Программное обеспечение для картирования микроглиальных параметров (MMPS): открытый, удобный для пользователя инструмент для количественного анализа морфологии микроглии

Краткое содержание

Программное обеспечение для картирования микроглиальных параметров (MMPS) — это удобный конвейер анализа, не требующий знаний в программировании и полуавтоматизирующий анализ морфологии микроглиальной морфологии отдельных клеток на основе иммунофлуоресцентных изображений. Валидированная в модели нейровоспаления, вызванной липополисахаридами, MMPS воспроизводимым образом обнаруживает морфологические изменения, связанные с активацией, и позволяет стандартизированное, масштабируемое микроглиальное фенотипирование.

Аннотация

Микроглия — это иммунные клетки центральной нервной системы, полученные от миелоидов, которые опосредуют деградацию и ремоделирование тканей после неврологического повреждения и стали перспективными терапевтическими целями при ряде нейродегенеративных заболеваний. Количественный анализ микроглиальной морфологии может выявить тонкие различия между микроглиальными субпопуляциями, сохраняя при этом важную информацию in situ . Однако многие современные платформы микроглиального морфологического анализа либо не являются публично доступными, либо требуют специализированной вычислительной экспертизы, что ограничивает их широкое распространение. Для устранения этих ограничений была разработана открытая платформа микроглиального морфологического анализа под названием Mapping Microglial Parameters Software (MMPS) на Python 3.11. MMPS совместим с рабочими процессами на основе иммунофлуоресценции и не требует экспертизы в программировании для установки или эксплуатации. Программное обеспечение полуавтоматизирует анализ микроглиальной морфологии в одной клеточке с помощью доступного графического интерфейса и включает настраиваемые рабочие процессы обработки изображений и генерации масок. Исследование включает валидацию MMPS с помощью модели нейровоспаления, вызванной липополисахаридами грызунов (LPS). Количественный анализ на уровне животных показал, что микроглия у животных, обработанных ЛПС, демонстрировала значительно увеличенную площадь сомы (p < 0,01) и уменьшенный клеточный периметр (p < 0,05) по сравнению с контролями, обработанными транспортными средствами, что соответствует морфологическим особенностям, связанным с активацией микроглии и нейровоспалением. В целом, MMPS предоставляет стандартизированную, воспроизводимую платформу для количественного анализа микроглиальной морфологии в лабораториях.

Введение

Микроглия — это врождённые иммунные клетки центральной нервной системы (ЦНС), которые непрерывно изучают окружающую среду на наличие патогенов и повреждения^{тканей 1}. После активации микроглии втягивают свои отростки и переходят из гомеостатической разветвлённой морфологии к амебоидному^{фенотипу 2,3}. При нейродегенеративных заболеваниях, таких как ишемический^{инсульт 4,5} и болезнь Альцгеймера ^6,7. Микроглия часто укрепляет нейровоспаление за счёт устойчивого выработки цитокинов, обширного разрушения тканей и^{фагоцитозу 2}. Эти процессы способствуют нарушению работы нейроваскулярной единицы, что ещё больше усугубляет активацию микроглии и повреждение^{ЦНС 8}, что делает микроглию перспективными терапевтическими^{целями 9,10}.

Один из подходов к выявлению тонких различий между микроглиальными субпопуляциями при нейродегенеративных заболеваниях — это морфологический анализ. Обычно это проводится с использованием животных Cx3CR1-GFP с помощью in vivo двухфотонной^{микроскопии 11} или с помощью иммунофлуоресцентной (IF) маркировки установленных микроглиальных маркеров, таких как ионизированная кальцие-связывающая адапторная молекула-1 (Iba1) или P2Y пуринорецепторный^{рецептор 12}. Хотя микроглия часто переходит между гомеостатической и амебоидной морфологией после травмы, предыдущие исследования показали, что микроглия может также принимать дополнительные фенотипы, включая гиперразветвлённую^{микроглию 3,13}, сотовую^{микроглию 3,14}, реактивную^{микроглию 15} и палочную^{микроглию 3,16}. Однако микроглиальные исследования морфологии часто опираются на ручную классификацию гомеостатических и амёбоидных фенотипов. Эти подходы требуют специализированных анализных конвейеров, которые часто не имеют стандартизации между лабораториями, и затрудняют различие между похожими морфологиями, такими как гомеостатические и гиперветвифицированные фенотипы, даже для обученного^{персонала 17}. Кроме того, анализ тонких морфологических изменений на основе ИФ требует высокоразрешающей визуализации, что может создавать дополнительные технические сложности.

Для решения этих ограничений были разработаны несколько аналитических платформ, которые полуавтоматически¹¹ или¹⁸ обнаруживают микроглию и генерируют множество бинарных представлений клеток, называемых «масками», в пользовательских целевых областях (например, 200–800 мкм²). Эти подходы снижают пользовательскую предвзятость, повышают воспроизводимость и повышают аналитическую эффективность. Несмотря на эти достижения, многие существующие программные платформы имеют ограничения, ограничивающие широкое распространение, включая отсутствие доступности с открытым исходным^{кодом. 17}, требования к экспертизе в^{программировании 11, 19, 20}, зависимость от систем микроскопии с двумя фотонами in ^{vivo 11, 19}, отсутствие интуитивно понятных графических интерфейсов^{11, 21, 22}, медленные Скорости обработки¹¹, или зависимость от коммерческих программных платформ^{12, 19, 21}. Хотя недавние исследования начали решать некоторые из этих проблем, многие существующие платформы по-прежнему плохо подходят для рабочих процессов на основе IF, которые по-прежнему широко используются для изучения микроглиальной морфологии.

