Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Исследовательская статья

Защитный эффект LNCRNA FGD5-AS1 против повреждений мозга после внутримозгового кровоизлияния с целью нацеливания на miR-93-5p

93 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71556

⸱

4 августа 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Emergency Medicine, Nanjing Drum Tower Hospital, The Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School, 2Department of Neurology, Jianli People's Hospital, 3Department of Rehabilitation Medicine, Ganzhou People's Hospital, 4Department of Nephrology and Endocrinology, Ganzhou Fifth People's Hospital, 5Department of Neurosurgery, Langfang People's Hospital

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этом исследовании изучалось взаимодействие между FGD5-AS1 и miR-93-5p в экспериментальных моделях внутримозговых кровоизлияний и было обнаружено, что снижение FGD5-AS1 связано с уменьшением неврологических повреждений, воспаления и окислительного стресса.

Аннотация

Внутримозговое кровоизлияние (ИХГ) — это неврологическое заболевание, связанное с высокой смертностью и инвалидностью, которое может привести к тяжёлым неврологическим повреждениям. В данном исследовании изучалась роль и основной механизм FGD5-AS1 при НК. Были установлены модели ICH in vitro и in vivo . Для измерения экспрессии FGD5-AS1 и miR-93-5p использовалась обратная транскрипционно-количественная полимеразная цепная реакция (RT-qPCR). Неврологические дефициты оценивались с помощью модифицированной системы неврологической тяжести (mNSS), а церебральный отёк оценивался с помощью метода сухо-влажного веса. Ферментно-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA) использовался для измерения воспалительных цитокинов и маркеров окислительного стресса. Жизнеспособность клеток оценивалась с помощью набора для анализа жизнеспособности клетки и пролиферации. Взаимодействие между FGD5-AS1 и miR-93-5p было изучено с помощью двухлюциферазных репортерных тестов и корреляционного анализа Пирсона. Экспериментальный НГГ сопровождался повышенной экспрессией FGD5-AS1 как на животных, так и у клеточных моделей. Подавление FGD5-AS1 облегчило отёк мозга, улучшило неврологическую работоспособность, снизило воспалительные и окислительные повреждения, а также увеличило выживаемость эндотелиальных клеток. Ингибирование miR-93-5p ослабляло эти защитные эффекты, поддерживая регулирующее взаимодействие между двумя молекулами. FGD5-AS1 негативно регулировал экспрессию miR-93-5p, а ингибирование miR-93-5p ослабляло эффекты, наблюдаемые после снижения FGD5-AS1. Эти результаты свидетельствуют о том, что FGD5-AS1 может способствовать повреждению мозга, связанному с ICH, через регуляцию miR-93-5p, а ось FGD5-AS1/miR-93-5p может стать потенциальной целью для дальнейших исследований в экспериментальных ICH.

Введение

Внутримозговое кровоизлияние (ИХГ) — это неврологическое заболевание с высокой смертностью и инвалидностью, которое составляет от 10% до 20% всех случаевинсульта 1,2. Из-за отсутствия эффективных терапевтических целей лечение НГ в настоящее время ограничено хирургическим вмешательством и поддерживающейпомощью. Пиньо и соавторы подтвердили прогнозы смертности от НК, функциональных исходов и доли роста гематомы, предоставив новый взгляд длямедицинских работников 4. Несмотря на прогресс в лечении НГ, результаты для пациентов остаются плохими. Поэтому выявление новых терапевтических целей для НГГ важно для улучшения долгосрочного прогноза.

