Выделение, очистка и характеристика функциональных митохондрий, полученных из скелетных мышей мышиных мышей, для трансплантации митохондрий

Summary

Был разработан стандартизированный протокол, объединяющий расщепление трипсина и дифференциальную центрифугу для выделения, очистки и функциональной характеристики митохондрий из скелетных мышец, а также для оценки их применения в митохондриальной трансплантации.

Abstract

Митохондрии — это важные органеллы, регулирующие энергетический обмен, передачу сигналов и клеточный гомеостаз в эукариотических клетках. Дисфункция митохондрий способствует патогенезу множества заболеваний и способствовала развитию трансплантации митохондрий как регенеративной терапевтической стратегии. Успешное применение митохондриальной трансплантации зависит от наличия высокоочищенных и функционально целых митохондрий. Скелетная мышца является подходящим источником донора благодаря высокому содержанию митохондрий, метаболической активности и доступности. В этом исследовании был установлен стандартизированный, воспроизводимый протокол для выделения, очистки и характеристики функциональных митохондрий из скелетных мышц мыши и оценено их применение в митохондриальной трансплантации. Процедура состояла из двух основных этапов. Сначала митохондрии были выделены из скелетной мышцы мышей C57BL/6 с помощью переваривания трипсина, а затем дифференциальной центрифугирования. Во-вторых, были охарактеризованы изолированные митохондрии для оценки чистоты, ультраструктуры и функциональной активности. Чистота митохондрий оценивалась с помощью количественного определения белков бицинхониновой кислоты (BCA) и анализа западных блотов. Ультраструктурная целостность была исследована с помощью трансмиссионной электронной микроскопии. Функциональная активность оценивалась с помощью маркировки JC-1 и митохондриальной флуоресцентной маркировки, а также измерения потребления кислорода, производственной способности АТФ и соотношения контроля дыхания с использованием системы высокоразрешающей респирометрии. Изолированные митохондрии демонстрировали сохранившийся потенциал мембраны, целостную ультраструктуру и стабильную дыхательную активность, что указывает на пригодность для дальнейших функциональных исследований и применения митохондриальных трансплантаций.

Introduction

Митохондрии являются основными участками образования аденозинтрифосфата (АТФ) и играют центральную роль в апоптозе, гомеостазе кальция и метаболизме реактивных кислородных форм (ROS). Функциональная целостность митохондрий критически важна для поддержания клеточного гомеостаза и определения судьбы клетки ^1,2. Нарушение митохондрий, включая мутации митохондриальной ДНК (мтДНК) и нарушения цепи транспорта электронов (ETC), приводят к нарушению энергетического обмена, окислительному стрессу и нарушению^{апоптоза 3,4}. Эти аномалии связаны с широким спектром заболеваний, включая наследственные митохондриальные нарушения, нейродегенеративные заболевания и сердечно-сосудистые^{заболевания 5,6}. Традиционные терапевтические методы для дисфункции митохондрий, такие как антиоксиданты и метаболические кофакторы, обычно обеспечивают ограниченную эффективность, поскольку они облегчают симптомы без прямого восстановления функции митохондрий ^7,8. В результате митохондриальная трансплантация стала перспективным терапевтическим подходом в регенеративной медицине. Эта стратегия предполагает доставку целых экзогенных митохондрий в повреждённые или дисфункциональные клетки для восстановления активности митохондрий и метаболизма энергии клетки ^9,10. Предыдущие исследования показали, что экзогенные митохондрии могут быть интернализированы реципиентными клетками и интегрированы в эндогенную митохондриальную сеть, что приводит к улучшению биоэнергетической функции и увеличению выживаемости^клеток 11,12,13.

Скелетная мышца считается подходящим донором для изоляции митохондрий из-за высокого содержания митохондрий, метаболической активности и^{доступности} 14,15,16. Трансплантация митохондрий требует нескольких ключевых этапов, включая выделение митохондрий, очистку, функциональную характеристику и эффективную доставку в клетки реципиента. Тем не менее, среди протоколов, опубликованных на сегодняшний день, сохраняется значительная методологическая вариативность, особенно в процедурах, связанных с гомогенизацией тканей, ферментативным пищеварением, контролем температуры и очисткой. Такая вариабельность может влиять на выход митохондрий, чистоту и функциональную целостность, тем самым ограничивая воспроизводимость экспериментов.

Для улучшения методологической согласованности и воспроизводимости в этом исследовании представлен стандартизированный протокол выделения и характеристики функциональных митохондрий скелетной мыши с использованием переваривания трипсинов и дифференциальной центрифуга. Изолированные митохондрии оценивались на чистоту, ультраструктурную целостность и функциональную активность с помощью количественной оценки белков бицинхониновой кислоты (BCA), вестерн-блотинга, трансмиссионной электронной микроскопии, анализов мембранного потенциала на основе флуоресценции и высокоразрешающей респирометрии. Кроме того, было оценено поглощение изолированных митохондрий клетками-реципиентами для оценки их пригодности для трансплантации митохондрий. Этот протокол обеспечивает воспроизводимый рабочий процесс для получения функциональных митохондрий, полученных из скелетных мышц, для дальнейших экспериментальных исследований.

Protocol

Все эксперименты на животных проводились в специализированном помещении без патогенов (SPF) и были одобрены Комитетом по этике и использованию животных Третьего аффилированного госпиталя Медицинского университета ВВС (Номер одобрения: IACUC-2024kq-065).

Самцы мышей C57BL/6 (6-8 недель, вес 18-20 г) были приобретены в Центре лабораторных животных Медицинского университета ВВС (производственная лицензия: SCXK (Шэньси) 2024-002). Мыши содержались в индивидуально вентилируемых клетках (IVC) при положительном давлении и чистых условиях, с температурой 20-26 °C, относительной влажностью 40%-70%, 12-часовым циклом светло-тёмный и не менее 15 сменами воздуха в час. Обеспечивались стерилизованное питание, питьевой вода и обогащение окружающей среды.