Здесь представлена ориентированная на пользователя платформа микроглиального морфологического анализа под названием Mapping Microglial Parameters Software (MMPS). MMPS не требует знаний в программировании, интегрируется с устоявшимися рабочими процессами на базе ImageJ и специально разработан для использования с IF-изображениями. Программное обеспечение было разработано на Python 3.11 и включает концепции из ранее опубликованных открытых платформ^{морфологии 11}. MMPS обладает интуитивно понятным графическим интерфейсом, позволяющим пользователям импортировать и обрабатывать большие партии IF-изображений, используя несколько настраиваемых опций обработки изображений. Платформа также включает ручной отбор клеток для минимизации артефактов перевыборки, возникающие при IF-визуализации, а также ручное планирование сома для предотвращения включения клеточных процессов в измерения сома. Кроме того, MMPS включает настраиваемые параметры генерации масок и множество функций обеспечения качества для повышения точности масок. Программное обеспечение рассчитывает несколько часто используемых морфологических параметров, включая периметр, среднее расстояние до центроида, площадь маски, эксцентриситет, округлость и площадь сомы. Для более продвинутых исследований выходы, генерируемые MMPS, совместимы с несколькими плагинами ImageJ и могут быть дополнительно проанализированы с помощью сопутствующих плагинов для анализа фракталов, скелетов и оболочек.

MMPS был валидирован с помощью модели нейровоспаления, вызванной липополисахаридами грызунов (LPS), изучая микроглиальные изменения внутри кортикального слоя IV. Количественный анализ показал, что введение LPS значительно увеличивает площадь микроглиальной сомы при уменьшении клеточного периметра по сравнению с контролями, обработанными транспортными средствами, что свидетельствует о точном обнаружении тонких морфологических изменений, связанных с микроглиальной активацией.

Протокол

Все процедуры на животных проводились в соответствии с Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Университета Западной Вирджинии (протокол #2109047180) и Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, поддерживаемым Национальными институтами здоровья. Оборудование, реагенты и программное обеспечение, используемые в этом методе, перечислены в Таблице материалов.

1. Экспериментальные животные

1. Заведите 10 самцов крыс рода Спраг-Доули (2-3 месяца). Когда крысы прибывают в приют, их следует содержать в группе по 12-часовому циклу света и темноты с импровзационным доступом к еде и воде. По прибытии крысы акклиматизируются в течение трёх дней перед использованием.
2. Случайным образом распределяйте крыс по группам с транспортными средствами или группами, обработанными ЛПС (n = 5 крыс/группа).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за небольшого количества крыс можно использовать простую стратегию рандомизации с компьютерно сгенерированными случайными числами для распределения крыс в группу лечения.
3. Следите за крысами после лечения на наличие «болезненного поведения»: снижение веса (>15%), секреция порфирина, респираторные нарушения или снижение активности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Симптомы поведения при болезни часто проявляются в первые 12 часов после введения, поэтому вводите препараты рано утром (6-8 часов), контролируйте поведение в течение дня и возвращайте крыс в учреждение поздно вечером (с 17 до 19 часов).

2. Модель нейровоспаления

1. Приготовьте стандартный раствор LPS (O111:B4) (10 мг/мл), растворив 50 мг LPS в 5 мл фосфатно-буферном физиологическом растворе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: ЛПС — это эндотоксин. Исследователям следует следовать стандартным стандартам своего учреждения при обращении и утилизации.
2. Взвесьте крыс, а затем внутрибрюшинно вводите LPS (10 мг/кг) или PBS (транспортное средство).
3. В зависимости от веса крыс ожидается объём инъекции от 150 до 300 мкл.
4. Усыпить крыс через 24 часа после инъекции путём сердечной перфузии с последующим обезглавливанием.
5. Анестезируйте крыс ингаляционным изофлураном (5% в_O2) на 5–10 минут. Подтвердите анестезию по отсутствию рефлектора отмены педали.
6. Во время анестезии сделайте средний грудной разрез, чтобы обнажить диафрагму и грудину. Зажмите ксифовидный отросток с помощью гемостатов, чтобы открыть грудную полость.
7. Разрежьте диафрагму и грудную клетку ближе к передним конечностям, чтобы открыть сердце.
8. Зажмите нисходящую аорту и нижнюю полую вену гемостатами. Введите 25-гейджную крылатую иглу в левый желудочек.
9. Перфузируйте крыс с ледяным PBS (25 мл при 30 мл/мин) с помощью перистальтического насоса. Разрезать левый предсердие в течение нескольких секунд после начала перфузии, чтобы обеспечить дренаж перфузата.
10. Перфузные крысы с 4% параформальдегида (25 мл при 30 мл/мин).
    ВНИМАНИЕ: Обращайтесь с параформальдегидом с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты в хорошо проветриваемой среде. Утилизировать параформальдегидные отходы в соответствии с институциональными и местными нормативами.
11. Обезглавливайте крыс гильотиной после перфузии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте рекомендациям вашего учреждения по ведению отсечений голов и заточке лезвий.
12. Обнажите череп, притянув кожу головы к ушной голове.
13. Сломайте лобную кость с помощью гемостатов или ронжеров, вставленных в глазницы.
14. Вставьте щипцы в отверстие magnum и снимите теменные кости.
15. Удалять мозг с помощью тонких щипцев и инкубировать за ночь в 4% параформальдегида.
16. Последовательно переносите мозг в 20% сахарозы и 30% сахарозы за ночь для криозащиты.