Длинные некодируемые РНК (lncRNAs) составляют класс некодируемых белками транскриптов длиной более 200 нуклеотидов, которые регулируют экспрессию генов с помощью различных механизмов, включая транскрипционные, посттранскрипционные и эпигенетическиепроцессы 5. Накопленные данные показали, что аномальная экспрессия LNCRNA участвует в патогенезе ряда неврологических заболеваний, таких как инсульт, травматическое повреждение мозга, внутримозговое кровоизлияние (ИХГ) и субарахноидальноекровоизлияние 6. Среди этих регулирующих молекул FGD5-AS1 связан с несколькими клеточными процессами, включая пролиферацию, апоптоз, воспалительные сигналы и ответы на окислительный стресс. С помощью таких механизмов, как конкурирующая эндогенная активность РНК, транскрипционная регуляция и эпигенетическая модификация, FGD5-AS1 влияет на экспрессию нескольких следующих мишеней. Нарушение экспрессии FGD5-AS1 сообщалось при различных патологических состояниях, включая злокачественные опухоли, сердечно-сосудистые заболевания и метаболическиезаболевания 7,8,9,10,11. Тем не менее, его биологическое значение при неврологических заболеваниях остаётся неполностью изученным. Предыдущие исследования показали, что FGD5-AS1 участвует в прогрессировании глиомы и глиобластомы12,13 и способствует повреждению нейронов при условиях дефицита кислорода/глюкозы 14. Эти наблюдения свидетельствуют о том, что FGD5-AS1 может играть регуляторную роль при нейронных повреждениях; однако его вклад в повреждение мозга после НГГ до конца не раскрыт.

МикроРНК (миРНК) — это короткие некодирующие РНК, которые регулируют экспрессию генов через взаимодействие с комплементарными последовательностями внутри целевых мессенджерныхРНК 15. Исследования показали, что миРНК также играют важную роль в НК. В частности, miR-143-3p способствует трансэндотелиальной миграции нейтрофилов после острого повреждения мозга, нацеливаясь наATP6V1A 16. miR-195-5p оказывает защитное действие против повреждений мозга, вызванного НКГ, подавляя экспрессию MMP-9 и MMP-217. MiR-93-5p также был выявлен как терапевтическая мишень для улучшения результатов послеICH 18. Хотя исследования подтвердили аномальную экспрессию FGD5-AS1 и miR-93-5p при НКВ и их участие в прогрессировании неврологических нарушений после ИХ, предыдущие исследования в основном сосредотачивались на их индивидуальных биологических эффектах. Конкурентная регуляторная связь между FGD5-AS1 и miR-93-5p как эндогенными РНК пока не установлена чётко.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Экспериментальные животные

Это исследование было одобрено Комитетом по этике животных Народной больницы Ганьчжоу (Одобрение No 20230789) и проведено в строгом соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных. В этом исследовании использовались самки SD-крыс класса SPF (6–8 недель, вес 180–230 г). Крыс содержались с свободным доступом к еде и воде при контролируемых условиях 22 °C ± 3 °C и 12-часовом цикле свет/тьма. Животным позволили привыкнуть в течение 7 дней перед экспериментом. Химикаты, реагенты и оборудование, используемые в протоколе, перечислены в Таблице материалов.

2. Создание модели ICH in vivo

Для создания экспериментальной модели внутримозгового кровоизлияния (ICH) растворили 0,23 U коллагеназы типа VII в 1 мкл стерильной физиологической физиологической жидкости. Крыс подвергались анестезии внутрибрюшническому пентобарбиталу натрия (50 мг/кг), после чего раствор коллагеназы стереотаксически вводили в стриатум со скоростью 0,5 мкл/мин (0,2 мм за лобной точкой, 3,0 мм латерально от средней линии и 6 мм глубины в поверхность черепа). Животные в контрольной группе прошли ту же процедуру, но получили одинаковое количество физиологического физиологического раствора вместо коллагеназы. Схематический обзор экспериментального дизайна приведён в дополнительном рисунке 1.

