царапину, затем удаляли отслоившиеся клетки и проводили визуализацию одних и тех же отмеченных полей через 0 h, 24 h, 48 h и 72 h. Площадь раны измеряли в программе ImageJ, а степень закрытия раны рассчитывали по формуле: (площадь в 0 h − площадь в указанный момент времени) / площадь в 0 h × 100%. Было проведено три независимых биологических эксперимента. Фармакологические блокаторы пролиферации не использовались, поэтому данный анализ интерпретировали как измерение закрытия раны, а не как специфический показатель миграции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Царапины должны быть нанесены с одинаковой шириной и силой нажатия; на протяжении всего временного интервала необходимо наблюдать за одними и теми же участками.
Анализ инвазии клеток
Тесты на инвазию в системе Transwell проводили с использованием поликарбонатных мембранных вставок для 24-луночных планшетов с размером пор 8 µm. Верхнюю поверхность каждой вставки покрывали 100 µL матрикса базальной мембраны Matrigel, разведенного в безсывороточной среде DMEM в соотношении 1:8 до приблизительной конечной концентрации белка 1 mg/mL, и инкубировали при 37 °C в течение 4 h. Клетки A549 и H358 ресуспендировали в безсывороточной среде RPMI-1640 с плотностью 8 × 105 клеток/mL и 4 × 105 клеток/mL соответственно. В верхнюю камеру добавляли аликвоту клеточной суспензии объемом 200 µL, что соответствовало 1.6 × 105 клеток A549 или 8 × 104 клеток H358 на одну вставку. Нижнюю камеру заполняли 500 µL среды RPMI-1640, содержащей 20% эмбриональной бычьей сыворотки в качестве хемоаттрактанта. После инкубации при 37 °C в увлажненной атмосфере с 5% CO₂ в течение 48 h неинвазивные клетки, оставшиеся на верхней поверхности мембраны, осторожно удаляли ватным тампоном. Клетки, прошедшие через мембрану, фиксировали 4% параформальдегидом в течение 20 min и окрашивали 0.1% кристаллическим фиолетовым в течение 20 min при комнатной температуре. Для каждой вставки получали изображения пяти случайно выбранных микроскопических полей, а количество инвазивных клеток подсчитывали с помощью ImageJ. Среднее количество клеток в пяти полях принимали за одно значение для каждой вставки; при этом в качестве экспериментальной единицы рассматривали вставку, а не отдельное микроскопическое поле. Проводили три независимых биологических эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно и равномерно удалите клетки, не проникшие через мембрану, чтобы избежать ее повреждения или смещения клеток, мигрировавших на ее нижнюю поверхность.
Статистический анализ
Данные представлены в виде среднего значения ± SD — стандартное отклонение; n обозначает количество независимых биологических экспериментов, если не указано иное. Технические повторности или данные из нескольких микроскопических полей одного и того же экспериментального объекта усреднялись перед проведением статистического анализа. Для сравнения трех клеточных линий использовался однофакторный дисперсионный анализ с последующим попарным сравнением с поправкой Тьюки. Для анализа временных кривых CCK-8 и времени закрытия раны использовался двухфакторный дисперсионный анализ с повторными измерениями для оценки эффектов воздействия, времени и взаимодействия воздействия и времени с последующим сравнением в отдельные моменты времени с поправкой Шидака. Сравнение двух групп проводилось с помощью двустороннего непарного t-критерия Стьюдента t-критерииСтатистический анализ и визуализация данных проводились с использованием программного обеспечения для статистического анализа и построения графиков. Точный pЗначения p указаны на панелях рисунков или в таблицах с исходными данными. Статистическая значимость определялась как p < 0.05; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0,001 и ****p < 0.0001.
Результаты
Анализ данных TCGA/starBase показывает снижение содержания miR-486-3p при LUAD, а TargetScan позволяет определить потенциальные сайты связывания
Данные об экспрессии из базы TCGA, полученные с помощью starBase v3.0, показали, что уровень miR-486-3p был значительно ниже в 512 образцах аденокарциномы легкого (LUAD), чем в 20 образцах непухолевой ткани легкого (критерий суммы рангов Уилкоксона, p = 3.2 × 10⁻5; Рисунок 1). С помощью TargetScanHuman был идентифицирован слабоконсервативный кандидатный сайт 7mer-m8 для miR-486-3p в позициях 468–474 3′-нетранслируемой области (3′ UTR) DVL1 со значением context++ score −0.23 и процентилем context++ score 80. Слабоконсервативный кандидатный сайт 8mer был идентифицирован в позициях 913–920 3′ UTR WNT5B со значением context++ score −0.46 и процентилем context++ score 97 (Рисунок 2). Эти сайты, предсказанные вычислительным методом, были использованы для формулирования экспериментальной гипотезы и не рассматривались как доказательство прямого связывания микроРНК с мишенью. Ссылки на источники приведены в Таблице 2.