3. Иммунофлуоресценция

1. Заморозить криозащищённые мозги в Tissue Tek O.C.T. Compound на сухом льду.
2. Срез мозга с 30 мкм с помощью криостата.
3. Соберите секции в PBS и переместите их в сетевые колодцы, вставленные в 12-ядровую пластину.
4. Выберите как минимум две секции на крысу, содержащие передний спинной гиппокамп.
5. Стирите секции в PBS по 5 минут дважды, пока раскачиваетесь.
6. Пермеабилизуйте срезы в 0,3% Triton X-100/PBS в течение 45 минут во время раскачивания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте раствор 3 мл на каждом этапе стирки или инкубации, если не указано иное.
7. Стирите секции в PBS по 5 минут дважды.
8. Разведите раствор для извлечения антигена до 1x в PBS и добавьте 2 мл на каждую яму.
9. Инкубировать участки при 80°C в течение 20 минут с использованием водяной бани.
10. Дайте секциям остыть до комнатной температуры перед тем, как продолжить.
11. Стирите секции в PBS по 5 минут дважды.
12. Блокирующие секции в сыворотке 10% «осла»/0,05% Triton X-100/PBS в течение 2 часов при 37°C при встряхивании при 75 об/мин.
13. Промывайте секции в сыворотке 1% «осла»/0,05% Triton X-100/PBS по 5 минут три раза.
14. Перенос секций в новую пластину с 12 лунками без чистых колодц, содержащих 500 мкл первичного раствора антитела против Iba1, приготовленного в сыворотке 1% «осла»/0,05% Triton X-100/PBS.
15. Подготовьте отрицательные контроли, исключив первичное антитело из инкубационного раствора.
16. Инкубировать все секции ночью при 4°C на орбитальном рокере
17. Вернуть секции в сетчатые скважины.
18. Промывайте секции в сыворотке 1% осли/0,05% Triton X-100/PBS три раза по 10 минут.
19. Инкубировать секции с антикроличьим вторичным антителом (разбавление 1:1000) в сыворотке 1% осла/0,05% Triton X-100/PBS в течение 1,5 часа при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Минимизировать воздействие света во время всех последующих процедур и обернуть пластины алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить разрушение флюорофоров.
20. Стирите секции в PBS по 5 минут дважды.
21. Крепите секции на стекли микроскопа.
22. Сушка на воздухе в темноте в течение >2 часа.
23. Срезы с использованием водорастворимых соединений.
24. Подготовьте слайды с отрицательным контролем с помощью монтажного материала.
25. Храните слайды в коробке для слайдов при комнатной температуре в тёмной среде.

4. Визуализация

1. Определите размер пикселя системы изображения при увеличении 40x. Если масштаб не найден, добавьте к каждому изображению полосу масштаба.
2. Используйте окрашивание DAPI, чтобы определить плотную полосу корковых ядер при низком увеличении, соответствующую кортикальному слою IV.
3. Сфокусируйте изображение на выявленной корковой области.
4. Переключитесь на увеличение в 40 раз.
5. Настройте настройки экспозиции канала для максимального разделения сигнала DAPI и Iba1 от фоновой флуоресценции.
6. Получите изображения Z-стека (> 30 шагов), охватывающие всю глубину микроглии.
7. Сгенерируйте и сохраните композитное изображение проекции максимальной интенсивности из полученного Z-стека обоих окрасок.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизируйте экспозицию и настройки Z-стека для каждого изображения, чтобы максимизировать разделение сигналов между DAPI/Iba1 и фоновым флуоресценцией. Плохое разделение сигналов снижает точность генерации масок.

5. Программное обеспечение для картирования микроглиальных параметров (MMPS)