Реагенты, химикаты и экспериментальные приборы, используемые в протоколе, перечислены в Таблице материалов.

1. Жертвоприношение животных и сбор тканей

1. Поместите мышь в герметичную камеру для эвтаназии и проведите эвтаназия постепенным вдыханием углекислого газа (CO₂), объем камеры 30%–70% в минуту.
2. Подтвердить смерть путём прекращения спонтанного дыхания и сердечного ритма, потери зрачковых рефлексов и отсутствия реакции на механическую стимуляцию.
3. Погрузите эвтаназированных мышей C57BL/6 в 75% этанол на 5 минут для дезинфекции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать фиксации тканей, вызванной алкоголем, и повреждения клеток, ограничьте время погружения до 10 минут. Используйте свежие ткани на протяжении всего протокола, так как замораживание снижает жизнеспособность митохондрий и функциональную целостность.
4. Поместите мышь в стерильную чашку Петри внутри ламинарного капюшона с животом, обращённым вверх, чтобы полностью обнажать брюшную и заднюю части конечностей.
5. Поднимите кожу нижней части живота возле генитальной области с помощью щипцов и сделайте небольшой разрез. Проведите тупую диссекцию, чтобы отделить кожу от подлежащей ткани. Протяните разрез вверх вдоль средней линии к голеностопу и латерально к обеим задним конечностям, чтобы полностью обнажать мышечные группы задних конечностей.
6. Определите мышцу квадрицепса бедра на передней части бедра и аккуратно разделите мышцу вдоль направления мышечных волокон с помощью тупой диссекции. Перерезать дистальную надколенную связку и проксимальное сухожилие, чтобы полностью изолировать мышечную ткань.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Промывайте ткань три раза в предварительно охлаждённом фосфат-буферном физиологическом растворе (PBS), дополненном 2% пенициллин-стрептомицином, используя свежую чашку Петри для каждой мытья, чтобы минимизировать загрязнение.
7. Немедленно поместите изолированную мышечную ткань в предварительно охлаждённый PBS и тщательно прополоскайте, чтобы удалить волосы и кровь с поверхности ткани.
8. Аккуратно промокните лишнюю влагу с ткани стерильной марлей. Разделите ткань на микроцентрифугные пробирки объёмом 1,5 мл и взвесьте образцы. Используйте примерно 100 мг ткани на образец для поддержания консистенции между препаратами.

2. Измельчение тканей и гомогенизация

1. Поместите микроцентрифугную трубку, содержащую ткань из шага 1.8 , на лёд. Измельчите ткань на мелкие фрагменты размером примерно 1–2^{мм 3} с помощью стерильных ножниц.
2. Добавьте 8 томов предварительно охлаждённого трипсина 0,25% и переварите фрагменты ткани на льду в течение 15 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рассчитайте требуемый объём трипсина в зависимости от массы ткани (1 мг ≈ 1 мкл). Например, добавьте 640 мкл 0,25% трипсина к 80 мг ткани.
3. Центрифугуйте смесь при 1 000 × г в течение 5 минут при 4 °C. Отбросьте супернатант и оставьте тканевую гранулу. Ресуспензировать гранулу в предварительно охлаждённом митохондриальном изоляционном буфере объемом 1 мл, содержащем D-маннитол (215 мМ), сахарозу (75 мМ), HEPES (20 мМ), EGTA (1 мМ) и безжирнокислотный бычий сывороточный альбумин (0,5% w/v).
4. Перенесите подвеску в стеклянный гомогенизатор, поддерживаемый на льду. Унифицируйте ткань с помощью 10-12 плавных движений вверх-вниз, пока подвеска не станет мутной.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте вращения стеклянного пестика в бок внизу гомогенизатора, так как чрезмерная механическая нагрузка может повредить мембраны митохондрий и ухудшить их функцию.

3. Дифференциальная центрифугирование

1. Переместите гомогенат в микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл и центрифугуйте при 1000 × г в течение 5 минут при 4 °C.
2. Перенесите супернатант в свежую микроцентрифугную трубку объемом 1,5 мл и центрифугуйте при 12 000 × г в течение 5 минут при 4 °C, чтобы получить примитивную митохондриальную гранулу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно собирайте супернатант с помощью шприца объёмом 1 мл, избегая нарушения гранулы и остатков тканей.

4. Очистка и хранение митохондрий

1. Аккуратно суспензируйте природную митохондриальную гранулу в предварительно охлаждённом буфере, содержащем сахарозу (250 мМ), HEPES (10 мМ, pH 7,4), EGTA (1 мМ) и бычий альбумин в сыворотке крупного рогатого рогатого скота (0,15% в/в). Центрифугуйте подвеску при 1 000 × г в течение 5 минут при 4 °C.
2. Перенесите супернатант в свежую центрифугную трубку и центрифугу при 12 000 × г на 10 минут при 4 °C, чтобы получить очищенную митохондриальную гранулу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте свежеизолированные митохондрии немедленно, когда это возможно. Краткосрочное хранение при 4 °C или длительное хранение при −80 °C в митохондриальном буфере, содержащем сахарозу (0,25 м), Tris-MOPS (10 мМ, pH 7,4) и EGTA (0,1 мМ) осуществим. Однако замораживание может нарушать ферментативную активность митохондрий и дыхательные функции. Используйте замороженные образцы преимущественно для анализа белков.