Уровень экспрессии miR-486-3p снижен в клеточных линиях LUAD и заметно увеличивается после лентивирусной трансдукции
При соответствующих стандартных условиях культивирования анализ RT-qPCR показал, что содержание miR-486-3p в клетках A549 и H358 было ниже, чем в клетках бронхиального эпителия Beas-2b. Сравнения с поправкой Тьюки после однофакторного дисперсионного анализа выявили значимые различия между клетками A549 и Beas-2b (p < 0.01), а также между клетками H358 и Beas-2b (p < 0.001; Рисунок 3A).
Стабильная трансдукция с помощью LV-miR-486-3p заметно увеличила содержание miR-486-3p по сравнению с соответствующими группами LV-NC. Экспрессия увеличилась примерно в 1 470 раз в клетках A549 и в 220 раз в клетках H358; оба сравнения были статистически значимыми (p < 0.001; Рисунок 3B,C). Эти результаты подтвердили успешное создание стабильных клеточных моделей с гиперэкспрессией miR-486-3p.
Принудительная экспрессия miR-486-3p связана со снижением экспрессии WNT5B, DVL1, β-catenin и BCL-2
Вестерн-блоттинг показал более низкое содержание белков WNT5B, DVL1, общего β-catenin и BCL-2 в клетках, трансдуцированных LV-miR-486-3p, по сравнению с соответствующими контрольными клетками LV-NC (Рисунок 4A–E). В клетках A549 принудительная экспрессия miR-486-3p была связана со снижением содержания белков β-catenin (p = 0,022), WNT5B (p = 0,0008), DVL1 (p = 0,019) и BCL-2 (p = 0,0017). Соответствующее снижение также наблюдалось в клетках H358 для β-catenin (p = 0,001), WNT5B (p = 0,0002), DVL1 (p = 0,0003) и BCL-2 (p = 0,0018).
Затем была проведена RT-qPCR, чтобы определить, сопровождались ли изменения на уровне белка соответствующими изменениями на уровне транскриптов (Рисунок 4F–I). В клетках A549 принудительная экспрессия miR-486-3p привела к снижению уровня мРНК CTNNB1 до 0,226 раза по сравнению с группой LV-NC (p = 0,004), мРНК WNT5B — до 0,180 раза (p = 0,004), мРНК DVL1 — до 0,278 раза (p = 0,006) и мРНК BCL2 — до 0,259 раза (p = 0,003).
Аналогичные изменения на уровне транскриптов были обнаружены в клетках H358. Уровень мРНК CTNNB1 снизился до 0,288 относительно группы LV-NC (p = 0,028), мРНК WNT5B — до 0,250 (p = 0,019), мРНК DVL1 — до 0,271 (p = 0,020) и мРНК BCL2 — до 0,534 (p = 0,003). Таким образом, направление изменений на уровне транскриптов соответствовало соответствующим результатам на уровне белков в обеих клеточных линиях. Эти результаты демонстрируют скоординированные изменения экспрессии, но не устанавливают прямое воздействие или активность линейного сигнального механизма WNT5B/DVL1/β-catenin.
Принудительная экспрессия miR-486-3p снижает связанный с ростом сигнал CCK-8
Показатели CCK-8 были нормированы относительно соответствующих значений через 0 ч для каждой экспериментальной группы. Нормированный сигнал CCK-8 увеличивался со временем как в клетках, трансдуцированных LV-NC, так и в клетках, трансдуцированных LV-miR-486-3p, однако при принудительной экспрессии miR-486-3p в целом наблюдались более низкие значения (Рисунок 5).
В клетках A549 сравнения с поправкой Шидака после двухфакторного дисперсионного анализа с повторными измерениями показали значимо более низкие сигналы CCK-8 в группе LV-miR-486-3p через 24, 48 и 96 ч по сравнению с группой LV-NC (p < 0.05), в то время как различие через 72 ч не было статистически значимым (Рисунок 5A). В клетках H358 сигнал CCK-8 был значимо ниже в группе LV-miR-486-3p через 24, 48, 72 и 96 ч (p < 0.05; Рисунок 5B). Эти результаты указывают на то, что принудительная экспрессия miR-486-3p снижала связанную с ростом метаболическую активность, при этом более выраженный и стабильный эффект наблюдался на протяжении всего временного курса в клетках H358.
Принудительная экспрессия miR-486-3p снижает клоногенный рост
Для оценки долгосрочного клоногенного роста были проведены анализы на формирование колоний. Клетки A549, трансдуцированные LV-miR-486-3p, образовали значительно меньше колоний, чем соответствующие клетки LV-NC (p = 0.013; Рисунок 6A). Значительное снижение количества колоний также наблюдалось в клетках H358 (p = 0.006; Рисунок 6B). Снижение было более выраженным в клетках H358, чем в клетках A549, что указывает на различие в величине клоногенного эффекта между двумя моделями LUAD.