1. Храните все составные изображения в одном каталоге изображений.
2. Создайте отдельный каталог выводов для результатов, генерируемых MMPS.
3. Скачайте отдельный пакет MMPS или MMPS.py скрипт из репозитория GitHub.
4. Установите все зависимости, указанные в файле requirements.txt, если запускаете MMPS через MMPS.py.
5. Откройте MMPS-пакет или запустите MMPS.py скрипт.
6. Выберите «Выбрать папку изображений» и выберите каталог изображений.
7. Выберите «Выберите папку вывода» и выберите директорию вывода.
8. Предоставьте права доступа к папкам при запросе операционной системы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные инструкции по установке, рекомендации по устранению неполадок и примеры использования приведены в дополнительной документации и репозитории GitHub.
9. Выберите «Маркировка изображения» и назначьте идентификаторы животных и группы лечения каждому изображению.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если маркировка изображений пропущена, MMPS вызывает идентификаторы группы лечения и животных перед экспортом данных.
10. Введите размер пикселя во вкладке «Параметры».
11. Выберите «Калибровать с шкалы», если размер пикселя неизвестен. Выберите начальную и конечную точки на шкале при запросе. Введём известное расстояние между масштабами в микрометрах.
12. Выберите флуоресцентный канал, содержащий микроглиальный сигнал.
13. Выберите изображения для обработки, ставя галочку рядом с именем каждого изображения. Обрабатывайте изображения по отдельности, когда фоновая флуоресценция существенно различается между изображениями.
14. Просмотрите вкладки «Оригинал», «Предпросмотр», «Обработанно» и «Маски», чтобы сравнить этапы обработки изображений.
15. Выберите «Предварительный просмотр текущего изображения» для оценки настроек обработки изображения.
16. Регулируйте настройки вычитания фона, снятия шума и резкости для катящихся шаров по мере необходимости.
17. Используйте значения rolling ball от 5 до 150 пикселей для фонового вычитания.
18. Используйте значения снятия шума от 3 до 7 пикселей, чтобы уменьшить артефакты неравномерного освещения.
19. Используйте значения резкости от 1 до 2 для улучшения рельефа.
20. Выберите «Выбранные изображения обработки» после оптимизации настроек обработки изображений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время обработки изображения варьируется в зависимости от номера изображения и выбранных параметров.
21. Выберите «Выбрать сома (все изображения)».
22. Выберите «Показать цвет (C)» для отображения RGB-композитных изображений. Выберите «Каналы...» и отменить выделение неиспользуемых каналов, если цвет изображения искажен.
23. Выберите микроглиальные сомы, отображающие DAPI и колокализацию Iba1. Избегайте выделения ячеек, контактирующих с рамками изображения. Удалите неправильно выбранные маркеры сомы с помощью клавиш «Backspace» или «Delete».
24. Нажмите «Enter» или «Return», чтобы перейти к следующему изображению.
25. Выберите «Outline Somas (Все)» после завершения выбора сомы.
26. Обведите периметр сомы каждой выбранной микроглиальной клетки. Исключите клеточные процессы из контура сомы и используйте как минимум восемь контурных точек на каждую сому. Удалите неправильно расположенные контурные точки с помощью «Отменить последний пункт», «Удалить» или «Backspace».
27. Пресса «Enter», «Return», двойной клик или правый клик, чтобы окончательно определить контур каждой сомы.
28. Выберите «Redo Last Outline», чтобы повторить предыдущий план сомы при необходимости.
29. Выберите «Generate All Masks» после завершения плана сома.
30. Примените минимальное пороговое значение для ограничения включения пикселей фона низкой интенсивности в маски.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокие значения сохраняют точность сома за счёт ветвления, тогда как низкие значения сохраняют точность ветвления за счёт сомы. Пороговые значения от 10 до 30% обычно обеспечивают сбалансированное подавление фона и сохранение ветвей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время генерации маски зависит от количества выбранных ячеек.
31. Выберите «QA All Masks», чтобы начать контроль качества масок.
32. Обзор масок, представленных от самых больших (800 мкм²) до самого маленького (200 мкм²).
33. Сравните каждую маску с соответствующими микроглиями с помощью вкладок «Обработанное» и «Маска».
34. Принимайте маски с помощью клавишного ярлыка «A». Отклоняйте маски с помощью клавишного ярлыка «R». Нажмите «B», чтобы отменить принятие или отказ. Перемещайтесь по размерам масок с помощью стрелок на клавиатуре.
35. Выберите самую большую допустимую маску, которая точно фиксирует микроглиальные ветвления без включения соседних клеток, избыточного фона, границ изображения или полос масштаба.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отказывайтесь от масок, если есть сомнения в их точности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите «Очистить все маски», затем перегенерируйте маски с другим пороговым значением, если большинство из них неточны.
36. Выберите «Вычислить простые характеристики» после завершения контроля качества маски, чтобы
    Вычислите среднее расстояние центроида, площадь маски, периметр, эксцентриситет, округлость и размер сомы, используя принятые маски и контуры сомы.
37. См. таблицу 1 для определения параметров и микроглиальных тенденций нейровоспаления.
38. Скачать «Sholl.py», «FractalAnalysis_ImageJ.py» и «SkeletonAnalysisImageJ.py» для проведения дополнительных анализов.
39. Откройте «FractalAnalysis_ImageJ.py» как фиджийский плагин для анализа фракталов и корпуса.
40. Вводите местоположение каталога выхода и размер пикселя по запросу. Выберите опцию «только самая большая маска», если требуется анализ только самой большой допустимой маски.
41. Откройте "Sholl.py" как фиджийский плагин для анализа Sholl.
42. Вводите местоположение каталога выхода и размер пикселя по запросу.
43. Введите желаемый размер шага по анализу Шолла. Выберите «Использовать радиус сомы как стартовый радиус», чтобы использовать радиусы, полученные из MMPS, в качестве начального радиуса для анализа Шолля. Вводим фиксированное значение радиуса сомы, если радиусы, полученные из MMPS, не используются.
44. Откройте "SkeletonAnalysisImageJ.py" как фиджийский плагин для анализа скелетов.
45. При запросе вводите местоположение каталога вывода, размер пикселя и папку масок.
46. Экспортируйте все результаты, сгенерированные плагинами, в CSV-файлы в каталог вывода после завершения.

6. Формулы, используемые в MMPS для вычислений морфологии микроглии

ПРИМЕЧАНИЕ: Все вычисления выполняются автоматически MMPS при нажатии «Вычислить простые характеристики». Ниже приведены расчеты параметров.

1. Периметр
   1. Рассчитайте периметр с помощью следующего уравнения:
      
   2. Определим как периметр, как количество пикселей по краям и как размер пикселя в мкм.
2. Среднее расстояние до центроида
   ПРИМЕЧАНИЕ: Среднее расстояние до центроида также называют разбросом^{ячеек 11}.
   1. Определите четыре конечных точки ветви на основе координат ячеек:
      верхняя ветвь: минимальная y-координата,
      нижняя ветвь: максимальная y-координата,
      Левая ветвь: минимальная x-координата,
      Правая ветвь: максимальная координата X.
   2. Вычислите координаты центроида с помощью следующих уравнений:
      
      
   3. Определим c_x и c_y как координаты центроида, x_i и _y i — как координаты пикселей, а также как общее количество пикселей.
   4. Вычислите расстояние ветви с помощью следующего уравнения:
      
   5. Определим d как расстояние ветвления, x_i и _y i — как координаты конца ветви, а c_x и c_y — как координаты центроида.
   6. Вычислите среднее расстояние до центра с помощью следующего уравнения:
      
   7. Определим как среднее расстояние центроида, как расстояние ветвей d_i и размер пикселя в μm.
3. Зона масок
   1. Вычислите площадь маски с помощью следующего уравнения:
      