Дополнительный рисунок 1: Схема проектирования экспериментов на животных. Крысы были случайным образом разделены на две группы: одна группа использовала коллагеназу типа VII 0,23U для построения модели ICH; Одна группа использовала физиологический физиологический раствор в качестве контрольной группы. Модельные группы крыс были случайным образом разделены на две партии для анализа роли FGD5-AS1 в ICH и синергетического эффекта оси FGD5-AS1/miR-93-5p. Через час после индукции ИХК реагент трансфекции был введён в мозг крысы. Оценить неврологическую функцию крыс с помощью mNSS на днях 0, 1, 3 и 7; Собирайте мозговую ткань после индуцирования ИХС в течение 7 дней. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Крыс случайным образом разделили на две группы. Одна группа была использована для анализа роли FGD5-AS1 в НК, а затем была разделена на четыре подгруппы: контрольные, ICH, ICH + лентивирус (LV)-shNC и ICH + LV-shFGD5-AS1. Другая группа использовалась для анализа синергетических эффектов оси FGD5-AS1/miR-93-5p и была разделена на пять подгрупп: ICH, ICH + LV-shNC, ICH + LV-shFGD5-AS1, ICH + LV-shFGD5-AS1 + антагомир NC и ICH + LV-shFGD5-AS1 + miR-93-5p антагомир. В каждой группе было по 12 крыс. Через 1 час после индукции ИХК реагент для трансфекции был введён в мозг крысы в дозе 2 мг/кг.

3. Культивирование и обработка клеток

Микроваскулярные эндотелиальные клетки мозга (BMEC) служат ключевой моделью для изучения гематоэнцефалического барьера, механизмов, лежащих в основе неврологических заболеваний, и доставкилекарств 20. Модель in vitro ICH была создана с использованием лечения кислородно-глюкозного дефицита (OGD)/гемина в BMEC3. BMEC культивировали в безглюкозно- и сывороточном DMEM в газовой смеси 5%CO2 и 95%N2 в течение 10 минут. Клетки затем обработали гемином (10 мкм) и перемещали в анаэробную камеру с 5%CO2 и 95%N2 в течение 2 часа. ОГД прекращался путём возвращения клеток к нормальным условиям культуры. Контрольная группа проходила лечение с помощью PBS при тех же условиях.

Клетки были трансфектированы согласно инструкции производителя. Клетки были трансфектированы 20 нМ сиРНК FGD5-AS1 (si-FGD5-AS1), отрицательным контрольным siRNA (si-NC), ингибитором miR-93-5p или ингибитором контроля пустых элементов (ингибитор NC).

4. Модифицированный тест на неврологическую тяжесть

После установления модели in vivo ICH неврологическая функция оценивалась с использованием модифицированной шкалы неврологической тяжести (mNSS) на днях 0, 1, 3 и 7. Оценки количественно оценивались по четырём областям: моторная функция, сенсорная функция, равновесие и рефлекторная функция. Оценки 1–4 указывали на лёгкое нарушение, 5–9 — на умеренное, а 10–14 — на тяжёлое нарушение.

5. Сбор образцов

Через 7 дней после индукции НКВ крысам анестезировали внутрибрюшинной инъекцией 50 мг/кг пентобарбитала натрия, после чего следовала эвтаназия через вывих шейки матки и сбор мозговой ткани.

6. Оценка церебрального отёка

Церебральный отёк оценивался с помощью метода сухо-влажноговеса 19. Мозг взвешивался сразу после извлечения, чтобы получить влажный вес. Затем ткань сушили в духовке при температуре 100 °C в течение 24 часов и снова взвешивали для получения сухого веса. Содержание воды в тканях рассчитывалось следующим образом:

[(влажный вес - сухой вес) / мокрый вес] × 100%

7. Количественная ПЦР в реальном времени

Общая РНК была выделена из образцов тканей и клеток с помощью реагента для экстракции РНК согласно протоколу производителя. Впоследствии комплементарная ДНК была синтезирована с помощью комплекта обратной транскрипции. Затем был проведён количественный ПЦР-анализ с использованием платформы ПЦР в реальном времени, где GAPDH и U6 выступали в качестве эндогенных эталонных генов. Протокол усиления включал начальный этап денатурации при 95 °C в течение 10 минут, затем 40 циклов денатурации при 95 °C в течение 15 секунд и отжига/расширения при 60 °C в течение 60 с. Относительные уровни экспрессии генов рассчитывались с помощью метода 2−ΔΔCt . Последовательности праймеров, используемые в этом исследовании, приведены в Дополнительной таблице 1.

