Количественная оценка уровня эмбриональной летальности у Caenorhabditis elegans

Краткое содержание

Этот протокол предоставляет простую и недорогую процедуру для количественной оценки уровня эмбриональной летальности у Caenorhabditis elegans. Она позволяет легко выявлять эмбриональные аномалии в разных популяциях без специализированного оборудования или опыта в ловле червей. Протокол может использоваться для количественной оценки влияния генетических мутаций, устранения генов, опосредованных интерференцией РНК, и рациона.

Аннотация

Эмбриональная летальность — это краеугольный фенотип, используемый в исследованиях Caenorhabditis elegans для характеристики дефектов развития, возникающих из-за таких факторов, как токсичное воздействие и генетические мутации. Поэтому точная количественная оценка проникновения эмбриональной летальности крайне важна для понимания механизмов и влияния этих возмущений на развитие животных. Хотя существуют автоматизированные платформы для подсчёта оценок, эти подходы часто требуют значительных финансовых вложений и специализированного аппаратного или программного обеспечения. В этой статье описывается низкотехнологичный, недорогой анализ, который количественно оценивает эмбриональную летальность путём измерения процента эмбрионов, которые успешно не вылупились. Особенно стоит отметить, что эта версия анализа устраняет необходимость в ловушке червяков, что делает его исключительно подходящим для новичков. Дополнительным преимуществом такого подхода является то, что каждая техника воспроизводит анализы потомков нескольких животных, избегая возможных искажений анализов на отдельных червях. Этот протокол включает обсуждение критических параметров, таких как минимальное количество потомков, необходимых для точного фиксирования проникновения фенотипов, и обоснование методологии. Наконец, мы предоставляем рекомендации по адаптации анализа для оценки эффектов обрыва генов с помощью РНК-интерференции, фармакологических методов или питательных добавок, добавляя универсальный и доступный инструмент в набор исследователей C. elegans .

Введение

Эмбриональная летальность — это критически важный фенотип для оценки роли генов и факторов окружающей среды в раннем развитии. C. elegans является мощной моделью для изучения процессов развития благодаря своей инвариантной клеточной линии, прозрачному телу и быстрому жизненному^{циклу 1}. Эмбриональная летальность C. elegans может использоваться для оценки целостности развития при химических, фармакологических, питательных и генетических^{воздействиях} 2,3,4,5. Таким образом, доступные и универсальные методы точного количественного определения эмбриональной летальности принесли бы пользу исследовательскому сообществу.

Современные высокопроизводительные и высокопродуктивные методы, изучающие эмбриогенез, основаны на специализированных системах визуализации и программного обеспечения, часто требуя значительных финансовых^{вложений 4,6,7}, тогда как более простые высокопроизводительные методы обеспечивают преимущественно качественные^{показатели 8,9}. Классические методы, напротив, используют ручной, недорогой подход, который обычно предполагает многократную переноску отдельных гермафродитов с помощью червячной очистки для оценки эмбриональной летальности всего^{выводка 2,10}. Однако этот метод может быть технически сложным для новичков и имеет ограниченную масштабируемость. Кроме того, классические анализы на размере потомства количественно оценивают эмбриональную жизнеспособность потомства одинокой матери, что может привести к непреднамеренному искажению.

Общая цель этого метода — предоставить альтернативный, простой, экономичный и универсальный подход для количественной оценки эмбриональной жизнеспособности при средней пропускной способности. Этот метод измеряет показатели эмбриональной летальности у потомства нескольких животных на одно размножение, не требует использования глистовой кирки и избегает специализированного или дорогостоящего оборудования. Исследование также показывает, как метод можно применить к распространённым возмущениям, таким как интерференция РНК и тестирование на лекарства или питательные вещества.

Протокол

1. Обслуживание C. elegans

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные рекомендации по уходу C. elegans можно найти в^{WormBook 11}.