   2. Определим как площадь маски в^{μm 2}, как количество пикселей внутри маски, и как размер пикселя в мкм.
4. Эксцентричность
   1. Вычислите вторые центральные моменты с помощью следующих уравнений:
      
      
      
   2. Определим_{μ 20}, μ₀₂ и μ₁₁ как вторые центральные моменты, x_i и _y i — как координаты пикселей, c_x и c_y — как центроидные координаты, а N — как общее число пикселей.
   3. Вычислите собственные значения матрицы ковариации с помощью следующего уравнения:
      
   4. Определим λ₁ ≥ λ₂.
   5. Вычислите длины больших и малых осей с помощью следующих уравнений:
      
   6. Определим a как длину большой оси, а b — как малую длину оси.
   7. Вычислите эксцентриситет с помощью следующего уравнения:
      
   8. Определите это как эксцентричность.
5. Округлость
   1. Вычислите округлость с помощью следующего уравнения:
      
   2. Определите как округлость, как длину большой оси и как малую длину оси.
6. Размер сома
   1. Вычислите площадь сомы с помощью следующего уравнения:
      
   2. Определим Sa как площадь сомы в^{μm 2}, как количество пикселей внутри маски сомы, а S — как размер пикселя в μm.

7. Статистический анализ

1. Выполнять все статистические анализы с использованием версии R 4.3.2.
2. Наборы данных фильтруются с использованием самой большой допустимой маски для каждой ячейки.
3. Средние клеточные параметры на уровне животных до статистического анализа.
4. Оценивайте нормальность и дисперсию с помощью тестов Шапиро–Уилка и Левена.
5. Проведите t-тесты Стьюдента или ANOVA с повторяющимися средними с пост-хок парными t-тестами с корректировкой Холма, когда наборы даты удовлетворяют параметрическим предположениям.
6. Проводите тесты с суммой рангов Уилкоксона или Фридмана с помощью парных тестов Уилкоксона с знаковым рангом, скорректированными по Хольму, когда наборы данных не удовлетворяют параметрическим предположениям.
7. Определим статистическую значимость как p < 0,05 .

Результаты

Была разработана открытая автономная платформа анализа микроглиальной морфологии, названная Mapping Microglial Parameters Software (MMPS), чтобы обеспечить доступный, стандартизированный рабочий процесс для микроглиального морфологического анализа на основе IF. Платформа основывается на предыдущих методологиях морфологического анализа, не требует экспертизы в программировании и включает доступный графический интерфейс. MMPS был разработан для улучшения обнаружения тонких микроглиальных ветвлений при включении множества мер предосторожности для минимизации переоценки микроглиальных масок.

MMPS был валидирован с использованием модели нейровоспаления грызунов, вызванной LPS. После обработки тканей и получения изображений (рисунок 1) специфичность ИФ была подтверждена с помощью отрицательных контрольных срезов без первичного окрашивания антител (дополнительный рисунок 1). Обработка MMPS начинается с импорта IF-образов в программный интерфейс (рисунок 2A). Программное обеспечение предоставляет несколько вариантов обработки изображений для улучшения обнаружения микроглиальных сигналов и фонового разделения. Обязательное фоновое вычитание выполняется с использованием алгоритма rolling-ball, реализованного в пакете Scikit-image, а опциональные фильтры для снятия шума и резкости доступны с помощью гауссовой фильтрации на базе SciPy. После обработки изображений микроглиальные сомы выбираются вручную и идентифицируются с помощью красных маркеров отбора (рисунок 2B). Границы сома далее обводятся вручную для морфологических расчётов на основе (рисунок 2C).

Рисунок 1: Графический обзор модели и обработки нейровоспаления. Крысам вводили LPS или PBS и проводили 24 часа с помощью сердечной перфузии с последующим обезглавливанием. Мозги извлекались и разрезались на срезы диаметром 30 мкм для использования в IF для микроглиального маркера Iba1, которые затем обрабатывались с помощью MMPS. Создано с помощью Biorender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Обзор использования MMPS. (A) Пример изображения корковой микроглии (красный, Iba1) с ядрами клеток (синие, DAPI), которые можно ссылаться в MMPS (шкала = 75 мкм, 40x). После обработки изображения с помощью MMPS фон уменьшается, а точные морфологии оцениваются (B) После обработки изображения в MMPS сомы выбираются вручную с помощью красного круга для использования на последующих этапах, описанных в методах (шкала = 75 мкм, 40x). (C) Две репрезентативные микроглии были обведены вручную, а сохраненные изображения контуров сомы показаны ниже. (D) Генерация масок выбранных клеток автоматически отслеживает микроглиальные ветви до 800 мкм², но требует ручной контроля качества. Здесь мы показываем неточную маску 800^{мкм 2} , за которой следует более точная маска 700 мкм² . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

После определения сомы MMPS генерирует маски итеративно в диапазоне размеров 200–800 мкм^² с использованием адаптивного порога, ограниченного пользовательским порогом минимальной интенсивности. Меньшие маски ближе следуют пользовательскому порогу, тогда как большие маски постепенно ослабляют пороговы ограничения для максимизации включения ветвей. Сгенерированные маски проходят ручную проверку качества, чтобы предотвратить включение соседних ячеек, чрезмерное включение фона или усечение по границам изображения или полосам масштаба. Как показано на рисунке 2D, маска⁸⁰⁰ мкм 2 для представительной микроглиальной клетки распространяется в соседнюю ячейку. Отторжение маски^{800 мкм 2} и выбор маски⁷⁰⁰ мкм 2 корректировали ошибку сегментации, сохраняя при этом точное разграничение микроглии цели.