Принудительная экспрессия miR-486-3p замедляет закрытие раны
Степень закрытия раны количественно оценивали через 24 ч, 48 ч и 72 ч после нанесения царапины (Рисунок 7). В культурах A549 в группе LV-miR-486-3p наблюдалось значимо более низкое закрытие раны по сравнению с группой LV-NC через 24, 48 и 72 ч (p < 0.05 для каждого сравнения; Рисунок 7A,C).
Аналогичным образом, закрытие раны было снижено в культурах H358, трансдуцированных LV-miR-486-3p, через 24 ч и 48 ч (p < 0,05) и через 72 ч (p < 0,01; Рисунок 7B,D). Поскольку анализ проводился без использования фармакологического ингибитора пролиферации, данные результаты были интерпретированы как замедление закрытия раны, а не как свидетельство исключительно миграционного эффекта.
Принудительная экспрессия miR-486-3p снижает прохождение через мембраны, покрытые Matrigel
Способность клеток проникать через мембраны Transwell, покрытые Matrigel, оценивали через 48 ч. В группе A549 LV-miR-486-3p на нижней поверхности мембраны было обнаружено значительно меньше окрашенных кристаллическим фиолетовым клеток, чем в группе A549 LV-NC (p = 0.0001; Рисунок 8A). Аналогичное снижение наблюдалось и в клетках H358 (p = 0.0007; Рисунок 8B).
Для каждого вкладыша было вычислено среднее значение по пяти микроскопическим полям, при этом вкладыш рассматривался как экспериментальная единица. Эти результаты демонстрируют снижение прохождения через мембраны, покрытые Matrigel, после принудительной экспрессии miR-486-3p в условиях, использованных в данном анализе.
ДОСТУПНОСТЬ ДАННЫХ:
Все исходные данные, лежащие в основе рисунков, представлены в Дополнительном файле 1, включая исходные файлы баз данных, данные RT-qPCR, необрезанные вестерн-блоттинги, значения денситометрии, микроскопические изображения, записи подсчета, результаты измерений CCK-8 и файлы статистического анализа.
Рисунок 1: Содержание miR-486-3p в образцах LUAD и нормальной ткани легкого из TCGA/starBase. Данные об экспрессии из TCGA были получены через starBase v3.0 в мае 2026 года и включали 512 образцов аденокарциномы легкого (LUAD) и 20 образцов нормальной ткани легкого. Группы сравнивали с помощью критерия суммы рангов Уилкоксона (p = 3,2 × 10⁻5). LUAD — аденокарцинома легкого. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Предсказанные с помощью TargetScan сайты связывания miR-486-3p в 3′ UTR генов DVL1 и WNT5B. Программа TargetScanHuman идентифицировала потенциальный сайт 7mer-m8 в позициях 468–474 3′-нетранслируемой области (3′ UTR) DVL1 и потенциальный сайт 8mer в позициях 913–920 3′ UTR WNT5B. Ссылки на источники приведены в Таблице 2. Данные вычислительные прогнозы использовались для формулирования гипотез и не являются экспериментальным доказательством прямого связывания. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3Базовый уровень экспрессии miR-486-3p и верификация лентивирусной гиперэкспрессии. (A) RT-qPCR анализ miR-486-3p содержание в клетках A549, H358 и Beas-2b, поддерживаемых в соответствующих стандартных культуральных средах. (B, C) Верификация методом ОТ-кПЦР (RT-qPCR) miR-486-3p оверэкспрессия в клетках A549 (B) и H358 (C) клетки, трансдуцированные LV-NC или LV-miR-486-3p. Экспрессия была нормализована по U6. Данные представлены как среднее значение ± SD по результатам трех независимых биологических экспериментов. (A) анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим проведением множественных сравнений с поправкой Тьюки. (B, C) были проанализированы с помощью двухстороннего непарного t-критерия Стьюдента t—тесты. *p < 0.01; **p < 0,001. LV-NC, негативный контроль лентивируса; RT-qPCR, количественная ПЦР с обратной транскрипцией; SD, стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4Принудительная экспрессия miR-486-3p связана со снижением экспрессии генов-кандидатов. (A) Репрезентативные вестерн-блоттинги, демонстрирующие содержание β-катенина, WNT5B, DVL1, BCL-2 и β-актина в клетках A549 и H358, трансдуцированных LV-NC или LV-miR-486-3p. Молекулярные массы указаны в килодальтонах. (B–E) Денситометрический количественный анализ β-катенина (B), WNT5B (C), DVL1 (D), и BCL-2 (Е), нормированных по β-актину. (F–I) анализ методом ОТ-кПЦР CTNNB1 (F), WNT5B (G), DVL1 (H), и BCL2 (I) обилие транскриптов, нормированное по GAPDHДанные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD) по результатам трех независимых биологических экспериментов; отдельные точки соответствуют независимым биологическим повторностям. Сравнение групп проводили с использованием двухстороннего непарного t-критерия Стьюдента t-тесты. Точные pЗначения p и кратность изменения указаны на соответствующих панелях. кДа, килодальтоны; LV-NC, лентивирус с отрицательным контролем; RT-qPCR, количественная ПЦР с обратной транскрипцией; SD, стандартное отклонение. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Принудительная экспрессия miR-486-3p снижает связанные с ростом сигналы CCK-8 с течением времени. Клетки A549 (A>) и H358 (B>), трансдуцированные LV-NC или LV-miR-486-3p, анализировали через 0 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч и 96 ч. Значения OD450 были нормированы по соответствующему значению в 0 ч внутри каждой группы. Данные представлены как среднее ± SD по трем независимым биологическим экспериментам. Эффекты воздействия, времени и взаимодействия воздействия и времени анализировали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с повторными измерениями, с последующим сравнением групп в каждой временной точке с поправкой по методу Šídák. *p < 0,05. CCK-8, набор для подсчета клеток 8; LV-NC, негативный контролирующий лентивирус; OD450, оптическая плотность при 450 nm; SD, стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6Принудительная экспрессия miR-486-3p снижает клоногенный рост. Представлены репрезентативные изображения всей лунки и количественные подсчеты колоний для A549 (A) и H358 (B) клетки, трансдуцированные LV-NC или LV-miR-486-3p. Количество колоний определяли с помощью программы ImageJ, используя идентичные настройки анализа для всех групп. Данные представлены в виде среднего значения ± SD по результатам трех независимых биологических экспериментов и анализировались с помощью двустороннего непарного t-критерия Стьюдента Пожалуйста, предоставьте текст для перевода.-тесты. Точные pЗначения p приведены на соответствующих панелях. LV-NC — негативный контроль лентивируса; SD — стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Принудительная экспрессия miR-486-3p замедляет закрытие раны. Представлены репрезентативные изображения и количественные измерения закрытия раны для клеток A549 (A,C) и H358 (B,D) через 0 ч, 24 ч, 48 ч и 72 ч после нанесения царапины. Степень закрытия раны рассчитывали следующим образом: (площадь раны через 0 ч − площадь раны в указанный момент времени) / площадь раны через 0 ч × 100%. Данные представлены как среднее значение ± SD по трем независимым биологическим экспериментам. Эффекты воздействия, времени и взаимодействия воздействия и времени анализировали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с повторными измерениями, с последующим сравнением групп в каждой временной точке с использованием поправки Шидака (Šídák). Масштабные отрезки, 200 µm. *p < 0.05; **p < 0.01. LV-NC, негативный контрольный лентивирус; SD, стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8Принудительная экспрессия miR-486-3p снижает прохождение через мембраны Transwell, покрытые Matrigel. Представлены репрезентативные микроскопические поля, окрашенные кристаллическим фиолетовым, и количественные показатели числа клеток на уровне вставок для A549 (A) и H358 (B) клетки, трансдуцированные LV-NC или LV-miR-486-3p. Вставки Transwell с порами размером 8-µm использовался размер пор. Для каждого вкладыша вычислялось среднее значение по пяти микроскопическим полям, при этом каждый вкладыш рассматривался как одна экспериментальная единица. Данные представлены в виде среднего значения ± SD по результатам трех независимых биологических экспериментов и анализировались с помощью двустороннего непарного t-критерия Стьюдента t-тесты. Масштабные отрезки, 200 µmТочный pЗначения p указаны на соответствующих панелях. LV-NC — негативный контроль лентивируса; SD — стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Ген | Последовательности праймеров | Длина ампликона | Эффективность амплификации | |
| WNT5B | Прямой: 5'-AAATGCCACGGCGTCTCG-3', | 118 bp | 101% | |
| Обратный: 5'-GGGTGAAGCGGCTGTTGA-3' | ||||
| DVL1 | Прямой: 5'-GAGGGTGCTCACTCGGATG-3', | 158 bp | 95.60% | |
| Обратный: 5'-GTGCCTGTCTCGTTGTCCA-3' | ||||
| CTNNB1 | Прямой: 5'- GCGCCATTTTAAGCCTCTCG -3', | 140 bp | 96.30% | |
| Обратный: 5'-AAATACCCTCAGGGGAACAGG-3' | ||||
| BCL2 | Прямой: 5'- GTCATGTGTGTGGAGAGCGT-3', | 139 bp | 97.20% | |
| Обратный: 5'-ATAGTTCCACAAAGGCATCC-3' | ||||
| GAPDH | Прямой: 5'-GACTTCAACAGCAACTCCCACTC-3', | 107 bp | 98.30% | |
| Обратный: 5'-TAGCCGTATTCATTGTCATACCAG-3' | ||||
Таблица 1: Последовательности праймеров, использованные для RT-qPCR.
| Мишень | Информация о прогнозировании | Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. | ||
| DVL1 | 7-мер-m8, позиции 468–474 | URL TargetScan (https://www.targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_80/view_gene.cgi? rs=ENST00000397196.2&taxid=9606&члены=miR-486-3p&показатьcnc=1& показаноc=1&показатель_нк=1&показаноcf1=1&показанcf2=1&подмножество=1) | ||
| WNT5B | 8-мер, позиции 913–920 | URL TargetScan (https://www.targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_80/view_gene.cgi? rs=ENST00000378891.5&taxid=9606&члены=miR-486-3p&показатьcnc=1& показанос=1&shownc_nc=1&показанcf1=1&показаноcf2=1&подмножество=1) | ||
Таблица 2: База данных TargetScan и соответствующий URL-адрес.