1. Подготовьте тарелки для среды роста нематод для обслуживания (NGM).
   1. Чтобы получить 1 л НГМ, смешайте 3 г NaCl, 2,5 г бактериологического пептона и 17 г агара в бутылке на 2 л. Добавьте 975 мл дистиллированной воды и батончик для перемешивания, затем задержите автоклав на 20 минут при 121 °C.
   2. Дайте среде остыть до 55 °C в водяной бане. Поставьте бутылку на тарелку для перемешивания и, используя асептическую технику, добавьте 25 мл буфера калия-фосфата 1 М и по 1 мл каждого из следующих компонентов: 1 М МгСО₄, 1 М CaCl₂ и 5 мг/мл холестерина. Налейте примерно 25 мл в каждую 100-мм пластину.
2. Подготовьте ночные культуры E . coli OP50.
   1. Используя асептическую технику, наполните колбу Эрленмайера объёмом 1 л до пятой части её объёма (200 мл) LB-средой. Инокуляция среды одной колонией E. coli OP50 с помощью стерильной инокуляционной петли. Инкубировать ночь при 37 °C на орбитальном встряхивателе при скорости 200 об/мин.
3. Семенные платы для обслуживания NGM с E. coli OP50 (рисунок 1A).
   1. Переложите культуру E. coli OP50 в автоклавные центрифугные бутылки и центрифугу на 30 минут при 3 500 г при комнатной температуре. Суспензировать бактериальную гранулу в одной двадцатой от исходного объёма. Используйте 1–1,5 мл концентрированной культуры для посева каждой 100-мм пластины NGM.
   2. Инкубировать тарелки на ночь при комнатной температуре, чтобы бактерии могли размножаться.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти поддерживающие пластины имеют высокую плотность бактерий, способную поддерживать до 4000 червей на одну пластину, что желательно при проведении большого количества анализов или работы с медленно растущим штаммом C. elegans. Посеянные тарелки для обслуживания можно хранить в холодильнике при 4 °C до 1 месяца.
4. Установите первичную культуру C. elegans (рисунок 1A).
   1. Используйте стерильный наконечник пипетки, чтобы вырезать небольшой кусочек агара, содержащий ~1000 червей, из истощённой пластины для обслуживания. Положите кусок агарa на тарелку с посеянными NGM.
   2. Поместите новую тарелку в пластиковый контейнер и инкубуйте при 20 °C в течение 3 дней, пока черви не станут усыпляющимися и не откладывают яйца. Убедитесь, что бактериальный газон достаточен и чтобы популяция червей не голодала. На данный момент популяция червей готова к эксперименту.

2. Подготовка экспериментальных сред и бактериальных культур

ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе переходите к методу 1 для проверки эффекта knockdown генов с помощью РНКi, либо к методу 2 для изучения диетических добавок.