5. Митохондриальная и цитозольная экстракция белков и количественная оценка BCA

1. Извлечение митохондриального белка
   1. Суспензировать очищенную митохондриальную гранулу в 50 мкл буфера лизиса RIPA на 100 мг начальной ткани и инкубировать суспензию на льду в течение 15 минут.
   2. Центрифугуйте лизат при примерно 14 000 × г в течение 15 минут при 4 °C. Переместить супернатант в свежую микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл, чтобы получить долю митохондриального белка.
2. Экстракция цитозольного белка
   1. Центрифугайте цитозольный супернатант, полученный на шаге 4.2 при 12 000 × г в течение 15 минут при 4 °C. Отбросьте супернатант и оставьте гранулу как обогащённую цитозольную фракцию.
   2. Суспензировать цитозольную гранулу в 50 мкл буфера лизиса RIPA и обработать образец как описано в шагах 5.1.1-5.1.2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте лизисный буфер свежим с ингибиторами протеазы и выполняйте все процедуры на льду, чтобы минимизировать разрушение белка. Митохондрии, используемые на этом этапе, могут быть как свежими, так и замороженными.
3. Количественная оценка белков BCA
   1. Подготовьте рабочий раствор BCA, смешивая реагент A и реагент B в соотношении 50:1 (v/v). Добавьте 200 мкл рабочего раствора в каждую скважину пластины с 96 лунками.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте рабочий раствор BCA непосредственно перед использованием и используйте его в течение 1 часа при комнатной температуре.
   2. Разведите стандартный раствор бычьей сыворотки альбумина (BSA) до 0,5 мг/мл и держите раствор на льду до применения.
   3. Подготовьте стандартную кривую, добавив 20, 19, 18, 16, 12, 8, 4 или 0 мкл раствора BSA в отдельные скважины. Отрегулируйте итоговый объём до 20 мкл с помощью раствора NaCl.
   4. Добавьте 4 мкл митохондриального белка и 16 мкл раствора NaCl в один набор колодцев. Добавьте 4 мкл цитозольного белка и 16 мкл раствора NaCl в другой набор колодц.
   5. Добавьте 200 мкл рабочего раствора BCA в каждую скважину и инкубуйте пластину при 37 °C в темноте в течение 30 минут. Измерьте поглощение при 562 нм с помощью считывателя микропластин.
   6. Постройте стандартную кривую белка с коэффициентом корреляции (R²) ≥ 0,999. Вычислите концентрации белков (мкг/мкл) путём интерполяции значений поглощения из стандартной кривой.

6. Оценка чистоты митохондрий, происходящих из скелетных мышц

1. Разведите митохондриальные и цитозольные образцы белка до конечной концентрации 1,5 мкг/мкл. Приготовьте реакционные смеси объемом 20 мкл, содержащие 30 мкг белка и 4 буфера × нагрузки. Регулируйте оставшуюся громкость с помощью раствора NaCl. Пробуждайте образцы на 10 минут и храните при −80 °C до использования.
2. Разделяйте образцы белка с помощью 4%-20% градиентных сборных гелей. Проведите электрофорез при 140-150 В в течение 50 минут.
3. Активировать мембрану PVDF (0,22 мкм) в метаноле на 1 минуту. Переносите белки с помощью буфера быстрого переноса при 400 мА в течение 30 минут.
4. Снимите мембрану PVDF из сэндвича для переноса и помойте её в TBST в течение 5 минут. Заблокируйте мембрану 5% обезжиренным молоком комнатной температуры на 1 час с аккуратным встряхиванием.
5. Разбавьте первичные антитела (COX IV, цитохром c, β-актин) в буфере разбавления антител в соотношении 1:1 000. Инкубировать мембрану первичными антителами за ночь при 4 °C.
6. Промывайте мембрану три раза с помощью TBST по 10 минут за одну стирку.
7. Инкубировать мембрану вторичным антителом, разбавлённым в размере 1:10 000 при комнатной температуре в течение 1 часа.
8. Промой мембрану три раза с помощью TBST по 10 минут каждая. Проявите пятно и захватите изображения.

7. Окрашивание митохондрий скелетных мышц MitoTracker

1. Разведите рабочий раствор для окрашивания до конечной концентрации 200 нМ в предварительно нагретой среде непосредственно перед использованием.
2. Суспензировать митохондриальную гранулу в 100 мкл рабочего раствора и инкубировать при 37 °C в темноте в течение 20 минут.
3. Добавьте пять томов предварительно охлаждённого буфера хранения после инкубации. Центрифугуйте суспензию при 12 000 × г в течение 10 минут при 4 °C и уберите супернатант с несвязанным красителем.
4. Перенесите аликвот окрашенной митохондриальной суспензии на стеклянный слайд и накройте образец накрывшим слоем.
5. Захват флуоресцентных изображений с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа с соответствующими настройками возбуждения и излучения для обнаружения красных флуоресцентных митохондриальных красителей.

8. Оценка потенциала мембраны митохондрий с использованием окрашивания JC-1

1. Группа лечения CCCP (карбонилцианид m-хлорфенилгидразона)
   1. Обрабатывайте митохондриальную суспензию CCCP при конечной концентрации 10 мкм и инкубируемые в течение 20 минут для рассеивания потенциала мембраны митохондрий.
   2. Инкубировать обработанную CCCP митохондриальную суспензию с 250 мкл раствора окрашивания JC-1 при 37 °C в течение 20 минут с мягким перемешиванием.
2. Группа лечения JC-1
   1. Суспензировать митохондриальную гранулу в 100 мкл рабочего раствора JC-1 и инкубировать при 37 °C в течение 20 минут, защищённых от света.
   2. Подготовьте 1× буфер для окрашивания JC-1, разбавляя раствор 5× дистиллированной воды в соотношении 2:8 (v/v) и держите буфер на льду.
   3. Удалите раствор для окрашивания и дважды промой митохондриальную гранулу с предварительно ох×лаждённым буфером JC-1 JC-1.
   4. Суспензируйте окрашенные митохондрии в PBS и сфотографируйте их с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Используйте соответствующие настройки возбуждения и излучения для обнаружения зелёных флуоресцентных мономеров JC-1 и агрегатов красного флуоресцентного JC-1.