Дополнительный файл 1: Данные, подтверждающие результаты этого исследования.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Обсуждение
В настоящем исследовании по увеличению функции оценивалось влияние стабильной принудительной экспрессии miR-486-3p в клетках аденокарциномы легкого (LUAD) линий A549 и H358. В обеих моделях гиперэкспрессия miR-486-3p сопровождалась снижением сигналов CCK-8, связанных с ростом, уменьшением клоногенного роста, замедлением закрытия раны и меньшим количеством клеток, прошедших через мембраны Transwell с покрытием из Matrigel. Эти фенотипические изменения сопровождались снижением содержания белков WNT5B, DVL1, общего β-catenin и BCL-2, а также более низкими уровнями транскриптов WNT5B, DVL1, CTNNB1 и BCL2. В совокупности эти результаты подтверждают связь между принудительной экспрессией miR-486-3p, ослаблением нескольких фенотипов злокачественных клеток и скоординированными изменениями выбранных молекул, связанных с путем Wnt. Однако они не устанавливают прямого связывания миРНК с мишенью, активность сигнального пути или причинно-следственную последовательность сигнализации.
Общий опухолесупрессивный фенотип, наблюдаемый в данном исследовании, согласуется с предыдущими отчетами и не должен интерпретироваться как основной новый результат. Ранее Tomioka et al. продемонстрировали, что и miR-486-3p, и miR-486-5p подавляют злокачественные фенотипы в клетках LUAD, и идентифицировали GINS4 с помощью стратегии непредвзятого скрининга мишеней26. Вклад настоящего исследования носит более специфический характер: принудительная экспрессия miR-486-3p сопровождалась снижением содержания WNT5B, DVL1 и β-catenin в двух моделях клеток LUAD. Кроме того, в исследовании представлен комплексный экспериментальный рабочий процесс, сочетающий стабильную лентивирусную трансдукцию, RT-qPCR, вестерн-блоттинг, анализ CCK-8, определение способности к образованию колоний, анализ заживления ран и анализы в системе Transwell с покрытием из Matrigel. Это различие важно, поскольку настоящая работа расширяет молекулярные наблюдения, связанные с оверэкспрессией miR-486-3p, не претендуя на первую демонстрацию ее противоопухолевой активности при LUAD.
Результаты, касающиеся Wnt, требуют осторожной интерпретации. WNT5B обычно описывают как неканонический Wnt-лиганд, который может активировать сигнализацию полярности клеток (planar-cell-polarity) или Wnt/Ca2⁺ зависимым от рецептора и контекста образом. В некоторых клеточных условиях неканоническая Wnt-сигнализация может также выступать антагонистом β-catenin-зависимой сигнализации10,11. DVL1 является общим внутриклеточным медиатором, который может участвовать как в канонической, так и в неканонической Wnt-сигнализации, и он был связан с β-catenin-зависимыми фенотипами при немелкоклеточном раке легкого12. Следовательно, одновременное снижение уровней WNT5B, DVL1 и общего β-catenin не доказывает существование линейного пути WNT5B→DVL1→β-catenin. Полученные данные вместо этого указывают на сопутствующее снижение экспрессии WNT5B, а также содержания DVL1 и β-catenin после принудительной экспрессии miR-486-3p.
Результаты на уровне транскриптов были согласованны по направлению с данными вестерн-блоттинга. Принудительная экспрессия miR-486-3p приводила к снижению содержания транскриптов WNT5B, DVL1 и CTNNB1 как в клетках A549, так и в H358. Такое соответствие позволяет предположить, что наблюдаемые изменения белков могут сопровождаться изменением содержания транскриптов, а не быть следствием исключительно изменений стабильности белков. Тем не менее, снижение уровней транскриптов и белков не доказывает прямого связывания miR-486-3p с предсказанными 3′-нетранслируемыми областями. Для определения того, регулируются ли WNT5B или DVL1 напрямую с помощью miR-486-3p, потребовалось бы проведение двухлюциферазного репортерного анализа с использованием сайтов связывания дикого типа и мутантных форм, а также эксперименты по реверсии (rescue experiments). Аналогичным образом, снижение содержания BCL-2 указывает на изменение уровня белка, связанного с выживаемостью, но в отсутствие валидированных анализов клеточной смерти не может быть интерпретировано как доказательство усиления апоптоза.
Функциональные анализы также имеют свои специфические ограничения. CCK-8 измеряет метаболическую активность клеток, а не определяет количество клеток напрямую, и изменения абсорбции могут отражать изменения пролиферации, метаболизма или жизнеспособности. Определение колониеобразующей способности позволяет оценить клоногенный потенциал в долгосрочной перспективе, однако выраженность эффекта различалась для двух линий клеток: наблюдалось умеренное снижение в клетках A549 и более значительное снижение в клетках H358. Это различие позволяет предположить, что ответ на принудительную экспрессию miR-486-3p может зависеть от молекулярного и клеточного контекста.