1. Метод 1: Подготовьте экспериментальные NGM-пластины для РНКи путём подачи.
   1. Приготовьте 1 л NGM, как описано в шаге 1.1, затем с помощью асептической техники добавьте 1 мл 1 M IPTG и 1 мл 50 мг/мл ампициллина. Налейте примерно 5 мл в каждую 35-мм пластину.
   2. Инокулировать желаемое количество клонов E. coli HT115 РНК, питающихся с плазмидами L4440, нацеленных на интересующие гены C. elegans , вместе с пустым контролем вектора. Выберите одну колонию с инокуляционной петлей и перенесите её в 1,5 мл LB, содержащего 50 мкг/мл ампициллина. Инкубировать 18 часов при 37 °C на орбитальном встряхивателе при 200 об/мин.
   3. Семена 35 мм NGM-пластин, содержащие ампициллин и IPTG, с 100 мкл ночной культуры E. coli HT115, с подготовкой двух технических репликий на каждое состояние. Инкубировать пластины на ночь при комнатной температуре, чтобы обеспечить рост бактерий и стимулировать производство двухцепочечной РНК. Храните равное количество несеянных тарелок при 4 °C для последующего использования при переносе яиц.
2. Метод 2: Подготовьте экспериментальные NGM-тарелки с пищевой или лекарственной добавкой.
   1. Приготовьте 1,5-кратный концентрированный NGM, следуя инструкциям из шага 1.1, но добавьте 642 мл дистиллированной воды вместо 975 мл. Подготовленное средство храните в водяной бане при температуре 55 °C.
   2. Подготовьте водный запас интересующего вещества с концентрацией в 3 раза выше целевого уровня (например, для подготовки пластин с 40 мМ натриевого формиата сделайте запас на 120 мм). Рассчитайте требуемый объём запаса, умножив количество экспериментальных пластин на 1,666 мл (треть объёма пластины). Используйте фильтр-фильтр для фильтрации бульона, затем нагрейте его до 55 °C в водяной бане.
   3. В конической трубке объёмом 50 мл смешайте 2 части 1,5x NGM с 1 компонентом дополнительного материала. Для отсутствия контроля добавок смешайте 2 части 1,5x NGM с 1 частью горячей стерильной воды. Аккуратно перемешайте, перевернув трубку 10 раз, затем с помощью асептической техники быстро налейте примерно 5 мл среды в каждую 35-мм пластину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 1,5x NGM используется для компенсации среднего разбавления при добавлении большого количества добавок. Однако, если запас препарата или метаболита концентрирован до 100× или более конечной концентрации, можно использовать обычный NGM вместо 1,5× NGM. При приёме органической кислоты использование её натриевой соли поможет предотвратить падение среднего pH.
   4. Используя асептическую технику, наполните колбу Эрленмайера объёмом 50 мл до пятой части её объёма (10 мл) LB-средой. Инокуляция колонией E. coli OP50 и инкубация ночью при 37 °C на орбитальном шейкере при скорости 200 об/мин.
   5. Посеять 35 мм NGM-пластины с 100 мкл ночной культуры E. coli OP50, подготовьте по две технические реплики на каждом состоянии. Инкубировать тарелки на ночь при комнатной температуре. Храните равное количество несеянных тарелок при 4 °C для последующего использования при переносе яиц.

3. Получение синхронизированной популяции личинок L1

1. Приготовьте щелочный отбеливатель, смесив 7 мл стерильной воды, 2 мл раствора 5% натрия гипохлорита и 1 мл 5 N NaOH.
2. Подготовьте буфер M9, растворив 3 г KH₂PO₄, 6 г Na_{2HPO 4} и 5 г NaCl в 1 л дистиллированной воды, затем отрегулируйте pH до 6,5. Автоклав на 20 минут при 121 °C, дайте раствору остыть, а затем асептически добавьте 1 мл 1 M MgSO4.
3. Смойте взрослых червей (шаг 1.4.2) с пластины с помощью буфера M9 и переместите их в коническую трубку объемом 15 мл. Центрифугуйте при 350 г на 2 минуты, аспирируйте супернатант и наполните трубку свежим буфером M9. Повторите стирку два раза.
4. Добавьте 2 мл буфера M9 и 2 мл щелочного отбеливателя в червячную гранулу. Вихрь и энергичный встряхивание, периодически проверяя под микроскопом, пока почти все черви не растворятся.
5. Заполните трубку буфером M9 и центрифугуйте при 350 x g на 2 минуты. Удалите супернатант, перевернув трубку, затем четыре раза промывайте буфером M9. Убедитесь, что первая промывка проводится сразу после лиза, чтобы предотвратить чрезмерное отбеливание. После последней промывки наполните трубку 8 мл буфера M9 и инкубируете на коромысле 18–20 часов, пока яйца не вылупятся.

4. Культивирование материнских популяций

1. Поместите пять капель червячной суспензии по 3 мкл на стеклянный стекло и подсчитайте количество вылупившихся личинок L1 под микроскопом. Разделите общее количество на 15, чтобы получить концентрацию на микролитр.
2. Поставьте 30 личинок L1 на каждую посеянную пластину диаметром 35 мм и инкубировать при 20 °C в течение 72 часов. Если экспериментальные условия вызывают задержку развития, продлите время инкубации до тех пор, пока черви не станут гравидными и не начнут откладывать яйца (рисунок 1B).