После обработки MMPS микроглиальная активация оценивалась с использованием самой большой допустимой маски для каждой клетки, поскольку эти маски наиболее точно фиксировали дистальные ветвления при минимизации фонового включения. Рассчитанные морфологические параметры приведены в таблице 1 и представлены на рисунке 3. Введение ЛПС значительно снизило среднее расстояние до центра и периметр клетки по сравнению с контролями, обработанными транспортными средствами (p < 0,05; Рисунок 3A,B), что соответствует ретракции микроглиальных процессов во время активации. Значимых различий в площади маски, округлости или эксцентриситете между группами лечения не было выявлено (рисунок 3C–E), несмотря на то, что предыдущие отчёты связывали эти параметры с активированными микроглиальными фенотипами ^3,23. Настоящее исследование не было статистически способно выявить тонкие различия в форме сомы или площади маски, и микроглиальные субпопуляции могут принимать гетерогенные воспалительные морфологии, которые не единородно соответствуют этим^{тенденциям 3.} В отличие от этого, площадь сома значительно увеличилась у животных, обработанных ЛПС, по сравнению с контролями транспортных средств (p < 0,01; Рисунок 3F), дополнительное подтверждение морфологического ремоделирования, связанного с^{активацией 22}.

Рисунок 3: Сравнение микроглиальных морфологических параметров. Для всех панелей проводились тесты на нормальность (Шапиро-Уилк и Левин), при этом незначительные значения были обнаружены во всех случаях (p>0.05), что привело к применению t-тестов студентов. Точки представляют отдельных животных (n=5 на обработку) (A) Среднее расстояние до центроидов было значительно выше в группе транспортных средств по сравнению с группой лечения LPS. (B) Периметр клеток микроглии был значительно выше в группе транспортных средств по сравнению с группой лечения LPS. (C) Существенной разницы в площади маски между группами лечения не было. (D) Существенной разницы в эксцентричности сома между группами не было. (E) Существенной разницы в округлости сома между группами лечения нет. (F) В группе LPS наблюдалось значительное увеличение площади сома * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Параметр	Определение	Связь с микроглиальной активацией
Среднее расстояние до центроида	Среднее расстояние от самой дальней ветви в верхней, правой, нижней и левой позициях	Снижения
Периметр	Измерение периметра ячейки	Снижения
Зона масок	Фактическая область клетки, а не область маски цели	Снижения
Эксцентричность	Измерение приблизительного удлинения сомы клетки (0: круговая, 1: сильно удлинённая)	Снижения
Округлость	Измерение приблизительной циркулярности сомы клетки (0: удлинённая, 1: круглая)	Повышения
Сома Сайз	Площадь клетки сома	Повышения

Таблица 1: Рассчитанные параметры из MMPS и прогнозируемые изменения в ответе на активацию микроглии. В таблице приведены морфологические параметры, рассчитанные программным обеспечением Mapping Microglial Parameters Software (MMPS), включая периметр, среднее расстояние до центроида, площадь маски, эксцентриситет, округлость и площадь сомы.

Воспроизводимость между пользователями впоследствии оценивалась путём предоставления того же набора изображений слепым, ранее не обученным пользователям для независимого анализа (Дополнительный рисунок 2). Статистически значимые различия между пользователями не выявлены, и все пользователи воспроизводили морфологические тенденции, соответствующие микроглиальной активации у животных, обработанных ЛПС.

MMPS также поддерживает дальнейшие продвинутые морфологические анализы. Коррелятивный анализ параметров, полученных на рисунке 3 , показал взаимосвязи между различными морфологическими признаками. Крысы, обработанные транспортным средством, показали лишь слабую корреляцию между округлостью микроглии и периметром (R² = 0,17), тогда как крысы, обработанные ЛПС, показали более сильную корреляцию (R² = 0,64), что указывает на то, что повышенная активация микроглии была связана с одновременным уменьшением округлости и периметра (рисунок 4A). Кроме того, площадь маски показала сильную положительную корреляцию со средним расстоянием до центроидов как в группах, так и в группах, обработанных с помощью ЛПС (R² = 0,71 и 0,88 соответственно), что соответствует изменениям сложности ветвления, связанными с активацией микроглии (см. рисунок 4B).