В обеих клеточных линиях наблюдалось замедление закрытия раны, однако в ходе анализа ингибиторы пролиферации не использовались. Поскольку принудительная экспрессия miR-486-3p также повлияла на показатели роста, снижение пролиферации могло способствовать формированию фенотипа замедленного закрытия раны. Следовательно, полученные результаты следует интерпретировать как снижение скорости закрытия раны, а не как эффект, специфичный для миграции. Аналогично, на результаты 48-часового анализа в системе Transwell с покрытием из Matrigel могли повлиять различия в прохождении через мембрану, пролиферации, выживаемости или адгезии. Таким образом, наблюдаемое снижение количества клеток на нижней поверхности мембраны подтверждает нарушение прохождения при протестированных условиях, но не позволяет выделить конкретный механизм инвазии.
Дополнительным аспектом является степень гиперэкспрессии miR-486-3p. Лентивирусная трансдукция увеличила содержание miR-486-3p примерно в 1 470 раз в клетках A549 и в 220 раз в клетках H358 по сравнению с соответствующими контрольными группами. Такая супрафизиологическая экспрессия может усилить зависимую от сид-последовательности нецелевую репрессию, повлиять на доступность компонентов РНК-индуцированного комплекса сайленсинга или вызвать неспецифический клеточный стресс. Поскольку серия экспериментов по изучению зависимости «доза-эффект» не проводилась, связь между уровнем miR-486-3p и наблюдаемыми фенотипами определить не удалось. Кроме того, отсутствие экспериментов по потере функции с использованием ингибиторов не позволяет сделать выводы об эндогенной физиологической роли miR-486-3p в клетках LUAD. Таким образом, полученные результаты следует интерпретировать конкретно как последствия стабильной принудительной гиперэкспрессии.
Следует учитывать ряд ограничений. Были исследованы только две линии клеток LUAD с мутацией KRAS, а использование различных стандартных сред ограничивает интерпретацию сравнений с клетками Beas-2b. В ходе исследования не проводились аутентификация клеточных линий и тестирование на микоплазму, а в качестве единственного референса для количественного определения miR-486-3p использовалась U6. В исследовании также отсутствовали анализы с потерей функции, анализы доза-эффект, репортерные анализы, эксперименты по спасению (rescue) и функциональные анализы Wnt-пути. Кроме того, на результаты заживления раны и анализа в системе Transwell могли повлиять различия в пролиферации, жизнеспособности или адгезии. Наконец, в работу не были включены модели на животных, образцы пациентов или клинические валидационные когорты. Таким образом, полученные результаты ограничены данной системой с принудительной экспрессией in vitro и не устанавливают прямого таргетинга, причинно-следственной связи в сигнальном пути или клинической значимости.
В заключение, стабильная принудительная экспрессия miR-486-3p привела к снижению ряда показателей роста и подвижности в клетках LUAD линий A549 и H358, что сопровождалось снижением экспрессии WNT5B, DVL1, общего β-catenin и BCL-2. Эти результаты создают основу для дальнейшего изучения механизмов, однако не доказывают, что WNT5B или DVL1 являются прямыми мишенями, не подтверждают наличие линейного пути WNT5B/DVL1/β-catenin и не определяют клиническую значимость miR-486-3p.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Данное исследование получило финансовую поддержку в рамках Плана медицинской и санитарной науки и техники провинции Чжэцзян (2025KY349) и программы ключевых поддерживаемых дисциплин города Цзясин (2023-zc-014).