5. Перенос эмбрионов на пластины для вылупления

1. Удалите несеянные пластины диаметром 35 мм из холодильника и дайте им достичь комнатной температуры.
2. Осмотрите пластины червя под микроскопом и убедитесь, что в них более 100 эмбрионов, при этом личинок L1 не вылуплено.
3. Аккуратно заполните пластину буфером M9. Используйте вакуумную линию для аспирации жидкости и удаления материнской популяции. Убедитесь, что на тарелке не осталось взрослых червей.
4. Наполните кончик микропипетки 200 мкл буфера M9 и сильно поднимите и опустите пипетку, чтобы отделить эмбрионы от бактериального газона. При осмотре через микроскоп направляйте кончик пипетки к участкам, где зародышены эмбрионы.
5. Возьмите незасеянную пластину и вкиньте каплю эмбриональной суспензии в центр. Осмотрите каплю под микроскопом. Если в ней нет 100–300 эмбрионов, добавьте ещё больше эмбрионов до достижения этого диапазона. Убедитесь, что ни один глист из родительской популяции не переносится вместе с эмбрионами.
6. Дайте жидкости высохнуть, затем инкубировать переносные пластины при 20 °C не менее 24 часов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если личинки L1 уже присутствуют на экспериментальной пластине, используйте вакуумную линию вместо промывки M9, чтобы удалять всю материнскую популяцию по одной. Это предотвращает смывание детёнышей L1, которые не прилипают к бактериальному газону, как эмбрионы. Переходите к переносу потомства, который теперь включает как эмбрионы, так и личинки L1. Убедитесь, что один и тот же подход применяется ко всем условиям.

Рисунок 1: Экспериментальная хронология и схема ключевых этапов эмбрионального теста летальности. (A) Хронология блок-диаграммы, отражающая полный срок действия экспериментального протокола — от подготовки технической среды до штриховых пластин. Ключевые процедуры указаны для соответствующих дней эксперимента. (B) Схема эмбрионального теста летальности (шаги 4–6). На 4-й день синхронизированные личинки L1 добавляются в экспериментальные РНКи или дополнительные пластины для формирования материнской популяции. Через 72 часа, на седьмой день, после откладывания икры червя, материнская популяция смывается, а эмбрионы остаются прикреплёнными к бактериальному газону. Затем эмбрионы смываются с газона пипеткой и перемещаются на вылупляющую пластину, на которую содержится не менее 100 эмбрионов. Через 24 часа инкубации подсчитываются вылупившиеся личинки и невылупившиеся эмбрионы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

6. Таблицы для подсчёта очков

1. Используйте перманентный маркер, чтобы нарисовать сетку примерно 4 мм × 4 мм на крышке чашки Петри диаметром 35 мм, затем поместите крышку под тарелку. Используйте сетку как ориентир и под микроскопом подсчитывайте количество личинок L1 и невылупившихся эмбрионов с помощью ручного счётчика клика.
2. Объединяйте подсчёты технических репликатов, чтобы обеспечить правильное взвешенное распределение каждой реплики на основе её количества потомков. В частности, подсчитайте количество невылупившихся эмбрионов и вылупившихся личинок по техническим копиям.
3. Вычислите один эмбриональный уровень летальности на биологическую реплику, разделив количество эмбрионов (невылупившихся червей) на общее количество червей и эмбрионов, затем умножьте на 100, чтобы выразить это значение в процентах.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если на пластине содержится только вылупившиеся личинки или только эмбрионы, этот этап подсчёта можно пропустить, так как уровень эмбриональной летальности составляет 0 (0%) или 1 (100%) соответственно.

7. Статистический анализ

1. Повторите весь эксперимент как минимум три раза, чтобы получить независимые биологические реплики. Для каждой биологической реплики используйте две технические пластины для репликации, при этом минимум 100 эмбрионов на каждую техническую реплику.
2. Определить, различаются ли показатели летальности эмбриона значительно между состояниями с помощью одностороннего ANOVA, затем пост-хок парные t-тесты Стьюдента с многократной коррекцией, такие как метод Бенджамини-Хохберга.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Объединение двух технических репликат даёт минимум 200 эмбрионов на биологическую копию. Это удовлетворяет требованию по размеру выборки (~184 эмбриона/состояние), оцененному базовой функцией R power.prop.test, чтобы выявить 15-процентную разницу в летальности (например, 20 % против 35%) при 90% мощности и уровне значимости α = 0,05.