Дополнительная таблица 1: Праймерные последовательности и связанные с ними последовательности реагентов, использованные в данном исследовании. Последовательности, участвующие в экспериментах с qPCR в реальном времени, и соответствующие последовательности реагентов, используемых in vitro экспериментами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

8. Анализ клеточной пролиферации

Трансфектированные клетки были засеяны в пластины с 96 колодцами. После культивирования на 0, 24, 48 и 72 часа в каждую скважину добавлялось по 10 мкл реагента CCK-8. Клетки инкубировали при 37 °C в течение 2 часа, а оптическая плотность измерялась на 450 нм с помощью считывателя микропластин.

9. Анализ репортеров с двойной люциферазой

Дикие (WT) и мутантные (MUT) 3′-UTR FGD5-AS1, содержащие сайт связывания miR-93-5p, были клонированы в pGL3-вектор. Вектор был котрансфектирован с мимиком miR-93-5p с использованием трансфекционного реагента. Относительная активность люциферазы измерялась с помощью двойной репортерской системы.

10. Ферментно-связанный иммуносорбентный анализ

Образцы мозговой ткани (20–50 мг) были гомогенизированы в ледяной буфере RIPA при соотношении ткани к буферу 1:9. После гомогенизации образцы были центрифугированы при 12 000 × г в течение 20 минут при 4 °C, после чего полученные супернатанты были собраны для анализа. BMEC из каждой экспериментальной группы собирались и центрифугировали при 12 000 × г в течение 10 минут при 4 °C, после чего супернатанты сохранялись. Концентрации MDA, IL-1β, IL-6 и TNF-α были впоследствии определены с помощью соответствующих тестовых наборов в соответствии с инструкциями производителя.

11. Статистический анализ

Все данные представлены как среднее ± SD. Данные визуализировались с помощью статистического программного обеспечения. Каждый эксперимент повторялся как минимум три раза. Для сравнения двух групп использовался AT-тест, а односторонний анализ дисперсии с последующим пост-хок тестом Тьюки — для сравнения более чем двух групп. Значение P < 0,05 считалось статистически значимым.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Влияние FGD5-AS1 на крыс с ICH

Экспрессия FGD5-AS1 была значительно выше в группе ICH, чем в контрольной группе (P < 0,0001; Рисунок 1A). После трансфекции LV-shFGD5-AS1 экспрессия FGD5-AS1 была заметно снижена по сравнению с группой LV-shNC (рисунок 1B). Оценка церебрального отёка выявила более тяжёлый отёк мозга у крыс с ICH, чем у контрольных, тогда как заглушание FGD5-AS1 значител...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Повреждение мозга после внутримозгового кровоизлияния возникает не только из-за первоначального кровотечения, но и в результате серии вторичных патологических реакций, развивающихся современем 21. В то время как первичная гематома вызывает прямое механическое нарушение окружающей ткани, последующее повреждение сопровождается такими процессами, как воспалительная активация, окислительное повреждение и запрограммированная гибель клеток. Эти вторичные механизмы сущес...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет соответствующих финансовых или нефинансовых интересов для раскрытия.