9. Ультраструктурный анализ изолированных митохондрий скелетных мышц с помощью трансмиссионной электронной микроскопии

1. Зафиксируйте только что выделенные митохондрии в 2,5% глутаральдегиде, приготовленном в буфере фосфатов 0,2 М (pH 7,4), и инкубировать образцы ночью при 4 °C.
2. Промыйте образцы солевым раствором с буфером фосфата 0,1 млн (PBS, pH 7,4) и постфиксируйте образцы в тетроксиде осмия 1% в течение 1 часа при комнатной температуре.
3. Сушить образцы через серию градуированного этанола, затем инфильтрацию, встраивание и полимеризацию в эпоксидную смолу.
4. Разрезать вложенные образцы толщиной 50-70 нм с помощью ультрамикротома.
5. Двойное окрашивание срезов уранилацетатом и свинцовым цитратом. Наблюдайте и снимите образцы с помощью прозрачного электронного микроскопа.

10. Клеточное поглощение митохондрий, происходящих из скелетных мышц

1. Клон NCTC Culture 929 (L929; RRID: CVCL_0462) клетки, полученные у коммерческого поставщика в полной среде, содержащей MEM Alpha, дополненных 10% сывороткой плода и 1% пенициллин-стрептомицином.
2. Когда слияние ячеек достигает 80%-90%, аспирируете среду и дважды промывайте клетки предварительно нагретым PBS. Добавьте трипсин-ЭДТА и инкубуйте до тех пор, пока клетки не отсоединятся.
3. Добавьте полную среду, чтобы прекратить пищеварение и получить суспензию с помощью мягкой пипетки. Центрифугуйте подвеску при 1000 × г в течение 5 минут и уберите супернатант.
4. Суспензируйте клеточную гранулу в свежей полной среде и засеяйте клетки в новые культурные чаши с нужной плотностью. Инкубировать клетки при 37 °C в увлажнённой атмосфере, содержащей 5% CO₂.
5. Пропустите 5 клеток (P5) семян в чашу с стеклянным дном шириной 35 мм и выращивайте клетки на ночь.
6. Маркируйте изолированные митохондрии специфическим для митохондрий красным флуоресцентным красителем при температуре 37 °C в темноте на 20 минут и промыйте митохондрии PBS, чтобы удалить несвязанные красители.
7. Добавьте в клетки митохондрии, маркированные красителем красителем (20 мкг митохондриального белка на блюдо) и инкубируемые в течение 24 часов при 37 °C в увлажнённой атмосфере с содержанием 5% CO₂.
8. Окрашьте клетки флуоресцентным актиновым зондом в течение 30 минут, чтобы визуализировать актиновый цитоскелет, а ядра контрокрашивайте флуоресцентным ядерным красителем.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно контролируйте концентрацию сыворотки во время совместной инкубации, так как избыток сыворотки может снизить эффективность поглощения митохондриями. Митохондрии, используемые на этом этапе, свежие.

11. Измерение функции дыхания митохондрий с помощью высокоразрешающей респирометрии

1. Подготовка инструментов
   1. Очистите дыхательные камеры, электродные отсеки и пробки.
   2. Вставьте в каждую камеру магнитную перемешивающую планку и проверьте целостность кислородной электродной мембраны.
2. Калибровка приборов
   1. Добавьте 2,1 мл буфера для митохондриального дыхания (MiR05, pH 7,10) в каждую дыхательную камеру и убедитесь, что нет воздушных пузырьков.
   2. Уравновесить систему высокоразрешающей респирометрии при 37 °C в течение 30 минут и выполнить ежедневную калибровку воздуха после стабилизации базового уровня кислорода.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте введения пузырьков воздуха в дыхательные камеры, так как они мешают сигналам кислородных электродов и ухудшают качество данных. Митохондрии, используемые на этом этапе, свежие.
3. Загрузка и уравновесление выборок
   1. Добавьте свежеизолированные митохондрии с примерно 30 мкг белка в дыхательную камеру и герметизируйте камеру.
   2. Уравновесьте камеру на 5-8 минут и зафиксируйте базальное потребление кислорода.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраняйте митохондрии на льду и проводите измерения дыхания сразу после изоляции для поддержания активности.
4. Протокол SUIT
   1. Добавьте 5 мкл пирувата (2 м), 10 мкл глутамата (2 м) и 10 мкл малата (400 мм) последовательно. Стабилизируйте реакцию на 5 минут и зафиксируйте дыхание с утечкой CI.
   2. Добавьте 10 мкл ADP (500 мМ) для индуцирования окислительного фосфорилирования и фиксации CI OXPHOS дыхания. Добавьте 10 мкл хлорида магния (0,3 м).
   3. Добавьте 20 мкл сукцината (1 м) и зафиксируйте дыхание CI+CII OXPHOS после стабилизации.
   4. Добавьте 2 мкл ингибитора синтазы АТФ (0,01 мМ) и зафиксируйте дыхание через утечку протонов.
   5. Добавляйте CCCP (1 мМ) постепенно в три добавления по 2 мкл с интервалом в 2 минуты, пока потребление кислорода не достигнет плато. Зафиксировать максимальную ёмкость системы переноса электронов.
   6. Добавьте 1 мкл ротенона (1 мМ) для подавления активности комплекса I.
   7. Добавьте 1 мкл антимицина A (5 мМ) для ингибирования активности комплекса III и фиксации остаточного потребления кислорода.
   8. Добавьте 5 мкл аскорбата (800 мМ) и 5 мкл N,N,N',N'-тетраметил-p-фенилендиамин (200 мМ). Зафиксировать максимальную комплексную внутривенную дыхательную активность после стабилизации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аликвотируйте все реагенты перед заморозкой, чтобы избежать повторяющихся циклов заморозки и оттаивания. Добавляйте CCCP постепенно, так как чрезмерное разъединение подавляет митохондриальное дыхание.
5. Анализ данных
   1. Получите параметры митохондриального дыхания, включая CI утечку, CI OXPHOS, CI+CII OXPHOS, CI+CII утечку, CI+CII ET, CII ET и CIV, с помощью программного обеспечения для анализа данных.
   2. Рассчитайте коэффициент контроля дыхания (RCR; Дыхание состояния 3/дыхания состояния 4) и производственной мощности АТФ. Сохраняйте все значения до трёх значимых для статистического анализа. Программное обеспечение для анализа данных использовалось Oroboros Datlab 8 (Oroboros Instruments).