Рисунок 4: Расширенный анализ микроглиальных параметров. Все панели представляют собой животные линии наилучшего соответствия, вычисленные методом обычного наименьшего квадрата, отображаемые с коэффициентом определения (^R2) и зашиненные 95% доверительным интервалом. (A) Микроглиальная сома округлость и общая длина периметра слабо формируют группу транспортных средств (R² = 0,17), но имеют более сильную корреляцию после воздействия LPS (R² = 0,64). (B) Среднее расстояние до центроида коррелирует с площадью микроглии в группах транспортного средства (^{R 2} = 0,71) и LPS (R² = 0,88). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Дополнительный рисунок 1: Валидация протокола IF через отрицательный контроль. Один срез мозга одной и той же области для каждой крысы прошёл IF протокол без добавления первичных антител для подтверждения отсутствия аутофлуоресценции (шкала = 75 мкм). (A) Репрезентативное изображение ткани, окрашенной транспортным средством, для DAPI (синий). (B) Репрезентативное изображение ткани, окрашенной транспортным средством, для Iba1 (красный). (C) Репрезентативное изображение ткани, окрашенной транспортным средством, для DAPI (синий) и Iba1 (красный). (D) Репрезентативное изображение ткани, окрашенной LPS, для DAPI (синий). (E) Репрезентативное изображение ткани, окрашенной LPS, для Iba1 (красный). (F) Репрезентативное изображение ткани, окрашенной LPS, для DAPI (синий) и Iba1 (красный). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Оценка межпользовательской вариации MMPS. Несколько слепых пользователей использовали MMPS на тех же образцах, что и на рисунке 3 , и результаты на уровне животных сравнивались. Для всех тесты нормальности (Шапиро-Уилк и Левене) были незначимыми (p>0.05), что привело к использованию повторяющегося среднего ANOVA с пост-хок корректированным Хольмом парным t-тестом (p>0.05). (A) В каждой группе между пользователями по среднему расстоянию центроида (p>0,05) не было значимой разницы. (B) В каждой группе между пользователями по периметру не было значительной разницы (p>0.05). (C) В каждой группе не было значительной разницы между пользователями по площади маски (p>0.05). (D) В каждой группе не было значимой разницы по эксцентричности (p>0.05). (E) В каждой группе не было значимой разницы по округлости (p>0.05). (F) В каждой группе не было значимой разницы между пользователями для площади сома (p>0.05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Основная цель этой методологии — расширить доступность микроглиального морфологического анализа путём снижения распространённых технических барьеров при сохранении сильных сторон устоявшихся морфологических методов оценки. MMPS позволяет обнаруживать тонкие микроглиальные морфологические изменения при сохранении совместимости с продвинутыми анализами, включая фрактальные, скелетные, корпусные и шолловские анализы. По сравнению с ранее опубликованными подходами, MMPS обеспечивает доступный графический интерфейс, интегрированные расчёты для широко используемых морфологических параметров и устранение требований к кодированию, сохраняя при этом совместимость с более продвинутыми анализами по текущей линии.

Несколько ключевых методологических шагов сильно влияют на аналитическую точность и воспроизводимость. Высококачественная иммунофлуоресцентная (ИФ) визуализация необходима для надёжной генерации масок и расчётов морфологии. Специфичность антител является важным фактором качества изображения, поскольку неспецифическая маркировка увеличивает фоновую флуоресценцию и уменьшает разделение сигналов между микроглией и окружающей тканью. Аналогично, субоптимальные концентрации антител могут снижать интенсивность флуоресценции и снижать разрешение изображения. Получение Z-стековых изображений также имеет решающее значение, поскольку отсутствие изображения Z-стека может искусственно изменить кажущуюся сложность микроглиального ветвления и распространение процесса, тем самым смещённо смещая морфологические расчёты.

При обработке MMPS важны дополнительные моменты. Хотя MMPS поддерживает пакетную обработку изображений, индивидуальная оптимизация часто предпочтительнее, поскольку характеристики фона и качество окрашивания могут значительно различаться между изображениями. Качество изображения напрямую влияет на точность генерации масок; Поэтому оптимизация во время предварительной обработки изображений значительно повышает воспроизводимость и устойчивость дальнейших анализов. Тщательный отбор микроглиальных сома также важен, особенно избегание контакта клеток с границами изображения, поскольку частичный отбор клеток искусственно снижает измерения сома и искажает образование маски. При проверке качества масок маски, включающие соседние клетки, чрезмерный фон или границы изображения, должны быть отклонены. Наоборот, меньшие маски не следует отвергать только потому, что они не захватывают все дистальные процессы, поскольку итеративный алгоритм генерации масок намеренно корректирует локальные пороговые параметры в зависимости от размера маски и региональной интенсивности пикселей.

Эта методология отличается высокой адаптивностью и может быть модифицирована для удовлетворения конкретных экспериментальных требований. Поскольку MMPS является открытым исходным кодом, платформу можно расширить для анализа отдельных кадров Z-стека или внедрения автоматизированных алгоритмов обнаружения клеток для создания полностью автоматизированного конвейера морфологического анализа. Кроме того, сгенерированные маски и контуры сомы остаются совместимыми с рабочими процессами на базе ImageJ для анализа фракталов, корпуса, скелета и анализа Шолла. Поскольку MMPS был разработан на Python 3.11, дополнительные анализы могут быть также интегрированы напрямую в программное обеспечение с помощью широко доступных научных пакетов Python без необходимости использования внешних программных платформ.

Несмотря на эти преимущества, следует учитывать ряд ограничений. MMPS был валидирован с помощью модели нейровоспаления в конкретной области мозга самцов крыс Спраг-Доули, и различные области мозга, модели заболеваний, вид или биологический пол могут влиять на морфологические исходы. Применимость MMPS к альтернативным экспериментальным парадигмам, следовательно, должна быть подтверждена через пилотные исследования или подтверждена сравнением предыдущей литературы. Кроме того, визуализация на основе ИФ неполно захватывает трёхмерные ветвящиеся структуры, поскольку процессы, простирающиеся непосредственно над или ниже фокальной плоскости, могут не быть обнаружены на изображениях с максимальной проекцией. Увеличение количества анализируемых клеток может помочь смягчить это ограничение. MMPS также остаётся зависимым от качества получения изображений, поэтому требует оптимизации для отдельных систем визуализации, протоколов окрашивания и препаратов антител. Изображения низкого разрешения могут искусственно увеличивать размер маски из-за размытых границ вокруг сома и плотно уплотнённых ветвей. По этой причине существующий протокол включает методы свободно плавающего IF и несколько вариантов обработки изображений для максимизации качества изображения.

MMPS также сохраняет потенциал вариативности, зависящей от пользователя, поскольку пользователи вручную выбирают ячейки и очертают сома. Однако использование DAPI и колокализации Iba1 значительно снижает неоднозначность при отборе клеток. Кроме того, слепой межпользовательский анализ показал минимальную вариабельность между ранее не обученными пользователями, что подтверждает воспроизводимость аналитического рабочего процесса.