Благодарности

Ни одного.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Antagomir NCGenePharma, ChinaB04007Negative control antagomir
BMECsATCC, USACRL-8270Human brain microvascular endothelial cells
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)Beyotime, ChinaC0038Kit for assay of cell viability
DMEM mediumGibco, USA12430054Glucose-free, serum-free medium
Dual-Glo Luciferase Assay SystemPromega, USAE2920Detection of luciferase activity
Electronic balanceSartoriusSecura224-1CNPrecision balance for tissue weighing
GAPDH and U6 primersSangon BiotechCustom primer synthesis serviceInternal reference primers
Graphpad Prism 8.0GraphPad Software, USA——Statistical analysis software
HeminMCE, ChinaHY-19424Hemin reagent for cell injury induction
IL-1 beta ELISA kitsAbcam, UKab197742Quantification of inflammatory cytokine
IL-6 ELISA kitsAbcam, UKab222503Quantification of inflammatory cytokine
LightCycler 96 PCR systemRoche,Switzerland5815916001Real-time PCR instrument
Lipofectamine 3000Invitrogen, USAL3000001Transfection reagent
MDA assay kitBeyotime, ChinaS0131Lipid peroxidation assay
Microplate readerBioTekSynergy H1Measurement of OD450 absorbance
miR-93-5p antagomirGenePharma, ChinaB05001miR-93-5p inhibitor for in vivo experiments
PBSSolarbio, ChinaP1020Phosphate-buffered saline
Pentobarbital sodiumSigma, Merck KGaA11715Anesthetic agent
pGL3-PromoterNovoPro, ChinaV011541Luciferase reporter vector
PrimeScript RT Mix kitTakara, JapanRR037AReverse transcription kit
RIPABeyotime, ChinaP0013BProtein/tissue lysis buffer
ShFGD5-AS1 lentivirusGenePharma, ChinaD02001FGD5-AS1 knockdown vector
SPF-grade female SD ratVital River——6–8 weeks old, SPF grade
SYBR Green Realtime PCR Master MixTakara, JapanRR420AQuantitative PCR reagent
TNF-α ELISA kitsAbcam, UKab208348Quantification of inflammatory cytokine
TRIzol reagentInvitrogen, USA15596026Total RNA extraction reagent
Type VII collagenaseSigma, Merck KGaAC0773From Clostridium histolyticum; ICH induction