Results

Схематический обзор процесса изоляции и очистки митохондрий приведён на рисунке 1. Все процедуры проводились при 4 °C для сохранения целостности митохондрий и функциональной активности. Свежеизолированная скелетная мышечная ткань была измельчена и переварена трипсином для облегчения диссоциации тканей, затем гомогенизирована в изотоническом изоляционном буфере с помощью стеклянного гомогенизатора. Впоследствии была проведена дифференциальная центрифугировка для отделения митохондрий от тканевых остатков и цитозольных загрязнителей. Первоначальное центрифугирование при 1 000 × г удалила ядра и крупный мусор, тогда как последующее центрифугирование при 12 000 × г дало примитивную митохондриальную гранулу. Дополнительные этапы промывки и центрифугирования дополнительно снизили цитозольное загрязнение, что позволило получить очищенные митохондрии, пригодные для структурного и функционального анализа в последующих направлениях (см. рисунок 1).

Рисунок 1: Схематическая схема изоляции и очистки митохондрий. Митохондрии высокой чистоты были выделены с помощью комбинированного подхода контролируемого расщепления трипсинов и дифференциального центрифуга. Все процедуры проводились при 4 °C для сохранения структурной и функциональной целостности митохондрий. Недавно выделенная скелетная мышечная ткань подвергалась ферментативному перевариванию, гомогенизации и последовательным этапам центрифугирования для получения очищенных митохондрий, подходящих для дальнейших функциональных и структурных анализов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Функциональная активность изолированных митохондрий оценивалась с помощью окрашивания JC-1 и флуоресцентного митохондриального маркирования (рисунок 2). Окрашивание JC-1 показало сильную красную флуоресценцию в свежевыделенных митохондриях при базальных условиях, что свидетельствует о сохранении потенциала мембраны митохондрии. После обработки карбонилцианидом m-хлорфенилгидразоном (CCCP) флуоресценция красной флуоресценции снизилась, а зелёная флуоресценция увеличилась, что соответствует деполяризации митохондриальных мембран. Эти данные подтвердили, что изолированные митохондрии сохраняют чувствительность мембранного потенциала и остаются функционально активными после изоляции. Флуоресцентная маркировка дополнительно показала, что митохондрии выглядели как дискретные, равномерно распределенные пунктатные структуры по всему полю, без явной агрегации или осадка красителей. Низкая фоновая флуоресценция и равномерный рисунок окрашивания свидетельствовали о сохранении целостности митохондрий и мембранного потенциала после изоляции.

Рисунок 2: Характеристика функциональной активности изолированных митохондрий. (A) Оценка потенциала мембраны митохондрий с помощью окрашивания JC-1. Очищенные митохондрии окрашивались JC-1 и наблюдались под флуоресцентной микроскопией. В контрольной группе митохондрий были обнаружены отчетливые красные флуоресцентные агрегаты, что указывает на сохранение потенциала мембраны митохондрий. После обработки разъединителем CCCP флуоресценция преимущественно сместилась в сторону зелёных мономеров JC-1, что указывает на деполяризацию мембраны и коллапс мембранного потенциала (шкала = 50 мкм). (B) Митохондриальная флуоресцентная маркировка очищенных митохондрий. Флуоресцентно маркированные митохондрии выглядели как рассеянные, пунктатные структуры без очевидной агрегации и с минимальной фоновой флуоресценцией, что указывает на сохранение целостности митохондрий и стабильный потенциал мембраны (шкала = 100 мкм). (C) Количественный анализ коэффициентов интенсивности флуоресценции JC-1 в различных группах после окрашивания JC-1. Данные представлены как среднее ± SEM (n = 3). Статистическая значимость анализировалась с помощью непарного t-теста (****P < 0,0001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Ультраструктурная целостность изолированных митохондрий была изучена с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (см. рисунок 3). Визуализация с низким увеличением выявила очищенные митохондрии с преимущественно овальной морфологией, тогда как при высоком увеличении были выявлены целостные внешние мембраны и чётко очерченные структуры кристаллов. Явных отёков, разрывов или структурных повреждений не наблюдалось. Для количественной оценки были проанализированы пять случайно выбранных полей с примерно 40-60 митохондрий на поле. Эти наблюдения показали, что процедура изоляции эффективно сохраняет ультраструктуру митохондрий и формирует митохондрии, подходящие для дальнейших функциональных исследований.