Результаты

Эмбриональный тест летальности проводился в двух штаммах: дикий тип N2 и РНК-гиперчувствительный штамм rrf-3(pk1426). Используя РНК при кормлении, мы удалили гены, ранее сообщавшихся как вызывающие эмбриональную летальность, в высокопроизводительных^{скринингах 9,12}. Рисунок 2 демонстрирует эффективность анализа. Knockdown T04G9.4 обеспечил почти полностью проникновение эмбриональной летальности как у животных с rrf-3 (pk1...

Обсуждение

Для воспроизводимости и точности анализа критически важно выполнять несколько этапов. Во-первых, этап отбеливания должен быть тщательно рассчитан на растворение взрослых червей без повреждения эмбрионов. Ещё один важный момент — перенос достаточного количества эмбрионов для подсчёта: слишком мало снижает точность, а слишком много делает подсчёт излишне утомительным. Далее следует провести перенос эмбрионов до начала вылупления. В противном случае детёныши будут смыты вместе со взрослыми,...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Ампициллин натрия соль	Sigma-Aldrich	A9518
Бактериологический пептон	Fischer Scientific	DF0118-17-0
C. elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center	N2	wild type
C. elegans NL2099	Caenorhabditis Genetics Center	NL2099	rrf-3(pk1426) II. RNAi сверхчувствительный
Хлорид кальция безводный	Sigma-Aldrich	746495
Холестерин	Sigma-Aldrich	C3045
Коническая пробирка, 15 мл	VWR	60818-725
Культуральная пробирка, 14 мл	VWR	470150-966
Мембранный вакуумный насос	Amazon	TC-100
Диссекционный микроскоп	AmScope	SM-2
Escherichia coli HT115	Caenorhabditis Genetics Center		RNAse III-дефицитный, используется для экспериментов по кормлению RNAi
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center
Гранулированный агар	Fischer Scientific	BP97445
Ручной счетчик	LabDepot	HTCP01
IPTG, свободный от диоксана (Изопропил-b-D-тиогалктозид)	US Biological	I8500
LB Бульон (Миллер)	US Biological	L1520	Для приготовления LB среды растворите 25 г LB порошка в 1 л дистиллированной воды. Проведи автоклавирование в течение 20 минут при температуре 121.1 °C.
Одноразовый шприц Luer Lok	BH Supplies	BH20LL
Сульфат магния	Sigma-Aldrich	M2643
Предметные стёкла	Sail Brand	7101
Петри чаши, 100 мм	Tritech Research	T3371
Петри чаши, 35 мм	Tritech Research	T3501
Фосфатный буфер калия (PPB)			Для приготовления фосфатного буфера калия (1 М) растворите 98 г фосфата калия монобазного и 48 г фосфата калия дибазного в 1 л дистиллированной воды. Настройте pH до 6. Проведи автоклавирование в течение 20 минут при температуре 121 °C.
Дифосфат калия	Sigma-Aldrich	795496
Монофосфат калия	Sigma-Aldrich	529568
Раскачиватель (нутирующий миксер)	Corning LSE	6720
Серологические пипеты, 25 мл	Corning	4489
Серологические пипеты, 5 мл	Celltreat	229235
Инкубатор с колебанием Infors Multitron	INFORS HT	NA
Хлорид натрия	Sigma-Aldrich	S9888
Раствор едкого натра, 5 Н	Fisher Scientific	SS256-500
Гипохлорит натрия, 5%	LabDepot	LC246302
Дифосфат натрия	Sigma-Aldrich	S9763
Центрифуга Sorvall ST1 Plus	Thermo Scientific	75016030
Пластиковая плита	ONilab	ONi28-S
Фильтры для шприца	Semmerfeld	JQP033022QE1
Водяная баня	FOUR E's Scientific	WB401