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1 M Tris-HCl (pH 6.8) | Solarbio | T1020 | Приготовление концентрирующего геля для SDS-PAGE |
| 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) | Solarbio | T1010 | Приготовление разделяющего геля для SDS-PAGE |
| 20× TBS буфер | Solarbio | 71080 | Стоковый буфер для промывки при вестерн-блоттинге и разведения антител |
| 30% раствор акриламида/бис-акриламида (29:1) | Solarbio | A1010 | Приготовление гелей для SDS-PAGE |
| 4% параформальдегидный фиксатор | Servicebio | G1101 | Фиксация для тестов на колониеобразование и в камерах Transwell |
| 5× буфер для нанесения белков | Beyotime | P0015 | Подготовка белковых образцов для SDS-PAGE |
| Персульфат аммония | Solarbio | 427A038 | Инициатор полимеризации геля для SDS-PAGE |
| Набор для определения концентрации белка BCA | Beyotime | P0009-1 | Определение концентрации белка |
| Антитело к BCL-2 | Boster Biological Technology | A00040-2 | Кроличьи поликлональные антитела; вестерн-блоттинг в разведении 1:5,000 |
| Набор для подсчета клеток-8 (CCK-8) | TargetMol | C0005 | Анализ метаболической активности, связанной с ростом клеток; 10 μL на 100 μL культуральной среды |
| Система хемилюминесцентной визуализации | Bio-Rad | ChemiDoc MP | Визуализация результатов вестерн-блоттинга |
| Хлороформ | Servicebio | G3005 | Разделение фаз при экстракции РНК с помощью TRIzol |
| Раствор для окрашивания кристаллическим фиолетовым | Servicebio | G1014 | Окрашивание колоний и мембран Transwell |
| DMEM | Servicebio | G4511 | Стандартная культуральная среда для клеток Beas-2b |
| Антитело к DVL1 | Signalway Antibody | 53180 | Кроличьи первичные антитела; вестерн-блоттинг в разведении 1:5,000 |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Biosharp | BL203B | Добавка 10% (v/v) для стандартного культивирования клеток; 20% (v/v) в нижней камере Transwell |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | Version 8 | Построение графиков и статистический анализ |
| Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) | Yeasen Biotechnology | 11201ES08 | Количественная ПЦР с использованием SYBR Green |
| Hifair III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix для qPCR (gDNA digester plus) | Yeasen Biotechnology | 11141ES60 | Обратная транскрипция для RT-qPCR мРНК |
| IBM SPSS Statistics | IBM | Version 22.0 | Статистический анализ |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.53 | Денситометрия вестерн-блоттов, измерение площади раны, подсчет колоний и клеток в камерах Transwell |
| Инвертированный микроскоп | Olympus | CKX53 | Визуализация тестов на заживление ран и в камерах Transwell |
| Изопропанол | Servicebio | G3006 | Осаждение РНК при экстракции с помощью TRIzol |
| Лентивирусные препараты LV-miR-486-3p и LV-NC | GenePharma | Custom synthesis | Вектор для стабильной сверхэкспрессии miR-486-3p и вектор отрицательного контроля со скремблированной последовательностью |
| Матрикс базальной мембраны Matrigel | Corning | 354234 | Разведен 1:8 в среде DMEM без сыворотки; конечная концентрация белка приблизительно 1 mg/mL |
| Метанол | Xilong Scientific | GB/T 683-2006 | Активация ПВДФ-мембран |
| Микропланшетный ридер | BioTek | ELx800 | Измерение абсорбции при 450 nm |
| Микрообъемный УФ-Вид спектрофотометр | Allsheng | Nano-600 | Определение концентрации РНК и оценка чистоты по соотношению A260/A280 |
| Пенициллин-стрептомицин | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Добавка 1% (v/v) для стандартного культивирования клеток |
| Фосфатно-солевой буфер (PBS) | Servicebio | G0002 | Промывка клеток и мембран |
| Коктейль ингибиторов протеаз | APExBIO | K1007 | Добавляется в лизирующий буфер RIPA |
| Маркер молекулярной массы белков | Biosharp | BL712A | Эталон молекулярной массы для вестерн-блоттинга |
| ПВДФ-мембрана | Millipore | K2MA8350E | Мембрана для переноса белков при вестерн-блоттинге |
| Система ПЦР в реальном времени QuantStudio 5 | Thermo Fisher Scientific | QuantStudio 5 | Сбор данных RT-qPCR |
| Лизирующий буфер RIPA | Beyotime | P0013B | Экстракция общего клеточного белка |
| Реагент для экстракции РНК (типа TRIzol) | Servicebio | G3013 | Экстракция общей РНК |
| Среда RPMI 1640 | Servicebio | G4510 | Стандартная культуральная среда для клеток A549 и H358, а также безсывороточная суспензия клеток для Transwell |
| SDS | Solarbio | S8010 | Реагент для SDS-PAGE |
| Обезжиренное молоко в порошке | BD | 2271470 | 5% блокирующий раствор для вестерн-блоттинга |
| StarBase v3.0 | Sun Yat-sen University | https://rnasysu.com/encori/ | Анализ экспрессии miR-486-3p на основе данных TCGA |
| TargetScanHuman | Whitehead Institute for Biomedical Research | https://www.targetscan.org/vert_80/ | Предсказание потенциальных сайтов связывания miR-486-3p |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T8090 | Катализатор полимеризации геля для SDS-PAGE |
| Вставки Transwell, 24-луночные, размер пор 8 μm | Corning | 3428 | Анализ прохождения через мембрану, покрытую Matrigel |
| Трипсин | Servicebio | G4000 | Открепление клеток |
| Tween-20 | Solarbio | 815A043 | Приготовление промывочного буфера для вестерн-блоттинга |
| Система вертикального электрофореза | Liuyi Biotechnology | DYCZ-24DN | Разделение белков методом SDS-PAGE |
| Люминольный реагент-субстрат HRP для вестерн-блоттинга | Affinity Biosciences | KF001 | Хемилюминесцентная детекция при вестерн-блоттинге |
| Система «мокрого» переноса | Bio-Rad | 1703930 | Перенос белков на ПВДФ-мембрану |
| Антитело к WNT5B | Signalway Antibody | 56808 | Кроличьи первичные антитела; вестерн-блоттинг в разведении 1:5,000 |
| Антитело к β-актину | Abcam | ab8227 | Контроль нагрузки; вестерн-блоттинг в разведении 1:5,000 |
| Антитело к β-катенину | Signalway Antibody | 21725 | Кроличьи первичные антитела; вестерн-блоттинг в разведении 1:5,000 |
Ссылки
- Herbst RS, Heymach JV, Lippman SM. Lung cancer. N Engl J Med. 2008;359(13):1367-1380.
- Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2019. CA Cancer J Clin. 2019;69(1):7-34.
- Han B, et al. Cancer incidence and mortality in China, 2022. J Natl Cancer Cent. 2024;4(1):47-53.
- Lin JJ, et al. Five-year survival in EGFR-mutant metastatic lung adenocarcinoma treated with EGFR-TKIs. J Thorac Oncol. 2016;11(4):556-565.
- She J, Yang P, Hong Q, Bai C. Lung cancer in China: challenges and interventions. Chest. 2013;143(4):1117-1126.
- Barker N, Clevers H. Mining the Wnt pathway for cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 2006;5(12):997-1014.
- Komiya Y, Habas R. Wnt signal transduction pathways. Organogenesis. 2008;4(2):68-75.
- Stewart DJ. Wnt signaling pathway in non-small cell lung cancer. J Natl Cancer Inst. 2014;106(1):djt356.
- Zhang Z, et al. Wnt/β-catenin signaling in the development and therapeutic resistance of non-small cell lung cancer. J Transl Med. 2024;22(1):565.
- Zhang Q, et al. WNT5B exerts oncogenic effects and is negatively regulated by miR-5587-3p in lung adenocarcinoma progression. Oncogene. 2020;39(7):1484-1497.
- Suthon S, et al. WNT5B in physiology and disease. Front Cell Dev Biol. 2021;9:667581.
- Ji H, et al. SPATA2 suppresses epithelial-mesenchymal transition to inhibit metastasis and radiotherapy sensitivity in non-small cell lung cancer via. impairing DVL1/β-catenin signaling. Thorac Cancer. 2023;14(11):969-982.
- Wang Y, Wang L, Chen C, Chu X. New insights into the regulatory role of microRNA in tumor angiogenesis and clinical implications. Mol Cancer. 2018;17(1):22.
- Iqbal MA, Arora S, Prakasam G, Calin GA, Syed MA. MicroRNA in lung cancer: role, mechanisms, pathways and therapeutic relevance. Mol Aspects Med. 2019;70:3-20.
- Lee YS, Dutta A. MicroRNAs in cancer. Annu Rev Pathol. 2009;4:199-227.
- Lin G, et al. MiR-26a enhances invasive capacity by suppressing GSK3β in human lung cancer cells. Exp Cell Res. 2017;352(2):364-374.
- Jiang W, et al. MicroRNA-1258 suppresses tumor progression via. GRB2/Ras/Erk pathway in non-small-cell lung cancer. Cell Prolif. 2018;51(6):e12502.
- Xie Y, Xue C, Guo S, Yang L. MicroRNA-520a suppresses pathogenesis and progression of non-small-cell lung cancer through targeting the RRM2/Wnt axis. Anal Cell Pathol (Amst). 2021;2021:9652420.
- Peng Y, Zhang X, Feng X, Fan X, Jin Z. The crosstalk between microRNAs and the Wnt/β-catenin signaling pathway in cancer. Oncotarget. 2017;8(8):14089-14106.
- Wang X, et al. MiR-214 inhibits cell growth in hepatocellular carcinoma through suppression of β-catenin. Biochem Biophys Res Commun. 2012;428(4):525-531.
- Lulli V, et al. MicroRNA-486-3p regulates γ-globin expression in human erythroid cells by directly modulating BCL11A. PLoS One. 2013;8(4):e60436.
- Chou ST, et al. MicroRNA-486-3p functions as a tumor suppressor in oral cancer by targeting DDR1. J Exp Clin Cancer Res. 2019;38(1):281.
- Wu H, et al. Overexpression of miR-486-3p promoted by allicin enhances temozolomide sensitivity in glioblastoma via. targeting MGMT. Neuromolecular Med. 2020;22(3):359-369.
- Garajei A, et al. Evaluation of the expression of miR-486-3p, miR-548-3p, miR-561-5p and miR-509-5p in tumor biopsies of patients with oral squamous cell carcinoma. Pathogens. 2022;11(2):211.
- Li X, et al. MicroRNA-486-3p promotes the proliferation and metastasis of cutaneous squamous cell carcinoma by suppressing flotillin-2. J Dermatol Sci. 2022;105(1):18-26.
- Tomioka Y, et al. The molecular pathogenesis of tumor-suppressive miR-486-5p and miR-486-3p target genes: GINS4 facilitates aggressiveness in lung adenocarcinoma. Cancers (Basel). 2023;15(13):3408.