Рисунок 3: Ультраструктурная целостность изолированных митохондрий скелетных мышц, оцениваемая с помощью трансмиссионной электронной микроскопии. (Слева) Репрезентативное изображение TEM при низком увеличении (4 000×; шкала = 2 мкм), показывающее очищенные митохондрии с преимущественно овальной морфологией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

(Справа) Изображение TEM с большим увеличением (40 000×; масштабная полоса = 200 нм), демонстрирующее гладкие и непрерывные наружные мембраны митохондрий и чётко очерченные структуры кристаллов. Жёлтые стрелки указывают на целые наружные митохондриальные мембраны, а белые — хорошо организованные митохондриальные кресты. Не было обнаружено признаков отёка, разрыва или структурных повреждений. Были проанализированы пять случайно выбранных полей, содержащих примерно 40-60 митохондрий на поле. Эти результаты показывают, что протокол изоляции сохранял целостность митохондрий и обеспечивал надёжную структурную основу для дальнейших функциональных анализов.

Урожайность и чистота митохондрий были впоследствии оценены с помощью количественной оценки белков и иммуноблотного анализа (рисунок 4). Сравнение методов переваривания трипсина (TD) и обычной экстракции (NE) показало, что метод TD давал примерно 2,3-2,4 мкг митохондриального белка на мг ткани, тогда как метод NE — примерно 1,7-1,8 мкг/мг ткани. Анализ иммуноблот показал сильное обогащение митохондриальных маркеров, цитохром c оксидазы и COX IV в митохондриальных фракциях с минимальным обнаружением в цитозольных фракциях. В отличие от этого, цитозольный маркер β-актин демонстрировал лишь слабые сигналы в митохондриальных фракциях, что указывало на ограниченное цитозольное загрязнение. Сравнение групп TD и NE показало, что прудение трипсина улучшает выход и чистоту митохондрий. В совокупности эти результаты показали, что протокол генерирует митохондрии, подходящие для молекулярных и функциональных анализов в дальнейшем процессе.

Рисунок 4: Сравнение выхода и чистоты очищенных митохондрий. (A) Сравнение выхода митохондриального белка на единицу массы ткани, полученного с помощью методов трипсинового расщепления (TD) и нормальной экстракции (NE). Группа TD дала примерно 2,3-2,4 мкг/мг ткани, тогда как группа NE — примерно 1,7-1,8 мкг/мг. Данные представлены как среднее ± SEM (n = 3). Статистическая значимость анализировалась с помощью непарного t-теста (*P < 0,05). (B) Иммуноблотный анализ митохондриальных и цитозольных маркерных белков в митохондриальных фракциях, выделенных методами TD и NE. (C-D) Количественный анализ белков митохондриальных маркеров цитохром c оксидазы и COX IV. Митохондриальные маркеры были сильно обогащены митохондриальными фракциями, но показали минимальную экспрессию в цитозольных фракциях. Цитозольный маркер β-актин проявил лишь слабую экспрессию в митохондриальных фракциях, что свидетельствует об эффективном удалении цитозольных загрязнителей. По сравнению с группой NE, группа TD показала улучшенную чистоту митохондрий. Данные представлены как среднее ± SEM (n = 3). Статистическая значимость анализировалась с помощью непарного t-теста (*P < 0,05; **P < 0,01). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Для дальнейшей оценки дыхательной функции митохондрий потребление кислорода измерялось с помощью высокоразрешающей респирометрии (рисунок 5). Митохондрии, выделенные методом TD, имели значения респираторного контроля (RCR) примерно 9-10, тогда как митохондрии, выделенные методом NE, имели значения RCR примерно 8-9. Поскольку значения RCR выше 4 обычно считаются показателем сохраняемой респираторной активности митохондрий, эти результаты показали, что митохондрии, изолированные с помощью обоих методов, сохраняют функциональную целостность. Более высокие значения RCR, наблюдаемые в группе TD, свидетельствовали о лучшем сохранении функции дыхания митохондрий по сравнению с группой NE. Эффективность биохимического взаимодействия также оценивалась с помощью уравнения 1 − (частота дыхания через утечку/скорость переноса электронов), при этом значения, приближающиеся к 1, указывали на более плотную дыхающую связь и более эффективное производство АТФ. Обе группы демонстрировали эффективность взаимодействия, приближающуюся к 1, что свидетельствует о сохранении биоэнергетической функции митохондрий после выделения.

Рисунок 5: Анализ дыхательной функции в очищенных митохондриях. (A) Сравнение соотношения респираторного контроля митохондрий (RCR) между группами пищеварения трипсина (TD) и нормальной экстракции (NE). Значения RCR в обеих группах превышали 4, что свидетельствует о сохранении респираторной активности митохондрий после изоляции. Группа TD показала немного более высокие значения RCR, чем группа NE, что свидетельствует о лучшем сохранении дыхательной функции. Данные представлены как среднее ± SEM (n = 3). Статистическая значимость анализировалась с помощью непарного t-теста (**P < 0,01). (B) Сравнение эффективности биохимического взаимодействия митохондрий и способности синтеза АТФ между группами TD и NE. Значения эффективности взаимодействия приблизились к 1 в обеих группах, что указывает на высокосвязанное дыхание и эффективное выработку АТФ. Данные представлены как среднее ± SEM (n = 3). Статистическая значимость анализировалась с помощью непарного t-теста (*P < 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Поглощение изолированных митохондрий клетками-реципиентами оценивалось с использованием клеток L929 (см. рисунок 6). Клетки были совместно инкубированы с митохондриями скелетных мышц, маркированных красителями, а цитоскелет актина визуализировался с помощью флуоресцентного актинового зонда. Конфокальная микроскопия выявила пунктатные красные флуоресцентные структуры, распределённые по цитоплазме, что указывает на то, что клетки L929 заняли экзогенные митохондрии. Количественный анализ показал временно-зависимое увеличение поглощения митохондриями через 12, 24 и 48 часов. Однако между 24 и 48 часами наблюдалось лишь незначительное увеличение, что свидетельствует о том, что эффективность поглощения приблизилась к насыщению после 24 часа. Кроме того, клетки реципиента L929 демонстрировали повышенный митохондриальный потенциал мембраны после поглощения митохондриями, что указывает на улучшение функции митохондрий. Эти результаты показали, что митохондрии, полученные из скелетных мышц, выделенные с помощью этого протокола, могут быть эффективно интернализированы клетками-реципиентами при сохранении функциональной активности.