В отличие от нескольких ранее опубликованных платформ микроглиальной морфологии, MMPS не полностью автоматизирован. Однако этот дизайн был выбран для приоритета точности сегментации и маскировки контроля качества. Автоматизированные рабочие процессы могли быть интегрированы за счёт модификации исходного кода на Python для автоматического обнаружения колокализации DAPI/Iba1, контурного составления сома и принятия или отклонения масок на основе машинного обучения. Кроме того, MMPS требует значительной ёмкости дискового хранилища, поскольку сгенерированные маски и контуры сома автоматически сохраняются в виде .tiff файлов для дальнейших анализов и обеспечения качества. Требования к хранилищу можно снизить, модифицировав программное обеспечение для последовательной генерации масок по ячейкам, а затем немедленной оценки качества и извлечению параметров.

В заключение, MMPS расширяет доступ к количественному анализу микроглиальной морфологии, предоставляя стандартизированную платформу с открытым исходным кодом, не требующую экспертизы в программировании или возможностей визуализации in vivo . Платформа облегчает воспроизводимый анализ микроглиальной морфологии на основе ИФ, сохраняя совместимость с передовыми аналитическими подходами.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
12-well plate	Fisher Scientific	07-200-82	Пластина, используемая для инкубации и промывания тканевых секций.
Алюминиевая фольга	Fisher Scientific	01-213-101	Используется для защиты флуоресцентных образцов от воздействия света.
Буфер для извлечения антигена (10×)	ThermoFisher Scientific	00-4955-58	Используется для улучшения доступности антигена при иммунофлуоресцентной окраске.
Первичное антитело к Iba1	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	019-19741	Первичное антитело, используемое для иммунофлуоресцентного меток микроглии.
Криостат	Fisher Scientific	95-710-0L	Инструмент, используемый для разрезания замороженной ткани головного мозга на определенной толщине.
Донконская антирабичная IgG, Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	A-21428	Флуоресцентное вторичное антитело, используемое для визуализации первичных кроличьих антител.
Сыворотка донки	Fisher Scientific	50-413-115	Реагент для блокировки, используемый для уменьшения неспецифической связи антител.
Изображательная система EVOS FL Auto 2	ThermoFisher Scientific	AMAFD2000	Флуоресцентный микроскоп, используемый для получения изображений.
Fiji (ImageJ) 2.16.0	NIH	fiji.sc	Платформа обработки изображений, используемая для анализа морфологии и плагинов в дальнейшем.
Fluoromount-G	ThermoFisher Scientific	00-4959-52	Монтажное средство, используемое для сохранения флуоресценции и закрепления покровных стекол.
Изофлуран	EntirelyPets Pharmacy	MWI502017	Ингаляционный анестетик, используемый во время процедур на животных.
Липосахарид	Millipore Sigma	L2630	Используется для вызывания системного нейровоспаления и активацию микроглии у грызунов.
Matplotlib	https://pypi.org/project/matplotlib/		Python библиотека для построения графиков, используемая для визуализации данных и создания рисунков.
MMPS (Mapping Microglial Parameters Software) v1.00	This work	https://github.com/NeurodegenerativePharmaceuticalLab/Mapping-Microglia-Parameters-Software/releases/tag/v1.00	Платформа открытого программного обеспечения, разработанная для анализа морфологии микроглии.
Net wells	Millipore Sigma	CLS3477	Вставки, используемые для удержания свободно плавающих тканевых секций во время процедур окраски.
Numpy	https://pypi.org/project/numpy/		Python библиотека, используемая для числовых вычислений в рамках MMPS.
Объектив (4×)	ThermoFisher Scientific	AMEP4922	Объектив с низким увеличением, используемый для анатомической ориентации и идентификации областей.
Объектив (40×)	ThermoFisher Scientific	AMEP4625	Объектив с высоким увеличением, используемый для изображения морфологии микроглии.
opencv-python	https://pypi.org/project/opencv-python/		Библиотека компьютерного зрения, используемая для функций обработки изображений в рамках MMPS.
Параформальдегид	ThermoFisher Scientific	169650025	Фиксирующее средство, используемое для перфузии тканей и их сохранения перед разрезанием.
Permount	Fisher Scientific	SP15-100	Постоянное монтажное средство, используемое для сохранения слайдов.
Фосфатно-буферный раствор соли	Fisher Scientific	BP3991	Буферный раствор, используемый для промывания тканей и приготовления реагентов.
Pillow	https://pypi.org/project/Pillow/		Python библиотека обработки изображений, используемая для выполнения операций обработки изображений.
PyQt5	https://pypi.org/project/PyQt5/		Python фреймворк для создания графических пользовательских интерфейсов, используемый для создания графического пользовательского интерфейса MMPS.
Python 3.11	Python Software Foundation	python.org	Языковая среда программирования, используемая для разработки и запуска MMPS.
R 4.3.2	R Foundation for Statistical Computing	r-project.org	Статистическое программное обеспечение, используемое для анализа данных и создания графиков.
Scikit-image	https://pypi.org/project/scikit-image/		Python библиотека для анализа изображений, используемая для обработки и сегментации изображений.
Scipy	https://pypi.org/project/scipy/		Python пакет для научных вычислений, используемый для фильтрации и операций обработки изображений.
Крысы Спраг Дэли	Evingo	002	Экспериментальные животные, используемые для валидации модели нейровоспаления.
Сахароз	Fisher Scientific	S5-3	Криопротектор, используемый перед замораживанием ткани головного мозга.
Tifffile	https://pypi.org/project/tifffile/		Python пакет, используемый для чтения и записи файлов изображений TIFF.
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583	Средство для вложения, используемое для криосекторирования замороженных образцов тканей.
Тритон X-100	Fisher Scientific	BP