Ссылки

  1. Wang B, et al. CircTrim37 ameliorates intracerebral hemorrhage outcomes by modulating microglial polarization via .the miR-30c-5p/SOCS3 axis. Mol Neurobiol. 2024;61(7):4038-54.
  2. Sheth KN. Spontaneous intracerebral hemorrhage. N Engl J Med. 2022;387(17):1589-96.
  3. Xie L, Wang Y, Chen Z. LncRNA Blnc1 mediates the permeability and inflammatory response of cerebral hemorrhage by regulating the PPAR-γ/SIRT6/FoxO3 pathway. Life Sci. 2021;267:118942.
  4. Pinho J, et al. Intracerebral hemorrhage outcome: A comprehensive update. J Neurol Sci. 2019;398:54-66.
  5. Bridges MC, Daulagala AC, Kourtidis A. LNCcation: lncRNA localization and function. J Cell Biol. 2021;220(2):e202009045.
  6. Zhang L, et al. Targeting non-coding RNA for CNS injuries: Regulation of blood-brain barrier functions. Neurochem Res. 2023;48(7):1997-2016.
  7. He Z, et al. Exosome-derived FGD5-AS1 promotes tumor-associated macrophage M2 polarization-mediated pancreatic cancer cell proliferation and metastasis. Cancer Lett. 2022;548:215751.
  8. Aichen Z, Kun W, Xiaochun S, Lingling T. LncRNA FGD5-AS1 promotes the malignant phenotypes of ovarian cancer cells via .targeting miR-142-5p. Apoptosis. 2021;26(5-6):348-60.
  9. Zhu F, Niu R, Shao X, Shao X. FGD5-AS1 promotes cisplatin resistance of human lung adenocarcinoma cell via .the miR-142-5p/PD-L1 axis. Int J Mol Med. 2021;47(2):523-32.
  10. Wei J, et al. Long non-coding RNA FGD5 antisense RNA 1 targets Baculovirus inhibitor 5 via .microRNA-497-5p to alleviate calcific aortic valve disease. Clin Hemorheol Microcirc. 2024;86(3):285-302.
  11. Ajorlou P, Hosseini SA, Ghanbarnejad A, Shekari M. FGD5-AS1 and Th1/Th2 imbalance in the progression of diabetic nephropathy: Evidence from bioinformatic and experimental validation. Clin Exp Med. 2025;26(1):38.
  12. Gong X, Huang M, Chen L, Zeng H. FXR1 promotes glioma progression by downregulating microRNA-124-3p through long noncoding RNA FGD5-AS1 upregulation. Acta Neurol Belg. 2023;123(4):1453-64.
  13. Su D, et al. Long noncoding RNA FGD5-AS1 enhances the viability, migration, and invasion of glioblastoma cells by regulating the miR-103a-3p/TPD52 axis. Cancer Manag Res. 2020;12:6317-29.
  14. Zhang XQ, Song LH, Feng SJ, Dai XM. LncRNA FGD5-AS1 acts as a competing endogenous RNA for miRNA-223 to lessen oxygen-glucose deprivation and simulated reperfusion (OGD/R)-induced neuronal injury. Folia Neuropathol. 2019;57(4):357-65.
  15. Ho PTB, Clark IM, Le LTT. MicroRNA-based diagnosis and therapy. Int J Mol Sci. 2022;23(13):7167.
  16. Wu X, et al. Astrocyte-derived extracellular vesicular miR-143-3p dampens autophagic degradation of endothelial adhesion molecules and promotes neutrophil transendothelial migration after acute brain injury. Adv Sci (Weinh). 2024;11(5):e2305339.
  17. Tsai YC, et al. MicroRNA-195-5p attenuates intracerebral-hemorrhage-induced brain damage by inhibiting MMP-9/MMP-2 expression. Biomedicines. 2024;12(6):1373.
  18. Cheng X, et al. MicroRNA and their target mRNAs change expression in whole blood of patients after intracerebral hemorrhage. J Cereb Blood Flow Metab. 2020;40(4):775-86.
  19. Lu Z, Huang K. Protective effect of silencing lncRNA HCP5 against brain injury after intracerebral hemorrhage by targeting miR-195-5p. BMC Neurosci. 2025;26(1):2.
  20. Wu Z, Liang Y, Yu S. Downregulation of microRNA-103a reduces microvascular endothelial cell injury in a rat model of cerebral ischemia by targeting AXIN2. J Cell Physiol. 2020;235(5):4720-33.
  21. An SJ, Kim TJ, Yoon BW. Epidemiology, risk factors, and clinical features of intracerebral hemorrhage: An update. J Stroke. 2017;19(1):3-10.
  22. Keep RF, et al. Brain endothelial cell junctions after cerebral hemorrhage: Changes, mechanisms and therapeutic targets. J Cereb Blood Flow Metab. 2018;38(8):1255-75.
  23. Srinivas T, Siqueira E, Guil S. Techniques for investigating lncRNA transcript functions in neurodevelopment. Mol Psychiatry. 2024;29(4):874-90.
  24. Zhang J, et al. LncRNA Snhg3 contributes to dysfunction of cerebral microvascular cells in intracerebral hemorrhage rats by activating the TWEAK/Fn14/STAT3 pathway. Life Sci. 2019;237:116929.
  25. Ai Y, et al. Long non-coding RNA MIR17HG impedes FOSL2-mediated transcription activation of HIC1 to maintain a pro-inflammatory phenotype of microglia during intracerebral haemorrhage. Eur J Neurosci. 2023;58(10):4107-22.
  26. Jiang F, et al. LncRNA FGD5-AS1 accelerates intracerebral hemorrhage injury in mice by adsorbing miR-6838-5p to target VEGFA. Brain Res. 2022;1776:147751.
  27. Wang H, et al. Transforming growth factor-β1 functions as a competitive endogenous RNA that ameliorates intracranial hemorrhage injury by sponging microRNA-93-5p. Mol Med Rep. 2021;24(1):511.
  28. Xie B, Qiao M, Xuan J. LncRNA MEG3 downregulation relieves intracerebral hemorrhage by inhibiting oxidative stress and inflammation in an miR-181b-dependent manner. Med Sci Monit. 2021;27:e929435.
  29. Chen JX, Zhi JW, Wang YP, Ning B. LncRNA-PEAK1 promotes neuronal apoptosis after intracerebral hemorrhage by the miR-466i-5p/caspase-8 axis. Heliyon. 2023;9(4):e15091.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

МедицинаВыпуск 234Выпуск 234Пустое значениеВыпусквоспалениеокислительный стресс
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.