Рисунок 6: Клеточное поглощение скелетных мышечных митохондрий клетками L929. (A) Поглощение очищенных митохондрий клетками L929 в разное время инкубации (12 ч, 24 и 48 ч). Митохондрии с флуоресцентными красителями (красные) были обнаружены в цитоплазме реципиентных клеток, а для визуализации актинового цитоскелета использовалось окрашивание фаллоидином (зелёный). Ядерное окрашивание проводилось с использованием DAPI (синего цвета). Конфокальная микроскопия подтвердила интернализацию экзогенных митохондрий клетками L929 (шкала = 50 мкм). (B) Количественный анализ эффективности поглощения митохондрий клетками L929 в разные временные моменты. (C) Анализ окрашивания JC-1 потенциала мембраны митохондрий в клетках L929 после поглощения митохондрий, полученных скелетными мышцами. (D) Количественный анализ соотношения флуоресценции агрегата JC-1 к мономеру в клетках реципиента L929 после поглощения митохондриями. Потенциал мембраны митохондрий значительно увеличился после интернализации активных митохондрий, происходящих из скелетных мышц. Данные представлены как среднее ± SEM (n = 3). Статистическая значимость анализировалась с помощью одностороннего ANOVA (*P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

Трансплантация митохондрий — это новая стратегия в клеточной терапии и регенеративной медицине, которая восстанавливает физиологическую функцию в клетках с нарушенным энергетическим обменом через доставку функционально целых митохондрий. Помимо регулирования метаболизма клеточной энергии, эта техника может модулировать ключевые биологические процессы, такие как апоптоз и окислительный стресс, предоставляя тем самым новые терапевтические возможности для различных заболеваний 4,17,18,19. Тем не менее, клиническая трансляция трансплантации митохондрий по-прежнему сталкивается с рядом проблем, среди которых отсутствие стандартизированных, эффективных и воспроизводимых протоколов изоляции митохондрий, что остаётся основным узким местом.

Для решения этой проблемы в данном исследовании был создан стандартизированный и визуализированный экспериментальный протокол на основе дифференциальной центрифугирования для эффективной изоляции функциональных свободных митохондрий из скелетной мышцы C57BL/6. Оптимизируя процедуру очистки и включая этапы предварительного переваривания, промывки и очистки трипсина, этот метод эффективно улучшает диссоциацию тканей, сохраняет целостность митохондрий и снижает загрязнение от нецелевых клеточных компонентов.

Предлагаемый протокол обеспечивает благоприятный баланс между чистотой митохондрий и выходом. По сравнению с традиционными методами экстракции на основе помола, нынешний метод быстрее, практичнее и экономичнее, что делает его подходящим для рутинных лабораторных применений и подготовки донорских митохондрий. Существующие методы изоляции митохондрий имеют определённые ограничения. Например, центрифугирование с градиентом плотности и очистка иммуноаффинности могут достигать более высокой чистоты, но требуют много времени и затрат, тогда как методы на основе наномасштабных зондов остаются недостаточно развитыми для рутинного^{использования 20,21}. Для плотных тканей, таких как скелетные мышцы, оптимизированный этап предварительного переваривания трипсина (0,25% трипсина при 37 °C в течение 10–15 минут), в сочетании с мягкой гомогенизацией, лучше сохраняет целостность митохондрии, чем обычное дифференциальное центрифугирование отдельно.

В этом исследовании коммерчески доступный комплект для дифференциальной центрифугировки использовался при низких температурах на протяжении всей процедуры и в соответствии со стандартизированным рабочим процессом, что позволило быстро собирать структурно целые митохондрии. Для устранения потенциальных проблем, возникающих в процессе экстракции, включая низкую выдержку, загрязнение белками и аномальный потенциал мембран, предлагаются различные стратегии устранения неполадок.

Низкая митохондрийная выходность обычно вызвана недостаточной гомогенизацией, недостаточным количеством ткани или центробежной потерей. Эти проблемы можно минимизировать, обеспечив достаточное предварительное переваривание, проведение мягкой гомогенизации (10-15 проходов с использованием плотно прилегающего гомогенизатора), использование не менее 100-150 мг свежей скелетной мышечной ткани, строгий контроль условий центрифугации (1 000 × г для удаления мусора и 10 000–12 000 г × для митохондриального гранулирования) и повторное суспендирование образцов с помощью ширококалиберных наконечников пипеток. Загрязнение белками в основном происходит из-за неполного удаления мусора или липидных помех; Поэтому рекомендуется повторить этап центрифугации на 1 000 × г, включить два дополнительных шага промывания по 12 000 × г и аккуратно удалять жировую ткань. Аномальный потенциал мембраны митохондрий часто связан с механическими повреждениями или колебаниями температуры. Поэтому следует избегать чрезмерной гомогенизации, вся процедура должна проводиться на льду и завершаться в течение 60–90 минут, а изоляционные буферы должны дополняться EGTA и 0,5% BSA. Неполная гомогенизация может быть улучшена за счёт обеспечения достаточного ферментативного переваривания, выбора подходящего гомогенизатора и проведения фильтрации после гомогенизации.

Хотя текущий протокол значительно повышает эффективность и чистоту изоляции митохондрий, остаются некоторые ограничения. Во-первых, процедура сильно зависит от свежести тканей; В идеале образцы тканей должны быть обработаны в течение 1 часа после смерти. Во-вторых, остаточный трипсин может разрушать поверхностные белки митохондрии, включая связанные с транслоказами, если его недостаточно удалять во время промывания, что потенциально влияет на эффективность поглощения клеток. В-третьих, время хранения митохондрий остаётся ограниченным, поскольку длительное хранение при 4 °C или криоконсервация существенно снижает активность митохондрий.

На трансляционном уровне остаются дополнительные задачи, включая повышение эффективности доставки in vivo , понимание долгосрочных механизмов интеграции митохондрий и уточнение возможных взаимодействий между трансплантированными митохондриями и геномом хозяина. С постоянным развитием технологий изоляции и очистки митохондрий ожидается, что дальнейшие методологические инновации ускорят клиническую трансляцию терапии митохондриальной трансплантации.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Cytochrome C antibody	Abcam	EPR1327	Митохондриальная характеристика
Anti-fade mounting medium	PlantChemMed	PC-90016	Снижение фотоотбеливания флуоресцентных красителей
BCA Protein Assay Kit	Zhonghui Hecai Biotechnology Co., Ltd.	PQ003	Анализ концентрации белка
Beta-actin antibody	Cell Signaling technology	3700s	Антитител к бета-актину использовался для обнаружения чистоты изолированных митохондрий
BSA	Sigma	A6003	Во время изоляции связывает свободные жирные кислоты для защиты активности митохондрий.
Centrifuge	Eppendorf	5418R	Центрифугирование при 4 °C
CCCP	Solarbio	C6700	Для разрыва связи между окислительным фосфорилированием митохондрий и индукции максимальной утечек протонов
Confocal Laser Scanning Microscope	Olympus Corporation	FV4000	Наблюдение иммунофлюоресцентного окрашивания
COX IV polyclonal antibody	Proteintech	11242-1-AP	Митохондриальная характеристика
DAPI	Plant Chem Medicine	PC-90004	Для контр-окрашивания ядер
D-mannitol	Solarbio	IM00402	Поддержание осмотического баланса и предотвращение набухания митохондрий во время изоляции
EGTA	Sigma	E4378	Часто используется в буферах для изоляции митохондрий, чтобы защитить функции митохондрий, специфически связывая Ca2+
Fetal bovine serum	Every Green	11011-08611	Культура клеток L929
Forceps	RWD Life Science Co., Ltd.	F11003-11	Используется для захвата, удержания и подъема тканей
Glass homogenizer	Beyotime	FGH005	Используется для гомогенизации тканей и изоляции митохондрий
Glutaraldehyde	LEAGENE	DF0151	Быстро фиксирует и стабилизирует ультраструктуру клеток путем сшивания белков, предотвращая автолиз, чтобы сохранить естественную морфологию органоидов.
HEPES	Thermo Fisher	J67485	Обеспечивает стабильную среду pH.
Incubator	Thermo Fisher	51032874	Культура клеток L929
JC-1	Solarbio	M8650	Обнаружение изменений в мембранном потенциале очищенных митохондрий.
L929 cell line	Procell	CL-0137	Для анализа эндоцитоза митохондрий
Lead citrate	Sigma	15326	Для окрашивания ультратонких секций для наблюдения тонкой субклеточной структуры.
MEM Alpha basic (1x)	Gibco	6125510	Культура клеток L929
Methanol	Fuyu Chemical (China)	67-56-1	В качестве компонента буфера переноса используется для удаления SDS и облегчения переноса белков из геля на твердофазную мембрану.
Microplate Reader	Thermo Fisher	Varioskan LUX	Измерение поглощения митохондрий, окрашенных JC-1
Mitochondrial Membrane Potential Detection Kit	Solarbio	M8650	Обнаружение потенциала митохондриальных мембран в скелетных мышцах
Mitochondrial isolation Buffer	Solarbio	SM0020	Наборы для извлечения на основе дифференциальной центрифугации
Mitochondria Storage Buffer	Solarbio	SM0020	Для сохранения митохондрий
Mito Tracker Red CMXRos	Yeasen Biotechnology	40741ES50	Митохондриальная характеристика
MOPS	MedChemExpress	HY-D0859	Как буфер в приготовлении раствора
Multi-rAb HRP-Goat Anti-Mouse Recombinant Secondary Antibody (H+L)	Proteintech	RGAM001	RGAM001 нацелен на IgG мыши (H+L) в Western blot
Multi-rAb HRP-Goat Anti-Rabbit Recombinant Secondary Antibody (H+L)	Proteintech	RGAR001	RGAR001 нацелен на IgG кролика (H+L) в ELISA и Western blot
Non-fat dry milk	NCM Biotech	WB6503	В основном используется как блокирующий агент для снижения фонового сигнала путем занятия неспецифических связывающих сайтов на мембране.
O2k-FluoRespirometer	Oroboros Instruments	O2K	Определение митохондриальных функций дыхания и метаболизма кислорода.
Osmium tetroxide	Sigma	75633	или постофиксация для сохранения липидов и улучшения контраста мембран в образцах ТЭМ.
PBS (1x)	Plant Chem Medicine	PC-00003	Очистка мышечной ткани
Penicillin-Streptomycin	Procell	PB180120	Культура клеток L929
Phalloidin-488	Beyotime	C1035	Метка цитоскелетного F-актина для флуоресцентной микроскопической визуализации
Polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane	Millipore (Merck)	IPVH00010	Вестерн блотинг
PowerPac Basic	BIO-RAD	164-5050	Для разделения белков методом электрофореза SDS-PAGE
Precast gradient polyacrylamide gel (4–12%)	ACE Bioscience	ET12412LGel	Используется для разделения SDS-PAGE митохондриальных и клеточных белков